多重熒光pcr技術(shù)篩查和鑒定mll重排相關(guān)融合基因的引物及探針、組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明一種用多重熒光PCR技術(shù)篩查MLL重排相關(guān)融合基因的引物、探針、組合物和方法。所述篩查的MLL重排相關(guān)融合基因包括：MLL?AF9、MLL?AF6、MLL?AF4、MLL?AF1P、MLL?AF1Q、MLL?AF10、MLL?AF17、MLL?AFX1、MLL?ELL、MLL?ENL、MLL?SEPT6、MLL?CBP、dupMLL共計13種相對常見融合基因。本發(fā)明所述引物、探針、檢測組合方式和檢測方法方便、經(jīng)濟、快捷，特異性好，靈敏度高，通量大，適于大批量樣本的臨床檢測。
【專利說明】
多重熒光PCR技術(shù)篩查和鑒定MLL重排相關(guān)融合基因的引物及 探針、組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種采用多重熒光PCR技術(shù)篩查MLL 重排相關(guān)融合基因的引物、探針、組合物和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] MLL重排異?？梢娪诩s5-10 %的急性白血病(AL)患者。其中除MLL-AF9融合基因?qū)?于中等預(yù)后指標外，其余伴MLL重排的異常都與預(yù)后差相關(guān)。在急性白血病的臨床治療中， 特別是針對AML的治療會進行一個預(yù)后的評估分層，根據(jù)不同的預(yù)后分層選擇不同的治療 方案。同時還需要對治療過程中融合基因的表達量進行監(jiān)測，以預(yù)測療效及復(fù)發(fā)的可能性。 因此，MLL重排相關(guān)融合基因的篩查顯得尤為重要。
[0003] 由于MLL重排涉及的斷裂位點多樣，產(chǎn)生的融合基因種類也繁多，因此在臨床檢測 上存在一定的困難。目前用于MLL重排篩查的方法主要有:染色體核型分析，多重巢式PCR聯(lián) 合電泳法。染色體核型分析通過肉眼觀察判斷，需對樣本中的有核細胞進行培養(yǎng)，具有核分 裂相才能進行觀察;而細胞培養(yǎng)增殖過程中，會出現(xiàn)某類細胞優(yōu)勢生長，"淹沒"病變細胞的 可能，造成染色體核型正常的假象。其次，有些病例染色體的易位復(fù)雜且微小，無法靠肉眼 觀察進行分析。再者，染色體核型分析靈敏度無法滿足MRD(Minimal Residua Disease，微 小殘留病灶)檢測的需求。而多重巢式PCR聯(lián)合電泳的方法耗時長，過程繁瑣，易污染，結(jié)果 的判斷較主觀。且PCR反應(yīng)體系多，成本高，不適用于高通量的樣本檢測。只能進行定性檢測 的缺點，不能同時滿足靈敏度高和特異性好的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于目前篩查MLL重排相關(guān)融合基因的方法學(xué)不能同時滿足經(jīng)濟高效、結(jié)果準確 且能用于MRD監(jiān)測等需求，故本發(fā)明設(shè)計出一套用于多重熒光PCR技術(shù)檢測MLL重排常見融 合基因的引物、探針，并構(gòu)思出一種靈敏度高，特異性好，檢測通量大，快速且準確的篩查及 型別鑒定方案。
[0005] 一種用熒光PCR技術(shù)篩查及鑒定MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、MLL-AF1P、MLL-AF1Q、 MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL這 13 種常見 MLL重排相關(guān)融合基因的引物及探針，采用多重熒光PCR技術(shù)，將存在于MLL基因的上游引 物、及其對應(yīng)的探針配對不同的下游基因上的多條下游引物。其核苷酸序列如下：


[0057] (MLL基因參考序列：NM_001197104)
[0058] 篩查上述融合基因的引物探針還包括擴增作為內(nèi)參的管家基因 ABL的引物和探 針，其核苷酸序列如下：
[0062]本發(fā)明的引物和探針的設(shè)計思路為：
[0063] 1.MLL基因發(fā)生重排時，斷裂位點主要集中于內(nèi)含子5-12,導(dǎo)致MLL外顯子5-12與 其他基因發(fā)生融合;而其中又以6-9外顯子發(fā)生融合最為常見。若要檢測出5-12外顯子的各 種融合型式，宜在每個外顯子上設(shè)計一條上游引物;若要使PCR反應(yīng)盡量減少相互干擾，則 一管PCR反應(yīng)中的引物探針盡量單一越好。為兼顧上述兩個條件，本發(fā)明選擇在MLL第5、7和 第9外顯子上各設(shè)計一條引物，將PCR擴增產(chǎn)物的長度盡量控制在350bp以內(nèi)，以滿足熒光 PCR技術(shù)的檢測范圍要求:其中第5外顯子上的引物用于檢測5外顯子或6外顯子融合;第7外 顯子上的引物用于檢測第7外顯子或第8外顯子融合;第9外顯子上的引物用于檢測第9外顯 子或第10外顯子甚至第11外顯子融合。由于MLL重排產(chǎn)生的融合，每種融合基因均含有MLL 基因，故選擇將檢測探針與MLL上游引物配對，這樣上游引物與探針可共用于檢測13種融合 基因，減少成本。同時為了避免上下游引物探針之間的干擾，在第7和9外顯子上各設(shè)計了兩 對引物探針，可選擇其中一組以最優(yōu)化的組合方式與下游引物進行組對。MLL引物探針設(shè)計 方案見圖1。
[0064] 2.上游MLL基因的斷裂位點有6處之多，而下游各參與融合的基因其斷裂位點也極 其繁多。其中AF9多以外顯子3、4、5、6、9和10參與融合;AF6多第2外顯子參與融合;AF4從外 顯子6-13均可參與融合;AF1P多以外顯子2、6和10參與融合;AF1Q以第2外顯子參與融合； AF10以外顯子4、6、8-16參與融合;AF17多以外顯子7-9和11參與融合;AFX1第3外顯子參與 融合;ELL多以外顯子2、3、5和6參與融合;ENL以外顯子2、4-7參與融合;SEPT6多第2外顯子 參與融合;CBP多以外顯子3和16參與融合;MLL基因內(nèi)部部分序列的復(fù)制主要發(fā)生在MLL第 7-9外顯子和MLL第3外顯子產(chǎn)生融合。故本發(fā)明在下游引物設(shè)計時需兼顧各種融合方式能 檢測到，又不宜使一個PCR反應(yīng)體系中引物過于繁多，相互干擾。下游引物位置設(shè)計方案見 圖1和圖2。
[0065]各下游基因引物設(shè)置如下：
[0066] AF9基因：第5外顯子上的引物用于檢測第3或4或5外顯子參與的融合;第6外顯子 上的引物用于檢測第6外顯子參與的融合;第10外顯子上的引物用于檢測第9或10外顯子參 與的融合。
[0067] AF6基因：第2外顯子上的引物用于檢測第2外顯子參與的融合。
[0068] AF4基因：第7外顯子上的引物用于檢測第6或7外顯子參與的融合;第9外顯子上的 弓丨物用于檢測第8或9外顯子參與的融合;第13外顯子上的引物用于檢測第10或11或12或13 外顯子參與的融合。
[0069] AF1P基因：第3外顯子上的引物用于檢測第2外顯子參與的融合;第6外顯子上的引 物用于檢測第6外顯子參與的融合;第10外顯子上的引物用于檢測第10外顯子參與的融合。 [0070] AF1Q基因：第2外顯子上的引物用于檢測第2外顯子參與的融合。
[0071] AF10基因：第6外顯子上的引物用于檢測第4或6外顯子參與的融合;第10外顯子上 的引物用于檢測第8或9或10外顯子參與的融合;第11外顯子上的引物用于檢測第11外顯子 參與的融合;第15外顯子上的引物用于檢測第12或13或14或15外顯子參與的融合;第16外 顯子上的引物用于檢測第16外顯子參與的融合。
[0072] AF17基因：第9外顯子上的引物用于檢測第7或8或9外顯子參與的融合;第11外顯 子上的引物用于檢測第11外顯子參與的融合。
[0073] AFX1基因：第3外顯子上的引物用于檢測第3外顯子參與的融合。
[0074] ELL基因：第3外顯子上的引物用于檢測第2或3外顯子參與的融合;第6外顯子上的 引物用于檢測第5或6外顯子參與的融合。
[0075] ENL基因：第2外顯子上的引物用于檢測第2外顯子參與的融合;第6外顯子上的引 物用于檢測第4或5或6外顯子參與的融合;第7外顯子上的引物用于檢測第7外顯子參與的 融合。
[0076] SEPT6基因：第2外顯子上的引物用于檢測第2外顯子參與的融合。
[0077] CBP基因：第3外顯子上的引物用于檢測第3外顯子參與的融合;第16外顯子上的引 物用于檢測第16外顯子參與的融合。
[0078] MLL基因：dupMLL檢測的下游主要為第3外顯子，故下游引物也設(shè)計在第3外顯子。
[0079] 3.在上下游引物探針的組合方案上，本發(fā)明兼顧考慮引物二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)等干 擾因素和均衡各組篩查引物的數(shù)量及經(jīng)濟效益，將各下游引物分別與5對上游引物及探針 進行逐一評估，確認最優(yōu)組合，并將篩查方案設(shè)計如下：
[0080] 第一組:篩查MLL-AF9融合基因和檢測內(nèi)參ABL基因;MLL-AF9融合基因預(yù)后分層為 中等，區(qū)別于其他融合基因，單獨進行篩查。MLL-AF9與ABL這兩個基因通過不同的標記探針 "FAM"和"VIC"來進行區(qū)分。其引物探針序列如下：

[0093]第二組:篩查MLL-AF4和MLL-ENL融合基因。這兩個融合基因較為常見，其引物探針 序列如下：
[0106] 第三組:篩查MLL-AF10和MLL-AF6融合基因。這兩個融合基因較為常見，其引物探 針序列如下：
[0119] 第四組:篩查MLL-AF17，MLL-AF1Q，MLL-CBP和dupMLL融合基因。從檢測情況來看這 四個融合基因相對少見，合并成一組進行篩查，其引物探針序列如下：

[0132] 第五組：篩查MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P和MLL-SEPT6融合基因。從檢測情況來 看這四個融合基因相對少見，合并成一組進行篩查，其引物探針序列如下：
[0146] 綜合上述因素，最終設(shè)計的引物探針及篩查分組方案如上所述。
[0147] 本發(fā)明還提供 了鑒定MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、MLL-AF1P、MLL-AF1Q、MLL-AF10、 MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL這 13種融合基因的引 物探針，共用上游3組引物探針配對不同的下游引物進行檢測。其引物探針序列如下：
[0148] 1.MLL-AF9融合基因檢測引物探針：


[0242] 11 · MLL-SEPT6融合基因檢測引物探針：
[0250] 12. MLL-CBP融合基因檢測引物探針：
[0259] 13.dupMLL基因檢測引物探針：
[0267]鑒定上述融合基因的引物探針還包括擴增作為內(nèi)參的管家基因 ABL的引物和探 針，其核苷酸序列如下：
[0271] 本發(fā)明還提供了使用上述引物及探針篩查及鑒定MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、 MLL-AF1P、MLL-AF1Q、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL這13種MLL重排相關(guān)融合基因的方法，包括以下步驟：
[0272] ⑴采用紅細胞裂解液裂解紅細胞的方法提取全血樣本中的有核細胞。10 X紅細胞 裂解液配方為：NH4C1 82g，NaHC038.4g，EDTA-Na2 3.72g，加 ddH20定容至 1000ml。⑵采用 TRI zo 1 RNA提取方法提取有核細胞中的總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。⑶以步驟2中的cDNA 為模版，進行MLL重排相關(guān)融合基因的初步篩查。篩查分第一組到第五組5個體系進行。反應(yīng) 條件為:95°C預(yù)變性111^11 ;95°(：1〇8,581€5〇8，共40個循環(huán);58°(：時采集熒光。(4)根據(jù)步驟3中 的檢測結(jié)果，判斷是第一到第五組中的哪一組為陽性。在內(nèi)參ABL基因擴增正常(CT值彡32) 的情況下，各融合基因 CT值< 36判定為陽性。若第一組陽性，則為MLL-AF9融合基因陽性。在 臨床應(yīng)用中已經(jīng)可以根據(jù)第一組陽性和非第一組陽性判斷出預(yù)后的分層。第一組陽性預(yù)后 為中等，非第一組陽性則預(yù)后較差。非第一組陽性情況下，還可細分具體的融合基因：若第 二組陽性，則進一步鑒定MLL-AF4和MLL-ENL;若第三組陽性，則進一步鑒定MLL-AF10和MLL-AF6;若第四組陽性，則進一步鑒定MLL-AF17，MLL-AF1Q，MLL-CBP和dupMLL;若第五組陽性， 則進一步鑒定MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P，MLL-SEPT6 ;同時加入ABL基因作為內(nèi)參。
[0273] 本發(fā)明還提供了一種用熒光PCR技術(shù)篩查及鑒定趾1^-4?9、11^?6、11^4?4、11^-AF1P、MLL-AF1Q、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、 dupMLL 13種常見MLL重排相關(guān)融合基因的組合物，其特征在于，所述組合物包括組合物1至 組合物5。組合物1包括篩查MLL-AF9融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列 包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF9-5R，AF9-6R，和 AF9-10R。組 合物2包括篩查MLL-AF4和MLL-ENL融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列 包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F1，MLL-7P1，MLL-9F2，MLL-9P2，AF4-7R，AF4-9R，AF4-13R，ENL-2尺4見-61^陽見-71?。組合物3包括篩查祖^-4?10和趾1^-4?6融合基因的引物和探針，所述 引物和探針的核苷酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2， 八卩10-61?，4?10-101?4?10-111?，4?10-151?4?10-161?和4?6-1?。組合物4包括篩查趾1^-4卩17， MLL-AF1Q，MLL-CBP和dupMLL融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列包括： MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF17-9R，AF17-11R，AF1Q-2R，CBP-3R，CBP-16R 和 dupMLL-R。組合物 5 包括篩查 MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P和MLL-SEPT6融合 基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7?2，11^-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，ELL-3R，ELL-6R，AFX1-3R，AF1P-2R，AF1P-6R，AF1P-10R和SEPT6-2R。
[0274] 本發(fā)明還提供了一種用熒光PCR技術(shù)篩查及鑒定趾1^-4?9、11^?6、11^4?4、11^-AF1P、MLL-AF1Q、MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、 dupMLL 13種常見MLL重排相關(guān)融合基因的試劑盒，所述試劑盒包括引物和探針，其核苷酸 序列包括：]?1^-5卩、]\11^-5?、]\11^-7卩1、]\11^-7?1、]\11^-7卩2、]\11^-7?2、]\11^-9卩1、]\11^-9?1、]\11^-9F2、MLL-9P2、AF9-5R、AF9-6R、AF9-10R、AF6-R、AF4-7R、AF4-9R、AF4-13R、AF1P-2R、AF1P-6R、AF1P-10R、AF1Q-2R、AF10-6R、AF10-10R、AF10-11R、AF10-15R、AF10-16R、AF17-9R、AF17-11R、AFX1-3R、ELL-3R、ELL-6R、ENL-2R、ENL-6R、ENL-7R、SEPT6-2R、CBP-3R、CBP-16R和 dupMLL-R。
[0275] 本發(fā)明的有益效果是:據(jù)統(tǒng)計，這13種MLL相關(guān)融合基因在AL中的發(fā)生率大概在5-10%，且在臨床中對預(yù)后的評估具有重要意義。若采用多重巢式PCR進行篩查，則靈敏度、特 異性不能滿足臨床的要求，結(jié)果也不宜判斷。若分管對各個融合基因都進行單獨鑒定，則需 要進行13管檢測，不僅要消耗病人更多的血樣樣本，同時增加試劑和人力成本。本發(fā)明利用 三對上游引物探針覆蓋MLL基因98 %以上的斷裂位點，對應(yīng)多條下游引物覆蓋對應(yīng)基因> 99%的斷裂方式，先進行篩查后進行鑒定，將篩查檢查的反應(yīng)體系縮減到5管，既節(jié)約了成 本，又增加了檢測的通量，為大樣本的篩查工作提供便利。同時將這種組合方式與熒光PCR 技術(shù)相結(jié)合，避免巢式PCR的開蓋反應(yīng)，提高了結(jié)果的準確性，避免污染的發(fā)生;也提高了結(jié) 果的易判斷性，使檢測結(jié)果更加客觀易讀。此外，在融合基因篩查和鑒定時引入"VIC"標記 的ABL探針，實現(xiàn)一管雙檢，又一步減少了反應(yīng)體系。該方法利于臨床結(jié)合骨髓檢查、染色體 核型分析、免疫分型等結(jié)果綜合評估疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后，同時有針對性地進行MRD的監(jiān) 控，預(yù)測復(fù)發(fā)風險。該方法方便、經(jīng)濟、快捷，特異性好，靈敏度高，通量大，適于大批量樣本 的臨床檢測。
【附圖說明】
[0276] 圖1和圖2是本發(fā)明引物、探針設(shè)計區(qū)域示意圖。
[0277] 圖3是使用本發(fā)明引物探針及方法對第一個待檢樣本進行篩查及具體融合基因鑒 定的熒光擴增曲線圖。
[0278] 圖4是使用本發(fā)明引物探針及方法對第二個待檢樣本進行篩查的熒光擴增曲線 圖。
[0279]圖5是使用本發(fā)明引物探針及方法對第三個待檢樣本進行篩查及具體融合基因鑒 定的熒光擴增曲線圖。
[0280]圖6是使用本發(fā)明引物探針及方法對第四個待檢樣本進行篩查及具體融合基因鑒 定的熒光擴增曲線圖。
[0281]圖7是使用本發(fā)明引物探針及方法對第五個待檢樣本進行篩查及具體融合基因鑒 定的熒光擴增曲線圖。
[0282] 圖8是使用本發(fā)明引物探針及方法對第六個待檢樣本進行篩查及具體融合基因鑒 定的熒光擴增曲線圖。
[0283] 圖9是使用本發(fā)明引物探針及方法對第七個待檢樣本進行篩查的熒光擴增曲線 圖。
【具體實施方式】
[0284] 實施例1:
[0285] 全血RNA的提?。涸?.5ml離心管中加入lml IX紅細胞裂解液，取待檢全血樣本 0.5ml，顛倒混勻。4000rpm離心3min，吸棄上清，加紅細胞裂解液洗滌一次，得所需細胞;加1 ml Total RNA Isolation Reagent，反復(fù)吹吸直至無明顯細胞團塊，加入氯仿200μ1，漩禍 混勻30s，冰上靜置1011^11。14,000印111，4°(：離心101^11。用移液器吸取上清液45(^1轉(zhuǎn)移至另 一離心管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻后在冰上靜置lOmin。14，OOOrpm，4°C離心 10min。然后用75%的乙醇和無水乙醇分別洗滌離心一次。室溫干燥5min，加入50μ1 DEPC-Η20溶解。
[0286] 實施例2:
[0287] 逆轉(zhuǎn)錄：取實施例 1 中RNA溶液4ul(濃度約200ng/ul)加 lul Primer mix(ReverTra Ace qPCR RT Kit)和 3ulDEPC-H20 混勻，70°C 預(yù)變性 5min;冰上驟冷 lmin 后加入 5*RT buffer4ul(ReverTra Ace qPCR RT Kit),Enzyme Mix lul(ReverTra Ace qPCR RT Kit), 并加 DEPC-H20 7ul至總體積為20111371:6011^11反應(yīng)后98°C5min滅活，所得即為待檢樣本的 cDNA〇
[0288] 實施例3:
[0289] 多重熒光PCR篩查:根據(jù)下表所示各材料及用量配置篩查試劑。篩查試劑共含5個 反應(yīng)管:第一組至第五組各一管;其中ABL為內(nèi)參檢測在第一組，用于判斷RNA提取質(zhì)量是否 符合要求。加入實施例2中所得cDNA各2ul。按如下程序進行檢測:95°C預(yù)變性60s; 95°C 10s， 58°C 50s，共40個循環(huán);58°C時采集熒光。所得結(jié)果如圖3-A所示:篩查顯示第二組陽性。 [0290]


[0293] 實施例4:
[0294] 根據(jù)實施例3所示結(jié)果，對第二組的各個融合基因進行分別鑒定。ABL內(nèi)參基因與 MLL-ENL同一管反應(yīng)體系進行檢測。試劑配置如下表所示，并加入實施例2中所得cDNA各 2ul。檢測程序同實施例3。所得結(jié)果如圖3-B所示:融合基因鑒定為MLL-AF4陽性。該樣本同 時進行染色體核型分析檢測，確定為t(4;ll)(q21;q23)易位，兩個方法學(xué)的結(jié)果相符合。
[0295]
[0296] 實施例5:
[0297] 對第二個待檢樣本按實施例1-3所述進行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄及多重熒光PCR篩查，所 得結(jié)果如圖4所示:顯示第一組陽性，則該樣本為MLL-AF9融合基因陽性。該樣本同時進行染 色體核型分析檢測，確定20個細胞中15個細胞含有t (9; 11) (p22; q23)易位，兩個方法學(xué)的 結(jié)果相符合。
[0298] 實施例6:
[0299] 對第三個待檢樣本按實施例1-3所述進行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄及多重熒光PCR篩查， 所得結(jié)果如圖5-A所示:顯示第三組陽性。對第三組的各個融合基因進行分別鑒定。ABL內(nèi)參 基因與MLL-AF6同一管反應(yīng)體系進行檢測。試劑配置如下表所示，并加入實施例2中所得 cDNA各2ul。檢測程序同實施例3。所得結(jié)果如圖5-B所示:融合基因鑒定為MLL-AF6陽性。該 樣本同時進行染色體核型分析檢測，確定為t(6;ll)(q27;q23)易位，兩個方法學(xué)的結(jié)果相 符合。
[0300]
[0301] 實施例7:
[0302]對第四個待檢樣本按實施例1-3所述進行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄及多重熒光PCR篩查，所 得結(jié)果如圖6-A所示:顯示第二組陽性。按實施例4對第二組的各個融合基因進行分別鑒定， 所得結(jié)果如圖6-B所示:融合基因鑒定為MLL-ENL陽性。該樣本同時進行染色體核型分析檢 測，確定20個細胞中12個細胞含有t (11; 19)(q23;pl3.3)易位，兩個方法學(xué)的結(jié)果相符合。 [0303] 實施例8:
[0304]對第五個待檢樣本按實施例1-3所述進行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄及多重熒光PCR篩查，所 得結(jié)果如圖7-A所示：顯示第四組陽性。對第四組的各個融合基因進行分別鑒定。ABL內(nèi)參基 因與dupMLL同一管反應(yīng)體系進行檢測。試劑配置如下表所示，并加入實施例2中所得cDNA各 2ul。檢測程序同實施例3。所得結(jié)果如圖7-B所示:融合基因鑒定為MLL-AF1Q陽性。該樣本同 時進行染色體核型分析檢測，確定20個細胞中16個細胞含有t (1; 11) (q21; q23)易位，兩個 方法學(xué)的結(jié)果相符合。
[0305]
[0307] 實施例9:
[0308] 對第六個待檢樣本按實施例1-3所述進行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄及多重熒光PCR篩查，所 得結(jié)果如圖8-A所示:顯示第四組陽性。按實施例8對第四組的各個融合基因進行分別鑒定， 所得結(jié)果如圖8-B所示:融合基因鑒定為dupMLL陽性。由于dupMLL是染色體內(nèi)的微小易位， 染色體核型分析無法識別。
[0309] 實施例10:
[0310] 對第七個待檢樣本按實施例1-3所述進行RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄及多重熒光PCR篩查，所 得結(jié)果如圖9所示:除內(nèi)參ABL外，均無擴增曲線。經(jīng)染色體核型分析結(jié)果確認為核型正常。
[0311] 各實施例結(jié)果總結(jié)如下：
[0312]
【主權(quán)項】
1. 一種用熒光 PCR 技術(shù)篩查及鑒定 MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、MLL-AF1P、MLL-AF1Q、 MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL這13種MLL 重排相關(guān)融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列包括： MLL-5F:5 '-AGGTGCCTGAGGACTGTGGT-3 ' MLL-5P：5'-FAM-TTTGGTGGTCGCAATATAAAGAAGCAGTGC-TAMRA-3' MLL-7F1:5 '-CGCCTCAGCCACCTACTACAG-3 ' MLL-7P1:5 '-FAM-CGCCAAGAAAAGAAGTTCCCAAAACCACT-TAMRA-3， MLL-7F2:5 '-ACAGGACCGCCAAGAAAAG-3 ' MLL-7P2：5'-FAM-AAAGCAGCCTCCACCACCAGAATCAG-TAMRA-3' MLL-9F1：5'-AGGAGAATGCAGGCACTTTGA-3' MLL-9P1:5 '-FAM-CATCCTCAGCACTCTCTCCAATGGCAATA-TAMRA-3 ' MLL-9F2:5 '-GCAGGCACTTTGAACATCC-3 ' MLL-9P2：5'-FAM-TCAGCACTCTCTCCAATGGCAATAGTTCTAAG-TAMRA-3' AF9-5R:5 '-GCTGCTGCTGCTGGTATGAAT-3 ' AF9-6R:5 '-TGGCAGGACTGGGTTGTTC-3 ' AF9-10R:5 '-TAAGGTTCACGATCTGCTGC-3 ' AF6-R:5 '-GCGAGCGTTTCGATTACATC-3 ' AF4-7R:5 '-CTAGGCGTATGTATTGCTGTCA-3 ' AF4-9R:5 '-AGGTCGTCTTCGAGCATGGA-3 ' AF4-13R:5 '-TGCTGCCCTTACTCTCTGG-3 ' AF1P-2R:5 '-AGCCAACACCCTTCCAGTATT-3 ' AF1P-6R:5 '-AGGTTCCACTGATTAGCAAAGG-3 ' AF1P-10R:5 '-CTCCAATCCAGACACAAATCC-3 ' AF1Q-2R:5 '-GGCATCCTCCAGAAAAGAAAG-3 ' AF10-6R:5 '-TGTCATGCAAGCACCAGTG-3 ' AF10-10R:5 '-GAGGTGTGTGCAGAGACTTCCT-3 ' AF10-11R:5 '-TTTGAGCCCGCTTATATCCT-3 ' AF10-15R:5 '-GATCCCGAGCCAGATACTACA-3 ' AF10-16R:5 '-CCTGACTGAGAGAAGATCCAGA-3 ' AF17-9R:5，-AAGAGGAAGCCGAGGAGGA-3， AF17-11R:5 '-GAAGCAGAAGAGGAGGGGAG-3， AFX1-3R:5 '-CCTTGATGAACTTGCTGTGC-3 ' ELL-3R：5'-TTGGAGAGGTAGAAGGAGAACG-3' ELL-6R:5 '-GTAGCCAGGCCAGTCCTTCT-3 ' ENL-2R:5，-TCCAGTCGTGAGTGAACCC-3， ENL-6R:5 '-TCTTGCTGCTCTCCTTGTTG-3 ' ENL-7R:5 '-GGAGTTGGACGGGCTTGAC-3 ' SEPT6-2R：5'-GGACAGTTCGGCAACCTTC-3' CBP-3R：5'-CCAAATGGACTTGTGTTCCC-3' CBP-16R:5 '-CCACTTCCATTGGTTCTGATT-3 ' dupMLL-R:5 '-CACAGATGGATCTGAGAGGATAGC-3 '2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于， 用于MLL-AF9融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF9-5R，AF9-6R和AF9-10R; 用于MLL-AF6融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2和AF6-R; 用于MLL-AF4融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F1，MLL-7P1，MLL-9F2，MLL-9P2，AF4-7R，AF4-9I^PAF4-13R ; 用于MLL-AF1P融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，AF1P-2R，AF1P-6R和AF1P-10R; 用于MLL-AF1Q融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1和AF1Q-2R; 用于MLL-AF10融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，AF10-6R，AF10-10R，AF10-11R，AF10-15R和AF10-16R; 用于MLL-AF17融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF17-9R和AF17-11R; 用于MLL-AFX1融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2和AFX1-3R; 用于MLL-ELL融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，ELL-3R 和 ELL-6R; MLL-ENL 融合基因檢測的引物和探針的 核苷酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F1，MLL-7P1，MLL-9F2，MLL-9P2，ENL-2R，ENL-6R 和 ENL-7R； 用于MLL-SEPT6融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括^-5?^-5?，11^_ 7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2和SEPT6-2R; 用于MLL-CBP融合基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?，11^-5?，11^-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，CBP-3R和CBP-16R; 用于dupMLL基因檢測的引物和探針的核苷酸序列包括:11^-5?肩1^-5?，11^-7?2，11^-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1和dupMLL-R。3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2之一所述的引物和探針，其特征在于，還包括擴增作為內(nèi)參的管 家基因 ABL的引物和探針，其核苷酸序列包括:ABL-F，ABL-R和ABL-P。4. 一種用熒光 PCR 技術(shù)篩查及鑒定 MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF4、MLL-AF1P、MLL-AF1Q、 MLL-AF10、MLL-AF17、MLL-AFX1、MLL-ELL、MLL-ENL、MLL-SEPT6、MLL-CBP、dupMLL 13 種常見 MLL重排相關(guān)融合基因的組合物，其特征在于，所述組合物包括組合物1至組合物5，其中： 組合物1包括篩查MLL-AF9融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列包 括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF9-5R，AF9-6R，和AF9-1OR; 組合物2包括篩查MLL-AF4和MLL-ENL融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷 酸序列包括：]?1^-5卩，]\11^-5?，]\1讓-7卩1，]\11^-7?1，]\11^-9卩2，]\11^-9?2，八卩4-71?4卩4-91?4卩4-13R，ENL-2R，ENL-6R和ENL-7R; 組合物3包括篩查MLL-AF10和MLL-AF6融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷 酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，AF10-6R，AF10-10R， AF10-11R，AF10-15R，AF10-16I^PAF6-R; 組合物4包括篩查MLL-AF17，MLL-AF1Q，MLL-CBP和dupMLL融合基因的引物和探針，所述 引物和探針的核苷酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1， AF17-9R，AF17-11R，AF1Q-2R，CBP-3R，CBP-16R和dupMLL-R; 組合物5包括篩查MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P和MLL-SEPT6融合基因的引物和探針， 所述引物和探針的核苷酸序列包括:MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2， ELL-3R，ELL-6R，AFX1-3R，AF1P-2R，AF1P-6R，AF1P-1OR和SEPT6-2R。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，還包括擴增作為內(nèi)參的管家基因 ABL的 引物和探針，其核苷酸序列包括ABL-F，ABL-R和ABL-P。6. 篩查及鑒定MLL重排相關(guān)融合基因的方法，其特征在于，包括以下步驟： ⑴采用紅細胞裂解液裂解紅細胞的方法提取全血樣本中的有核細胞； ⑵采用TRI zo 1 RNA提取方法提取有核細胞中的總RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA; (3)以步驟2中的cDNA為模版，進行MLL重排相關(guān)融合基因的初步篩查，篩查分第一組到 第五組5個體系進行，反應(yīng)條件為:95 °C預(yù)變性lmin; 95 °C 10s，58 °C 50s，共40個循環(huán);58 °C時 米集焚光； ⑷根據(jù)步驟3中的檢測結(jié)果，判斷是第一到第五組中的哪一組為陽性，在內(nèi)參ABL基因 擴增正常(CT值$32)的情況下，各融合基因 CT值<36判定為陽性;若第一組陽性，則為MLL-AF9融合基因陽性，在臨床應(yīng)用中已經(jīng)可以根據(jù)第一組陽性和非第一組陽性判斷出預(yù)后的 分層，第一組陽性預(yù)后為中等，非第一組陽性則預(yù)后較差，非第一組陽性情況下，還可細分 具體的融合基因：若第二組陽性，則進一步鑒定MLL-AF4和MLL-ENL;若第三組陽性，則進一 步鑒定MLL-AF10和MLL-AF6;若第四組陽性，則進一步鑒定MLL-AF17，MLL-AF1Q，MLL-CBP和 dupMLL;若第五組陽性，則進一步鑒定MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P，MLL-SEPT6;同時加入 ABL基因作為內(nèi)參。 其中第一組至第五組檢測用的引物和探針分別對應(yīng)使用組合物1至組合物5中的引物 和探針，其中： 組合物1包括篩查MLL-AF9融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷酸序列包 括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1，AF9-5R，AF9-6R，和AF9-10R; 組合物2包括篩查MLL-AF4和MLL-ENL融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷 酸序列包括：]?1^-5卩，]\11^-5?，]\1讓-7卩1，]\11^-7?1，]\11^-9卩2，]\11^-9?2，八卩4-71?4卩4-91?4卩4-13R，ENL-2R，ENL-6R和ENL-7R; 組合物3包括篩查MLL-AF 10和MLL-AF6融合基因的引物和探針，所述引物和探針的核苷 酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2，AF10-6R，AF10-10R， AF10-11R，AF10-15R，AF10-16I^PAF6-R; 組合物4包括篩查MLL-AF17，MLL-AF IQ，MLL-CBP和dupMLL融合基因的引物和探針，所述 引物和探針的核苷酸序列包括：MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F1，MLL-9P1， AF17-9R，AF17-11R，AF1Q-2R，CBP-3R，CBP-16R和dupMLL-R; 組合物5包括篩查MLL-ELL，MLL-AFX1，MLL-AF1P和MLL-SEPT6融合基因的引物和探針， 所述引物和探針的核苷酸序列包括:MLL-5F，MLL-5P，MLL-7F2，MLL-7P2，MLL-9F2，MLL-9P2， ELL-3R，ELL-6R，AFX1-3R，AF1P-2R，AF1P-6R，AF1P-1OR和SEPT6-2R。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，10 X紅細胞裂解液配方為：NH4C1 82g， NaHC038 · 4g，EDTA-Na2 3 · 72g，加 ddH20定容至 1000ml。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969866SQ201610338956
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】鄒媛, 杜翠, 陳紅梅, 夏成青
【申請人】武漢艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司