一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，屬于突變或遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。以大腸桿菌的“偏好”和“排斥”的密碼子分別對(duì)人和蟾蜍PPDPF的ORF序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，分別獲得優(yōu)化后人和蟾蜍的PPDPF重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中；挑取單菌落接種于已加入Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成菌液；菌液按1%接菌于滅菌過的LB培養(yǎng)液中，260rpm于37℃震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.7?1，按1/1000的比例加入濃度不同的誘導(dǎo)劑IPTG，誘導(dǎo)兩種重組蛋白的表達(dá)。將發(fā)明應(yīng)用于原核表達(dá)系統(tǒng)，具有可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，屬于突變或遺傳工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] PPDPF很可能與多種疾病尤其是惡性腫瘤具有密切聯(lián)系，在包括胰腺癌、肝癌和腎 癌在內(nèi)的多種癌癥患者體內(nèi)表達(dá)量都有明顯升高，因此繼續(xù)深入研究PPDPF顯得很有必要。
[0003] 查閱資料顯示，目前還沒有有關(guān)PPDPF原核表達(dá)的研究報(bào)道；目前絕大多數(shù)重要的 目的基因都是在大腸桿菌中表達(dá)的。但原核表達(dá)系統(tǒng)也依然存在諸多難以克服的缺點(diǎn)：如 無法調(diào)控表達(dá)時(shí)間和水平、可能毒害宿主細(xì)胞、表達(dá)產(chǎn)物活性低下、包涵體式表達(dá)難以進(jìn)行 目的蛋白純化等，因此，如何保持基因片段中僅含有特異性酶切位點(diǎn)也沒有公開，如何進(jìn)行 定點(diǎn)突變以及保證插入載體片段為目的基因，是本申請(qǐng)要解決的技術(shù)問題。
[0004] 基于此，做出本申請(qǐng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有原核表達(dá)所存在的上述缺陷，本申請(qǐng)首先提供一種定點(diǎn)突變以保證 插入載體的片段為目的基因的原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采取的技術(shù)方案如下：
[0007] -種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，具體分為如下步驟：
[0008] (1)原核表達(dá)載體的構(gòu)建：以大腸桿菌(E . col i )的"偏好"和"排斥"的密碼子分別 對(duì)人(11111]^11)和中華大蟾蜍(1311；1^〇83找31^23118)?] ：)0??的01^'序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，對(duì)優(yōu)化 后的0RF序列進(jìn)行合成，并連接到表達(dá)載體PET-28M + )上，分別獲得密碼子優(yōu)化后的人和蟾 蜍的PPDPF重組質(zhì)粒；
[0009] (2)重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：
[0010] ①重組子轉(zhuǎn)化：分別將Bufo和人的pET-28b-PPDPF轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 BL21中，劃線后37°C過夜培養(yǎng)，第二天獲得大量單菌落，待大小合適時(shí)取出，可暫時(shí)放8°C冰 箱保存近期使用。
[0011]②前培養(yǎng):在誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)前一天晚上準(zhǔn)備前培養(yǎng)，挑取單菌落接種于2mL已 加入2yL(50mg · mL-OKanamyciWKan)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜震蕩(220rpm)培養(yǎng)。
[0012] ③大培養(yǎng):誘導(dǎo)當(dāng)天將前培養(yǎng)的兩種菌液按1 %接菌于高溫高壓滅菌過的LB培養(yǎng) 液(提前加入Kan至終濃度50yg · ml/1)中，260rpm于37°C震蕩培養(yǎng)，約lh時(shí)開始用紫外分光 光度計(jì)測(cè)其0D值，至0D 6QQ值達(dá)到0.7-1時(shí)，取出一部分菌液作為對(duì)照組，其余菌液等分為四 組，按1 /1 〇〇〇的比例加入不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG(0.001，0.01，0.1，lmo 1 · L-1)，將所有菌液 再放回恒溫培養(yǎng)箱中37°C260rpm培養(yǎng)l-4h，誘導(dǎo)兩種重組蛋白的表達(dá)。
[0013] 原核表達(dá)載體構(gòu)建是指將目的基因與能夠攜帶外源核酸序列進(jìn)入原核細(xì)胞進(jìn)行 表達(dá)的載體分別進(jìn)行雙酶切后經(jīng)連接酶將目的基因片段導(dǎo)入載體的過程。此過程中必須保 證目的基因片段中只含有單一的特異性酶切位點(diǎn)，否則需提前進(jìn)行定點(diǎn)突變以保證插入載 體的片段為目的基因的全長ORF。
[0014] 原核表達(dá)系統(tǒng)是指將已插入目的基因 DNA片段的載體（通常為質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化入細(xì)菌 (通常為大腸桿菌）后，通過IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)并純化所需目的蛋白，進(jìn)而探究目的蛋 白的相關(guān)性質(zhì)及生物學(xué)功能。該方法操作簡(jiǎn)單、表達(dá)周期短、蛋白表達(dá)量高且成本也比較 低，具有多種優(yōu)勢(shì)，因此是目前采用最廣泛的一種體外表達(dá)方法。但原核表達(dá)系統(tǒng)也依然存 在諸多難以克服的缺點(diǎn)：如無法調(diào)控表達(dá)時(shí)間和水平、可能毒害宿主細(xì)胞、表達(dá)產(chǎn)物活性低 下、包涵體式表達(dá)難以進(jìn)行目的蛋白純化等。因此，對(duì)PPDPF構(gòu)建真核表達(dá)載體，并試圖在細(xì) 胞水平上研究其作用機(jī)制顯得很有必要。
[0015] 本發(fā)明通過對(duì)中華大蟾蜍PPDPF和人PPDPF 0RF部分密碼子優(yōu)化，然后合成并構(gòu)建 中華大蟾蜍pET-28b-PPDPF和人pET-28b-PPDPF原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 BL21中成功表達(dá)，經(jīng)探究發(fā)現(xiàn)兩種重組蛋白在37°C下的最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度為 O.lmmol · L-1，誘導(dǎo)時(shí)間為AhJestern blotting檢測(cè)結(jié)果顯示僅該過量表達(dá)的條帶能被抗 His-tag抗體識(shí)別，表明該蛋白即為目的蛋白PPDPF。
[0016] 本申請(qǐng)利用大腸桿菌作為PPDPF蛋白的原核表達(dá)細(xì)胞，進(jìn)行該重組蛋白的體外表 達(dá)，為后續(xù)進(jìn)一步進(jìn)行重組蛋白的大量表達(dá)純化及鼠抗PPDPF抗血清的制備奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 采用的原核表達(dá)系統(tǒng)技術(shù)的主要流程是將前期克隆到的目的基因的0RF進(jìn)行密碼子優(yōu)化并 合成，然后連入表達(dá)載體形成重組質(zhì)粒，再通過轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入某原核細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò) 增，當(dāng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長期時(shí)加入誘導(dǎo)劑使目的蛋白得到表達(dá)，該方法具有研究深入、培養(yǎng)條件 簡(jiǎn)單、基因操作容易、從構(gòu)建到產(chǎn)物純化周期短、成本低、產(chǎn)量高、易于規(guī)模化等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0017] 圖1為表達(dá)載體pET-28b( + )的圖譜；
[0018] 圖2為中華大蟾蜍PPDPF的誘導(dǎo)表達(dá)；
[0019] 圖3為人PPDPF的誘導(dǎo)表達(dá)；
[0020] 圖2和圖3中，M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1:未誘導(dǎo)樣品；2-4,5-7,8-10，11-13分別為1?16濃度為 0.001、0.01、0· 1、lmmol · 1/^2,3,4:誘導(dǎo)2、3、4h時(shí)的樣品；5-7,8-10,11-13同2-4;
[0021] 圖4為中華大蟾蜍PPDPF和人PPDPF重組蛋白可溶性檢測(cè)；
[0022]其中，M:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1，5:未加 IPTG樣品；2，6:誘導(dǎo)后全菌；3，7:誘導(dǎo)菌體裂解后上 清;4,8:誘導(dǎo)菌體裂解后沉淀；
[0023] 圖5為中華大蟾蜍PPDPF重組蛋白的Western blotting檢測(cè)；
[0024] 圖6為人的PPDPF重組蛋白的Western blotting檢測(cè)。
[0025] 圖5和圖6中，Μ:標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1，2:考馬斯亮藍(lán)染色的樣品；3,4:Westernblotting樣 品；1，3:未用IPTG誘導(dǎo)的樣品；2，4: IPTG誘導(dǎo)4h的樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 1實(shí)驗(yàn)材料與試劑
[0027] 1.1主要實(shí)驗(yàn)儀器
[0028] Bio-Rad電泳儀、蛋白質(zhì)垂直電泳槽購自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；轉(zhuǎn)移電 泳槽購自上海天能科技有限公司；紫外分光光度計(jì)購自上海光譜儀器有限公司。
[0029] 1.2主要材料試劑
[0030] 實(shí)驗(yàn)試劑:ECL發(fā)光試劑盒購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司。
[0031] 1.3主要溶液配制
[0032] 1.3.1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)相關(guān)溶液的配制
[0033] (1)30%聚丙稀酰胺(305/^4):稱丙稀酰胺(4〇巧1&111丨(16)298及1'1，1'1-亞甲基丙稀酞 胺lg加入約80mL ddH20中，攪拌至充分溶解，移至量筒，再加去離子水(ddH20)定容至100mL， 4 °C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0034] (2)10%過硫酸銨(APS):稱0.2g過硫酸銨溶于2mL ddH20中，-20°C保存。
[0035] (3)1.5mol · L-^ris-HCKpHS.S):稱Tris 181.7g溶于約800mL ddH20中，滴加 5mol · Γ1鹽酸調(diào)pH值至8.8后，加去離子水定容至100〇11^，室溫保存。
[0036] (4)1.〇111〇1.1/11^8-!1(：1(口!16.84!17.6) :稱1^8 121.18溶于約80〇11^(1(1!12〇中， 滴加 5mol · L-1鹽酸調(diào)pH值至6.8(或7.6)，加 ((1(1!120)定容至10001^，室溫保存。
[0037] ( 5 ) 15 % SD S聚丙烯酰胺（分離膠，10mL):向小燒杯中依次加30 %丙烯酰胺 (Acrylamide)溶液5mL(開始攬摔），ddH2〇 2.3mL，1.5mol · SDS 0.1mL，10%APS 0.1 mL，TEMED (h004mL，攪拌均勻后立即灌膠。
[0038] (6 5 % SDS聚丙烯酰胺（濃縮膠，4mL):向小燒杯中依次加30 %丙烯酞胺溶液 0.67mL(開始攪拌），ddH20 2.7mL，lmol · L-^risCpHe.SW.SmUlO^SDSO.iMmLaO^APS 0.04mL，TEMED 0.004mL，攪拌均勻后立即灌膠。
[0039] (7)5XSDS蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液:加 lmol · L-^TrisbHe.SHJSmL于10mL塑料離 心管中，稱溴酚藍(lán)〇. 〇25g、SDS 0.5g加入充分溶解，再加入甘油2.5mL，最后加 ddH20定容至 5mL(500yL/份分裝，使用前每份加入25μ?3-巰基乙醇）。
[0040] (8)5XTris-甘氨酸電泳（SDS-PAGE)緩沖液:稱 Tris 堿 15.1g，甘氨酸(Glycine) 94g，SDS 5.0g加約600mL ddH20充分溶解后，加入去離子水定容至1000mL，室溫保存。
[0041 ] (9)考馬斯亮藍(lán)染色液的配制:稱0.25g考馬斯亮藍(lán)(Commassise blue，R250)溶于 90ml甲醇和水(1:1)的混合液，再加入10mL冰醋酸，過濾除去顆粒物質(zhì)后常溫保存。
[0042] 1.3.2免疫印跡(Western blotting)相關(guān)溶液的配制
[0043] (1)膜轉(zhuǎn)移緩沖液:稱甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g加入約600mL ddH20中充 分?jǐn)嚢枞芙夂?，?ddH20定容至800mL，再加入200mL的甲醇輕輕顛倒混勻，室溫保存。
[0044] (2)TBST緩沖液：稱NaCl 8.8g于800mL ddH20中溶解，加入l.Omol · L-^ris-HCl (pH7.6)20mL，再加入0.5mL Tween 20充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，用ddH20定容至1L，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0045] (3)封閉緩沖液:脫脂奶粉5g加入到100mL的TBST緩沖液中，充分?jǐn)嚢枞芙猓?°C保 存?zhèn)溆谩?br>[0046] 2實(shí)驗(yàn)方法
[0047] 2.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0048]因采用傳統(tǒng)方法構(gòu)建的原核表達(dá)載體連接PPDPF之后并不能在所選的原核表達(dá)宿 主菌株E. col i中順利表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)室試圖針對(duì)E. col i "偏好"和"排斥"的密碼子對(duì)蟾蜍 PTOPF的0RF序列進(jìn)行優(yōu)化(保證優(yōu)化前后其所編碼的氨基酸序列完全一致），降低E. coli對(duì) PH)PF的排斥程度，使該基因編碼的蛋白能順利通過E. col i表達(dá);為今后進(jìn)一步研究PPDPF 與人的關(guān)系，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載了人(Human) PPDPF的0RF序列，并用同樣的方法對(duì)人PPDPF 的ORF進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。
[0049] 密碼子優(yōu)化后的0RF序列委托蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行合成，并連接到 表達(dá)載體PET-28M + )上，分別獲得替換后Bufo和Human的PPDPF重組質(zhì)粒pET-28b-PPDPF-Bufo和pET-28b-PPDPF-Human。
[0050] 2.2重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) [0051 ] 2.2.1重組子轉(zhuǎn)化
[0052] 分別將Bufo和Human的pET-28b-ProPF轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞BL21中，劃線后37 °(：過夜培養(yǎng)，第二天獲得大量單菌落，待大小合適時(shí)取出，可暫時(shí)放8°C冰箱保存近期使用。
[0053] 2.2.2前培養(yǎng)
[0054]在誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)前一天晚上準(zhǔn)備前培養(yǎng)，挑取單菌落接種于2mL已加入2yL (50mg · mL-1 )Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜震蕩(220rpm)培養(yǎng)。2.2.3大培養(yǎng) [0055]誘導(dǎo)當(dāng)天將前培養(yǎng)的兩種菌液按1 %接菌于高溫高壓滅菌過的LB培養(yǎng)液(提前加 入Kan至終濃度50yg · ml/1)中，260rpm于37°C震蕩培養(yǎng)，約lh時(shí)開始用紫外分光光度計(jì)測(cè)其 0D值，至OD600達(dá)到0.7-1時(shí)，取出一部分菌液作為對(duì)照組，其余菌液等分為四組，按1/1000的 比例加入不同濃度的誘導(dǎo)劑IPTG(0.001，0.01，0.1，lmo 1 · I/1)，將所有菌液再放回恒溫培 養(yǎng)箱中37°C260rpm培養(yǎng)l-4h，誘導(dǎo)兩種重組蛋白的表達(dá)。
[0056] 在培養(yǎng)時(shí)間為2、3、4h時(shí)分別取各樣品lmL進(jìn)行離心，13 200rpm離心lmin，徹底去 上清后，將菌體溶于100yL的蛋白質(zhì)上樣緩沖液中，連同Protein Marker-起于干燥恒溫器 中100°C處理5min，取出后迅速置于冰上冷卻，最后將所有樣品分別取5yL進(jìn)行SDS-PAGE電 泳，檢測(cè)中華大蟾蜍PPDPF和人PPDPF兩種重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。
[0057] 2.2.4SDS-PAGE 電泳
[0058] 1 · SDS-PAGE 電泳膠制作：
[0059] (1)將厚薄兩塊玻璃板重疊下端對(duì)齊，確保玻璃板之間有灌膠縫隙，在制膠夾上固 定后整體裝到制膠架上固定(墊有橡膠條）。
[0060] (2)根據(jù)15%分離膠的配方（目的蛋白分子量較小，選用高濃度的膠進(jìn)行電泳)分 別將各成分加到小燒杯中（注:使用PH8.8濃度1.5mol · I/1的Tris-HCl)，在最后加入10% APS和TEMED后，確保用磁力攪拌器上充分混勻。
[0061] (3)迅速將膠倒入兩個(gè)玻璃板間，高度控制為玻璃板的2/3左右，剩余部分用ddH20 填滿，室溫靜置。當(dāng)分離膠凝聚后(H2〇和膠之間會(huì)出現(xiàn)一條明顯的分割線），盡可能倒盡兩 板之間的ddH2〇。
[0062] (4)根據(jù)濃縮膠的配方分別將各成分加入到小燒杯中（注：使用pH6.8濃度 l.Omol · Γ1的Tris-HCl)，同樣在加完10%APS和TEMED后充分混勻，迅速倒入兩玻璃間至滿 為止。
[0063] (5)插入孔數(shù)和大小合適的梳子，室溫靜置待濃縮膠充分凝聚。
[0064] 2. SDS-PAGE電泳檢測(cè)兩種蛋白的表達(dá)
[0065] (1)小心地垂直拔出SDS-PAGE梳子，用ddH20清洗膠孔，確保上樣孔無過多泡沫或 任何其他異物，將玻璃板裝到電泳架上，用ddH20檢漏。
[0066] (2)向電泳架之間加入1 X SDS-PAGE電泳液至加滿為止，取5yL處理好的樣品（100 °C煮沸5min)分別上樣，將上好樣的電泳架小心移至電泳槽中，向電泳槽補(bǔ)充電泳液至約2/ 3。采用恒流電泳，以每塊膠為10mA標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置電流大小，樣品進(jìn)入分離膠后電流可加倍。
[0067] (3)電泳結(jié)束后，按順序取出膠，簡(jiǎn)單沖洗后切除濃縮膠(為避免多塊膠混淆，可適 當(dāng)切角以示區(qū)別），將分離膠放到染色皿中用ddH 20清洗2-3次，每次5min。洗凈后加入事先 配置好的考馬斯亮藍(lán)染色液，微波爐加熱至微燙，輕輕振蕩染色〇. 5h.
[0068] (4)回收染色液(可重復(fù)利用），簡(jiǎn)單沖洗后加自來水于微波爐加熱至微燙，輕輕振 蕩脫色20min，之后換水兩到三次并重復(fù)上述步驟直至背景顏色基本透明，觀察重組蛋白表 達(dá)情況，并對(duì)必要數(shù)據(jù)進(jìn)行保存并備份。
[0069] 2.2.5重組蛋白的可溶性檢測(cè)
[0070] 經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩種蛋白在E. coli均能夠順利表達(dá)，且在誘導(dǎo)劑IPTG工作濃度 為O.lmmol · I/1，誘導(dǎo)時(shí)間為4h時(shí)表達(dá)量最高，因此繼續(xù)對(duì)的該蛋白進(jìn)行性質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè) 很有必要。
[0071] (1)分別取lmL經(jīng)IPTG(終濃度lmmol · L-4誘導(dǎo)4h的菌液加入已知重量的1.5ml離 心管，13 200rpm離心lmin，去上清，再次稱量離心管重量，得出菌體重量。
[0072] (2)按lyg菌體對(duì)應(yīng)20yL比例加入X-tractor裂解液，充分懸浮菌體。加入DNasel約 0. lyL避免溶液出現(xiàn)粘稠，另加入一定量溶菌酶(終濃度為lmg · ml/1)，室溫放置10min，每 2min上下顛倒一次。4°C13 200rpm離心20min。
[0073] (3)取上清到另一個(gè)離心管中（作為上清樣品保留檢測(cè)用），再在離心管中加入與 X-Tractor等量的ddH2〇，將沉淀充分懸浮。
[0074] (4)取上清和沉淀懸浮液各10yL，加入2.5yL的5XSDS上樣緩沖液，100°C處理5min 后迅速置于冰上。
[0075] (5)取5yL處理過的的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白水溶性。
[0076] 2.2.6免疫印跡(Western blotting)檢測(cè)
[0077] (l)SDS-PAGE電泳:在同一塊膠左右，加兩組相同的樣品，左邊用于考馬斯亮藍(lán)染 色(考染），右邊用于轉(zhuǎn)膜，用于轉(zhuǎn)膜的樣品上樣量可為考染的1/5。
[0078] (2)轉(zhuǎn)膜:SDS-PAGE電泳結(jié)束后切膠，按膠塊大小剪下形狀完大小完全相同的PVDF 膜和稍大的濾紙(每塊膠用量6片），PVDF膜用甲醇浸泡5-10min后將海棉、PVDF膜、膠和濾紙 一起放入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡15min。按照從負(fù)極到正極（即由黑-紅）依次放置海棉-濾紙3 層-膠-PVDF膜-濾紙3層-海棉的順序組裝"三明治"夾板，并確保膠和膜之間接合緊密無任 何氣泡（否則會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)印效果），組裝好后放入轉(zhuǎn)印槽中加滿轉(zhuǎn)印緩沖液，恒壓條件用 65V轉(zhuǎn)印約2.5h，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白的大小而定，蛋白分子量越大所需轉(zhuǎn)印時(shí)間越長。
[0079] (3)封閉：轉(zhuǎn)印結(jié)束后，ddH20水洗PVDF膜2-3次，每次5min。洗好后在封閉液（5g脫 脂乳溶于l〇〇mL TBST溶液）中處理1-2h(可放置室溫緩慢震搖），再用TBST輕搖洗滌2次，每 次5min〇
[0080] (4)一抗處理：TBST溶液或一抗稀釋液稀釋His-tag抗體2 000倍，將上述洗好的 PVDF膜放入其中，4°C過夜輕搖。
[0081 ] (5)二抗處理:將PVDF膜從一抗中取出用TBST輕搖洗滌3次，每次5min，加入用TBST 稀釋2 000倍的二抗(HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體)溶液中，室溫輕搖振蕩處理lh，TBST輕搖洗 滌5次，每次5min(必須徹底清洗干凈）。
[0082] (6)顯色:按照ECL發(fā)光試劑盒說明，將I液和Π 液事先分別稀釋6倍后等體積混合， 將PVDF膜置于干凈的保鮮膜上，用移液槍吸取混合均勻覆蓋于PVDF膜上。
[0083] (7)膠片曝光:待熒光出現(xiàn)，去盡顯色液，用保鮮膜將PVDF膜包好后放入暗盒中，壓 上合適大小的X光膠片，根據(jù)熒光亮度確定曝光時(shí)間，越亮曝光時(shí)間越短，時(shí)間從數(shù)秒至數(shù) 分鐘不等。曝光完成后，將膠片放入顯影液(確保顯影液為粉紅色，棕色即為氧化，若冬天結(jié) 冰需提前溫?。┲校逦鷹l帶出現(xiàn)后放入定影液中定影2-3min。膠片洗滌晾干后，進(jìn)行掃 描和圖像剪輯。
[0084] 3實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0085] 3.1原核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0086] 對(duì)中華大蟾蜍PPDPF和人PPDPF 0RF的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后，成功構(gòu)建了兩個(gè)重組質(zhì) 粒 pET-28 (b+) -PPDPF-Bufo 及 pET-28 (b+) -PPDPF-Human。
[0087] 3.2SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白PPDPF的誘導(dǎo)表達(dá)情況
[0088] 將兩種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞BL21后，分別用濃度為1，0.1，0.01， O.OOlmol · L-1的IPTG以1/1000比例加入后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入IPTG的重組質(zhì)粒的菌相 比未加 IPTG誘導(dǎo)的菌多出1條明顯的蛋白條帶，而且分子量與預(yù)測(cè)的接近，說明成功表達(dá)了 兩種攜帶His標(biāo)簽的蟾蜍和人的PPDPF重組蛋白，前者較后者表達(dá)量偏高。
[0089] 結(jié)果分析還發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的的IPTG誘導(dǎo)下，工作濃度為lmmol · I/1和 0. lmmol ·廠1的時(shí)候兩種蛋白有表達(dá)，更低濃度的誘導(dǎo)表達(dá)效果不明顯，而時(shí)間上則是在誘 導(dǎo)4小時(shí)的時(shí)候蛋白表達(dá)效果最佳(參見圖2和圖3所不）
[0090] 3.3重組蛋白可溶性檢測(cè)
[0091 ] 選用兩個(gè)0. lmol · L-hPTG誘導(dǎo)4h的菌體樣品進(jìn)行處理，經(jīng)Xtractor裂解液、DNase I和溶菌酶處理l〇min后，SDS-PAGE電泳檢查該重組蛋白可溶性，結(jié)果顯示該重組蛋白在上 清和沉淀中均有出現(xiàn)，但上清中較沉淀中多（如圖4所示）。說明該蛋白偏水溶性(取不同誘 導(dǎo)時(shí)間樣品進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果類似）
[0092] 3.4重組蛋白免疫印跡
[0093]為進(jìn)一步確定該重組蛋白是否為目的蛋白PPDPF，使用小鼠抗Hi s- tag抗體進(jìn)行 Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前的樣品在分子質(zhì)量17kD處無特異性條帶出現(xiàn)，只 有用IPTG誘導(dǎo)4h的樣品在約17kD處的蛋白條帶能夠被Hi s抗體識(shí)別，與蟾蜍和人的PPDPF重 組蛋白的預(yù)期分子量吻合，表明該蛋白確實(shí)是目的重組蛋白。
[0094] 4結(jié)論與討論
[0095]原核表達(dá)載體構(gòu)建是指將目的基因與能夠攜帶外源核酸序列進(jìn)入原核細(xì)胞進(jìn)行 表達(dá)的載體分別進(jìn)行雙酶切后經(jīng)連接酶將目的基因片段導(dǎo)入載體的過程。此過程中必須保 證目的基因片段中只含有單一的特異性酶切位點(diǎn)，否則需提前進(jìn)行定點(diǎn)突變以保證插入載 體的片段為目的基因的全長0RF。
[0096]原核表達(dá)系統(tǒng)是指將已插入目的基因 DNA片段的載體（通常為質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化入細(xì)菌 (通常為大腸桿菌）后，通過IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)并純化所需目的蛋白，進(jìn)而探究目的蛋 白的相關(guān)性質(zhì)及生物學(xué)功能。該方法操作簡(jiǎn)單、表達(dá)周期短、蛋白表達(dá)量高且成本也比較 低，具有多種優(yōu)勢(shì)，因此是目前采用最廣泛的一種體外表達(dá)方法。但原核表達(dá)系統(tǒng)也依然存 在諸多難以克服的缺點(diǎn)：如無法調(diào)控表達(dá)時(shí)間和水平、可能毒害宿主細(xì)胞、表達(dá)產(chǎn)物活性低 下、包涵體式表達(dá)難以進(jìn)行目的蛋白純化等。因此，對(duì)PPDPF構(gòu)建真核表達(dá)載體，并試圖在細(xì) 胞水平上研究其作用機(jī)制顯得很有必要。
[0097] 本發(fā)明通過對(duì)中華大蟾蜍PPDPF和人PPDPF 0RF密碼子優(yōu)化和基因合成，成功構(gòu)建 中華大蟾蜍pET-28b-PPDPF和人pET-28b-PPDPF原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 BL21中成功表達(dá)，經(jīng)探究發(fā)現(xiàn)兩種重組蛋白在37°C下的最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度為 O.lmmol · L-1誘導(dǎo)時(shí)間為4h(見圖2和圖3) Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示僅該過量表達(dá) 的條帶能被His-tag識(shí)別，表明該蛋白即為目的蛋白PPDPF(見圖5和圖6)。
[0098] 以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)所提供技術(shù)方案所作的進(jìn)一步詳 細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明創(chuàng)造具體實(shí)施只局限于上述這些說明，對(duì)于本發(fā)明創(chuàng)造所屬技術(shù) 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演 或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，其特征在于： (1) 原核表達(dá)載體的構(gòu)建：以大腸桿菌的"偏好"和"排斥"的密碼子分別對(duì)人和中華大 蟾蜍Ρ/?Ρ/御ORF序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化和合成，并連接到表達(dá)載體pET-28b ( + )上，分別獲得 密碼子優(yōu)化后的人和中華大蟾蜍的Ρ/?Ψ重組質(zhì)粒； (2) 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá):將步驟（1)的Ρ/?Ψ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中， 37°C過夜培養(yǎng)獲得大量單菌落;挑取單菌落接種于已加入Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C過夜震蕩培養(yǎng)形成菌液;菌液按1%接菌于滅菌過的LB培養(yǎng)液中，260rpm于37°C震蕩培養(yǎng) 至0D值達(dá)到0.7-1，取出一部分菌液作為對(duì)照組，其余菌液等分為四組，按1/1000的比例加 入濃度不同的誘導(dǎo)劑IPTG，將所有菌液再放回恒溫培養(yǎng)箱中37 °C 260rpm培養(yǎng)l-4h，誘導(dǎo)兩 種重組蛋白的表達(dá)。2. 如權(quán)利要求1所述的一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的單菌落預(yù)先 培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)出的單菌落要置于8 °C環(huán)境下備用。3. 如權(quán)利要求1所述的一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)中，所述的 單菌落培養(yǎng)基上Kanamycin的添加量為已加入2yLKanamycin/2mLLB液體培養(yǎng)基，震蕩速度 220rpm〇4. 如權(quán)利要求1所述的一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的滅菌過的LB 培養(yǎng)液中加入Kanamycin至終濃度50yg · ml/1。5. 如權(quán)利要求1所述的一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的誘導(dǎo)劑IPTG 的添加濃度分別為0.001 mol.L'O.Ol mol.L'0.1 mol.L'lmol.L-1。6. 如權(quán)利要求1所述的一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，其特征在于:所述的菌液在恒溫 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時(shí)間為2、3、4h時(shí)，分別取各樣品進(jìn)行離心，徹底去上清后，將菌體溶于100yL 的蛋白質(zhì)上樣緩沖液中，連同Protein Marker-起于干式恒溫器中100°C處理5min后，迅速 置于冰上冷卻，最后將所有樣品分別取出5yL進(jìn)行檢測(cè)。7. 如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的一種原核表達(dá)載體的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2) 中，所述的重組蛋白在37°C下的最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG濃度為0. lmmol. I/1誘導(dǎo)時(shí)間為4h。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK105969787SQ201610403066
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】李玉蘭, 楊仙玉, 何軍邀, 岳繼萍
【申請(qǐng)人】浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校