簇毛麥nam-v1基因及其分子標(biāo)記和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及簇毛麥NAM?V1基因及其分子標(biāo)記和應(yīng)用。本發(fā)明提供的來源于簇毛麥V染色體組的NAM?V1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示?；騈AM?V1在小麥籽粒蛋白質(zhì)積累方面發(fā)揮重要作用，并和小麥抗白粉病基因Pm21共分離，NAM?V1基因在高蛋白質(zhì)和抗白粉病小麥新品種培育中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。另外，本發(fā)明還提供用于特異檢測(cè)NAM?V1基因的分子標(biāo)記CauNAM?V1及其應(yīng)用，該標(biāo)記能夠特異檢測(cè)小麥品種中是否存在NAM?V1基因，還可以檢測(cè)小麥材料中是否含有抗白粉病基因Pm21，可同時(shí)用作小麥高蛋白和抗白粉病篩選的分子標(biāo)記。
【專利說明】
簇毛麥NAM-V1基因及其分子標(biāo)記和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及簇毛麥NAM-V1基因及其 分子標(biāo)記和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥目前是全球第一大糧食作物，全世界約有35 %~40 %的人口將其作為主要的 食物來源，約占全球卡路里消費(fèi)總量的20%，全球小麥年產(chǎn)量7億噸左右，提供約7000萬噸 的蛋白質(zhì)。因此，增加小麥籽粒的蛋白含量不僅能夠改良小麥的品質(zhì)，而且有助于大幅度提 高食用蛋白質(zhì)的總量。小麥籽粒蛋白含量(grain protein concentration，GPC)及其組成 決定著小麥的加工品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。小麥的籽粒蛋白含量是典型的數(shù)量性狀，而且容易受 到環(huán)境條件的影響(Groos et al.，2003)。2006年，1^1^等通過圖位克隆獲得了控制蛋白含 量的基因 NAM-B1，該基因位于小麥6BS染色體上，編碼一種NAC轉(zhuǎn)錄因子（Uauy et al.， 2006)。簇毛麥(Haynaldia ￥丨11〇83,211 = 21=14，￥基因組)屬小麥族，為一年生或多年生異 株授粉二倍體植物。簇毛麥基因耐寒、分蘗力強(qiáng)、抗病、耐鹽、抗旱和籽粒蛋白含量高等優(yōu)良 特性，是小麥遺傳改良的重要基因資源(G rqdzi e 1 e w ska, 2 0 0 6)。小麥-簇毛麥易位系是利 用簇毛麥優(yōu)異基因資源的重要途徑，例如，6VS · 6AL易位系攜帶抗白粉病基因 Pm21，對(duì)小麥 白粉病表現(xiàn)抗性強(qiáng)、抗譜廣，育成的品種累計(jì)推廣面積達(dá)到340萬公頃(Cao et al.，2011)。 除了抗白粉病基因，在簇毛麥6VS染色體上還定位了副硫α-醇溶蛋白（Sulfur-richa-prolamins)基因 Gli_V2、抗條銹（Stripe rust)基因 Yr26等優(yōu)異性狀（Blanco et al·， 1991;Ma et al.，2001)。但是目前還沒有簇毛麥中控制籽粒蛋白含量性狀的基因報(bào)道。
[0003] 白粉病是一種嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的世界性病害，在各國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)均有發(fā) 生。近二十年來，小麥白粉病發(fā)生的范圍和面積不斷擴(kuò)大，危害程度日益加重，目前，小麥白 粉病已成為影響小麥產(chǎn)量的重要限制因素。小麥白粉病的病原菌為禾本科布氏白粉菌小麥 專化型，屬子囊菌亞門真菌，該病菌具有多個(gè)生理小種，在不同地理生態(tài)環(huán)境中與寄主互作 過程中變異速度快，目前一些大面積生產(chǎn)應(yīng)用的品種已經(jīng)或正在喪失抗性，因此白粉病害 處于隨時(shí)大面積流行的嚴(yán)重態(tài)勢(shì)。農(nóng)藥防治對(duì)防控白粉病起到了一定的作用，但是會(huì)耗費(fèi) 大量的人力和財(cái)力資源，不利用生態(tài)環(huán)境。利用現(xiàn)代生物技術(shù)，不斷鑒定和挖掘小麥中的抗 白粉病基因或QTL位點(diǎn)，將抗白粉病基因或QTL位點(diǎn)通過分子基因工程或分子標(biāo)記輔助選擇 培育和推廣抗病品種，是防治小麥白粉病最為安全、經(jīng)濟(jì)和有效的途徑。目前已經(jīng)鑒定的小 麥抗白粉病基因/位點(diǎn)有70多個(gè)，隨著這些基因在小麥育種上的應(yīng)用和推廣，病原菌的生理 小種也發(fā)生了很大的變化。目前大部分的抗白粉病已經(jīng)失去了抗性。抗白粉病基因 Pm21來 源于簇毛麥，Pm21抗國(guó)內(nèi)所有的白粉病菌株及檢測(cè)過的120個(gè)歐洲生理小種，是目前世界上 抗譜最廣、抗性最穩(wěn)定的抗白粉病基因 （Cao et al.，2011)，因此，開發(fā)與Pm21連鎖的分子 標(biāo)記對(duì)于小麥抗白粉病抗病育種具有重要意義。目前，在現(xiàn)有文獻(xiàn)中小麥抗白粉病基因 Pm21的分子標(biāo)記報(bào)道較少，而且大部分Pm21的分子標(biāo)記是基于SDS-PAGE電泳的標(biāo)記，使用 不方便，限制了抗白粉病基因 Pm21在小麥抗病育種中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供簇毛麥NAM-V1基因，以及NAM-V1基因在增加小麥籽粒蛋白質(zhì) 含量中的作用，并且證明在小麥中該基因與抗白粉病基因 Pm21共分離。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供簇毛麥NAM-V1基因分子標(biāo)記CauNAM-Vl及其應(yīng)用，利用 該標(biāo)記特異檢測(cè)小麥品種中是否存在NAM-V1基因，還用于檢測(cè)小麥材料中是否含有抗白粉 病基因 Pm21，同時(shí)用作小麥高蛋白和抗白粉病篩選的分子標(biāo)記。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的簇毛麥NAM-V1基因，其為控制小麥籽粒蛋白 質(zhì)含量的基因，利用該基因可提尚小麥軒粒的蛋白含量。
[0007] 簇毛麥NAM-V1基因的核苷酸序列為：
[0008] i)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或
[0009] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且 表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或
[0010] iii)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID N0:1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸 序列，所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[0011] iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的 核苷酸序列。
[0012]本發(fā)明還提供由上述簇毛麥NAM-V1基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0: 2所示。
[0013] 本發(fā)明還提供含有所述簇毛麥NAM-V1基因的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞系。
[0014] 本發(fā)明還提供所述簇毛麥NAM-V1基因，含有所述NAM-V1基因的表達(dá)盒、重組載體、 重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在提高作物蛋白含量中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明中涉及的作物包括但不限于小麥、大麥、黑麥、燕麥、簇毛麥。
[0016] 攜帶有所述目的基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn) 化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463頁；Geiserson和 Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0017] 例如，可將含有所述NAM-V1基因的表達(dá)盒、重組載體、重組菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系通過 農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管導(dǎo)入或基因槍的方法轉(zhuǎn)入作物中，培育高籽粒蛋白含量的轉(zhuǎn)基因作物。
[0018] 本發(fā)明還提供所述簇毛麥NAM-V1基因的分子標(biāo)記CauNAM-Vl，用于特異性PCR擴(kuò)增 該分子標(biāo)記的引物為：正向引物F5 ' -TCCCCGGTATGCCATGTC-3 '和反向引物R5 ' -AAGATACCGCTAGACCGTGA-3，。
[0019] 本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記CauNAM-Vl在檢測(cè)作物中NAM-V1基因和/或Pm21基因 中的應(yīng)用，
[0020] 本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記CauNAM-Vl在小麥高蛋白含量和/或抗白粉病的分子 標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記CauNAM-Vl在篩選和鑒定兼具高蛋白含量和抗白粉病 的小麥新品種中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明還提供用于檢測(cè)作物中NAM-V1基因和/或Pm21基因的引物，包括正向引物 F5 ' -TCCCCGGTATGCCATGTC-3 ' 和反向引物R5 ' -AAGATACCGCTAGACCGTGA-3 '。
[0023]本發(fā)明進(jìn)一步提供含有所述引物F和R的檢測(cè)試劑盒。
[0024] 本發(fā)明從簇毛麥V染色體中克隆獲得一個(gè)小麥NAM家族基因，命名為NAM-V1，該基 因全長(zhǎng)1528bp，具有完整的開放閱讀框，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，在小麥6VS · 6AL易位 系中NAM-V1基因替換NAM-A1基因后提高了籽粒蛋白的含量，說明NAM-V1基因能夠提高小麥 籽粒的蛋白質(zhì)含量。根據(jù)NAM-V1基因的核苷酸序列，開發(fā)出特異檢測(cè)NAM-V1基因的分子標(biāo) 記CauNAM-Vl，在小麥6VS · 6AL易位系的分離群體中證明該標(biāo)記和小麥抗白粉病基因 Pm21 共分離，證明該標(biāo)記可同時(shí)檢測(cè)NAM-V1基因和Pm21基因。因此，利用NAM-V1基因能夠提高小 麥籽粒的蛋白含量。利用CauNAM-Vl標(biāo)記能同時(shí)檢測(cè)小麥的抗白粉病基因 Pm21，該標(biāo)用于小 麥的分子育種，能夠篩選和獲得兼具高蛋白和抗白粉病的小麥新品種。
[0025] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] ( - )小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，全球小麥年產(chǎn)量約7億噸，如果小麥籽 粒蛋白含量增加1 %，相當(dāng)于全球小麥蛋白含量增加700萬噸。本發(fā)明的NAM-V1基因?qū)π←?籽粒蛋白質(zhì)含量的貢獻(xiàn)率最高超過了 1%，因此，NAM-V1基因?qū)τ谠黾尤虻氖秤玫鞍踪|(zhì)供 應(yīng)具有重要意義。
[0027] (二）小麥抗白粉病基因 Pm21是目前世界上抗譜最廣、抗性最穩(wěn)定的抗白粉病基 因，此前開發(fā)的抗白粉病基因 Pm21的標(biāo)記大多是基于SDS-PAGE電泳技術(shù)的標(biāo)記，操作過程 中制膠、染色步驟復(fù)雜，并且丙烯酰胺、TEMED等對(duì)人體具有很高的毒性。本發(fā)明的CauNAM-VI標(biāo)記是基于瓊脂糖電泳的標(biāo)記，檢測(cè)方法較為簡(jiǎn)單，可使用新型的核酸染料進(jìn)行染色，更 加安全、實(shí)用。對(duì)于充分利用Pm21抗白粉病基因資源，促進(jìn)小麥抗病育種具有重要意義。 [0028](三)本發(fā)明提供的CauNAM-Vl標(biāo)記可同時(shí)檢測(cè)控制小麥籽粒蛋白含量的基因 NAM-VI和抗白粉病基因 Pm21，即一個(gè)標(biāo)記同時(shí)選擇兩種性狀，對(duì)于提高小麥分子育種的效率，實(shí) 現(xiàn)多性狀的聚合育種具有重要的意義。
【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中對(duì)克隆獲得的簇毛麥NAM-V1基因的電泳檢測(cè)結(jié)果以及基 因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果;其中，a: NAM-V1基因組和cDNA的克隆;b: NAM-V1基因結(jié)構(gòu)分析;c: NAM-V1 基因保守域預(yù)測(cè)。
[0030] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中構(gòu)建的簇毛麥NAM-V1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹;其中，物種縮寫： 山羊草(Aet)，硬粒小麥(Tt)，大麥(Hv)，水稻(Os)，擬南芥(At)，提莫非維小麥(G)。
[0031 ]圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中NAM家族基因序列比對(duì)結(jié)果及CauNAM-Vl分子標(biāo)記的位置。 [0032]圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中分子標(biāo)記CauNAM-Vl在不同小麥品種中的擴(kuò)增情況。
[0033]圖5為本發(fā)明實(shí)施例5中小麥抗白粉病基因 Pm21分離群體的表型分析結(jié)果。
[0034]圖6為本發(fā)明實(shí)施例5中分子標(biāo)記CauNAM-Vl在小麥Pm21分離群體中的擴(kuò)增情況。 [0035]圖7為本發(fā)明實(shí)施例6中NAM-V1基因調(diào)控小麥籽粒蛋白含量的效果。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，以下實(shí) 施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照制造廠商所建議的實(shí)驗(yàn) 條件;所用原料均為市售商品。
[0037] 實(shí)施例1簇毛麥NAM-V1基因的克隆
[0038] 根據(jù)NCBI上公布的NAM-A1 (DQ869672)、NAM-D1 (DQ869675)、NAM-B1 (DQ869673)、 NAM-B2(DQ869676)、NAM-D2(DQ869677)基因的序列信息，設(shè)計(jì)兩對(duì)克隆NAM基因完整編碼區(qū) 的引物NAM0RF1和NAM0RF2，正向引物包括起始密碼子，反向引物包括終止密碼子。分別以簇 毛麥的基因組DNA和cDNA為模板，用引物對(duì)NAM0RF1和NAM0RF2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系 為：模板DNA3yl，正、反向引物各ΙμL，dNTP( 10mM)0.4μ1，高保真Taq DNA聚合酶（5UAU) 0.2ul，10 X PCR反應(yīng)緩沖液2μ1，加 ddH20補(bǔ)足20μ1后混勻。PCR反應(yīng)條件為：94°C3min; 94°C 3〇8,6〇1€3〇8,721€21^11，共33個(gè)循環(huán);72 1€71^11，16°(：結(jié)束反應(yīng)。？0?反應(yīng)結(jié)束后，以1%瓊脂 糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。電泳結(jié)果表明，從基因組DNA和cDNA中分別擴(kuò)增得到了長(zhǎng)度為1.5kb 和1.2kb左右的目的條帶（圖la)。將目的條帶回收后連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感 受態(tài)細(xì)胞。切膠回收目的DNA，連接到克隆載體(pMDl 8-T)上進(jìn)行DNA序列的測(cè)定。將測(cè)序結(jié) 果和NCBI中已知基因（蛋白）進(jìn)行BlastN(BlastXP)比對(duì)分析，結(jié)果表明該基因編碼NAC轉(zhuǎn)錄 因子，是已報(bào)道的野生二粒小麥的NAM-B1基因，普通小麥的祖1^1、01、02、82的同源基因， 但序列差別較大，由于來源于簇毛麥的V染色組，因此命名為NAM-V1基因。NAM-V1基因全長(zhǎng) 1528bp，包括3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子（圖lb)。開放閱讀框全長(zhǎng)1224bp，編碼407個(gè)氨基酸，預(yù) 測(cè)分子量為43kDa，等電點(diǎn)為8.39。NCBI的CDD預(yù)測(cè)表明NAM-V1蛋白的N端編碼一個(gè)NAM_ superfamily的保守結(jié)構(gòu)域（圖lc) 〇
[0039] 表1引物序列信息
[0040]
[0041 ]實(shí)施例2簇毛麥NAM-V1基因的遺傳進(jìn)化分析
[0042] 利用比對(duì)軟件ClustalW 1.83對(duì)簇毛麥的NAM-V1和小麥、擬南芥、水稻等植物的 NAC蛋白進(jìn)行多序列同源比對(duì)，輸出的文件通過B0XSHADE 3.21進(jìn)行著色。采用Mega 4軟件 中的鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。對(duì)簇毛麥NAM-V1的編碼蛋白與其他 物種中同源NAC蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖2所示。不同來源的NAC蛋白分成了 4類 (Group)。其中簇毛麥NAM-V1屬于Group I，Group I還包括水稻的NAC4,硬粒小麥的TtNAM-B1(6B染色體）、TtNAM-B2(2B染色體）和TtNAM-Al(6A染色體），山羊草的AetNAM-D2(2D染色 體)和AetNAM-Dl(6D染色體），大麥的NAM-1和NAM-2(H基因組），提莫非維小麥的NAM-G(G基 因組）。其中來源于簇毛麥的NAM-V1和來源于小麥A、D、B亞基因組的第6號(hào)染色體的TtNAM-Al、AetNAM-Dl和TtNAM-Bl親緣關(guān)系最近，其次為來源于小麥A、D、B亞基因組的第2號(hào)染色體 TtNAM-B2、AetNAM-D2。這表明一方面，NAM-V1可能與祖1-81、六1、01、82、02具有相同的生物 學(xué)功能，即提高籽粒中蛋白質(zhì)、鐵、鋅的含量。另一方面，來源于B和D亞基因組第2號(hào)染色體 的TtNAM-B2、AetNAM-D2是來源于第6號(hào)染色體NAM-B1、A1和D1的旁系同源基因，可能來源于 一次基因復(fù)制事件(Gene duplication events)。根據(jù)小麥族植物的遺傳進(jìn)化模型，預(yù)測(cè)這 一基因復(fù)制事件可能發(fā)生在A基因組祖先種和B(S)D基因組祖先種分離之后，B(S)基因組祖 先種和D基因組祖先種分離之前，即大約在5.8± 1MYA到2.6±0.8MYA之間；在Group II中只 有3個(gè)基因，都來自擬南芥，分別是AtNAC2、AtNAC18和AtNAC20。其中AtNAC2相應(yīng)鹽脅迫，并 且和側(cè)根發(fā)育相關(guān);Group III中包含3個(gè)基因，分別是水稻的0sABA91266、0sABA95705和小 麥的TaNACe^TaNACeg相應(yīng)低溫、干旱和鹽脅迫，與小麥逆境下的適應(yīng)性相關(guān);Group IV中 包含3個(gè)基因，分別是小麥的TaNAC2、水稻的OsNP 912423和擬南芥的AtNAC3,其中TaNAC2和 AtNAC3也與植物抗逆相關(guān)。
[0043] 實(shí)施例3簇毛麥NAM-V1基因的序列比對(duì)和分子標(biāo)記開發(fā)
[0044] 基因 NAM-V1 和 NAM-A1、NAM-B1、NAM-B2、NAM-D1、NAM-D2 的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果表 明，在NAM-V1第247個(gè)堿基的位置有一個(gè)"ATGTC"的插入，在第785個(gè)堿基處有一個(gè)"G/T"的 SNP差異。根據(jù)這兩個(gè)位點(diǎn)的側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)出用于特異檢測(cè)NAM-V1基因的標(biāo)記CauNAM-Vl (圖3)。用于特異性PCR擴(kuò)增標(biāo)記CauNAM-Vl的引物見表1。
[0045] 實(shí)施例4利用分子標(biāo)記CauNAM-Vl檢測(cè)不同小麥材料中的NAM-V1基因
[0046] 為了檢測(cè)CauNAM-Vl引物的特異性，同時(shí)也為了證明NAM-V1來源于簇毛麥的6VS染 色體，分別在中國(guó)春(CS)、粗山羊草(Aegilops tauschii)、烏拉爾圖小麥(T.urartu)、栽培 一粒小麥(T.mononcoccum)、中國(guó)春小麥缺體四體系2B/2D和6A/6B、Pml2、Pm21感病單株和 Pm21抗病單株中進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，在含6V染色體短臂的Pm21抗病單株(6VS · 6AL易位 系）中能擴(kuò)增出與預(yù)期大小相同的特異目的條帶，而在其他供試材料中均未擴(kuò)增到相應(yīng)的 特異條帶。證明CauNAM-Vl引物能夠特異性的檢測(cè)NAM-V1基因的存在。該結(jié)果也證明了NAM-VI基因來源于簇毛麥的6VS染色體(圖4)。
[0047] 實(shí)施例5分子標(biāo)記CauNAM-Vl在檢測(cè)小麥Pm21抗病基因中的應(yīng)用
[0048]構(gòu)建小麥6VS · 6AL易位系的分離群體，對(duì)分離群體的后代單株經(jīng)白粉病菌生理小 種E09感染后進(jìn)行抗病性鑒定，抗病表型如圖5所示。
[0049] 挑選10個(gè)抗病單株和10感病單株，進(jìn)行CauNAM-Vl標(biāo)記的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果表明， CauNAM-Vl標(biāo)記呈現(xiàn)出抗白粉病特性共分離的現(xiàn)象，即在所有供試的抗病單株中均能檢測(cè) 到特異性的目的條帶，而在所有供試感病單株中均沒有檢測(cè)到相應(yīng)的目的條帶（圖6)。結(jié)果 證實(shí)了 CauNAM-Vl是可以作為Pm21抗病基因檢測(cè)的分子標(biāo)記。
[0050] 實(shí)施例6NAM-V1基因在增加小麥籽粒蛋白含量中的應(yīng)用
[0051 ]為了證明簇毛麥NAM-V1基因在小麥籽粒蛋白質(zhì)含量中的作用，利用小麥6VS · 6AL 易位系，構(gòu)建了NAM-V1基因的4個(gè)分離群體，分別是W50200、W50175、W50156和W50176。然后 用CauNAM-Vl標(biāo)記分別檢測(cè)了分離群體后代的基因型，并且單株測(cè)定了小麥籽粒的蛋白質(zhì) 含量(圖7)。結(jié)果表明，在含有NAM-V1基因和不含NAM-V1基因的情況下，在4個(gè)分離群體中的 籽粒蛋白含量分別為13.94%/13.42%、17.99%/16.88%、13.33%/13.31%、15.41%/ 14.33%，結(jié)果表明含有NAM-V1基因的后代材料中的籽粒蛋白質(zhì)含量均有所增加，其中在 W50175和W50176分離群體中籽粒蛋白含量分別增加了 1.11 %和1.08%。以上結(jié)果表明，簇 毛麥的NAM-V1基因能夠提高小麥籽粒的蛋白質(zhì)含量。
[0052]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。 [0053] 參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 簇毛麥NAM-V1基因，其特征在于，其核苷酸序列為： i) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)核苷酸且表達(dá) 相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或 iii) 在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 1所示序列雜交且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序 列，所述嚴(yán)格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 雜交，并用該溶液洗膜;或 iv) 與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達(dá)相同功能蛋白質(zhì)的核苷 酸序列。2. 由權(quán)利要求1所述簇毛麥NAM-V1基因編碼的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. 含有權(quán)利要求1所述簇毛麥NAM-V1基因的表達(dá)盒、重組載體或重組菌。4. 權(quán)利要求1所述簇毛麥NAM-V1基因，或權(quán)利要求2所述表達(dá)盒、重組載體或重組菌在 提高作物蛋白含量中的應(yīng)用，優(yōu)選所述作物為小麥、大麥、黑麥、燕麥、簇毛麥。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求3所述的表達(dá)盒、重組載體或重 組菌，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)、花粉管導(dǎo)入或基因槍的方法轉(zhuǎn)入作物中，培育高籽粒蛋白含量的轉(zhuǎn) 基因作物。6. 權(quán)利要求1所述簇毛麥NAM-V1基因的分子標(biāo)記CauNAM-Vl，其特征在于，用于特異性 PCR擴(kuò)增該分子標(biāo)記的引物為：正向引物F5 ' -TCCCCGGTATGCCATGTC-3 '和反向引物R5 ' -AAGATACCGCTAGACCGTGA-3，。7. 權(quán)利要求6所述分子標(biāo)記在檢測(cè)作物中NAM-V1基因和/或Pm21基因中的應(yīng)用，優(yōu)選所 述作物為小麥、大麥、黑麥、燕麥、簇毛麥。8. 權(quán)利要求6所述分子標(biāo)記在小麥高蛋白含量和/或抗白粉病的分子標(biāo)記輔助育種中 的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求6所述分子標(biāo)記在篩選或鑒定高蛋白含量和/或抗白粉病小麥品種中的應(yīng) 用。10. 用于檢測(cè)作物中NAM-V1基因和/或Pm21基因的引物，其特征在于，包括正向引物 F5 ' -TCCCCGGTATGCCATGTC-3 ' 和反向引物R5 ' -AAGATACCGCTAGACCGTGA-3 '。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK105969778SQ201610306058
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】解超杰, 孫其信, 倪中福, 趙傳志, 李映輝, 耿妙苗, 李峰, 曹廷杰
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)