包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑及其制備方法。該制備方法先制備施氏假單胞菌菌體，得菌體A，然后制備納米鐵溶液B，再制備包埋劑瓊脂、PVA、SiO2溶液C，制備交聯(lián)劑硫酸鋁飽和硼酸溶液D，在50‐70℃恒溫水浴條件下，按體積比分別取15～18％溶液B，6～15％的菌體A加入到57～66％溶液C中，攪拌混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境下滴加至室溫的1‐22％溶液D中，交聯(lián)處理，清洗，保存，得到納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑。本發(fā)明利用納米鐵和微生物間的協(xié)同作用提高三氯生的降解效率；所制得的菌劑強(qiáng)度高、微生物毒性小、原材料來(lái)源價(jià)格低廉，可廣泛用于受三氯生污染的水體處理。
【專利說(shuō)明】
包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及三氯生廢水處理領(lǐng)域，具體是一種用于降解三氯生的包埋型納米鐵/ 單一微生物復(fù)合菌劑及其制備方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]三氯生具有良好的殺菌消毒作用，且具備良好的安全性，甚至有促進(jìn)人體皮膚新陳代謝、光亮潤(rùn)澤的功效。從20世紀(jì)70年代應(yīng)用于香皂生產(chǎn)以來(lái)，三氯生的應(yīng)用范圍逐步擴(kuò)大，現(xiàn)已被廣泛用于個(gè)人護(hù)理品及藥品的生產(chǎn)過(guò)程中，如洗滌劑、除臭劑、化妝品、消毒器械，以及紡織品的出廠前消毒殺菌處理等。三氯生屬于極性疏水性有機(jī)物，易沉積于土壤、 底泥等固相物質(zhì)。疏水物質(zhì)的親脂性使其易于在生物體內(nèi)積累，也增加三氯生環(huán)境殘留的可能性，并通過(guò)哺乳動(dòng)物的食物鏈積累威脅人類健康。這類污染物的易吸附沉積性、持久性、生物富集性，給周圍的生態(tài)環(huán)境帶來(lái)長(zhǎng)期的、不可預(yù)測(cè)的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)此類污染的控制與治理已引起人們的廣泛關(guān)注。
[0003]生物處理是當(dāng)前常用的廢水處理方法，這種方法通過(guò)微生物的新陳代謝作用，將廢水中的污染物質(zhì)分解、吸收，從而達(dá)到治理污染的目的。生物處理法與其他方法相比，其成本低，效率高，而且容易操作，最重要的是沒(méi)有二次污染，因此，在廢水處理中得到了廣泛的應(yīng)用。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，廢水的成分日益復(fù)雜，尤其當(dāng)廢水中含有有毒、難降解的有機(jī)污染物時(shí)，由于對(duì)該類有機(jī)物具有專項(xiàng)降解能力的微生物在環(huán)境中的種類、數(shù)量較少，同時(shí)它在種間競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，因此，傳統(tǒng)的生物處理技術(shù)面臨極大挑戰(zhàn)。
[0004]如果在傳統(tǒng)的生物處理體系中投加具有特定功能的微生物或某些基質(zhì)，增強(qiáng)它對(duì)特定污染物的降解能力，從而改善整個(gè)污水處理體系的處理效果，我們稱這種技術(shù)為生物強(qiáng)化技術(shù)。近年來(lái)，納米材料由于其巨大的比表面積和高活性，使反應(yīng)速率得到提高，應(yīng)用于被污染的土壤和地下水修復(fù)以及污水處理，而其中對(duì)納米零價(jià)鐵(nano-scale zero-valent，nZVI)研究相對(duì)較多。nZVI是一種有效的脫鹵還原劑，早在20世紀(jì)80年代就引起了人們的關(guān)注。納米零價(jià)鐵可催化還原多種有機(jī)鹵化物，如:鹵代烷烴、鹵代烯烴、鹵代芳香烴等難降解有機(jī)物污染物，將其轉(zhuǎn)化為無(wú)毒無(wú)害的化合物，同時(shí)提高其可生化性，能為進(jìn)一步生物降解創(chuàng)造有利條件。雖然納米零價(jià)鐵具有很多優(yōu)勢(shì)，但是在其應(yīng)用的過(guò)程中還遇到一些問(wèn)題，比如納米零價(jià)鐵的穩(wěn)定性較差。納米零價(jià)鐵很容易被氧化而形成鐵的氧化物或者氫氧化物在納米鐵表面沉積，從而使得納米零價(jià)鐵產(chǎn)生鈍化。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種三氯生的降解效率高，菌劑強(qiáng)度高、微生物毒性小、原材料來(lái)源價(jià)格低廉的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑及其制備方法。
[0006]本發(fā)明利用化學(xué)手段，將納米鐵和微生物進(jìn)行包埋制成復(fù)合菌劑，可以使其在三氯生污染物的處理上形成協(xié)同效應(yīng)，不僅可以利用納米鐵顆粒高的比表面積和表面活性，還可以保證微生物的穩(wěn)定性和活性，制成的包埋型菌劑適合原位修復(fù)且無(wú)二次污染。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，包括如下步驟:
[0009](1)菌體的制備:[〇〇1〇]挑取施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri ? )2環(huán)，轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)液中，細(xì)菌在35-37°C的條件下培養(yǎng)1 - 3天，以5-18 %的體積比接種至增殖培養(yǎng)基，在35 - 37 °C的條件下培養(yǎng)1 - 3 天，離心處理后，獲得上述菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；用磷酸鹽緩沖液洗滌，獲得用于三氯生降解的施氏假單胞菌菌體，記為菌體A;
[0011](2)納米鐵溶液的制備:[0〇12]采用液相還原法，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的液相體系中，強(qiáng)還原劑KBH4還原FeS〇4 ? 7H20得到Fe0，用FJ制備濃度為0.1?0.6g/L的納米鐵溶液，記為溶液B;[0013 ](3)包埋劑瓊脂、PVA、S i02溶液的制備:
[0014]將瓊脂和PVA在90-100 °C的溫度下加熱完全溶解于清水，得到瓊脂質(zhì)量百分含量為5?9%，PVA質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為7.5?15%的溶液，再加入Si02，控制Si02在混合物中質(zhì)量濃度為1?3mg/L，待混合交替冷卻至50-60°C，記為溶液C;[〇〇15](4)交聯(lián)劑硫酸鋁飽和硼酸溶液的制備:
[0016]將硫酸鋁粉末溶于飽和硼酸溶液中，得到摩爾濃度為0.1?lmol/L的硫酸鋁的飽和硼酸溶液，記為溶液D;
[0017](5)納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑制備:
[0018]在50-70°C恒溫水浴條件下，按體積比分別取15?18%溶液B，6?15%的菌體A加入到57?66%溶液C中，攪拌混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境下滴加至室溫的1 -22%溶液D中， 交聯(lián)處理，清洗，保存，得到納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑。[〇〇19]為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，施氏假單胞菌的營(yíng)養(yǎng)液為牛肉膏6.0g/L， NaCl5 ? Og/L，蛋白胨 10 ? Og/L，大豆粉2 ? Og/L，pH 6 ? 5，其余為水。
[0020]優(yōu)選地，施氏假單胞菌的增殖培養(yǎng)基為酪蛋白20.0g/L，磷酸氫鉀3.0g/L，葡萄糖 3.0g/L，大豆粉4.0g/L，氯化鈉5.0g/L，其余為水。
[0021]優(yōu)選地，按體積百分比計(jì)，所述磷酸鹽緩沖液的成分為氯化鈉9.0g/L，氯化鉀 0.3g/L，磷酸氫二鉀1.2g/L和磷酸二氫鉀0.3g/L，其余為水。[〇〇22]優(yōu)選地，所述包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的保存方法是指在無(wú)菌生理鹽水中浸泡并放置冰箱中4°C下保存;所述施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzer1.)2環(huán)轉(zhuǎn)移到30-40mL營(yíng)養(yǎng)液中。
[0023]優(yōu)選地，步驟1)所述離心處理為以4000 - 5000rpm的速度離心15 - 30min。
[0024]優(yōu)選地，步驟1)所述磷酸鹽緩沖液洗滌的次數(shù)為1 - 2次；[〇〇25]優(yōu)選地，步驟5)所述清洗為用0.8 -1.2 %的NaCl溶液洗滌。[〇〇26]優(yōu)選地，步驟5)所述交聯(lián)處理為在4_6°C條件下交聯(lián)10?36h。[〇〇27]一種用于降解三氯生的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑，由上述制備方法制得。
[0028]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):[〇〇29]1)本發(fā)明包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑，利用納米鐵對(duì)三氯生的強(qiáng)還原性、對(duì)微生物的吸附性，以及納米鐵可與微生物的線粒體的細(xì)胞色素C作用，改變細(xì)胞色素C的氧化還原電位和加強(qiáng)電子傳遞能力，復(fù)合菌劑能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)共同促進(jìn)三氯生的降解。 經(jīng)過(guò)本發(fā)明制備的復(fù)合菌劑與相同實(shí)驗(yàn)條件下單一的微生物實(shí)驗(yàn)和單一的納米鐵實(shí)驗(yàn)對(duì)比，可以驗(yàn)證復(fù)合菌劑能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)共同促進(jìn)三氯生的降解。
[0030]2)本發(fā)明所選用的包埋劑瓊脂原材料來(lái)源廣，廉價(jià)無(wú)毒，具有良好的生物相容性， 所制得的菌劑強(qiáng)度高，微生物毒性低，可重復(fù)利用4-5次，解決微生物的不穩(wěn)定問(wèn)題，納米鐵與微生物形成協(xié)同效應(yīng)加強(qiáng)三氯生降解效率，適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
[0031]3)本方法使用簡(jiǎn)單方便，可將制成菌劑活化后直接投放在污染水體中，實(shí)現(xiàn)污染水體的原位修復(fù)，有效避免微生物的流失，不存在二次污染。【具體實(shí)施方式】
[0032]為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于實(shí)施例表述的范圍。
[0033]實(shí)施例1[〇〇34](1)三氯生降解菌液的制備
[0035] 挑取施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri ?)2環(huán)，將其分別轉(zhuǎn)移到30mL營(yíng)養(yǎng)液中，細(xì)菌在35°C的條件下培養(yǎng)2天，以10%的體積比例接種至施氏假單胞菌的增殖培養(yǎng)基的容器中，然后在35°C的條件下培養(yǎng)2天，以5000rpm的速度離心15min后，獲得上述菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；[〇〇36]將上述菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞取出，用磷酸鹽緩沖液(其主要成分氯化鈉9.0g/L， 氯化鉀0.3g/L，磷酸氫二鉀1.2g/L和磷酸二氫鉀0.3g/L，其余為水)洗滌2次后，按并懸浮于生理鹽水中，在4°C冷藏備用，記為菌體A;[〇〇37]施氏假單胞菌的營(yíng)養(yǎng)液為牛肉膏6.(^/1，他(:15.(^/1，蛋白胨10.(^/1，大豆粉 2.0g/L，pH 6.5,其余為水。[〇〇38]施氏假單胞菌的增殖培養(yǎng)基為酪蛋白20.0g/L，磷酸氫鉀3.0g/L，葡萄糖3.0g/L， 大豆粉4.0g/L，氯化鈉5.0g/L，其余為水。[〇〇39](2)納米鐵溶液的制備[〇〇4〇] 采用液相還原法，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的液相體系中，強(qiáng)還原劑KBH4還原FeS〇4 ? 7H20得到 FeQ，用FJ制備濃度為0.4g/L的納米鐵溶液，記為溶液B。[〇〇411(3)包埋劑瓊脂、PVA、Si02溶液的制備
[0042]將瓊脂、PVA在90°C的溫度下加熱完全溶解于清水，得到瓊脂質(zhì)量百分含量為5%， PVA質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為7.5 %的溶液，再加入Si02，該Si02在混合物中質(zhì)量濃度為lmg/L，待混合交替冷卻至55 °C，記為溶液C;
[0043](4)交聯(lián)劑硫酸鋁飽和硼酸溶液的制備
[0044]將硫酸鋁粉末溶于飽和硼酸溶液中，得到摩爾濃度為0.5mol/L的硫酸鋁的飽和硼酸溶液，記為溶液D。[〇〇45](5)包埋型菌劑的制備[〇〇46] 在60°C恒溫水浴條件下，按體積百分比分別取15 %0.lmg/L的溶液B，6 %的菌體A 加入到57 %的溶液C(含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)5 %瓊脂和7.5 % PVA，lmg/LSi02)中，攪拌混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境下滴加至22%溶液D(室溫)中，在4°C條件下交聯(lián)10h，之后用0.9wt%的 NaCl溶液清洗、保存，得到納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑。[〇〇47](6)三氯生污染的降解效果[〇〇48]取制得的納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑3mg投入營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)6h，使其活化后直接投入10L濃度為5mg/L的三氯生模擬污染廢水中，曝氣處理5d，曝氣量為2L/h。以質(zhì)量濃度計(jì)，營(yíng)養(yǎng)液為牛肉膏6.0g/L，NaCl5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，大豆粉2.0g/L，pH 6.5，其余為水。
[0049]對(duì)照組采用相同實(shí)驗(yàn)條件下的單一施氏假單胞菌，但未與納米鐵形成包埋體。 [0〇5〇] 三氯生采用Waters高效液相色譜測(cè)定，測(cè)定條件為色譜柱:Waters Ci8柱(150 X 4.6臟1.0.，5111]1);35°〇柱溫，以乙腈/水(75:25，￥八)為流動(dòng)相，總流速1.〇11117/111；[11，進(jìn)樣量10 yL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間約是7.2min，樣品總檢測(cè)時(shí)間為12min。通過(guò)測(cè)試水樣中二氯生初始濃度C0和反應(yīng)后濃度Ct，得到二氯生去除率。[0051 ]采用本實(shí)施例方法，在含5mg/L三氯生5L廢水中投加2g納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑直接將菌劑投入營(yíng)養(yǎng)液(見(jiàn)本實(shí)施例)培養(yǎng)6h，活化后，直接投放使用。曝氣處理5d后三氯生去除率達(dá)83%明顯高于單一菌種的對(duì)照組20% (相同實(shí)驗(yàn)條件下的單一施氏假單胞菌， 未與納米鐵形成包埋體)，表明包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑對(duì)三氯生具有良好的降解效果。因?yàn)榧{米鐵對(duì)三氯生的強(qiáng)還原性、對(duì)微生物的吸附性，以及納米鐵可與微生物的線粒體的細(xì)胞色素c作用，改變細(xì)胞色素c的氧化還原電位和加強(qiáng)電子傳遞能力，因此復(fù)合菌劑能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)共同促進(jìn)三氯生的降解。[〇〇52]本發(fā)明制備的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑不僅在對(duì)三氯生的降解上有優(yōu)勢(shì)，而且該包埋劑可以利用納米鐵顆粒高的比表面積和表面活性，還可以保證微生物的穩(wěn)定性和活性，制成的包埋型菌劑適合原位修復(fù)且無(wú)二次污染，制成的包埋劑只需簡(jiǎn)單活化后即可投入使用，具有大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的前景。
[0053] 實(shí)施例2[〇〇54](1)三氯生降解菌液的制備[0〇55] 挑取施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzer1.)2環(huán)(來(lái)源同實(shí)施例1)，將其分別轉(zhuǎn)移到30mL營(yíng)養(yǎng)液中，細(xì)菌在35°C的條件下培養(yǎng)2天，以10%的體積比例接種至施氏假單胞菌的增殖培養(yǎng)基的容器中，然后在35°C的條件下培養(yǎng)2天，以5000rpm的速度離心15min后，獲得上述菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；
[0056]將上述菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞取出，用磷酸鹽緩沖液(其主要成分氯化鈉9.0g/L， 氯化鉀0.3g/L，磷酸氫二鉀1.2g/L和磷酸二氫鉀0.3g/L，其余為水)洗滌2次后，按并懸浮于生理鹽水中，在4°C冷藏備用，記為菌體A;[〇〇57]施氏假單胞菌的營(yíng)養(yǎng)液為牛肉膏6.(^/1，他(:15.(^/1，蛋白胨10.(^/1，大豆粉 2.0g/L，pH 6.5,其余為水。[〇〇58]施氏假單胞菌的增殖培養(yǎng)基為酪蛋白20.0g/L，磷酸氫鉀3.0g/L，葡萄糖3.0g/L， 大豆粉4.0g/L，氯化鈉5.0g/L，其余為水。[〇〇59](2)納米鐵溶液的制備[〇〇6〇] 采用液相還原法，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的液相體系中，強(qiáng)還原劑KBH4還原FeS〇4 ? 7H20得到 FeQ，用FJ制備濃度為0.4g/L的納米鐵溶液，記為溶液B。[0061 ](3)包埋劑瓊脂、PVA、Si02溶液的制備
[0062]將瓊脂、PVA在90°C的溫度下加熱完全溶解于清水，得到瓊脂質(zhì)量百分含量為7%， PVA質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為11.5 %的溶液，再加入Si02，Si02在混合物中質(zhì)量濃度為2mg/L，待混合交替冷卻至55 °C，記為溶液C;[〇〇63](4)交聯(lián)劑硫酸鋁飽和硼酸溶液的制備
[0064]將硫酸鋁粉末溶于飽和硼酸溶液中，得到摩爾濃度為0.5mol/L的硫酸鋁的飽和硼酸溶液。記為溶液D。[〇〇65](5)包埋型菌劑的制備
[0066]在60 °C恒溫水浴條件下，按體積比分別取16 % 0.4mg/L的溶液B，10 %的菌體A加入到61 %的溶液C(含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)7%瓊脂、11.5%PVA、2mg/L Si02)中，攪拌混合均勻。在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境下滴加至13 %溶液D(室溫)中，在4°C條件下交聯(lián)23h，之后用0.9wt %的NaCl溶液清洗、保存，得到納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑。[〇〇67](6)三氯生污染的降解效果[〇〇68]取制得的納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑3mg投入營(yíng)養(yǎng)液基進(jìn)行培養(yǎng)6h，使其活化后直接投入10L濃度為5mg/L的三氯生模擬污染廢水中，曝氣處理5d，曝氣量為2L/h。以質(zhì)量濃度計(jì)，營(yíng)養(yǎng)液的成分為牛肉膏6 ? Og/L，NaCl5 ? Og/L，蛋白胨10 ? Og/L，大豆粉2 ? Og/L，pH 6 ? 5， 其余為水。[0〇69]三氯生采用Waters高效液相色譜測(cè)定，測(cè)定條件為色譜柱:Waters Cis柱(150 X4.6臟1.0.，5111]1);35°〇柱溫，以乙腈/水(75:25，￥八)為流動(dòng)相，總流速1.〇11117/111；[11，進(jìn)樣量10 yL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間約是7.2min，樣品總檢測(cè)時(shí)間為12min。通過(guò)測(cè)試水樣中二氯生初始濃度Co和反應(yīng)后濃度Ct，得到二氯生去除率。
[0070]采用本實(shí)施例方法，在含5mg/L三氯生5L廢水中投加2g納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑;活化后，直接將菌劑投入營(yíng)養(yǎng)液(見(jiàn)本實(shí)施例)培養(yǎng)6h，直接投放使用。曝氣處理5d后三氯生去除率達(dá)83%，明顯高于單一菌種的對(duì)照組28% (相同實(shí)驗(yàn)條件下的單一施氏假單胞菌，未與納米鐵形成包埋體)，表明包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑對(duì)三氯生具有良好的降解效果。因?yàn)榧{米鐵對(duì)三氯生的強(qiáng)還原性、對(duì)微生物的吸附性，以及納米鐵可與微生物的線粒體的細(xì)胞色素c作用，改變細(xì)胞色素c的氧化還原電位和加強(qiáng)電子傳遞能力，因此復(fù)合菌劑能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)共同促進(jìn)三氯生的降解。[0〇71]三氯生采用Waters高效液相色譜測(cè)定，測(cè)定條件為色譜柱:Waters Cis柱(150 X4.6臟1.0.，5111]1);35°〇柱溫，以乙腈/水(75:25，￥八)為流動(dòng)相，總流速1.〇11117/111；[11，進(jìn)樣量10 此，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間約是7.2min，樣品總檢測(cè)時(shí)間為12min。[〇〇72] 實(shí)施例3[〇〇73](1)三氯生降解菌液的制備[0〇74]挑取施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzer1.)2環(huán)(來(lái)源同實(shí)施例1)，將其分別轉(zhuǎn)移到30mL營(yíng)養(yǎng)液中，細(xì)菌在35°C的條件下培養(yǎng)2天，以10%的體積比例接種至增殖培養(yǎng)基的容器中，然后在35°C的條件下培養(yǎng)2天，以5000rpm的速度離心15min后，獲得上述菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞；[〇〇75]將上述菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞取出，用磷酸鹽緩沖液(其主要成分氯化鈉9.0g/L， 氯化鉀0.3g/L，磷酸氫二鉀1.2g/L和磷酸二氫鉀0.3g/L，其余為水)洗滌2次后，按并懸浮于生理鹽水中，在4°C冷藏備用。記為菌體A;[〇〇76]施氏假單胞菌的營(yíng)養(yǎng)液為牛肉膏6.(^/1，他(:15.(^/1，蛋白胨10.(^/1，大豆粉 2.0g/L，pH 6.5,其余為水。[〇〇77]施氏假單胞菌的增殖培養(yǎng)基為酪蛋白20.0g/L，磷酸氫鉀3.0g/L，葡萄糖3.0g/L， 大豆粉4.0g/L，氯化鈉5.0g/L，其余為水。[〇〇78](2)納米鐵溶液的制備[〇〇79]采用液相還原法，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的液相體系中，強(qiáng)還原劑KBH4還原FeS〇4 ? 7H20得到FeQ，用FJ制備濃度為0.4g/L的納米鐵溶液。記為溶液B。
[0080](3)包埋劑瓊脂、PVA、S i 02溶液的制備
[0081]將瓊脂、PVA在90°C的溫度下加熱完全溶解于清水，得到瓊脂質(zhì)量百分含量為9%， PVA質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為15 %的溶液，再加入Si02，Si02在混合物中質(zhì)量濃度為3mg/L，待混合交替冷卻至55 °C，記為溶液C;[〇〇82](4)交聯(lián)劑硫酸鋁飽和硼酸溶液的制備[〇〇83]將硫酸鋁粉末溶于飽和硼酸溶液中，得到摩爾濃度為0.5mol/L的硫酸鋁的飽和硼酸溶液。記為溶液D。[〇〇84](5)包埋型菌劑的制備[〇〇85]在60°C恒溫水浴條件下，按體積百分比分別取15 %0.6mg/L的溶液B，6 %的菌體A加入到66%的溶液C(含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)9%瓊脂、15%PVA、3mg/L Si02)中，攪拌混合均勻。在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境下滴加至1 %溶液D(室溫)中，在4°C條件下交聯(lián)36h，之后用0.9wt %的NaCl溶液清洗、保存，得到納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑。[〇〇86](6)三氯生污染的降解效果[〇〇87]取制得的納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑3mg投入營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)6h，使其活化后直接投入10L濃度為5mg/L的三氯生模擬污染廢水中，曝氣處理5d，曝氣量為2L/h。以質(zhì)量濃度計(jì)，營(yíng)養(yǎng)液的成分為牛肉膏6 ? 0g/L，NaCl5 ? 0g/L，蛋白胨10 ? 0g/L，大豆粉2 ? 0g/L，pH 6 ? 5，其余為水。[0〇88]三氯生采用Waters高效液相色譜測(cè)定，測(cè)定條件為色譜柱:Waters Ci8柱(150 X4.6臟1.0.，5111]1);35°〇柱溫，以乙腈/水(75:25，￥八)為流動(dòng)相，總流速1.〇11117/111；[11，進(jìn)樣量10 yL，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間約是7.2min，樣品總檢測(cè)時(shí)間為12min。通過(guò)測(cè)試水樣中二氯生初始濃度Co和反應(yīng)后濃度Ct，得到二氯生去除率[〇〇89]采用本實(shí)施例方法，在含5mg/L三氯生5L廢水中投加2g納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑;活化后，直接將菌劑投入營(yíng)養(yǎng)液(見(jiàn)本實(shí)施例)培養(yǎng)6h，直接投放使用。曝氣處理5d后三氯生去除率達(dá)83%，明顯高于單一菌種(相同實(shí)驗(yàn)條件下的單一施氏假單胞菌，但未與納米鐵形成包埋體)的對(duì)照組21%，表明包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑對(duì)三氯生具有良好的降解效果。因?yàn)榧{米鐵對(duì)三氯生的強(qiáng)還原性、對(duì)微生物的吸附性，以及納米鐵可與微生物的線粒體的細(xì)胞色素c作用，改變細(xì)胞色素c的氧化還原電位和加強(qiáng)電子傳遞能力。因此復(fù)合菌劑能夠產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)共同促進(jìn)三氯生的降解。[0〇9〇]三氯生采用Waters高效液相色譜測(cè)定，測(cè)定條件為色譜柱:Waters Ci8柱(150 X4.6臟1.0.，5111]1);35°〇柱溫，以乙腈/水(75:25，￥八)為流動(dòng)相，總流速1.〇11117/111；[11，進(jìn)樣量10 此，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。目標(biāo)物質(zhì)出峰時(shí)間約是7.2min，樣品總檢測(cè)時(shí)間為12min。
[0091]本發(fā)明克服了單一菌種降解三氯生過(guò)程中容易受到中間代謝產(chǎn)物抑制的問(wèn)題，同時(shí)將納米鐵和微生物進(jìn)行包埋制成菌劑，不僅可以利用納米鐵顆粒高的比表面積和表面活性，還可以保證微生物的穩(wěn)定性和活性，使其在三氯生污染物的處理上形成協(xié)同效應(yīng)，去除率明顯增高。制成的包埋型菌劑適合原位休息且無(wú)二次污染。[〇〇92]根據(jù)相關(guān)細(xì)菌降解三氯生的報(bào)道:真菌漆酶(laccases)/氧化還原介體體系降解三氯生的降解率為90%[Murugesan K，Chang Y Y，Kim Y M，et al.Enhanced transformat1n of triclosanbylaccase in the presence of redox mediators[J].Water Research，2010，44( 1): 298-308 ?]，白腐真菌對(duì)三氯生的降解率亦為90% [Inoue Y, Hata T , Kawai S，et al.Eliminat1n and detoxificat1n of triclosan by manganeseperoxidase from white rot fungus[J].Journal of Hazardous Materials， 2010,180(1-3): 764-767.]。這些細(xì)菌對(duì)三氯生的降解效率都明顯低于本發(fā)明的菌劑，本發(fā)明制備的包埋型納米鐵單一微生物菌劑不僅在對(duì)三氯生的降解上有優(yōu)勢(shì)，而且該包埋劑可以利用納米鐵顆粒高的比表面積和表面活性，還可以保證微生物的穩(wěn)定性和活性，制成的包埋型菌劑適合原位修復(fù)且無(wú)二次污染；制成的包埋劑只需簡(jiǎn)單活化后即可投入使用，具有大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的前景。
[0093]本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟:(1)菌體的制備:挑取施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzer1.)2環(huán)，轉(zhuǎn)移到營(yíng)養(yǎng)液中，細(xì)菌在35_37°C的 條件下培養(yǎng)1-3天，以5-18%的體積比接種至增殖培養(yǎng)基，在35-37°C的條件下培養(yǎng)1-3天， 離心處理后，獲得上述菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞;用磷酸鹽緩沖液洗滌，獲得用于三氯生降解 的施氏假單胞菌菌體，記為菌體A;(2)納米鐵溶液的制備:采用液相還原法，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的液相體系中，強(qiáng)還原劑KBH4還原FeS〇4 ? 7H20得到FeQ，用 Fe^制備濃度為0.1?0.6g/L的納米鐵溶液，記為溶液B;(3)包埋劑瓊脂、PVA、Si02溶液的制備:將瓊脂和PVA在90-100°C的溫度下加熱完全溶解于清水，得到瓊脂質(zhì)量百分含量為5? 9%，PVA質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為7.5?15%的溶液，再加入Si02，控制Si02在混合物中質(zhì)量濃度為1? 3mg/L，待混合交替冷卻至50-60°C，記為溶液C;(4)交聯(lián)劑硫酸鋁飽和硼酸溶液的制備:將硫酸鋁粉末溶于飽和硼酸溶液中，得到摩爾濃度為0.1?lmol/L的硫酸鋁的飽和硼 酸溶液，記為溶液D;(5)納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑制備:在50 - 70 °C恒溫水浴條件下，按體積比分別取15?18 %溶液B，6?15 %的菌體A加入到 57?66 %溶液C中，攪拌混合均勻，在氮?dú)獗Ｗo(hù)的環(huán)境下滴加至室溫的1 - 22%溶液D中，交聯(lián) 處理，清洗，保存，得到納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，施氏假單胞 菌的營(yíng)養(yǎng)液為牛肉膏6.(^/1，似(:15.(^/1，蛋白胨10.(^/1，大豆粉2.(^/1，？116.5，其余為 水。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，施氏假單胞 菌的增殖培養(yǎng)基為酪蛋白20.0g/L，磷酸氫鉀3.0g/L，葡萄糖3.0g/L，大豆粉4.0g/L，氯化鈉 5.0g/L，其余為水。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，其特征在 于，按體積百分比計(jì)，所述磷酸鹽緩沖液的成分為氯化鈉9.0g/L，氯化鉀0.3g/L，磷酸氫二 鉀1.2g/L和磷酸二氫鉀0.3g/L，其余為水。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，所述包埋型 納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的保存方法是指在無(wú)菌生理鹽水中浸泡并放置冰箱中4°C下 保存;所述施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri ? )2環(huán)轉(zhuǎn)移到30_40mL營(yíng)養(yǎng)液中。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，步驟1)所述 離心處理為以4000-5000rpm的速度離心15_30min。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，步驟1)所述 磷酸鹽緩沖液洗滌的次數(shù)為1 _ 2次。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，步驟5)所述 清洗為用〇.8-1.2%的NaCl溶液洗滌。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑的制備方法，步驟5)所述交聯(lián)處理為在4-6°C條件下交聯(lián)10?36h。10.—種用于降解三氯生的包埋型納米鐵/單一微生物復(fù)合菌劑，其特征在于其由權(quán)利 要求1-9任一項(xiàng)所述制備方法制得。
【文檔編號(hào)】C12N11/14GK105969760SQ201610508532
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月29日
【發(fā)明人】陳元彩, 黎良浩
【申請(qǐng)人】華南理工大學(xué)