一種酶法拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內(nèi)酯的方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種酶法拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內(nèi)酯的方法，催化劑采用脂肪酶YCJ01，具體包括如下步驟：耐有機(jī)溶劑脂肪酶YCJ01在有機(jī)相中，催化底物N?羥甲基文斯內(nèi)酯和乙酸乙烯酯進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，高效拆分N?羥甲基文斯內(nèi)酯。本發(fā)明采用來自于BurkholderiaambifariaYCJ01的具有獨特底物特異性和立體選擇性的耐有機(jī)溶劑脂肪酶YCJ01來催化拆分N?羥甲基文斯內(nèi)酯，能夠達(dá)到很好的拆分效果，并獲得高純度的單一對映體?！緦＠f明】一種酶法拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內(nèi)酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及生物催化工程研究領(lǐng)域，具體涉及一種可以作為醫(yī)藥中間體的文斯內(nèi)酯的手性拆分工藝。【
背景技術(shù)：
】[0002]本發(fā)明所涉及的文斯內(nèi)酯，是制備碳環(huán)核苷類藥物的重要手性中間體?；瘜W(xué)名稱為2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，分子量為109.13，結(jié)構(gòu)式為：[0004]目前，碳環(huán)核苷類化合物在核苷類藥物中的重要性與日倶增，在已經(jīng)公開的抗病毒藥物中核苷類藥物占絕大多數(shù)。由光學(xué)純的（1R，4S)_文斯內(nèi)酯出發(fā)合成的藥物主要有抗HIV藥物阿巴卡韋，由（1S，4R)_文斯內(nèi)酯出發(fā)合成的主要有抗流感藥物帕拉米韋。阿巴卡韋是治療艾滋病和皰疹病毒感染的藥物，也是"雞尾酒療法"中的關(guān)鍵藥物組成成分。目前世界上艾滋病發(fā)展趨勢日趨嚴(yán)重，阿巴卡韋具有廣闊的市場前景，銷量正在逐年遞增。此外，近年來全球爆發(fā)了數(shù)次流感疫情。在這種情況下，繼續(xù)研究開發(fā)新型高效、副作用小的抗流感藥物迫在眉睫。帕拉米韋是一種新型的抗流感病毒藥物，能有效抑制各種流感病毒株的復(fù)制和傳播過程，耐受性好、毒性小。研究表明，帕拉米韋在禽流感方面的治療效果比"達(dá)菲"更加明顯。因而拆分外消旋文斯內(nèi)酯具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和社會價值。[0005]目前報道的文斯內(nèi)酯的拆分方法主要有兩種，不對稱合成法、酶法拆分。FranciscoVelazquez等（Theapplicationofchiraloxazolidinethionesandthiazolidinethionedinasymmetricsynthesis.CurrentOrganicChemistry，2002，[6]:1-38)首先利用不對稱合成法來制備單一構(gòu)型的文斯內(nèi)酯，但該方法存在很大的弊端，步驟煩瑣，成本高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。酶法主要有采用γ-內(nèi)酰胺酶催化水解拆分(+/_)γ-內(nèi)酰胺（即文斯內(nèi)酯）以及利用脂肪酶催化拆分文斯內(nèi)酯。TalorStephen等(Developmentofthebiocatalyticresolutionof2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5en-3-oneasanentrytosingle-enantiomercarbocyclicnucleosides.Tetrahedron:Asy_dtry，1993,4(6):1117-1118)利用內(nèi)酰胺酶對拆分文斯內(nèi)酯的效果進(jìn)行了研究，他們通過完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗，達(dá)到了良好的拆分效果，并分離得到了兩種分別可以專一性水解一種對映體的酶。但該方法會造成另一種單一對映體的浪費以及限制了最大的理論量。Brabban(R.Stereospecificy-lactamaseactivityinaPseudomonasfluoreseensspecies.JIndMicrobiol，1996，16(1):8-14)和Mahmoudian等（ApracticalenzymicprocedureforresolutionofN-substituted2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-ones·Tetrahedron:Asy_dtry，1999，10(6):1201-1206)利用乙醜苯丙氛酸為唯一碳源篩選得到了產(chǎn)γ-內(nèi)酰胺酶菌株，并應(yīng)用于拆分γ-內(nèi)酰胺。但是采用γ-內(nèi)酰胺酶催化水解拆分文斯內(nèi)酯仍然存在一些問題，高效率、高穩(wěn)定性的適于工業(yè)化生產(chǎn)的γ-內(nèi)酰胺酶不易尋找，拆分反應(yīng)存在副產(chǎn)物γ-氨基丁酸，尚未見產(chǎn)業(yè)化報道，因此該方法并不是最優(yōu)的方法。HirotoNakano等（Hiroto，Ν·，Kazuto，I.，Yuko，0·，Hiroshi，H.Lipase_catalyzedresolutionof2-azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-〇nes.Tetrahedron:Asymmetry.1996,7:2381-2386)首先利用脂肪酶對(+/-)γ-內(nèi)酰胺（即文斯內(nèi)酯)進(jìn)行了拆分，由于脂肪酶的立體選擇性，它只催化拆分消旋體中的一種，從而達(dá)到了拆分，但該方法底物濃度不高，拆分效果一般?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用酶法制備阿巴卡韋重要手性中間體文斯內(nèi)酯的方法。[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：[0008]選用耐有機(jī)溶劑脂肪酶YCJ01催化拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內(nèi)酯。所選用脂肪酶YCJ01已公開在同一發(fā)明人的在先授權(quán)專利CN102329745B中，產(chǎn)脂肪酶YCJ01菌株保藏登記號CCTCCN0:M2011058。[0009]脂肪酶YCJ01催化拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內(nèi)酯步驟具體如下：[0010](1)向密封瓶中加入N-羥甲基文斯內(nèi)酯，酰基供體，有機(jī)溶劑和脂肪酶YCJ01，置于搖床中反應(yīng)。[0011](2)反應(yīng)結(jié)束后，過濾反應(yīng)液，濾液用乙醚萃取三次，合并有機(jī)相，之后過柱純化，加入無水硫酸鈉干燥，獲得（1S，4R)-N-羥甲基文斯內(nèi)酯固體，將（1S，4R)-N-羥甲基文斯內(nèi)酯固體溶于甲醇后，加入ΝΗ40Η，室溫條件下攪拌后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，之后過柱純化，真空干燥得淡黃色固體，即為(1S，4R)_文斯內(nèi)酯。[0012]其中搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為180rpm/min。[0013]其中反應(yīng)底物外消旋體N-羥甲基文斯內(nèi)酯采用化學(xué)法制備，具體制備方法參考HirotoNakano等的文南犬（ElirotoNakano,Kazutolwasa,YukoOkuyanm,andHiroshiHongo.Lipase-catalyzedresolutionof2-azabicyclo[2.2.l]hept-5-en-3-ones.Tetrahedron:Asymmetry.1996,7:2381-2386)，N_輕甲基文斯內(nèi)酯最終產(chǎn)率為85%。[0014]本發(fā)明的反應(yīng)式如下：[0016]其中，所述步驟（1)中脂肪酶YCJ01拆分在有機(jī)相中進(jìn)行，所述有機(jī)溶劑可為單組分或雙組分。所述有機(jī)溶劑采用單組分時，選自環(huán)己烷、甲苯、異丙醇、甲基叔丁基醚、正己烷或丙酮中的一種，優(yōu)選甲基叔丁基醚。[0017]當(dāng)脂肪酶拆分在雙組分有機(jī)溶劑中進(jìn)行時，固定雙組分中的其中一個組分為甲基叔丁基醚，另一組分為環(huán)己烷、甲苯、異丙醇、正己烷或丙酮;雙組分有機(jī)溶劑優(yōu)選甲基叔丁基醚和正己烷，其中正己烷在混合液中的體積濃度(V/V)為0%-40%，優(yōu)選5%-15%，更優(yōu)選10%〇[0018]所述步驟（1)中?；w選自乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯中的一種。優(yōu)選的，所述?；w采用乙酸乙烯酯，所述乙酸乙烯酯的濃度為200~2000mM，優(yōu)選1000~1400mM。[0019]所述步驟（1)中耐有機(jī)溶劑脂肪酶YCJ01的用量為50~250U/ml，優(yōu)選125~150U/ml，更優(yōu)選150U/ml。[0020]所述步驟（1)中N-輕甲基文斯內(nèi)酯濃度為50~600mM，優(yōu)選300~350mM。[0021]所述步驟⑴中N-羥甲基文斯內(nèi)酯和乙酸乙烯酯的反應(yīng)濃度摩爾比為1:1~10,優(yōu)選1:1~5,更優(yōu)選1:4。[0022]所述步驟（1)中，反應(yīng)體系在搖床中反應(yīng)溫度為10~50°C，優(yōu)選25°C~40°C，更優(yōu)選32~37°C;反應(yīng)時間為6~24h，優(yōu)選12h。[0023]采用本發(fā)明所述的方法拆分文斯內(nèi)酯，轉(zhuǎn)化率達(dá)49.9~50.1%，產(chǎn)物（1R，4S)-N-羥甲基文斯內(nèi)酰胺酯的eeP值彡99.0%;拆分后其中剩余底物（1S，4R)-N-羥甲基文斯內(nèi)酯的ees值彡99.2%〇〇[0024]本發(fā)明的有益效果在于使用來自于BurkholderiaambifariaYCJ01的具有獨特底物特異性和立體選擇性的耐有機(jī)溶劑脂肪酶YCJ01來催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，并對其各個條件進(jìn)行了優(yōu)化，并篩選出了適合于使用脂肪酶YCJ01手性拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯的生產(chǎn)條件。此方法步驟簡單，無副產(chǎn)物，所使用的脂肪酶YCJ01立體選擇性高，不但可以保證有比較高的收率，而且保證最終手性產(chǎn)品的ee值達(dá)到99%以上，達(dá)到了很好的拆分效果。[0025]本發(fā)明所使用的自主知識產(chǎn)權(quán)的脂肪酶立體選擇性高，應(yīng)用于催化外消旋底物N-羥甲基文斯內(nèi)酯的拆分反應(yīng)，拆分后底物（1S，4R)-N-羥甲基文斯內(nèi)酯ees值彡99%;產(chǎn)物(1R，4S)-N-羥甲基文斯內(nèi)酰胺酯eeP值彡99%。本發(fā)明的工藝路線具有較好的經(jīng)濟(jì)性和技術(shù)可行性，具備一定的科研與實用意義?！揪唧w實施方式】[0026]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但并不限制本發(fā)明。[0027]本發(fā)明所述的耐有機(jī)溶劑脂肪酶YCJ01來自于Burkholderia，所選用脂肪酶YCJ01已公開在同一發(fā)明人的在先授權(quán)專利CN102329745B中，產(chǎn)脂肪酶YCJ01菌株保藏登記號CCTCCN0：M2011058〇[0028]脂肪酶YCJ01的粗酶粉制備參考Yao等的文獻(xiàn)（AnorganicsolventandthermallystablelipasefromBurkholderiaambifariaYCJ01:Purification,characteristicsandapplicationforchiralresolutionofmandelicacid)。[0029]實施例1[0030]向4ml的密封瓶中加入質(zhì)量為83.4mg，濃度為300mmol的N-羥甲基文斯內(nèi)酯，222μ1濃度為1200mmol的乙酸乙烯酯和2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積的正己烷)和30mg脂肪酶YCJ01，置于搖床中反應(yīng)。搖床反應(yīng)溫度為35°C，搖床轉(zhuǎn)速為180rpm/min，反應(yīng)12h。[0031]反應(yīng)結(jié)束后，過濾反應(yīng)液，濾液用乙醚萃取劑約12ml，分3次萃取，合并有機(jī)相，之后過柱子純化，加入400mg無水硫酸鈉干燥2h，獲得（1S，4R)-N-羥甲基文斯內(nèi)酯固體，將其溶于10ml甲醇后，加入lmlNH40H，室溫條件下攪拌12h后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，之后過柱純化，真空干燥得淡黃色固體，即為(1S，4R)_文斯內(nèi)酯。[0032]反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率C%為50.1%，eeP%S99.0%，eesS99.2%。[0033]實施例2[0034]本實施例反應(yīng)體系中的底物濃度為:300mM的N-羥甲基文斯內(nèi)酯，200mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積的正己烷）中置于35°C、180rpm的搖床中反應(yīng)6h。實驗操作步驟同實施例1中的步驟。具體的結(jié)果如下：[0035][0036]實施例3[0037]本實施例反應(yīng)體系中的底物濃度為:300mM的N-羥甲基文斯內(nèi)酯，2000mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積比的正己烷）中置于35°C、180rpm的搖床中反應(yīng)24h。實驗操作步驟同實施例1中的步驟。具體的結(jié)果如下：[0038][0039]實施例4[0040]本實施例反應(yīng)體系中的底物濃度為:300mM的N-羥甲基文斯內(nèi)酯，1400mM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積比的正己烷）中置于35°C、180rpm的搖床中反應(yīng)12h。實驗操作步驟同實施例1中的步驟。具體的結(jié)果如下：[0041][0042]實施例5[0043]本實施例反應(yīng)體系中的底物濃度為:300mM的N-羥甲基文斯內(nèi)酯，lOOOmM的乙酸乙烯酯，并加入30mg脂肪酶YCJ01，在2ml甲基叔丁基醚(包含10%體積比的正己烷）中置于35°C、180rpm的搖床中反應(yīng)12h。實驗操作步驟同實施例1中的步驟。具體的結(jié)果如下：[0044][0045]實施例6:有機(jī)溶劑對N-輕甲基文斯內(nèi)酯酶促拆分的影響[0046]實施例6采用和實施例1同樣的實驗步驟，對有機(jī)溶劑種類對N-羥甲基文斯內(nèi)酯酶粗拆分的影響進(jìn)行了討論。[0047]由于有機(jī)溶劑可以通過改變酶蛋白分子的動態(tài)移動性及構(gòu)象，從而顯著影響酶的活性及立體選擇性，所以在有機(jī)相中進(jìn)行酶促反應(yīng)時，選擇合適的有機(jī)溶劑是十分必要的。相關(guān)研究表明有機(jī)溶劑對酶活性及立體選擇性的影響大小主要與溶劑的極性（logP)有關(guān)，因此同時根據(jù)脂肪酶YCJ01對有機(jī)溶劑的耐受性，選擇環(huán)己烷、甲苯、異丙醇、甲基叔丁基醚、環(huán)己烷和丙酮作為溶劑，考察它們對N-羥甲基文斯內(nèi)酯拆分效果的影響。在本實施例中，底物N-羥甲基文斯內(nèi)酯的濃度為100禮，乙酸乙烯酯的濃度為500禮，分別選取以上幾種有機(jī)溶劑，在35°C條件下反應(yīng)12h來催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，其中耐有機(jī)溶劑脂肪酶的用量為lOOU/ml。具體的拆分效率與不同有機(jī)溶劑的關(guān)系為：[0048]表1.不同有機(jī)溶劑對N-輕甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響[0051]由此可見，甲基叔丁基醚最適合作為脂肪酶YCJ01催化N-羥甲基文斯內(nèi)酯轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的反應(yīng)介質(zhì)。在極性較強(qiáng)的溶劑中，酶通常不會有太高的活力，并且通常反應(yīng)體系需要較高的水活度才能保持酶分子的適當(dāng)活性構(gòu)象，從而使酶表現(xiàn)出一定的催化活力。此外，有的有機(jī)溶劑還可能滲透到酶的活性中心從而改變酶的構(gòu)像，進(jìn)而影響酶的性能。以甲基叔丁基醚作為反應(yīng)溶劑效果佳，故而進(jìn)一步通過條件的進(jìn)一步優(yōu)化來提高拆分效率。[0052]實施例7:兩種底物濃度摩爾比對N-輕甲基文斯內(nèi)酯酶促拆分的影響[0053]在酶促反應(yīng)體系中，底物濃度的變化會影響酶的催化活性及立體選擇性，而底物濃度的變化可以通過改變反應(yīng)體系中兩種底物的摩爾濃度比來實現(xiàn)。通常在此類反應(yīng)中，過量的乙酸乙烯酯可以防止產(chǎn)物酯的水解，從而提高了反應(yīng)平衡以及增加理論最大的產(chǎn)品產(chǎn)量。本實驗中固定N-羥甲基文斯內(nèi)酯的摩爾濃度為100mM，通過改變乙酸乙烯酯的摩爾濃度來調(diào)節(jié)兩種底物的摩爾濃度比(N-羥甲基文斯內(nèi)酯與乙酸乙烯酯摩爾濃度比為1:1~6)，選取甲基叔丁基醚作為反應(yīng)溶劑，在35°C條件下反應(yīng)12h來催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，其中耐有機(jī)溶劑脂肪酶的用量為l〇〇U/ml。具體的拆分效率與不同摩爾濃度比的關(guān)系為：[0054]表2:不同底物摩爾濃度比對N-輕甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響[0057]由此可見，脂肪酶YCJ01的催化活力隨乙酸乙烯酯與N-羥甲基文斯內(nèi)酰胺的摩爾濃度比的增加而增大，當(dāng)比值為4:1時達(dá)到最大，繼續(xù)增大摩爾濃度比，隨著乙酸乙烯酯濃度的增大，催化活力逐漸降低。[0058]實施例8:催化劑用量對N-輕甲基文斯內(nèi)酯酶促拆分的影響[0059]脂肪酶催化非對稱轉(zhuǎn)酯反應(yīng)時的催化活力和立體選擇性在很大程度上受用酶量的影響。本實驗針對甲基叔丁基醚中脂肪酶YCJ01的用量對N-羥甲基文斯內(nèi)酯的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響進(jìn)行了研究。本實驗中底物N-羥甲基文斯內(nèi)酯的濃度為100mM，乙酸乙烯酯的濃度為400mM，選取甲基叔丁基醚作為反應(yīng)溶劑，在35°C條件下反應(yīng)12h來催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，脂肪酶YCJ01的用量分別為10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg。具體的加酶量對N-羥甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響關(guān)系為：[0060]表3:不同加酶量對N-輕甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響[0062]由此可見，在50~200U/ml的用酶量范圍內(nèi)，隨著酶量的增加，脂肪酶YCJ01的催化活性升高，且在用酶量為125~150U/ml時活性達(dá)到最大，超過150U/ml時活性提高甚微。原因可能是當(dāng)用酶量較少時，酶與底物碰撞機(jī)會小，導(dǎo)致酶活不高，隨著用酶量的增加，酶與底物碰撞幾率增大，使酶的活性增大，而加酶量超過一定值時，與底物接觸的酶已達(dá)飽和，所以酶活力幾乎不再提高。因此采用125~150U/ml作為后續(xù)的實驗用酶量。[0063]實施例9:?；w對N-輕甲基文斯內(nèi)酯酶促拆分的影響[0064]脂肪酶催化動力學(xué)拆分過程中，乙烯酯類酰化試劑具有重要的作用，它通常在脂肪酶催化的手性醇的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中作為?；w，先與酶形成?；鶑?fù)合體，而后?；笍?fù)合體優(yōu)先與手性醇中的某一對映體結(jié)合，將其酯化，從而達(dá)到拆分手性醇的目的。?；w的鏈長不同造成的位阻差異會引起脂肪酶的立體選擇性發(fā)生改變。本實驗選擇了5種不同鏈長的酰基供體，對N-羥甲基文斯內(nèi)酯的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的影響進(jìn)行了研究。本實驗中底物N-羥甲基文斯內(nèi)酯的濃度為l〇〇mM，?；w的濃度為400mM，選取甲基叔丁基醚作為反應(yīng)溶劑，在35°C條件下反應(yīng)12h來催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，脂肪酶YCJ01的用量為150U/ml。不同鏈長的?；w對N-羥甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響關(guān)系為：[0065]表4:不同鏈長的酰基供體對N-輕甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響[0066][0067]由此可見，中等長度鏈長的?；w對脂肪酶YCJ01拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯的效果比較好，當(dāng)丁酸乙烯酯作為?；w時，脂肪酶YCJ01的催化拆分效果最好。但隨著鏈長的增加，其催化效果明顯降低。因此，中等長度鏈長的?；w是脂肪酶YCJ01的最佳作用底物。由于乙酸乙烯酯，丙酸乙烯酯及丁酸乙烯酯對脂肪酶YCJ01的催化活性及立體選擇性的影響相差不大，而乙酸乙烯酯價格相對低廉。從經(jīng)濟(jì)層面考慮，選擇乙酸乙烯酯作為脂肪酶YCJ01催化N-羥甲基文斯內(nèi)酯反應(yīng)的酰基供體。[0068]實施例10:雙組分混合有機(jī)溶劑對N-輕甲基文斯內(nèi)酯酶促拆分的影響[0069]有機(jī)溶劑耐受性是衡量脂肪酶催化活性的重要特征之一。非水相體系中的酶催化不僅取決于酶的性質(zhì)，同時與所選有機(jī)溶劑也密切相關(guān)。相關(guān)研究表明，使用雙組分有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)對底物熱力學(xué)活度和反應(yīng)活化能有重要影響。因此固定雙組分中的其中一個組分為甲基叔丁基醚。雙組分有機(jī)溶劑選自甲基叔丁基醚和環(huán)己烷，甲基叔丁基醚和甲苯，甲基叔丁基醚和異丙醇，甲基叔丁基醚和正己烷，甲基叔丁基醚和丙酮中的一種。本實驗對不同的雙組分溶劑對酶促拆分的影響進(jìn)行了研究，為了保證實驗的可行性，其中甲基叔丁基醚的含量設(shè)定為90%，另一有機(jī)溶劑含量為10%，底物N-羥甲基文斯內(nèi)酯的濃度為1OOmM，乙酸乙烯酯的濃度為400mM，在35°C條件下反應(yīng)12h來催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，脂肪酶YCJ01的用量為150U/ml。不同的雙有機(jī)溶劑組分對N-羥甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響關(guān)系為：[0070]表5:不同雙有機(jī)溶劑組分對N-輕甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響[0071][0072]由此可見，當(dāng)雙有機(jī)溶劑組分選擇甲基叔丁基醚和正己烷時，反應(yīng)效果最好。為了更進(jìn)一步的提高反應(yīng)效率，在其他條件不變的情況下，對不同含量的正己烷進(jìn)行了研究，具體結(jié)果如下：[0073]表6:不同含量正己烷對N-輕甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響[0076]由此可見，當(dāng)往反應(yīng)體系中添加10%正己烷時，脂肪酶YCJ01催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯效果最佳。同時可以看出，采用雙有機(jī)溶劑體系確實提高了催化效率。原因可能是脂肪酶YCJ01在正己烷中具有非常好的耐受性，脂肪酶的穩(wěn)定性比較好。有研究表明在疏水性較強(qiáng)溶劑中酶的催化活力和對映體選擇性較高。與此同時，雙組分有機(jī)溶劑中進(jìn)行酶促酯化反應(yīng)，對反應(yīng)的活化能有一定的影響，同時也會影響脂肪酶的催化活性。[0077]實施例11:反應(yīng)溫度對N-輕甲基文斯內(nèi)酯酶促拆分的影響[0078]酶的生物本質(zhì)為蛋白質(zhì)，因此溫度對酶催化的反應(yīng)必然有很大的影響。相關(guān)研究表明，溫度不僅可以影響酶的活性，有時還可能會影響酶的立體選擇性。本實驗研究了不同的溫度對N-羥甲基文斯內(nèi)酯酶促拆分的影響。本實驗中底物N-羥甲基文斯內(nèi)酯的濃度為100mM，?；w的濃度為400mM，選取甲基叔丁基醚和正己烷(9:lv/v)雙組分有機(jī)溶劑作為反應(yīng)溶劑，在不同的溫度條件下反應(yīng)12h來催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，脂肪酶YCJ01的用量為150U/ml。不同溫度對N-羥甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響關(guān)系為：[0079]表7:不同反應(yīng)溫度對N-輕甲基文斯內(nèi)酯拆分的影響[0081]由此可見，隨著反應(yīng)溫度的升高，脂肪酶YCJ01的催化效率隨之升高，但當(dāng)溫度到達(dá)35°C之后，隨著溫度的升高，脂肪酶的催化效率趨于不變。從該反應(yīng)中酶的催化活力與立體選擇性以及經(jīng)濟(jì)節(jié)能方面考慮，選擇32~40°C作為有機(jī)相中脂肪酶YCJ01催化N-羥甲基文斯內(nèi)酯酶促拆分的反應(yīng)溫度。[0082]實施例12:底物N-輕甲基文斯內(nèi)酯濃度對酶促拆分的影響[0083]由于過多的底物對于酶具有抑制作用，所以N-羥甲基文斯內(nèi)酯的濃度對于脂肪酶YCJ01的拆分效率具有很大的影響。本實驗中兩種底物濃度摩爾比(N-羥甲基文斯內(nèi)酯與乙酸乙烯酯摩爾濃度比）為1:4，N-羥甲基文斯內(nèi)酯的濃度分別為100mM，200mM，300mM，400mM，500mM，600mM在35°C條件下反應(yīng)12h來催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，脂肪酶YCJ01的用量為150U/ml。不同濃度的N-羥甲基文斯內(nèi)酯對拆分的影響關(guān)系為：[0084]表8:不同濃度N-輕甲基文斯內(nèi)酯對拆分的影響[0085][0086]由此可見，當(dāng)N-羥甲基文斯內(nèi)酯濃度小于300mM時，脂肪酶YCJ01催化拆分的效率很高且相差不大。但當(dāng)N-羥甲基文斯內(nèi)酯的濃度超過300mM時，脂肪酶YCJ01催化拆分的效率逐漸下降，因此選取300~350mM作為最優(yōu)的底物濃度，提高底物濃度，有利于擴(kuò)大化生產(chǎn)。[0087]基于以上原因，脂肪酶YCJ01能夠在較高底物濃度下實現(xiàn)高效拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯。拆分反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物為（1R，4S)-N-羥甲基文斯內(nèi)酰胺酯，eeP值彡99.0%，底物為(15,41〇4-羥甲基文斯內(nèi)酯，^值彡99.2%，達(dá)到了很好的拆分效果。并且為以后使用脂肪酶YCJ01催化拆分手性物質(zhì)提供了一種方法。最后，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍?！局鳈?quán)項】1.一種酶法拆分阿巴卡韋手性中間體文斯內(nèi)酯的方法，其特征在于:采用耐有機(jī)溶劑脂肪酶YCJO1催化拆分N-羥甲基文斯內(nèi)酯，具體步驟如下：(1)向密封瓶中加入N-羥甲基文斯內(nèi)酯，?；w，有機(jī)溶劑和脂肪酶YCJ01，置于搖床中反應(yīng)；(2)過濾反應(yīng)液，濾液用乙醚萃取三次，合并有機(jī)相，之后過柱純化，加入無水硫酸鈉干燥，獲得（1S，4R)-N-羥甲基文斯內(nèi)酯固體;將（1S，4R)-N-羥甲基文斯內(nèi)酯固體溶于甲醇后，加入ΝΗ40Η，室溫條件下攪拌后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，之后過柱純化，真空干燥得淡黃色固體，即為（1S，4R)_文斯內(nèi)酯。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述有機(jī)溶劑采用單組分或雙組分;選用單組分有機(jī)溶劑時，所述有機(jī)溶劑選自正己烷、環(huán)己烷、甲苯、異丙醇、甲基叔丁基醚、或丙酮中的一種;選用雙組分有機(jī)溶劑時，固定雙組分中的其中一個組分為甲基叔丁基醚，另一組分為環(huán)己烷、甲苯、異丙醇、正己烷或丙酮。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為雙組分有機(jī)溶劑，所述有機(jī)溶劑為甲基叔丁基醚和正己烷，其中正己烷在混合液中的體積濃度(v/v)為0%-40%，優(yōu)選5%-15%，更優(yōu)選10%。4.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)溶劑為單組分有機(jī)溶劑，所述單組分有機(jī)溶劑為甲基叔丁基醚。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述?；w選自乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、戊酸乙烯酯、己酸乙烯酯中的一種。6.根據(jù)權(quán)利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述?；w為乙酸乙烯酯，所述乙酸乙烯酯的濃度為200~2000mM，優(yōu)選1000~1400mM。7.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐有機(jī)溶劑脂肪酶YCJ01的用量為50~250U/ml，優(yōu)選125~150U/ml。8.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-羥甲基文斯內(nèi)酯濃度為50~600mM，優(yōu)選300~350mM。9.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述N-羥甲基文斯內(nèi)酯與乙酸乙烯酯的反應(yīng)摩爾濃度比為1:1~10，優(yōu)選1:1~5，更優(yōu)選1:4。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述搖床反應(yīng)溫度為10~50°C，優(yōu)選25°C>40°C，更優(yōu)選32~37°C;反應(yīng)時間為6~24h，優(yōu)選12h?！疚臋n編號】C12P17/10GK105969836SQ201610310542【公開日】2016年9月28日【申請日】2016年5月11日【發(fā)明人】何冰芳,朱玲,劉可可,儲建林,吳斌【申請人】南京工業(yè)大學(xué)