大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541、引物及應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541，該分子標記TCR541與CRb基因共分離，可用于蕓薹種包括結球白菜和青梗菜抗根腫病基因的分子標記輔助選擇。在輔助選擇過程中同時使用這些標記，選擇理論準確度可達到100％，并且該標記重復性好，可靠性高，檢測成本低，省時省力。
【專利說明】
大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541、引物及 應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子 標記TCR541、引物及應用。
【背景技術】
[0002] 2002年，本課題組獲得了 1份抗蕓薹根腫病的大白菜雙單倍體系'CR Shinki DH' 系，研究表明該抗病材料抗蕓薹根腫菌生理小種2、4和8(Piao等，Conversion of AFLP marker linked to clubroot resistance gene into SCAR marker·2002，J Kor Soc Hort Sci 43:653-665)。進一步研究證明抗根腫病基因為顯性單基因，并命名為CRb(Piao 等，SCAR and CAPS mapping ofCRb,a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，TheorAppl Genet， 2004，108:1458-1465)。
[0003] 在蕓薹種抗根腫病品種轉育過程中，每代都需要采用田間接種根腫病菌的方法鑒 定中間材料的基因型，而且環(huán)境條件會影響到正確中間材料的選擇，這樣勢必影響轉育進 程，因此抗病品種轉育難的問題還沒有徹底解決。分子標記輔助選擇技術(MAS)可能是最終 解決這一問題的有效途徑。
[0004] 目前，國內沈陽農業(yè)大學樸鐘云課題組獲得了與蕓薹種抗根腫病基因 CRb連鎖的 標記（2004,2014)，包括TCR01，TCR05和TCR09,見（Piao等，SCAR and CAPS mapping of CRb,a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，以及TCR108、TCR30、TCR74、TCR79，M(Zhang 等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping ofthe CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding，34:1173-1183)。但這些標記并不 是與CRb共分離的標記，利用這些標記進行分子標記輔助選育時容易造成連鎖累贅。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541、弓丨 物及應用，利用該分子標記可對待測植株進行苗期鑒定，從而減少連鎖累贅，簡化大白菜抗 根腫病品種的轉育程序。
[0006] 本發(fā)明提供了一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541，所述大白 菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541的核苷酸序列為：
[0008]本發(fā)明還提供了一種上述大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541的 PCR特異性擴增引物，包括：
[0009] F TCR541:5-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 '
[0010] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '。
[0011 ]本發(fā)明還提供了 一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541，在分子 標記輔助選擇中的應用。
[0012]本發(fā)明還提供了 一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541，在大白 菜抗根腫病分子標記輔助選擇中的應用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種上述大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541的應 用方法，具體包括：
[0014] (1)用CTAB方法提取待測材料的基因組DNA
[0015] ⑵PCR擴增
[0016] a.反應體系：10yL體系，各組分物質的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · I/1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20補齊 10yL，混勻，離 心，
[0017] 其中引物的序列為F TCR541:5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3'，
[0018] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '；
[0019]匕擴增程序：94°(：預變性51^11;94°(：變性3〇8;60°(：退火458 ;72°(：延伸3〇8;35個循 環(huán)后;72°C延伸lOmin;最后4°C保存；
[0020] C.電泳:將擴增產物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測序 電泳儀上進行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳2小時，電泳結束后，進行銀染， 并觀察擴增結果；
[0021] d.判斷:擴增結果中如果能夠檢測到252bp和大于252bp兩條帶，則待測材料中含 有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100%。
[0022]本發(fā)明提供的一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541，與蕓薹種 抗根腫病基因 CRb共分離，可廣泛應用于蕓薹種抗根腫病基因 CRb的分子標記輔助選擇育 種。本發(fā)明通過特異引物PCR擴增可對待測植株進行苗期鑒定，大大提高育種效率，縮短育 種進程。
【附圖說明】
[0023] 圖1為TCR540和TCR541在抗病材料'CRBJN3-2'、感病材料'BJN3-2'以及重組體中 的擴增結果；
[0024] 圖2為大白菜抗根腫病CRb基因的遺傳連鎖圖譜。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明，但應當理解本發(fā)明的保護 范圍并不受【具體實施方式】的限制。
[0026] -、大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541和TCR540的獲得
[0027] 1、分離群體的構建
[0028]以含抗根腫病基因 CRb的大白菜品系'CRBJN3-2'為父本，易感染根腫病的大白菜 品系' B JN3-2 '為母本雜交獲得?:，所獲FHf植株全部表現(xiàn)為抗病。以上兩個親本' CRBJN3-2 ' 和'BJN3-2'均保存于沈陽農業(yè)大學。選擇單株Fi自交構建內代作圖群體，群體數(shù)為4783個。 播種的全部4783個F 2群體，種植10天后接種根腫菌。40天后進行抗病性鑒定，4783個F2群體 中3641個抗病，1142個感病，經(jīng)卡方檢驗符合3:1的分離比（X2 =3.16 =3.84)。
[0029] 2、CTAB 法提取 DNA
[0030] 1)、在1.5ml離心管中加入498uL 1 X CTAB提取液以及2uLf3-巰基乙醇，搖勻，其中1 X CTAB提取液包含2% 的CTAB，100mmol/L的Tris-HCl，20mmol/L的EDTA和 1 · 4mol/L的NaCl， 其中2%的CTAB指的質量濃度為2%(w/v);
[0031] 2)、取0.2g幼嫩葉片，在液氮條件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和β-巰基 乙醇的離心管中，搖勻；
[0032] 3)、隨后將離心管放入65°C水浴中，每隔5分鐘搖一次，水浴30min;
[0033] 4)、取出離心管，加入等體積的氯仿:異戊醇混合物(24:1，v/v)，搖晃lOmin后，常 溫下 12000r/min 離心 lOmin;
[0034] 5)、將上清液轉移到另一離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1，v/v)，搖晃 lOmin后，常溫下 12000r/min離心 lOmin;
[0035] 6)、將上清液移至另一離心管當中，加入2倍體積事先預冷的無水乙醇，混勻后，將 抱團的DNA挑入到裝有400uL TE緩沖液的離心管中溶解；
[0036] 7)、加入 1.5uL RNaseA(10ug/uL)，混勻后37Γ保存30min;
[0037] 8)、重復步驟5);
[0038] 9)、將上清液轉移到另一離心管中，向離心管中加入50uL 3mol/L NaAC溶液和預 冷的等體積的異丙醇，-20 °C沉淀20min;
[0039] 10)、4°C條件下12000r/m離心10min，棄掉上清液，加入75%的乙醇清洗2次；
[0040] 11)、在超凈工作臺上風干DNA，加入50yL TE (Tri s-EDTA)溶解DNA，-20 °C冰箱中保 存。
[0041 ]二、大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541和TCR540的獲得和鑒定 [0042] 1、多態(tài)性引物的篩選
[0043] 根據(jù)樸鐘云課題組2014年發(fā)表的抗根腫病CRb基因的2個側翼標記TCR79和TCR108 序列（Zhang等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding,34:1173-1183), 將該基因錨定在大白菜A3連鎖群83.5kb區(qū)間內。分析Brassica Database數(shù)據(jù)庫(http:// brassicadb.org)序列信息，發(fā)現(xiàn)目標區(qū)域存在15個基因。根據(jù)這15個基因的基因功能，對 其中5個抗病相關基因在抗病材料' CRBJN3-2 '上進行測序。對測序結果進行比對，發(fā)現(xiàn)抗病 材料中有3個基因的序列與Brassica Database數(shù)據(jù)庫(http://brassicadb.org)中參考基 因組序列存在差異。因此，根據(jù)抗病材料的測序結果，利用Primer5.0軟件，共設計3對引物。 [0044]利用設計的3對引物擴增親本' CRBJN3-2 '和' BJN3-2 '的DNA，其中有2對引物在親 本間具有多態(tài)性，并分別命名為TCR540和TCR541，TCR540和TCR541對應的分子標記的序列 分別為：
[0045] (l)TCR540(148bp)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示，為：

[0047] (2)TCR541(252bp)的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，為：
[0049] 根據(jù)上述序列分別設計并合成了針對TCR540的一對引物F TCR540/R TCR540,以 及針對TCR541的一對引物F TCR541/R TCR541，具體序列如下：
[0050] (1)TCR540的引物：
[0053] (2)TCR541 的引物：
[0056] 2、分子標記的鑒定
[0057] 為了驗證這些分子標記的可靠性，首先，利用CRb兩翼連鎖標記TCR79和TCR74見 (Zhang等，F(xiàn)ine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa·，Mol Breeding，34:1173-1183)篩 選1142株F2代感病個體中的重組體；然后，利用TCR540的引物（F TCR540/R TCR540)和 TCR541的引物(F TCR541/R TCR541)分別對含抗根腫病基因 CRb的大白菜'CR BJN3-2'和易 感根腫病的大白菜自交系'BJN3-2 '及其44fF2代感病重組體進行了PCR擴增。擴增結果表 明如圖1所示，圖1A為TCR540在抗病材料' CRBJN3-2 '（R泳道）、感病材料' BJN3-2 '（S泳道）以 及重組體（1-44號泳道）中的擴增結果，使用TCR540的引物進行擴增，在抗病親本'CRBJN3-2 '上能擴增出一條148bp的條帶，在感病親本' BJN3-2 '和44株?2代感病重組體上均能擴增 出一條大于148bp的條帶；圖1B為TCR541在抗病材料' CR BJN3-2 '（R泳道）、感病材料' BJN3-2'（S泳道）以及重組體(1-44號泳道)中的擴增結果，使用TCR541的引物進行擴增，在抗病親 本' CRBJN3-2 '上能擴增出一條252bp的條帶，在感病親本' BJN3-2 '和44株?2代感病重組體 上均能擴增出一條大于252bp的條帶。
[0058] 3、遺傳圖譜的構建
[0059] 根據(jù)F2群體的篩選鑒定結果，計算各標記與CRb基因間的重組率，Mapchart2.1繪 制CRb基因的遺傳連鎖圖譜（圖2)，圖右側標記之間的數(shù)字表示標記間的重組體數(shù)，圖左側 的數(shù)字表示兩標記之間的遺傳距離，由圖可知!'0?79、1'0?108、1'0?30、1'0?37、1'0?74，分別定 位于距離CRb基因0.03cM、0.04cM、0.36cM、0.43cM、0.49cM處。而新開發(fā)的分子標記TCR540、 TCR541與CRb基因存在共分離關系。因此，確定這2個標記可以運用到今后大白菜抗根腫病 CRb基因的分子標記輔助選育過程當中，并且由于這2個分子標記為共分離標記，與之前的 連鎖標記相比，在分子標記輔助育種的應用中能夠消除連鎖累贅現(xiàn)象，大大提高轉育效率。
[0060] 三、大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541和TCR540在輔助選擇大白 菜抗根腫病植株中的應用方法，具體包括：
[0061 ] 1、用CTAB方法提取待測材料的基因組DNA
[0062] 用CTAB方法提取待測大白菜材料的基因組DNA，具體步驟參照上文中"一、大白菜 抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541和TCR540的獲得"中"2、CTAB法提取DNA"部分記 載的內容。
[0063] 2、PCR 擴增
[0064] a.反應體系：10yL體系，各組分物質的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · L-1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20補齊 10yL，混勻，離 心，
[0065]其中，TCR540使用的引物的序列為：
[0066] F TCR540:5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3 '，
[0067] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '，
[0068] TCR541使用的引物的序列為：
[0069] F TCR541:5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 '，
[0070] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '；
[0071] 匕擴增程序：94°(：預變性51^11;94°(：變性3〇8;60°(：退火458 ;72°(：延伸3〇8;35個循 環(huán)后;72°C延伸lOmin;最后4°C保存。
[0072] 3、電泳：
[0073] TCR540:將擴增產物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測序 電泳儀上進行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳1.5小時，電泳結束后，進行銀 染；
[0074] TCR541:將擴增產物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測序 電泳儀上進行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳2小時，電泳結束后，進行銀染。
[0075] 需要說明的是，上樣緩沖液采用聚丙烯酰胺凝膠電泳常用的緩沖液，其中包含 98%(w/v)的formamide，10mM的EDTA，0·001 %(w/v)的xylene cyanol和0·001 %(w/v)的 bromphenol blue。
[0076] 4、結果分析
[0077] ①在使用TCR540的引物的擴增結果中如果能夠檢測到148bp和大于148bp兩條帶， 則待測材料中含有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
[0078]②在使用TCR541的引物的擴增結果中如果能夠檢測到252bp和大于252bp兩條帶， 則待測材料中含有大白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
[0079] 如果①、②2項中的擴增結果均可獲得，則待測材料具有大白菜抗根腫病基因 CRb 的概率為100 %。
[0080] 盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創(chuàng)造 性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優(yōu) 選實施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。
[0081] 顯然，本領域的技術人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精 神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權利要求及其等同技術的范圍 之內，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內。
【主權項】
1. 一種大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541，其特征在于，所述大白菜抗 根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541的核苷酸序列為： 5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAAAAATCTACCTGGAAGCATCAAGAAACTTCATCATCTCAAATCTCTTT ACTTGCATTGTCAACAGCTCGTTTCTCTTCCACTGCTTCCATCAAATCTGCAGTATCTGGATGCTCATGGCTGTATC TCACTCGAAACAGTGGCTAAACCCATGACGCTTCTTGTGGTAGCTGAAAGGAACCAGTCTACTTTCGTCTTCACTGA TTGTTTCAAGCTAAACAGAGATGCGCAA-3'〇2. -種權利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541的PCR特異 性擴增引物，包括： F TCR541:5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 ' R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '。3. 根據(jù)權利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541，在分子標 記輔助選擇中的應用。4. 根據(jù)權利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541，在大白菜 抗根腫病分子標記輔助選擇中的應用。5. -種權利要求1所述的大白菜抗根腫病CRb基因的共分離分子標記TCR541的應用方 法，具體包括： (1) 用CTAB方法提取待測材料的基因組DNA (2) PCR擴增 a. 反應體系：10yL體系，各組分物質的含量分別為15ng模板DNA;5pmol · I/1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20補齊 10yL，混勻，離 心， 其中引物的序列為F TCR541:5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3'，R TCR541:5'_ TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3'； b. 擴增程序：94°C預變性5min; 94°C變性30s; 60°C退火45s; 72°C延伸30s; 35個循環(huán)后； 72°(：延伸1〇11^11;最后4°(：保存； c .電泳:將擴增產物與等體積的上樣緩沖液混合，94°C變性6min，之后在DNA測序電泳 儀上進行6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，70W條件下電泳2小時，電泳結束后，進行銀染，并觀 察擴增結果； d.判斷:擴增結果中如果能夠檢測到252bp和大于252bp兩條帶，則待測材料中含有大 白菜抗根腫病基因 CRb的概率為100 %。
【文檔編號】C12N15/11GK105969881SQ201610457997
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月22日
【發(fā)明人】樸鐘云, 張騰, 龐文星, 李曉楠, 樸英蘭, 張椿雨
【申請人】沈陽農業(yè)大學