氨基酸衍生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了可用于生物偶聯(lián)過(guò)程中的式(X)、(I)、(II)、(V)、(VI)、(VII)和(VIII)的吡咯賴氨酸類似物，其中a、b、d、X、Y、Z、FG、R、R1、R2和R3是如權(quán)利要求書中所定義的；以及含有這些吡咯賴氨酸類似物的突變體蛋白。
【專利說(shuō)明】氨基酸衍生物
[0001] 本發(fā)明涉及用于生物偶聯(lián)過(guò)程中的氨基酸衍生物。
[0002] 盟直
[0003] 吡咯賴氨酸是由琥珀密碼子可靠地指定的唯一一種天然氨基酸。其使用天然進(jìn)化 成正交于所有其他氨基酸和tRNA的第21個(gè)氨基?；?tRNA合成酶(PylRS)。布萊特(Blight) 等人，2004顯示在大腸桿菌(E. coli)中，Py 1RS和其對(duì)應(yīng)部分tRNA(tRNApy 1)可在琥珀密碼 子處納入吡咯賴氨酸。其還表明wt PylRS是天然混雜的且可納入賴氨酸的類似物。
[0004] 橫山（Yokoyama)等人(EP 1911840)展示，PylRS/tRNApyl系統(tǒng)在真核細(xì)胞中是正 交的，且顯示在細(xì)菌細(xì)胞中將若干非天然氨基酸(nnAA)納入由琥珀密碼子編碼的靶蛋白 中。這些作者還鑒定了pylRS中形成氨基酸結(jié)合口袋且起到相對(duì)于其他典型氨基酸選擇吡 咯賴氨酸的作用的關(guān)鍵氨基酸殘基。此位點(diǎn)處的突變生成能夠識(shí)別tRNApyl且用AzZ-lys將 tRNApyl氨基?；耐蛔凅w(柳澤(Yanagisawa)，2008)。
[0005] 這種正交性延伸到細(xì)菌和真核細(xì)胞。
[0006] PylRS是天然混雜的合成酶，其已經(jīng)天然進(jìn)化以排除賴氨酸，但將在不突變的情況 下納入賴氨酸類似物，包括疊氮化物、炔烴和烯烴(柳澤等人，2008;諾伊曼(Neumann)等人， 2008;向井(Mukai)等人，2008;阮（Nguyen)等人，2009)。這種特異性的基礎(chǔ)取決于在pylRS 結(jié)合口袋的氨基酸殘基之間的疏水性相互作用，其中吡咯賴氨酸的吡咯環(huán)使該氨基酸穩(wěn)定 并且將該氨基酸正確地定位在該合成酶的活性位點(diǎn)中（卡佛蘭(Kavran)等人，2007)。此RS/ tRNA對(duì)已通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染引入細(xì)菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，且已顯示可有效地將多種非天 然氨基酸納入靶蛋白中。
[0007] 例如，EP 1911840展示在大腸桿菌細(xì)胞中將Ν-ε-boc-賴氨酸納入靶蛋白中。
[0008] 在過(guò)去幾年中，例如費(fèi)克納(Fekner)等人(費(fèi)克納、李(Li)和成(Chan)，2010)和劉 (Liu)等人已揭示并綜述吡咯賴氨酸類似物，其定義為由天然或以遺傳方式進(jìn)化的PylRS識(shí) 別且在琥珀密碼子位點(diǎn)處納入蛋白質(zhì)中的氨基酸衍生物。具有官能團(tuán)或翻譯后修飾的類似 物已使用pylRS-tRNApyl系統(tǒng)以位點(diǎn)特異性方式納入蛋白質(zhì)中。若干研究(參見(jiàn)例如柳澤等 人)關(guān)注PylRS酶內(nèi)的突變以適應(yīng)其中N6取代基為結(jié)合口袋吡咯賴氨酸內(nèi)的芳香族環(huán)的類 似物。其他研究（例如阮等人(也在W0 2010/139948中）和李等人(也在W0 2011/044255中）） 關(guān)注不攜載龐大N6取代基的吡咯賴氨酸類似物的鑒定，其中結(jié)果是獲得將易于合成且與天 然pylRS/tRNApyl對(duì)相互作用的較簡(jiǎn)單類似物。此外，秦(Chin)等人研發(fā)出兩種具有末端炔 和疊氮化物基團(tuán)的類似物，其適用于通過(guò)銅催化的點(diǎn)擊化學(xué)(CUAAC)進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記。
[0009] 業(yè)內(nèi)仍需要研發(fā)出其他吡咯賴氨酸類似物。盡管迄今為止所制得的吡咯賴氨酸類 似物限于從賴氨酸骨架演變來(lái)的那些，但本
【發(fā)明人】已成功地自多種氨基酸結(jié)構(gòu)開(kāi)始利用天 然pylRS/tRNApyl對(duì)生成納入蛋白質(zhì)中的吡咯賴氨酸類似物

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0010] 本發(fā)明提供如本文所述式I至VIII的吡咯賴氨酸類似物。
[0011] 本發(fā)明還提供含有作為非天然氨基酸的一種或多種(例如一種)如本文所述式I至 VIII的吡咯賴氨酸類似物的突變體蛋白。
[0012] 本發(fā)明還提供如前所述的突變體蛋白，其通過(guò)一種或多種(例如一種)非天然氨基 酸偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)(例如一個(gè))選自蛋白質(zhì)、細(xì)胞毒性劑、藥物和聚合物的部分。
[0013] 本發(fā)明還提供使用如前所述的吡咯賴氨酸類似物制造含有一種或多種非天然氨 基酸的突變體蛋白。
[0014] 本發(fā)明所述的氨基酸類似物是新穎且有用的，且其在容易納入蛋白質(zhì)（在適當(dāng)使 用時(shí)通常不損失生物活性）中并提供有用的生物偶聯(lián)方式方面具有直接制備的優(yōu)勢(shì)。
[0015] 圖式簡(jiǎn)單說(shuō)明
[0016] 圖1:含有疊氮化物的單克隆抗體的聚乙二醇化。泳道1:含有納入重鏈中且經(jīng)受聚 乙二醇化條件的式IA.1類似物的抗體;泳道2:含有納入重鏈中且經(jīng)受聚乙二醇化條件的式 III. 1類似物的抗體。
[0017] 序列表簡(jiǎn)單說(shuō)明
[0018] SEQ ID No 1 :PylRS馬氏甲燒八疊球菌(Methanosarcina mazei)WT核昔酸序列
[0019] SEQ ID No 2:PylRS馬氏甲烷八疊球菌WT氨基酸序列
[0020] SEQ ID No 3:PylRS馬氏甲烷八疊球菌Y384F突變體核苷酸序列 [0021] SEQ ID No 4:PylRS馬氏甲烷八疊球菌Y384F突變體氨基酸序列
[0022] SEQ ID No 5:tRNApyl馬氏甲烷八疊球菌Gol
[0023] SEQ ID No 6:U6snRNA啟動(dòng)子
[0024] SEQ ID No 7:U6-tRNApyl構(gòu)建體
[0025] SEQ ID No 8:GFP核苷酸序列
[0026] SEQ ID No 9:GFP氨基酸序列
[0027] SEQ ID No 10:GFPY40核苷酸序列
[0028] SEQ ID No 11:GFPY40氨基酸序列
[0029] SEQ ID No 12:抗Her2(4D5) γ 核苷酸序列
[0030] SEQ ID No 13:抗Her2(4D5) γ 氨基酸序列
[0031] SEQ ID No 14:抗Her2(4D5) γ_Κ274琥珀核苷酸序列
[0032] SEQ ID No 15:抗Her2(4D5) γ_Κ274琥珀氨基酸序列
[0033] SEQ ID No 16:抗Her2(4D5)K核苷酸序列
[0034] SEQ ID No 17:抗Her2(4D5)K氨基酸序列
[0035] 實(shí)施方式
[0036] 定義
[0037]術(shù)語(yǔ)"酰胺"是指_C( = 0)-ΝΗ-鍵。
[0038] 術(shù)語(yǔ)"氨基甲酸酯"是指-0_C(=0)-NH-鍵。
[0039] 術(shù)語(yǔ)"酯"是指-C-C ( = 0) -0-C 鍵。
[0040] 術(shù)語(yǔ)"烷基"是指通常含有1至6個(gè)、例如1至4個(gè)碳原子且可為直鏈或具支鏈的脂肪 族鍵或取代基。實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基和叔丁基。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"烷氧基"是指基團(tuán)-0-烷基。
[0042] 術(shù)語(yǔ)"烯基"、"烯烴"或"烯烴"是指通常含有2至6個(gè)、例如2至4個(gè)碳原子且可為直 鏈或具支鏈并因含有至少一個(gè)C = C部分而為不飽和的脂肪族鍵或取代基。實(shí)例包括乙烯 基、丙烯-1-基、丙烯-2-基和2-甲基-丙烯-2-基。烯基可任選地經(jīng)例如一個(gè)或多個(gè)(例如1 個(gè))諸如鹵素(例如C1)或醚基(例如-0-&-6烷基)等取代基取代，但適宜地其不經(jīng)取代。
[0043] 術(shù)語(yǔ)"炔基"或"炔經(jīng)"是指通常含有2至6個(gè)、例如2至4個(gè)碳原子且可為直鏈或具支 鏈并因含有至少一個(gè)C=C部分而為不飽和的脂肪族鍵或取代基。實(shí)例包括-C=CH和-c=c-CH 3。炔基可任選地經(jīng)例如一個(gè)或多個(gè)(例如1個(gè))諸如鹵素(例如Cl)或醚基(例如-O-Ci-6烷 基)等取代基取代，但適宜地其不經(jīng)取代。
[0044] 術(shù)語(yǔ)"環(huán)烷基"是指通常含有3至8個(gè)環(huán)碳原子的脂環(huán)族不飽和化合物。環(huán)烷基可含 有支鏈。碳原子總數(shù)通常將為3至10。實(shí)例性基團(tuán)包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、3-甲基-環(huán)丙 基和環(huán)己基。
[0045] 術(shù)語(yǔ)"環(huán)烯基"是指通常含有5至8個(gè)環(huán)碳原子且含有至少一個(gè)C = C部分的脂環(huán)族 化合物。環(huán)烯基可含有支鏈。
[0046] 碳原子總數(shù)通常將為5至10。實(shí)例性基團(tuán)包括環(huán)戊烯基、3-甲基-環(huán)丙烯基和環(huán)己 烯基。
[0047]術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)基"是指其中環(huán)含有一個(gè)或多個(gè)(例如一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)，例如一個(gè)或兩 個(gè)，尤其一個(gè))選自〇、N和S的雜原子的環(huán)烷基或環(huán)烯基部分。實(shí)例包括氮雜環(huán)丁烷、吡咯烷、 哌啶、哌嗪、N-甲基哌嗪、嗎啉和硫嗎啉。
[0048]術(shù)語(yǔ)"芳基""是指可為鍵的一部分或取代基的一部分的芳香族環(huán)結(jié)構(gòu)。芳基部分 可含有一個(gè)環(huán)(例如苯基)或兩個(gè)環(huán)(例如萘基）。芳基可經(jīng)例如一個(gè)或多個(gè)(例如一個(gè)或兩 個(gè)，例如一個(gè))選自以下的取代基取代:烷基、烯基、炔基、氣烷基、鹵素、烷氧基、硝基和氛 基。實(shí)例性芳基是苯基。
[0049]術(shù)語(yǔ)"雜芳基"是指可為鍵的一部分或取代基的一部分的雜芳香族環(huán)結(jié)構(gòu)。雜芳香 族環(huán)可含有1至4個(gè)(更通常1至3個(gè)，例如一個(gè)或兩個(gè))選自0、N和S的雜原子。雜芳基部分可 含有一個(gè)環(huán)或兩個(gè)環(huán)。含有一個(gè)6元環(huán)的實(shí)例基團(tuán)包括吡啶和嘧啶。含有一個(gè)5元環(huán)的實(shí)例 基團(tuán)包括吡咯、呋喃、噻吩、噁唑、噻唑、二唑、噻二唑和四唑。含有兩個(gè)環(huán)的雜芳基部分可在 一個(gè)或兩個(gè)環(huán)中含有雜原子。實(shí)例包括喹啉和異喹啉。雜芳基可經(jīng)例如一個(gè)或多個(gè)(例如一 個(gè)或兩個(gè)，例如一個(gè))選自以下的取代基取代:烷基、烯基、炔基、氟烷基、鹵素、烷氧基、硝基 和氰基。
[0050] 術(shù)語(yǔ)"芳香族鹵化物"是指經(jīng)至少一個(gè)(例如一個(gè))諸如氟、氯、溴或碘等鹵基取代 的芳香族環(huán)(通常苯基）。所述芳香族環(huán)可含有其他取代基，例如針對(duì)芳基所提到的那些。
[0051] 術(shù)語(yǔ)"疊氮化物"和"疊氮基"是指N=N( + )=N(_)官能團(tuán)。
[0052]術(shù)語(yǔ)"環(huán)炔經(jīng)"是指包括環(huán)結(jié)構(gòu)中所捕獲的碳-碳三鍵的碳原子的環(huán)狀排列(通常6 至9元，尤其8至9元）。實(shí)例包括環(huán)辛炔和環(huán)壬炔。另一實(shí)例是苯炔。環(huán)炔烴基團(tuán)可含有支鏈。 碳原子總數(shù)通常將為6至12,例如6至10。
[0053] 術(shù)語(yǔ)"酮"是指C-C(=0)-C鍵。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"吡咯賴氨酸類似物"意指由天然或以遺傳方式進(jìn)化的PylRS識(shí)別且在琥珀密 碼子位點(diǎn)處納入蛋白質(zhì)中的氨基酸衍生物。
[0055]表述"20種天然氨基酸中的一者的側(cè)鏈"是指與通過(guò)其單一字母代碼A、C、D、E、F、 G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W和Y已知的20種天然氨基酸相關(guān)的式H00C-CHR-NH2中的基 團(tuán)R。預(yù)期L或D立體化學(xué)(或其混合物），但L立體化學(xué)是優(yōu)選的。
[0056] 本發(fā)明揭示吡咯賴氨酸類似物。
[0057] 本發(fā)明的一些吡咯賴氨酸類似物具有式I的結(jié)構(gòu)：
[0059] 其中
[0060] Z =鍵、CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0、S或CH-NH2;
[0061 ] a是整數(shù)3至7;
[0062] b是0或整數(shù)1至7;且
[0063] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴。
[0064]已知某些式（I)化合物。
[0065] 因此，式（I)化合物（其中a表示4，Z表示0且_(CH2) b-FG表示-〇12_(^〇1、-〇12012-N3、-CH 2-CH=CH2和-CH2-Ph)揭示于TO 2012/032181中。其他式（I)化合物(其中a表示4，Z表 示0且-(CH2) b-FG表示-CH2CH2CH2-C (= 0) CH3和-CH2CH2CH2-CH=CH2)揭示于W0 2010/139948 中。
[0066] 式（I)化合物(其中a表示4，Z表示鍵，b表示0且-(CH2)b-FG表示-C(=0)Bn和-C( = 0)Me)揭示于W0 2012/032181中。此外，式（I)化合物(其中a表示4，Z表示鍵且-(CH2)b_FG表 示-CH 2CH2-CeCH)揭示于TO 2010/139948中。
[0067]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，式I化合物具有a = 4，從而產(chǎn)生通式IA化合物：
[0069]在本發(fā)明的一個(gè)替代性實(shí)施例中，a = 3,從而產(chǎn)生通式IB化合物：
[0071] 在式I、IA和IB的一個(gè)實(shí)施例中，Z是鍵，例如，Z是鍵，b是0且FG是C( =0)-芳基或C (=0)-烷基。
[0072]在式 I、IA和 IB 的一個(gè)實(shí)施例中，Z是CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0、S或CH-NH2。例如，Z可 表示〇。替代地，Z可表示NH。替代地，Z可表示CH2、CH-NH2、CH-OH、S或CH-NH2。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施例中，b是1至4。
[0074]在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是疊氮化物。
[0075]在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是炔烴(例如乙炔基)或環(huán)炔烴。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是烯烴，例如乙烯基。
[0077] 在式I、IA和IB中，當(dāng)FG表示芳基時(shí)，一個(gè)實(shí)例是芳香族削七物，例如4-?苯基，例 如4-碘苯基。
[0078]實(shí)例性式IA化合物是以下各項(xiàng)：
[0079] (2S)-2_氨基-6-{[(2_疊氮基乙氧基)羰基]氨基}己酸
[00811 (2S)-2_氨基_6-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}己酸
[0083] (2S)-2_氨基_6-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}己酸
[0085] (2S)-2_氨基-6-{[(2_疊氮基乙基)氨甲?；鵠氨基}己酸
[0087] (2S) -2-氨基-6- {[(丙-2-烯-1 -基)氨甲?；鵠氨基}己酸
[0089] (2S)-2_氨基-6-{[(3_疊氮基丙氧基)羰基]氨基}己酸
[0091 ] (2S) -2-氨基-6-[ (2S) -2-氨基-4-疊氮基丁酰胺基]己酸
[0093] (2S)-2-氨基-6-({[ (4-碘苯基）甲氧基]羰基}氨基)己酸
[0095] (2S) -2-氨基-6-( 4-疊氮基丁酰胺基）己酸
[0097]以下化合物是式IB化合物的實(shí)例：
[0098] (2S)-2_氨基-5-{[(2_疊氮基乙氧基)羰基]氨基}戊酸
[0100] (2S)-2_氨基_5-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}戊酸
[0102] (2S)_2_氨基_5_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}戊酸
[0104]本發(fā)明的替代性吡咯賴氨酸類似物具有式II的結(jié)構(gòu)：
[0106] 其中
[0107] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0108] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0109] a =整數(shù)3或5至7;且 [0110] b =整數(shù) 1 至4。
[0111] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是疊氮化物。在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是炔烴，例如乙炔基或環(huán)炔 烴。在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是烯烴，例如乙烯基。在一個(gè)實(shí)施例中，Z表示NH。在一個(gè)實(shí)施例中，b 表示1或2。在一個(gè)實(shí)施例中，Z (CH2) bFG表示NH (CH2) 2N3或NHCH2C ^ CH。
[0112] 在式II中，當(dāng)FG表示芳基時(shí)，一個(gè)實(shí)例是芳香族削七物，例如4-?苯基，例如4-碘 苯基。
[0113] 部分Z(CH2)bFG可表示例如C0-芳基，例如C0-苯基或-C0烷基，例如-COMe。
[0114] 本發(fā)明的其他吡咯賴氨酸類似物具有式III的結(jié)構(gòu)：
[0116] 其中
[0117] Y = CH2、NH、0或 S;
[0118] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0119] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0120] a =整數(shù) 1 至7;
[0121 ] b =整數(shù)1至7，只是當(dāng)Z是ΝΗ、0或S時(shí)，則b是整數(shù)2至7;
[0122] 條件是a+b介于2至8范圍內(nèi)；
[0123] 且
[0124] d =整數(shù) 1 至4。
[0125] 在一個(gè)實(shí)施例中，a+b介于3至6范圍內(nèi)，例如3至4。
[0126] 在一個(gè)實(shí)施例中，a是1。
[0127] 在一個(gè)實(shí)施例中，b是2。在另一實(shí)施例中，b是3。
[0128] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是疊氮化物。
[0129] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是炔烴(例如乙炔基)或環(huán)炔烴。
[0130] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是烯烴，例如乙烯基。
[0131] 在式III中，當(dāng)FG表示芳基時(shí)，一個(gè)實(shí)例是芳香族鹵化物，例如4-?苯基，例如4-碘 苯基。
[0132] 實(shí)例性式III化合物是：
[0133] (2S)-2_氨基-3-[(2-{[(2_疊氮基乙氧基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0135] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_塊-1-基氧基)幾基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0137] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙-2-稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0139] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{ [ (2-疊氮基乙基)氨甲酰基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0141 ] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_塊-1-基)氨甲?；鵠氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0143] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_稀-1-基)氨甲?；鵠氨基}乙基)硫烷基]丙酸
[0145] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{ [ (2-疊氮基乙基)氨甲?；鵠氧基}乙基)硫烷基]丙酸
[0147] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_塊-1-基)氨甲?；鵠氧基}乙基)硫烷基]丙酸
[0149] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_稀-1-基)氨甲酰基]氧基}乙基)硫烷基]丙酸
[0151] (2S)-2_氨基-3-({3_[(2-疊氮基乙基)氨甲?；鵠丙基}硫烷基)丙酸
[0153] (2S)_2_氨基_3_( {3-[(丙_2_塊-1-基)氨甲?；鵠丙基}硫烷基)丙酸
[0155] (2S)_2_氨基_3_( {3-[(丙_2_稀-1-基)氨甲?；鵠丙基}硫烷基)丙酸
[0157] (2S)-2_氨基-3-({3-[(2_疊氮基乙基)氨甲?；鵠丙基}硫烷基)丙酸
[0159]其他吡咯賴氨酸類似物具有式IV的結(jié)構(gòu)：
[0161] 其中
[0162] Y = CH2、NH、0或 S;
[0163] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0164] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0165] a =整數(shù) 1 至7;
[0166] b =整數(shù)1至7，只是當(dāng)Z是ΝΗ、0或S時(shí)，則b是整數(shù)2至7;
[0167] 條件是a+b介于2至8范圍內(nèi)；
[0168] 且d =整數(shù)1至4。
[0169] 在一個(gè)實(shí)施例中，a+b介于3至6范圍內(nèi)，例如3至4。
[0170] 在一個(gè)實(shí)施例中，a是1。
[0171] 在一個(gè)實(shí)施例中，b是2。在另一實(shí)施例中，b是3。
[0172] 在一個(gè)實(shí)施例中，Y是NH且Z是0。在一個(gè)實(shí)施例中，Y是NH且Z是NH。
[0173] 在一個(gè)實(shí)施例中，Y是0且Z是0。在一個(gè)實(shí)施例中，Y是CH2且Z是NH。
[0174] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是疊氮化物。
[0175] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是炔烴(例如乙炔基)或環(huán)炔烴。
[0176] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是烯烴，例如乙烯基。
[0177] 在式IV中，當(dāng)FG表示芳基時(shí)，一個(gè)實(shí)例是芳香族削七物，例如4-?苯基，例如4-碘 苯基。
[0178] 更通常來(lái)說(shuō)，式III和IV化合物稱為式X化合物：
[0180] 其中X表示0或S，且所有其他變量如針對(duì)式III或IV化合物所定義。
[0181] 實(shí)例性化式IV合物如下：
[0182] (2S)_2_氨基_3_(2_{ [ (2_疊氮基乙氧基)幾基]氨基}乙氧基)丙酸
[0184] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_塊-1-基氧基)幾基]氨基}乙氧基)丙酸
[0186] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙氧基)丙酸
[0188] (2S)-2_氨基-3-(2-{[(2_疊氮基乙基)氨甲?；鵠氨基}乙氧基)丙酸
[0190] (2S)-2-氨基-3-(2-{[(丙-2-炔-1-基)氨甲?；鵠氨基}乙氧基)丙酸
[0192] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_稀-1-基)氨甲酰基]氨基}乙氧基)丙酸
[0194] (2S)-2_氨基-3-(2-{[(2_疊氮基乙基)氨甲?；鵠氧基}乙氧基)丙酸
[0196] (2S)-2_氨基_3-(2-{[(丙-2-炔-1-基)氨甲?；鵠氧基}乙氧基)丙酸
[0198] (2S)-2_氨基_3-(2-{[(丙-2-烯-1-基)氨甲?；鵠氧基}乙氧基)丙酸
[0200] (2S)-2-氨基-3-{3-[(2-疊氮基乙基)氨甲?；鵠丙氧基}丙酸
[0202] (2S)-2-氨基-3-{3-[(丙-2-炔-1-基)氨甲?；鵠丙氧基}丙酸
[0204] (2S)-2-氨基-3-{3-[(丙-2-烯-卜基)氨甲?；鵠丙氧基}丙酸
[0206]其他吡咯賴氨酸類似物具有式V的結(jié)構(gòu)：
[0208] 其中
[0209] R = 20種天然氨基酸中的一者的側(cè)鏈；
[0210] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0211] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0212] a = l;且
[0213] b =整數(shù) 1 至4。
[0214] 在一個(gè)實(shí)施例中，Z是0。
[0215] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是疊氮化物。
[0216] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是炔烴(例如乙炔基)或環(huán)炔烴。
[0217] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是稀烴，例如乙烯基。
[0218] 在式V中，當(dāng)FG表示芳基時(shí)，一個(gè)實(shí)例是芳香族鹵化物，例如4-鹵苯基，例如4-碘苯 基。
[0219] 實(shí)例性式V化合物如下：
[0220] (2S)_2_氨基_3_(2_{ [ (2_疊氮基乙氧基)幾基]氨基}乙酰胺基)丙酸
[0222] (2S)_2_氨基_3-(2-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)丙酸
[0224] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙酰胺基)丙酸
[0226]其他吡咯賴氨酸類似物具有式VI的結(jié)構(gòu)：
[0228] 其中
[0229] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0和 S;
[0230] FG =疊氮化物、稀烴、炔經(jīng)、酮、酯、芳基和環(huán)炔烴；
[0231] a = 4 或 5;且
[0232] b =整數(shù) 1 至 4;
[0233] 在一個(gè)實(shí)施例中，Z是NH。
[0234] 在一個(gè)實(shí)施例中，a是5。
[0235] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是疊氮化物。
[0236] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是炔烴(例如乙炔基)或環(huán)炔烴。
[0237] 在一個(gè)實(shí)施例中，F(xiàn)G是烯烴，例如乙烯基。
[0238] 在式VI中，當(dāng)FG表示芳基時(shí)，一個(gè)實(shí)例是芳香族削七物，例如4-?苯基，例如4-碘 苯基。
[0239] 以下是實(shí)例性式VI化合物：
[0240] (2S)-2_氨基-7-[(2_疊氮基乙基)氨甲酰基]庚酸
[0242 ] (2S) -2-氨基-7-[(丙-2-炔-!-基)氨甲?；鵠庚酸
[0244] (2S)-2_氨基-7-[(丙-2-烯-1-基)氨甲?；鵠庚酸
[0246]替代性吡咯賴氨酸類似物具有式VII的結(jié)構(gòu)
[0248] 其中
[0249] R =烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；
[0250] a =整數(shù)1至7;且
[0251] b =整數(shù) 1 至3。
[0252] 在一些優(yōu)選實(shí)施例中，a = 4。
[0253] 優(yōu)選的式VII化合物是(2S)-2_氨基-6-(2-疊氮基戊酰胺基)己酸
[0255]替代性吡咯賴氨酸類似物具有式(VIII)的結(jié)構(gòu)
[0257] 其中
[0258] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0259] = H、烷基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；
[0260] R2 =烷基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；
[0261] R3 = H、烷基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基;且
[0262] a = 1 〇
[0263] 適宜地表示Η或烷基，例如Η或甲基，尤其Η。
[0264] 適宜地R3表示Η或烷基，例如Η或甲基，尤其Η。
[0265] 適宜地Ζ表示0。
[0266] R2可表示例如C3-4烯基(例如CH2CH=CH2)或&-4烷基(例如正丙基或叔丁基）。
[0267] 實(shí)例性式VIII化合物如下：
[0268] (2S)-2-氨基-3-(4-疊氮基-2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基} 丁酰胺基)丙酸
[0270] (2S)_2_氨基-3-{4_疊氮基_2_[(丙氧基羰基)氨基]丁酰胺基}丙酸
[0272] (2S)-2_氨基-3-{4-疊氮基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰胺基}丙酸
[0274] 在式I至VI和X的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)FG表示烯烴時(shí)，其適宜地表示_CH=CH2或-CH=CH_CH 3， 優(yōu)選地-01=012。-(012)廣卩6 和-(CH2)d-FG 的實(shí)例是-CH2-CH=CH2 和-CH2-CH2-CH=CH2。
[0275] 在式I至VI和X的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)FG表示炔烴時(shí)，其適宜地表示_C = CH或-C = C_CH3,優(yōu) 選地-C Ξ CH。- (CH2) b-FG和-(CH2) d-FG 的一個(gè)實(shí)例是-CH2-C Ξ CH 〇
[0276] 在式I至VI和X的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)FG表示酮時(shí)，其適宜地表示_C( =0)-CH3或_C( =0)-CH2-CH3，優(yōu)選地 _C (= 0) -CH3。
[0277] 在式I至VI和X的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)FG表示酯時(shí)，其適宜地表示_C( =0)-0烷基，例如_C( = 〇)-〇甲基。
[0278] 在式I至VI和X的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)FG表示芳基時(shí)，其適宜地表示經(jīng)鹵素、尤其碘取代的苯 基(例如4-碘-苯基）。
[0279] 在式I至VI和X的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)FG表示環(huán)炔烴時(shí)，其適宜地表示環(huán)辛炔，例如環(huán)辛-4， 5_炔。
[0280] 在式I至VI和X的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)FG表示疊氮化物時(shí)，-(CH2)b-FG或-(CH 2)d_FG的一個(gè)實(shí) 例是_(CH2)2_N3。
[0281] 在式VII和VIII的結(jié)構(gòu)中，當(dāng)R、R\R2和R3表示芳基時(shí)，其適宜地表示苯基。
[0282] 本文所揭示的吡咯賴氨酸類似物可使用多種方法來(lái)制備。反應(yīng)條件通?？捎伤鶎?領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)決定。
[0283] 式I類似物容易地通過(guò)以下方式來(lái)制備:將活化羰基(例如氯甲酸酯、活化羧酸酯、 異氰酸酯、活化碳酸酯或磺酰鹵）添加至類型1的單保護(hù)二氨基底物中，其中α-氨基被保護(hù) 基團(tuán)（"PG"）（例如8〇〇、0?、了?4、乙?；?111〇(3基團(tuán)）保護(hù)(參見(jiàn)方案1)。偶合產(chǎn)物3可經(jīng)歷其 他修飾，例如用疊氮基親核試劑置換鹵化物以布置所需官能性。另外，對(duì)中間體3脫保護(hù)以 去除α_氨基酸遮蔽基團(tuán)以獲得所需式1類似物。
[0284]方案 1:
[0286]式VII類似物容易地通過(guò)以下方式來(lái)制備:首先制備所需α_疊氮基前體。實(shí)現(xiàn)此的 一個(gè)策略是用疊氮化鈉置換離去基團(tuán)（LG)(例如鹵離子(Cl、Br或I)或烷基磺酸根（甲苯磺 酸根、甲磺酸根、三氟甲磺酸根））以獲得α-疊氮基酸6。然后可通過(guò)用諸如HBTU、DCC和NHS或 CDI等基團(tuán)活化羧酸將此偶合至類型7的單保護(hù)二氨基底物。通過(guò)去除遮蔽α-氨基的保護(hù)基 團(tuán)獲得產(chǎn)物8。保護(hù)基團(tuán)可依照方案1來(lái)使用。參見(jiàn)方案2:
[0288]式II類似物是通過(guò)以下方式來(lái)制備:用活化羰基(例如羧酸酯、異氰酸酯、酰氯、活 化碳酸酯或磺酰鹵10)將羥基氨基酸9偶聯(lián)至底物。偶合產(chǎn)物11可經(jīng)歷其他修飾，例如通過(guò) 置換離去基團(tuán)（例如鹵離子或活化醇)布置疊氮化物官能團(tuán)。通過(guò)最終脫保護(hù)去除氨基酸 遮蔽基團(tuán)來(lái)獲得所需氨基酸類似物12。保護(hù)基團(tuán)可依照方案1來(lái)使用。參見(jiàn)方案3:
[0290] 含有硫醚鍵的式III類似物容易地通過(guò)關(guān)鍵S-烷基化步驟來(lái)制備。用所需官能化 烷基化劑14處理硫代氨基酸(例如半胱氨酸13)以影響S-烷基化。然后進(jìn)行額外官能化以將 氨基酸固定在其最終形式(例如，布置疊氮化物基團(tuán)）。視需要最終脫保護(hù)顯露所需氨基酸 16。保護(hù)基團(tuán)可依照方案1來(lái)使用。
[0291] 參見(jiàn)方案4:
[0293]式IV類似物可以與半胱氨酸類似物類似的方式制備，其中醚鍵是通過(guò)羥基烷基化 來(lái)制備。用烷基化劑18處理經(jīng)保護(hù)的羥基氨基酸(例如絲氨酸17)以影響0-烷基化。然后進(jìn) 行額外官能化以將氨基酸固定在其最終形式(例如，布置疊氮化物基團(tuán)）。視需要最終脫保 護(hù)顯露所需氨基酸20。保護(hù)基團(tuán)可依照方案1來(lái)使用。參見(jiàn)方案5:
[0295]式V類似物是以直接方式通過(guò)與單保護(hù)二氨基衍生物24的關(guān)鍵肽偶合來(lái)制備。該 過(guò)程開(kāi)始于將雙官能胺(例如α或β氨基酸21)偶合至活化羰基（例如羧酸酯、異氰酸酯、酰 氯、活化碳酸酯或磺酰鹵）以獲得中間體23。然后用諸如HBTU、DCC和NHS或CDI等試劑或試劑 的組合來(lái)活化23的羧酸且將其用于酰化單保護(hù)二胺(例如二氨基丙酸24)以獲得肽25。對(duì)中 間體25脫保護(hù)或在即將脫保護(hù)成所需氨基酸26之前進(jìn)一步官能化(例如，疊氮基化）。保護(hù) 基團(tuán)可依照方案1來(lái)使用。參見(jiàn)方案6:
[0297]式VI類似物可通過(guò)烷基化甘氨酸等效物的α-中心來(lái)制備。在此序列中，在堿性條 件下用烷基化劑（例如28)處理經(jīng)保護(hù)的甘氨酸等效物(例如乙酰胺基丙二酸二乙酯27)以 實(shí)現(xiàn)甘氨酸衍生物的位置處的烷基化。在酸性或堿性條件下的后續(xù)脫保護(hù)提供所需氨基 酸30。
[0299]式VIII類似物是通過(guò)將疊氮基高丙氨酸衍生物偶合至雙官能胺(例如24)的側(cè)鏈 胺來(lái)制備。該過(guò)程開(kāi)始于偶合疊氮基高丙氨酸31與活化羰基(例如羧酸酯、異氰酸酯、酰氯、 活化碳酸酯或磺酰鹵）以獲得中間體33。然后用諸如HBTU、DCC和NHS或CDI等試劑或試劑的 組合來(lái)活化33的羧酸且將其用于?；瘑伪Ｗo(hù)二胺(例如二氨基丙酸24)以獲得肽34。對(duì)中間 體34脫保護(hù)以獲得35。保護(hù)基團(tuán)可依照方案1來(lái)使用。
[0300] 參見(jiàn)方案8:
[0302]將非天然氨基酸納入蛋白質(zhì)中
[0303]本文所揭示的吡咯賴氨酸類似物可納入重組蛋白中。具體來(lái)說(shuō)，可通過(guò)琥珀阻抑 將類似物位點(diǎn)特異性納入重組蛋白中，其中將無(wú)義(琥珀)密碼子在欲插入吡咯賴氨酸類似 物的位點(diǎn)處插入編碼重組蛋白的核苷酸序列內(nèi)。將突變核苷酸序列以及一個(gè)或多個(gè)編碼 Py 1RS和tRNApy 1的質(zhì)粒插入無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)胞中。
[0304]宿主細(xì)胞可為經(jīng)包含如上述DNA構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞系。
[0305] 替代地，提供無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，其中自宿主細(xì)胞獲得的合成反應(yīng)裂解物包含至少 一種合成多肽所需的組份。自細(xì)菌或真核細(xì)胞獲得合成反應(yīng)裂解物。
[0306] 優(yōu)選地自真核細(xì)胞、更優(yōu)選地自兔網(wǎng)狀細(xì)胞或小麥胚芽獲得合成反應(yīng)裂解物。 [0307]優(yōu)選地，無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)能夠表達(dá)本發(fā)明的WT PylRS和tRNApyl，其中使用本發(fā)明 的DNA構(gòu)建體將tRNApy 1引入所用細(xì)胞中以獲得合成反應(yīng)裂解物。
[0308] 適用于本發(fā)明中的無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)描述于例如WO 201008110、W0 2010081111、TO 2010083148中，這些專利的全文均以引用方式并入本文中。
[0309] 當(dāng)將吡咯賴氨酸類似物添加至細(xì)胞或表達(dá)系統(tǒng)中時(shí)，所述類似物在指定位置處納 入重組蛋白中。通過(guò)pylRS使nnAA與tRNApyl結(jié)合且隨后用nnAA將tRNApyl氨酰化。含有琥?白 反密碼子的此tRNApyl釋放至胞液中，其中響應(yīng)于琥泊終止密碼子該tRNApyl可與核糖體和 所釋放的rmAA相互作用以與正生長(zhǎng)的多肽鏈形成肽鍵。
[0310] 經(jīng)修飾以納入本發(fā)明吡咯賴氨酸類似物的重組蛋白包括適于位點(diǎn)特異性翻譯后 修飾的所有重組蛋白，例如治療性蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞因子、抗體和抗體衍生物(例如Fab片段 或單鏈抗體，例如單鏈可變片段(scfv))、肽、酶、融合蛋白、誘餌受體、蛋白質(zhì)疫苗、蛋白質(zhì) 激素（例如胰島素、生長(zhǎng)因子(例如人類生長(zhǎng)激素、1^、1^5?、1^!1、^^))?？山?jīng)本發(fā)明的 吡咯賴氨酸類似物修飾的其他蛋白質(zhì)包括診斷標(biāo)記、成像試劑。
[0311 ]適宜地，蛋白質(zhì)可經(jīng)位點(diǎn)特異性修飾以納入本發(fā)明的一或一個(gè)以上nnAA(P比略賴 氨酸類似物）。例如，抗體可在重鏈上或輕鏈上或在輕鏈和重鏈二者上納入本發(fā)明nnAA。
[0312] 蛋白質(zhì)與所納入非天然氨基酸的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)
[0313] 已納入本發(fā)明吡咯賴氨酸類似物的蛋白質(zhì)可用于制備官能化蛋白質(zhì)偶聯(lián)物?？膳?聯(lián)至已納入非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的分子包括（i)其他蛋白質(zhì)，例如抗體、尤其單克隆抗 體；（ii)聚合物，例如PEG基團(tuán)或可使在系統(tǒng)中的半衰期延長(zhǎng)的其他基團(tuán)；（iv)細(xì)胞毒性劑， 例如奧里斯他汀(Auristatin)F;和(v)藥物部分，例如多柔比星(doxorubicin)和含有放射 性同位素的部分。此外，這些經(jīng)修飾蛋白質(zhì)可偶聯(lián)至藥物或核苷酸用于靶向遞送這些強(qiáng)效 化合物。
[0314] 下文于抗體藥物偶聯(lián)物的論述中給出某些實(shí)施例的更多細(xì)節(jié)。
[0315] 吡咯賴氨酸類似物可方便地含有獨(dú)特的化學(xué)基團(tuán)，此容許以靶向方式偶聯(lián)而無(wú)與 其他氨基酸發(fā)生副反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。例如，非天然氨基酸可含有疊氮化物或炔基團(tuán)，此容許利用 胡伊斯根(Hui Sgen)l，3-偶極環(huán)加成反應(yīng)與含有相應(yīng)炔烴或疊氮化物基團(tuán)的欲偶聯(lián)分子反 應(yīng)。
[0316]本發(fā)明的優(yōu)選偶聯(lián)化學(xué)包括正交于20種天然氨基酸的反應(yīng)。所述反應(yīng)并不與20種 天然氨基酸相互作用或引起與其的副反應(yīng)，其特異性針對(duì)與該反應(yīng)相關(guān)的官能團(tuán)。適宜地， 所需官能團(tuán)通過(guò)本發(fā)明的吡咯賴氨酸類似物納入靶蛋白中。
[0317]此外，所述反應(yīng)是在以下條件下進(jìn)行：不破壞蛋白質(zhì)，例如水性溶劑，且pH范圍為 蛋白質(zhì)所接受且維持其溶解度，在不對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生有害作用的溫度下。
[0318]增加蛋白質(zhì)與連接體之間的附接部分的穩(wěn)定性可能有利。常規(guī)方法通過(guò)與馬來(lái)酰 亞胺反應(yīng)偶聯(lián)至半胱氨酸的硫醇基團(tuán)形成硫醇醚。硫醇醚可經(jīng)歷逆反應(yīng)，自抗體釋放連接 體藥物衍生物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，在疊氮化物與炔烴之間采用的偶聯(lián)化學(xué)產(chǎn)生顯 著更穩(wěn)定且不易于可逆的芳香族三唑。
[0319]此外，反應(yīng)產(chǎn)物、蛋白質(zhì)與有效負(fù)載之間的鍵應(yīng)穩(wěn)定，穩(wěn)定性等于或大于與常規(guī)鍵 (酰胺、硫醇醚)相關(guān)的穩(wěn)定性。盡管并不妨礙偶聯(lián)，但若可在天然條件下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)則通 常有利，這是因?yàn)榇藢⑾~外重折疊處理步驟。
[0320] 用于產(chǎn)生本發(fā)明偶聯(lián)物的優(yōu)選化學(xué)偶聯(lián)包括:3+2炔烴-疊氮化物環(huán)加成;3+2偶極 環(huán)加成；胡伊斯根3+2環(huán)加成;銅促進(jìn)的疊氮化物-炔烴環(huán)加成(CuAAC);釕促進(jìn)的疊氮化物 炔烴環(huán)加成(RAAC);金屬促進(jìn)的疊氮化物炔烴環(huán)加成(MAAC);應(yīng)變促進(jìn)的疊氮化物炔烴環(huán) 加成（SPAAC);基于鈀的偶合，包括赫克反應(yīng)(Heck reaction)、菌頭反應(yīng)（Sonogashira reaction)、鈴木反應(yīng)（Suzuki reaction)、斯蒂爾偶合（Stille coupling)、檜山/丹麥反應(yīng) (Hiyama/Denmark reaction)、稀經(jīng)復(fù)分解、狄爾斯-阿爾德反應(yīng)(Diels-alder reaction)、 羰基與肼、酰肼、烷氧基胺或羥基胺的縮合;應(yīng)變促進(jìn)的與腈和腈氧化物的環(huán)加成；電子促 進(jìn)的環(huán)加成;片段擠出環(huán)加成;烯烴環(huán)加成、然后β-消除反應(yīng)。
[0321] 根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，所納入的氨基酸含有疊氮化物或炔基團(tuán)，且化學(xué)修飾的工 藝包含使所述疊氮化物或炔基團(tuán)與包含炔或疊氮化物基團(tuán)的試劑反應(yīng)。所設(shè)想的反應(yīng)是胡 伊斯根1，3_偶極環(huán)加成反應(yīng)，其可產(chǎn)生三唑鍵。包含炔烴或疊氮化物基團(tuán)的試劑可為任選 地通過(guò)連接體攜載炔烴或疊氮化物基團(tuán)的蛋白質(zhì)（例如抗體)或細(xì)胞毒性劑或藥物或適于 延長(zhǎng)半衰期的物質(zhì)（例如PEG基團(tuán)）。
[0322] 所納入nnAA與靶有效負(fù)載之間的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)可使用完全折疊的蛋白質(zhì)(例如 抗體、抗體片段和細(xì)胞因子)來(lái)進(jìn)行。替代地，可在變性劑(例如十二烷基硫酸鈉和尿素)存 在下對(duì)變性蛋白質(zhì)進(jìn)行偶聯(lián)?？稍谧冃詣┖瓦€原劑(例如二硫蘇糖醇和2-巰基乙醇)存在下 進(jìn)行銅催化的疊氮化物炔加成。
[0323] 當(dāng)將一種以上的nnAA納入靶蛋白（例如抗體）中時(shí)，化學(xué)修飾可相同或不同。例如， 若納入兩種nnAA，則一者可經(jīng)修飾以偶聯(lián)至藥物部分，且一者可經(jīng)修飾以偶聯(lián)至PEG部分。
[0324] 方便地，在納入一種以上具有不同但互補(bǔ)的反應(yīng)基團(tuán)的本發(fā)明nnAA后，所述nnAA 可彼此反應(yīng)生成分子內(nèi)鍵。
[0325] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的偶聯(lián)化學(xué)用于制備抗體藥物偶聯(lián)物。偶聯(lián)化學(xué)還可用 于組裝抗體-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，例如由抗體片段構(gòu)成的雙特異性抗體。 偶聯(lián)化學(xué)還可用于將聚合物鍵結(jié)的藥物偶聯(lián)物偶聯(lián)至靶向劑，例如抗體和抗體片段。偶聯(lián) 化學(xué)還可用于將聚合物(例如PEG)附接至蛋白質(zhì)以操縱藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。
[0326] PEG 部分
[0327] 靶蛋白可偶聯(lián)至PEG部分。PEG部分可納入抗體藥物偶聯(lián)物中。PEG部分通?？删哂?介于5kDa與40kDa之間的分子量，更優(yōu)選地，PEG部分可具有約20kDa的分子量。PEG部分可為 直鏈或具支鏈。
[0328] 抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)
[0329] 本發(fā)明的吡咯賴氨酸類似物尤其可用于制造具有同源性質(zhì)的抗體藥物偶聯(lián)物(通 過(guò)合成連接體共價(jià)結(jié)合至給定藥物(通常細(xì)胞毒性藥物或者蛋白質(zhì)或PEG基團(tuán)）的重組抗 體），其中每個(gè)抗體中藥物(或其他偶聯(lián)分子)的數(shù)量和抗體上那些藥物的位置明顯受控制， 由此獲得含有所納入非天然氨基酸的單克隆抗體且通過(guò)正交化學(xué)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)至攜載 藥物部分的連接體(或其他偶聯(lián)分子）。
[0330] 使用本發(fā)明吡咯賴氨酸類似物獲得的ADC可遵循以下方法來(lái)制造，這些方法包括 以下步驟：
[0331] 1.將一個(gè)或多個(gè)攜載編碼全長(zhǎng)抗體的DNA序列的質(zhì)粒引入本發(fā)明的穩(wěn)定細(xì)胞系 中，由此在該序列的特定位置處引入終止密碼子
[0332] 2.純化經(jīng)布置在所需位置處的吡咯賴氨酸類似物(nnAA)修飾的抗體。
[0333] 3.使經(jīng)修飾以包括與布置在抗體中的nnAA互補(bǔ)的官能團(tuán)的細(xì)胞毒素-連接體衍生 物與通過(guò)正交化學(xué)含有互補(bǔ)反應(yīng)基團(tuán)的經(jīng)修飾抗體反應(yīng)
[0334] 4.純化所得ADC
[0335] 因此，本發(fā)明還提供ADC，其中抗體組份已經(jīng)修飾以在所需位置納入具有獨(dú)特反應(yīng) 性官能團(tuán)的非天然氨基酸，由此所述官能團(tuán)允許偶聯(lián)至藥物部分(或蛋白質(zhì)或PEG基團(tuán)）。
[0336] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供抗體偶聯(lián)物，其包含通過(guò)包含三唑部分的連接體偶 聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)(例如一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)，優(yōu)選地一個(gè)或兩個(gè)，尤其一個(gè))選自蛋白質(zhì)、 藥物和PEG部分的部分的抗Her-2抗體。
[0337] 具體來(lái)說(shuō)，三唑部分可通過(guò)納入抗Her-2抗體的序列中的非天然氨基酸的側(cè)鏈中 的疊氮化物或炔烴部分與附接至蛋白質(zhì)、藥物或PEG部分的炔烴或疊氮化物部分的反應(yīng)來(lái) 形成。
[0338] 在一個(gè)實(shí)施例中，三唑部分是通過(guò)在Cu(I)催化條件下納入抗Her-2抗體的序列中 的非天然氨基酸的側(cè)鏈中的疊氮化物或炔烴部分與附接至蛋白質(zhì)、藥物或PEG部分的炔烴 或疊氮化物部分的反應(yīng)來(lái)形成。
[0339] 在一個(gè)實(shí)施例中，使用疊氮化銅炔烴環(huán)加成進(jìn)行偶聯(lián)。適宜地，該反應(yīng)利用具有末 端炔烴的細(xì)胞毒性劑，例如奧里斯他汀、蠅蕈素(amanitin)、紫杉酚(taxol)或多柔比星。此 外，該反應(yīng)采用銅來(lái)源，例如硫酸銅、乙酸銅、碘化銅或溴化銅；還原劑，例如抗壞血酸鈉、 肼、羥胺、亞硫酸氫鈉、二硫蘇糖醇、半胱氨酸、b-巰基乙醇；銅螯合配體，例如三[α-芐基-1!1-1，2,3-三唑-4-基）甲基]胺〇8了六)或三(3-羥基丙基三唑基甲基）胺(1'即了六）。適宜地，該 反應(yīng)可在4°C至50°C下進(jìn)行。適宜地，反應(yīng)時(shí)間介于0.5hr至48hr范圍內(nèi)。在一個(gè)替代性實(shí)施 例中，利用應(yīng)變促進(jìn)的疊氮化物炔烴環(huán)加成進(jìn)行偶聯(lián)。適宜地，該反應(yīng)利用染料、PEG聚合物 或細(xì)胞毒性劑(例如具有環(huán)辛炔基團(tuán)的奧里斯他?。?。適宜地，允許將該反應(yīng)在室溫下培育 0·5hr至48hr。
[0340] 鹽
[0341] 本文所述的吡咯賴氨酸類似物可任選地以鹽形式使用。任何所述鹽形成本發(fā)明的 一個(gè)方面。羧酸鹽可包括與1族或2族金屬形成的鹽，尤其可溶性鹽，例如鈉鹽和鉀鹽。胺鹽 可包括與弱酸和強(qiáng)酸(例如HCl、HBr或乙酸)形成的鹽。
[0342] 本發(fā)明的實(shí)施例
[0343] 本發(fā)明的實(shí)施例表示如下：
[0344] 1. -種式I的吡咯賴氨酸類似物：
[0346] 其中
[0347] Z =鍵、CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0、S或CH-NH2;
[0348] a是整數(shù)3至7;
[0349] b是0或整數(shù)1至7;且
[0350] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴。
[0351] 2.根據(jù)實(shí)施例1所述的吡咯賴氨酸類似物，其中a是3。
[0352] 3.根據(jù)實(shí)施例1所述的吡咯賴氨酸類似物，其中a是4。
[0353] 4.根據(jù)實(shí)施例3所述的吡咯賴氨酸類似物，其選自
[0355] 5.根據(jù)實(shí)施例2所述的吡咯賴氨酸類似物，其選自
[0356] 式 IB.1，
[0358] 6. -種式II的吡咯賴氨酸類似物：
[0360] 其中
[0361] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0362] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0363] a =整數(shù)3或5至7;且
[0364] b =整數(shù) 1 至4。
[0365] 7. -種式III的吡咯賴氨酸類似物：
[0367] 其中
[0368] Y = CH2、NH、0或 S;
[0369] Z = (?、CH-Mfc、CH-OH、順、0或 S;
[0370] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0371] a =整數(shù) 1 至7;
[0372] b =整數(shù)1至7，只是當(dāng)Z是ΝΗ、0或S時(shí)，則b是整數(shù)2至7;
[0373] 條件是a+b介于2至8范圍內(nèi)；
[0374] 且d =整數(shù)1至4。
[0375] 8.根據(jù)實(shí)施例7所述的吡咯賴氨酸類似物，其選自
[0376] 式丨 11.1


[0381] 其中
[0382] Y = CH2、NH、0或 S;
[0383] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0384] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0385] a =整數(shù) 1 至7;
[0386] b =整數(shù)1至7，只是當(dāng)Z是ΝΗ、0或S時(shí)，則b是整數(shù)2至7;
[0387] 條件是a+b介于2至8范圍內(nèi)；
[0388] 且
[0389] d =整數(shù) 1 至4。
[0390] 10.根據(jù)實(shí)施例9所述的吡咯賴氨酸類似物，其選自


[0394] 11. 一種式V的吡咯賴氨酸類似物：
[0396] 其中
[0397] R = 20種天然氨基酸中的一者的側(cè)鏈；
[0398] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0399] FG =疊氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0400] a = l;且
[0401] b =整數(shù) 1 至4。
[0402] 12.根據(jù)實(shí)施例11所述的吡咯賴氨酸類似物，其選自
[0404] 13. -種式VI的吡咯賴氨酸類似物：
[0406] 其中
[0407] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0408] FG =疊 氮化物、烯烴、炔烴、酮、酯、芳基或環(huán)炔烴；
[0409] a = 4 或 5;且
[0410] b =整數(shù) 1 至 4;
[0411] 14.根據(jù)實(shí)施例13所述的吡咯賴氨酸類似物，其選自
[0413] 15 · -種式VII的吡咯賴氨酸類似物：
[0415] 其中
[0416] R =烷基、烯基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；
[0417] a =整數(shù)1至7;且
[0418] b =整數(shù) 1 至3。
[0419] 16.根據(jù)實(shí)施例15所述的吡咯賴氨酸類似物，其為：
[0420]式 VIU
[0422] 17.-種式VIII的吡咯賴氨酸類似物：
[0424] 其中
[0425] Z = CH2、CH-NH2、CH-OH、NH、0或 S;
[0426] = H、烷基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；
[0427] R2 =烷基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基；
[0428] R3 = H、烷基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基;且
[0429] a = l〇
[0430] 18.根據(jù)實(shí)施例17所述的吡咯賴氨酸類似物，其選自
[0432] 19. -種突變體蛋白，其含有作為非天然氨基酸的一種或多種根據(jù)實(shí)施例1至18中 的任一者所述的吡咯賴氨酸類似物。
[0433] 20.根據(jù)技術(shù)方案19所述的突變體蛋白，其含有作為非天然氨基酸的一種根據(jù)實(shí) 施例1至18中的任一者所述的吡咯賴氨酸類似物。
[0434] 21.根據(jù)實(shí)施例19或?qū)嵤├?0所述的突變體蛋白，其通過(guò)一種或多種非天然氨基 酸偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)選自蛋白質(zhì)、細(xì)胞毒性劑、藥物和聚合物的部分。
[0435] 22.根據(jù)實(shí)施例21所述的突變體蛋白，其偶聯(lián)至PEG部分。
[0436] 23.根據(jù)實(shí)施例21所述的突變體蛋白，其偶聯(lián)至抗體部分。
[0437] 24.根據(jù)實(shí)施例21所述的突變體蛋白，其偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑部分。
[0438] 25.根據(jù)實(shí)施例21所述的突變體蛋白，其偶聯(lián)至藥物部分。
[0439] 26. -種根據(jù)實(shí)施例1至18中的任一者所述的吡咯賴氨酸類似物的用途，其用于制 造含有一種或多種非天然氨基酸的突變體蛋白。
[0440] ^lj
[0441 ]實(shí)例1.式I和IB類似物的制備
[0442] (2S)-2-氨基-6-[(2S)-2-氨基-4-疊氮基丁酰胺基]己酸(式IA.7)的制備。在具有 磁力攪拌器的20mL小瓶中放置4mL DMF中的N-Boc-疊氮基高丙氨酸（200mg，1當(dāng)量）和HBTU (31 lmg，1當(dāng)量）。將混合物攪拌15min，且然后添加 N-Boc-賴氨酸（235mg，1當(dāng)量)于DMF(3mL) 中的溶液，隨后添加三乙胺(228uL)。將小瓶蓋上蓋且攪拌4h。將混合物分配于250mM梓檬酸 與乙酸乙酯之間。保留有機(jī)層且用乙酸乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干 燥，過(guò)濾且濃縮。質(zhì)譜指示形成所需中間體。通過(guò)硅膠色譜實(shí)施額外純化。
[0443] 將經(jīng)Boc保護(hù)的中間體置于20mL小瓶中且懸浮于乙腈(4mL)中。向此中添加鹽酸于 二噁烷中的溶液(4N，4mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將混合物凍干。通過(guò)離子 交換樹脂(Dowex-50)進(jìn)行額外純化，提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0444] ((2S)-2_氨基-6-{[(2_疊氮基乙基)氨甲酰基]氨基}己酸(式IA.4)的制備。在具 有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置Boc-N-6-賴氨酸(50mg，l當(dāng)量)和DMF(lmL)。向此中添加異 氰酸2-氯乙基酯（17.3mg，1.0當(dāng)量)和吡啶（32.3uL，2當(dāng)量）。將小瓶蓋上蓋且允許攪拌4h。 將溶液轉(zhuǎn)移至萃取漏斗，用乙酸乙酯和l〇〇mM檸檬酸稀釋。振蕩混合物且分離各層。用乙酸 乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用5%氯化鋰洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮。通過(guò) 質(zhì)譜鑒定產(chǎn)物且將其直接用于下一步驟中。
[0445] 在具有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置粗氯代衍生物和DMSO(lmL)。將疊氮化鈉 (130mg，5當(dāng)量)和吡啶（32.3uL，2當(dāng)量)添加至混合物中且將小瓶蓋上蓋。在60°C下將混合 物攪拌過(guò)夜。將混合物轉(zhuǎn)移至萃取漏斗且用100mM檸檬酸和乙酸乙酯稀釋。振蕩混合物且分 離各層。用乙酸乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用5%氯化鋰洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò) 濾且濃縮。通過(guò)質(zhì)譜鑒定中間體且將其用于下一步驟。
[0446] 在20mL小瓶中放置該粗制物和乙腈（2mL)。向此中添加鹽酸于二噁烷中的溶液 (4N，2mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將混合物凍干成半固體且用于翻譯測(cè)試 中。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0447] (2S)-2_氨基_6-{[(丙-2-烯-1-基)氨甲?；鵠氨基}己酸(式IA.5)的制備。在具有 磁力攪拌器的4mL小瓶中放置Boc-N-6-羥基正亮氨酸(50mg，1當(dāng)量)和DMF(1 · 5mL)。向此中 添加異氰酸烯丙基酯（18. OuL，1.0當(dāng)量)和吡啶(32.3uL，2當(dāng)量）。將小瓶蓋上蓋且允許攪拌 4h。將溶液轉(zhuǎn)移至萃取漏斗，用乙酸乙酯和lOOmM檸檬酸稀釋。振蕩混合物且分離各層。用乙 酸乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用5%氯化鋰洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮。通 過(guò)質(zhì)譜鑒定產(chǎn)物且將其直接用于下一步驟中。
[0448]在20mL小瓶中放置乙腈(2mL)中的粗羥基亮氨酸-氨基甲酸烯丙基酯衍生物。向此 中添加鹽酸于二噁烷中的溶液(4N，2.5mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將混合物 凍干成半固體且用于翻譯測(cè)試中。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物?？衫秒x子交換色譜(D0WEX-50)進(jìn) 行額外純化。
[0449] (2S)-2_氨基-5-{[(2_疊氮基乙氧基)羰基]氨基}戊酸(式IB.1)的制備。在具有磁 力攪拌器的20mL小瓶中放置碳酸鉀（1M，2.5mL)和二噁烷(2.5mL)的溶液中的N-Boc-鳥氨酸 (500mg，l當(dāng)量）。氯甲酸2-氯乙基酯（223uL，l當(dāng)量)且將小瓶蓋上蓋并攪拌4h。用1M檸檬酸 將混合物酸化至接近pH 2。將溶液轉(zhuǎn)移至萃取漏斗且用乙酸乙酯（3X )萃取水層。合并有機(jī) 層，用硫酸鈉干燥且濃縮。LC/MS確認(rèn)主要產(chǎn)物具有所需質(zhì)量。粗中間體未經(jīng)額外純化即用 于下一步驟。
[0450] 將粗氯化物中間體置于20mL小瓶中且溶解于DMS0(15mL)中。添加疊氮化鈉 (625mg，4當(dāng)量)和吡啶（155uL)且將小瓶蓋上蓋并在60°C下攪拌過(guò)夜。將混合物傾倒至含有 250mM檸檬酸的萃取漏斗中且用乙酸乙酯（3 X)萃取。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥且濃縮。 LC/MS確認(rèn)形成產(chǎn)物。通過(guò)硅膠色譜實(shí)施額外純化。
[0451 ] 將Boc中間體置于20mL小瓶中且懸浮于乙腈(4mL)中。向此中添加鹽酸于二噁烷中 的溶液(4N，4mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將濃縮物溶解于水中且施加至離子 交換樹脂(Dowex-50)。用水洗滌捕獲材料且用碳酸氫銨洗脫。通過(guò)TLC鑒定富集有氨基酸的 部分，匯集且凍干以提供所需產(chǎn)物。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0452] (2S)_2_氨基_5_{[(丙-2-稀-1-基氧基)羰基]氨基}戊酸(式IB. 3)的制備。在具有 磁力攪拌器的20mL小瓶中放置碳酸鉀（1M，2mL)和二噁烷（2mL)的溶液中的N-Boc-鳥氨酸 (300mg，l當(dāng)量）。添加氯甲酸烯丙基酯（137uL，l當(dāng)量)且將小瓶蓋上蓋并攪拌4h。用1M檸檬 酸將混合物酸化至接近pH 2。將溶液轉(zhuǎn)移至萃取漏斗且用乙酸乙酯(3 X)萃取水層。合并有 機(jī)層，用硫酸鈉干燥且濃縮。LC/MS確認(rèn)主要產(chǎn)物具有所需質(zhì)量。通過(guò)硅膠色譜進(jìn)行額外純 化。
[0453] 將Boc中間體置于20mL小瓶中且懸浮于乙腈(3mL)中。向此中添加鹽酸于二噁烷中 的溶液(4N，3mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將濃縮物溶解于水中且施加至離子 交換樹脂(Dowex-50)。用水洗滌捕獲材料且用碳酸氫銨洗脫。通過(guò)TLC鑒定富集有氨基酸的 部分，匯集且凍干以提供所需產(chǎn)物。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0454] 實(shí)例2.式III化合物的制備
[0455] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{ [ (2_疊氮基乙氧基）幾基]氨基}乙基）硫烷基]丙酸（式 II1.1)的制備。在具有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置半胱氨酸(75mg，1當(dāng)量)和碳酸鈉溶液 (2.8M，620uL)。向此中添加 DMS0(620uL)中的N-(2-溴乙基)氨基甲酸2-氯乙基酯（99mg，1.0 當(dāng)量）。將小瓶蓋上蓋且允許攪拌8h。質(zhì)譜指示形成所需s-烷基化中間體。確認(rèn)中間體質(zhì)量 后，添加疊氮化鈉（120mg)和DMSO(lmL)，再次將小瓶蓋上蓋且將混合物加熱60°C過(guò)夜。質(zhì)譜 指示成功形成所需質(zhì)量。將粗混合物的pH調(diào)節(jié)至2,凍干成膏糊。將材料懸浮于水中且在離 子交換樹脂(D0WEX-50)上捕獲，用水洗滌并用氫氧化銨洗脫。匯集所洗脫部分且凍干以提 供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0456] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_塊-1-基氧基)幾基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸(式 111.2) 的制備。在具有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置半胱氨酸(75mg，1當(dāng)量)和碳酸鈉溶液 (2.81，620此）。向此中添加二噁烷（62〇111)中的1(2-溴乙基）氨基甲酸丙-2-炔-1-基酯 (86mg，l.0當(dāng)量）。將小瓶蓋上蓋且允許攪拌過(guò)夜。質(zhì)譜指示形成所需S-烷基化產(chǎn)物。將粗混 合物的pH調(diào)節(jié)至2，凍干成膏糊。將材料懸浮于水中且在離子交換樹脂(D0WEX-50)上捕獲， 用水洗滌并用氫氧化銨洗脫。匯集所富集部分且凍干以提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn) 物。
[0457] (2S)_2_氨基_3_[ (2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸(式 111.3) 的制備。在具有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置半胱氨酸(75mg，1當(dāng)量)和碳酸鈉溶液 (2.81，620此）。向此中添加二噁烷（62〇1^)中的1(2-溴乙基）氨基甲酸丙-2-烯-1-基酯 (88mg，l.0當(dāng)量）。將小瓶蓋上蓋且允許攪拌過(guò)夜。質(zhì)譜指示形成所需S-烷基化產(chǎn)物。將粗混 合物的pH調(diào)節(jié)至2，凍干成膏糊。將材料懸浮于水中且在離子交換樹脂(D0WEX-50)上捕獲， 用水洗滌并用氫氧化銨洗脫。匯集所富集部分且凍干以提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn) 物。
[0458] (25)-2-氨基-3-({3-[(2-疊氮基乙基)氨甲酰基]丙基}硫烷基）丙酸(式111.13) 的制備。在具有磁力攪拌器的20mL小瓶中放置半胱氨酸(75mg，1當(dāng)量)和碳酸氫鈉溶液(1M， 1.7mL)。向此中添加二噁烷（1.5mL)中的N-(2-疊氮基乙基)-4-溴丁酰胺(86mg，1.0當(dāng)量）。 將小瓶蓋上蓋且允許攪拌8h。質(zhì)譜指示形成所需S-烷基化產(chǎn)物。將粗混合物的pH調(diào)節(jié)至2且 施加至離子交換樹脂(D0WEX-50)，用水洗滌并用氫氧化銨洗脫。將通過(guò)TLC鑒定含有氨基酸 的部分匯集且凍干以提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0459] (2S)_2_氨基_3_( {3-[(丙_2_稀-1-基)氨甲?；鵠丙基}硫烷基)丙酸(式III. 12) 的制備。在具有磁力攪拌器的20mL小瓶中放置半胱氨酸（285mg，l當(dāng)量）和碳酸鈉溶液 (2.8M，1.2mL)。向此中添加4-溴-N-(丙_2_稀-1-基)丁酰胺（333mg，1.0當(dāng)量）。將小瓶蓋上 蓋且允許攪拌過(guò)夜。質(zhì)譜指示形成所需S-烷基化產(chǎn)物。將粗混合物的pH調(diào)節(jié)至2,凍干成膏 糊。將材料懸浮于水中且在離子交換樹脂(D0WEX-50)上捕獲，用水洗滌并用氫氧化銨洗脫。 匯集所富集部分且凍干以提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0460]實(shí)例3.式V化合物的制備
[0461 ] (2S)_2_氨基_3-(2-{ [ (2-疊氮基乙氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)丙酸(式V. 1)的制 備。在具有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置lmL DMF中的2-{[(2_氯乙氧基)羰基]氨基}乙酸 (5〇11^，1當(dāng)量）和冊(cè)1'1](10511^，1當(dāng)量）。將混合物攪拌151^11，且然后添加（25)-3-氨基-2-{[(叔丁氧基）羰基]氨基}丙酸（66mg，l當(dāng)量）于DMF(lmL)中的溶液，隨后添加三乙胺 (77uL)。將小瓶蓋上蓋且攪拌4h。將混合物傾倒至250mM檸檬酸和乙酸乙酯上且振蕩。分離 各層且保留有機(jī)層。用乙酸乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃 縮。質(zhì)譜指示形成所需產(chǎn)物。粗材料未經(jīng)額外純化即用于下一步驟中。
[0462] 將氯化物中間體置于20mL小瓶中且溶解于DMS0(5mL)中。添加疊氮化鈉（72mg，4當(dāng) 量)且將小瓶蓋上蓋并在60 °C下攪拌過(guò)夜。將混合物傾倒至250mM檸檬酸和乙酸乙酯上且振 蕩。分離各層且保留有機(jī)層。用乙酸乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò) 濾且濃縮。質(zhì)譜指示形成所需產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)硅膠色譜完成額外純化。
[0463] 通過(guò)簡(jiǎn)單酸化去除boc基團(tuán)。將Boc-疊氮化物中間體置于20mL小瓶中且懸浮于乙 腈(2mL)中。向此中添加鹽酸于二噁烷中的溶液(4N，2mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下 濃縮。將混合物凍干成膏糊。利用離子交換樹脂(Dowex-50)進(jìn)行額外純化，提供所需氨基 酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0464] (2S)_2_氨基_3_(2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}乙酰胺基)丙酸(式V. 3)的 制備。在具有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置lmL DMF中的2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨 基}乙酸（50mg，l當(dāng)量)和HBTU(120mg，l當(dāng)量）。將混合物攪拌15min，且然后添加（2S)-3-氨 基-2_{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酸(75mg，l當(dāng)量)于DMF(lmL)中的溶液，隨后添加三乙胺 (88uL)。將小瓶蓋上蓋且攪拌8h。將混合物分配于250mM檸檬酸與乙酸乙酯之間。保留有機(jī) 層且用乙酸乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮。質(zhì)譜指示形 成所需產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)硅膠色譜完成額外純化。
[0465] 將經(jīng)Boc保護(hù)的中間體置于20mL小瓶中且懸浮于乙腈(2mL)中。向此中添加鹽酸于 二噁烷中的溶液(4N，2mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將混合物凍干成膏糊。通 過(guò)離子交換樹脂(Dowex-50)進(jìn)行額外純化，提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0466] (23)-2-氨基-3-(2-{[(丙-2-炔-1_基氧基)羰基]氨基}乙酰胺基)丙酸(式￥.2)的 制備。在具有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置lmL DMF中的2-{[(丙-2-炔-1-基氧基)羰基]氨 基}乙酸（50mg，l當(dāng)量)和HBTU(121mg，l當(dāng)量）。將混合物攪拌15min，且然后添加（2S)-3-氨 基-2_{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酸(76mg，l當(dāng)量)于DMF(lmL)中的溶液，隨后添加三乙胺 (89uL)。將小瓶蓋上蓋且攪拌8h。將混合物分配于250mM檸檬酸與乙酸乙酯之間。保留有機(jī) 層且用乙酸乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮。質(zhì)譜指示形 成所需產(chǎn)物。可通過(guò)硅膠色譜完成額外純化。
[0467] 將經(jīng)Boc保護(hù)的中間體(2S)-2_{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-(2_{[(丙-2-炔-1-基 氧基)羰基]氨基}乙酰胺基）丙酸置于20mL小瓶中且懸浮于乙腈(2mL)中。向此中添加鹽酸 于二噁烷中的溶液(4N，2mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將混合物凍干成膏糊。 通過(guò)離子交換樹脂(Dowex-50)進(jìn)行額外純化，提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0468] 實(shí)例4.式VII類似物的制備
[0469] (2S)-2_氨基-6-(2-疊氮基戊酰胺基）己酸(式VII. 1)的制備。在具有磁力攪拌器 的20mL小瓶中放置3mL DMF中的2-疊氮基戊酸（100mg，l當(dāng)量）和HBTU(266mg，l當(dāng)量）。將混 合物攪拌15min，且然后添加 N-Boc-賴氨酸（200mg，1當(dāng)量)于DMF( 3mL)中的溶液，隨后添加 三乙胺（195uL)。將小瓶蓋上蓋且攪拌8h。將混合物分配于250mM檸檬酸與乙酸乙酯之間。保 留有機(jī)層且用乙酸乙酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮。質(zhì)譜 指示形成所需中間體。通過(guò)硅膠色譜實(shí)施額外純化。
[0470] 將中間體置于20mL小瓶中且懸浮于乙腈(2mL)中。向此中添加鹽酸于二噁烷中的 溶液（4N，2mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將混合物凍干。通過(guò)離子交換樹脂 (Dowex-50)進(jìn)行額外純化，提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0471 ]實(shí)例5.式VIII類似物的制備
[0472] (2S)_2_氨基-3-(4-疊氮基_2_{[(丙_2_稀-1-基氧基)幾基]氨基}丁酰胺基)丙酸 (式VIII.1)的制備。在具有磁力攪拌器的4mL小瓶中放置lmL DMF中的（2S)-3-(4-疊氮基-2_{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基} 丁酰胺基)-2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}丙酸(65mg，l 當(dāng)量)和HBTU(108mg，l當(dāng)量）。將混合物攪拌15min，且然后添加（2S)-3-氨基-2-{[(叔丁氧 基)羰基]氨基}丙酸(68mg，l當(dāng)量)于DMF(lmL)中的溶液，隨后添加三乙胺(79uL)。將小瓶蓋 上蓋且攪拌4h。將混合物傾倒至250mM檸檬酸和乙酸乙酯上，振蕩且保留有機(jī)層。用乙酸乙 酯將水層再萃取兩次。合并有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾且濃縮。質(zhì)譜指示形成所需產(chǎn)物。可 通過(guò)硅膠色譜完成額外純化。
[0473] 將經(jīng)Boc保護(hù)的中間體置于20mL小瓶中且懸浮于乙腈(2mL)中。向此中添加鹽酸于 二噁烷中的溶液(4N，2mL)。將溶液攪拌2h，且然后在減壓下濃縮。將混合物凍干。通過(guò)離子 交換樹脂(Dowex-50)進(jìn)行額外純化，提供所需氨基酸。通過(guò)質(zhì)譜確認(rèn)產(chǎn)物。
[0474] 實(shí)例6.使用GFP分析的翻譯測(cè)試。
[0475] 研發(fā)出基于體外細(xì)胞的分析以通過(guò)nnAA整合至靶蛋白中和其效率評(píng)價(jià)pylRS/ tRNA對(duì)與本發(fā)明吡咯賴氨酸類似物（nnAA)的相容性。為此，使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)染方案，用表達(dá) tRNApyl(SEQ ID N0 7)和編碼GFPY40的報(bào)告子構(gòu)建體(在氨基酸殘基編號(hào)40處含有琥珀密 碼子而非酪氨酸(其中1是起始子甲硫氨酸））（SEQ ID N0 10和11)的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表 達(dá)pylRS(SEQ ID N0 4)的HEK293細(xì)胞。將經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞與2mM nnAA-起培育2-3天。通過(guò)在顯 微鏡下肉眼檢查以定性方式分析GFP產(chǎn)生。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)使用Accur i流式細(xì)胞儀量化GFP 熒光，且確定發(fā)光細(xì)胞的幾何平均值。
[0476] 利用此基于細(xì)胞的分析來(lái)確定不同的nnAA是否是pylRS的適宜底物以及是否允許 其翻譯成靶蛋白。在nnAA存在下培育表達(dá)PylRS/tRNApyl對(duì)且含有編碼GFPY40報(bào)告基因的 載體的細(xì)胞。容易被PylRS/tRNApyl對(duì)利用的nnAA支持nnAA翻譯成GFP的琥珀位點(diǎn)，且允許 通讀產(chǎn)生全長(zhǎng)GFP(熒光蛋白）的基因。細(xì)胞的熒光強(qiáng)度取決于nnAA納入的效率。因此，被較 差利用的nnAA產(chǎn)生弱發(fā)光或非發(fā)光細(xì)胞。顯微觀察鑒定出無(wú)法被pylRS利用的nnAA的數(shù)量 (表1，陽(yáng)性GFP)。此外，比較每一樣品中的相對(duì)表達(dá)量與由已知可被pylRS有效利用的底物 生成的那些。式1六.1(]\^1 = 931，289)、式14.2(]\^1 = 1，676,250)和式14.3(]\^1 = 2,250， 〇〇〇)(參見(jiàn)表1)支持高GFP表達(dá)量與幾何平均值。
[0477] 本
【發(fā)明人】發(fā)現(xiàn)在所用實(shí)驗(yàn)條件下，本發(fā)明的類似物式IA.4、IA.5、III.1、III.2、 III.3、III.12、III.13、V.l、V.2、V.3、VII.l納入GFP報(bào)告基因中且產(chǎn)生綠色細(xì)胞。其中，在 所測(cè)試實(shí)驗(yàn)條件下，類似物式111.1(1^1 = 1，989,750)、式111.2(1^1 = 1，847,250)和式 II1.3(MFI = 2，187，000)(參見(jiàn)表2)支持高GFP表達(dá)量且代表可被pyIRS/tRNA對(duì)有效利用的 類似物。
[0478] 表1:式I類似物GFP結(jié)果
[0479] 式 IUPAC名稱陽(yáng)性GFP MFI
[0481 ] 表2:式III類似物GFP結(jié)果
[0486] 表4:式VII類似物GFP結(jié)果
[0488] 表5:式VIII類似物GFP結(jié)果
[0490]實(shí)例7.抗體中的吡咯賴氨酸類似物的位點(diǎn)特異性插入以及含有吡咯賴氨酸類似 物殘基的抗Her2抗體的偶聯(lián)構(gòu)建和表達(dá)
[0491] 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)含有兩種非天然氨基酸(在每一重鏈中的一者）的全長(zhǎng)抗 Her2抗體(4D5-2AZ ab)(SEQ ID N0 15)。將穩(wěn)定表達(dá)編碼位置K274處的琥珀位點(diǎn)的Her2抗 體(SEQ ID N0 14)且表達(dá)pylRS/tRNA對(duì)的CH0細(xì)胞暴露于式III.1和式IA.1的nnAA下。在重 鏈位置K274處納入含有疊氮化物部分的式III. 1或式ΙΑ. 1的nnAA，且通過(guò)親和色譜使用蛋 白質(zhì)A樹脂(GE醫(yī)療(GE Healthcare))或通過(guò)IgSelect(GE醫(yī)療，17096901)純化。然后濃縮 經(jīng)純化材料且使其經(jīng)受偶聯(lián)反應(yīng)。
[0492] 通過(guò)將小鼠抗體4D5的重鏈和輕鏈二者的可變區(qū)克隆至含有編碼人類IgG的基因 的載體中生成針對(duì)Her2/neu的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗體。使用重疊寡聚物通過(guò)基因合成生成 4D5的可變區(qū)，且將其克隆至由pFUSE-CHIg-hGl(IgGl重鏈；y)(SEQ ID N0 12和13)和 pFUSE-CHLIg-hK(輕鏈;κ;因沃維真（InviVOgen))(SEQ ID NO 16和 17)編碼的人類IgGl框 架中，以生成小鼠-人類雜合體。通過(guò)位點(diǎn)定向誘變將琥珀密碼子引入重鏈（γ )中的位置 Κ274處（SEQ ID Ν0 14和15)。通過(guò)DNA測(cè)序鑒定含有琥珀密碼子的克隆。為生成整合構(gòu)建 體，通過(guò)PCR擴(kuò)增重鏈的啟動(dòng)子和0RF，且通過(guò)限值酶消化克隆并連接至pOptivec(生命技術(shù) 公司(Life Technologies))中。通過(guò)兩步PCR方法使用重疊寡聚物連結(jié)輕鏈和單拷貝tRNA， 并將其克隆至可用位點(diǎn)中，進(jìn)而克隆至含有重鏈的pOptivec質(zhì)粒中。然后將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至 含有pylRS/tRNA對(duì)的CH0-DG44細(xì)胞系中，且借助使其在缺乏次黃嘌呤和胸苷的培養(yǎng)基中生 長(zhǎng)選擇轉(zhuǎn)染子。然后克隆所選細(xì)胞，且分離能夠?qū)nAA有效引入琥珀密碼子中的高IgG表達(dá) 子(表達(dá)全長(zhǎng)IgG)。使用所選細(xì)胞系生成含有上述nnAA的IgG。使細(xì)胞在Excel DHFR培養(yǎng)基 (西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich))中生長(zhǎng)至1-2 X 106個(gè)細(xì)胞/mL的密度，且將式III. 1或 式IA.1的nnAA添加至培養(yǎng)物中達(dá)到ImM的最終濃度。將細(xì)胞培育5天且自生長(zhǎng)培養(yǎng)基純化 IgG。收獲上清液且使其經(jīng)受離心以收集懸浮細(xì)胞和其他碎片。然后通過(guò)0.22um過(guò)濾器過(guò)濾 上清液以清除任何顆粒材料，然后施加至色譜柱。使用AKTA色譜系統(tǒng)以l-5mL/min流速將所 過(guò)濾上清液施加至lmL-5mL預(yù)填充HiTrap蛋白質(zhì)A Sepharose。用PBS洗滌所結(jié)合材料和樹 脂以去除松散結(jié)合的蛋白質(zhì)，且用1 OOmM甘氨酸(pH 3.0)以lmL/miη的流速洗脫所結(jié)合材 料。用0.1體積分?jǐn)?shù)的1Μ Tri s-HCl (pH 8.0)中和含有靶蛋白的峰部分。在4°C下針對(duì)roS將 所有構(gòu)建體透析16小時(shí)至最終磷酸鹽緩沖液中。具有式III. 1作為在位置274處納入其兩條 重鏈中的nnAA的抗體稱為"4D5-2AzAb-HC-274-(2S)-2-氨基-3-[ (2-{ [ (2-疊氮基乙氧基） 幾基]氣基}乙基)硫烷基]丙酸。
[0493] 4D5-2AzAb-HC-274-(2S)-2-氨基-3-[ (2-{ [ (2-疊氮基乙氧基）羰基]氨基}乙基） 硫烷基]丙酸的聚乙二醇化
[0494] 在200uL PCR管中放置4D5-2AzAb-HC274-(2S)-2-氨基-3-[(2-{[(2-疊氮基乙氧 基)羰基]氨基}乙基)硫烷基]丙酸（式ΠI · 1)的溶液（100uL，0 · 05mg/mL)，然后放置20KPEG 環(huán)辛炔的溶液(33.3,60mg/mL)。在渦旋儀上劇烈混合溶液且允許培育過(guò)夜。將混合物稀釋 至200uL且施加至蛋白質(zhì)-A磁珠。將混合物禍旋且允許旋轉(zhuǎn)以將珠?；旌?0min。固定珠粒 且處置運(yùn)行通過(guò)材料。用PBS(2X)洗滌珠粒，且然后懸浮于還原凝膠緩沖液中。渦旋且然后 加熱至95°C并保持3min。將懸浮液直接裝載至SDS-PAGE凝膠上。SDS-PAGE凝膠的考馬斯染 色(Commassie staining)指示重鏈的選擇性聚乙二醇化(圖1，泳道2)。
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[0505] 在說(shuō)明書和隨附權(quán)利要求書通篇中，除非上下文另有要求，否則應(yīng)理解，詞語(yǔ)'包 含（comprise) '和變化形式(例如'包含（comprises) '和'包含（comprising) '）暗示包括所 述整數(shù)、步驟、整數(shù)的群組或步驟的群組，但不應(yīng)理解為排除任何其他整數(shù)、步驟、整數(shù)的群 組或步驟的群組。
[0506]本文所提到的所有專利和專利申請(qǐng)案的全文均以引用方式并入本文中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種式X的化咯賴氨酸類似物：其中 X=0 或 S; Y = CH2、NH、0或 S; Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、0或 S; FG =疊氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或環(huán)烘控； a =整數(shù)1至7; b =整數(shù)1至7，只是當(dāng)Z是畑、0或卻寸，貝化是整數(shù)2至7; 條件是a+b介于2至8范圍內(nèi)； 且d =整數(shù)1至4。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化咯賴氨酸類似物，是式ΠI的化咯賴氨酸類似物：其中3、6、￥、2、(1和。6是如權(quán)利要求1中所定義的。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化咯賴氨酸類似物，其選自4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化咯賴氨酸類似物，是式IV的化咯賴氨酸類似物：其中3、6、￥、2、(1和。6是如權(quán)利要求1中所定義的。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的化咯賴氨酸類似物，其選自 式 I V.1為 rV；2其中 Z =鍵、C出、CH-NH2、CH-OH、畑、ο、S或 CH-NH2; a是整數(shù)3至7; b是0或整數(shù)1至7;且 FG =疊氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或環(huán)烘控； 其前提是： 當(dāng)a表示4且Z表示0時(shí)，-(C此）b-FG不表示-C此-C = CH、-C出CH2-化、-CH2-CH = C出或-C此- Ph； 當(dāng)a表示4且Z表示0時(shí)，-(C出)b-FG不表示-C出C出CH2-C (= 0) C出或-C出CH2C出-CH=CH2; 當(dāng)a表示4、Z表示鍵且b表示ο時(shí)，-(CH2)b-FG不表示-C( =0)化或-C( =0)Me;且 當(dāng)a表示4且Z表示鍵時(shí)，-(C出)b-FG不表示-OfcC出-C三CH。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化咯賴氨酸類似物，其中a是3。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的化咯賴氨酸類似物，其中a是4。9. 根據(jù)權(quán)利要求6至化中任一項(xiàng)所述的化咯賴氨酸類似物，其中Z是0。10. 根據(jù)權(quán)利要求6至化中任一項(xiàng)所述的化咯賴氨酸類似物，其中Z是N。11. 根據(jù)權(quán)利要求6至化中任一項(xiàng)所述的化咯賴氨酸類似物，其中Z是鍵。12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的化咯賴氨酸類似物，其選自13.根據(jù)權(quán)利要求7所述的化咯賴氨酸類似物，其選自其中 Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、0或 S; FG =疊氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或環(huán)烘控； a =整數(shù)3或5至7;且 b =整數(shù)1至4。15. -種式V的化咯賴氨酸類似物：其中 R=20種天然氨基酸中的一者的側(cè)鏈； Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、0或 S; FG =疊氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或環(huán)烘控； a=l;且 b =整數(shù)1至4。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的化咯賴氨酸類似物，其選自其中 Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、0或 S; FG =疊氮化物、締控、烘控、酬、醋、芳基或環(huán)烘控； a = 4或5;且 b =整數(shù)1至4。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的化咯賴氨酸類似物，其選自其中 R=烷基、締基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基； a =整數(shù)1至7;且 b =整數(shù)1至3。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的化咯賴氨酸類似物，其是： 式mi21. -種式VIII的化咯賴氨酸類似物：其中 Z = C出、CH-N 出、CH-OH、畑、ο或 S; 化=H、烷基、締基、環(huán)烷基、環(huán)締基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基； 化=烷基、締基、環(huán)烷基、環(huán)締基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基； 化=H、烷基、締基、環(huán)烷基、環(huán)締基、芳基、雜芳基或雜環(huán)基;且 a= 1。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的化咯賴氨酸類似物，其選自23. -種突變體蛋白，該突變體蛋白含有作為非天然氨基酸的一種或多種根據(jù)權(quán)利要 求1到22中任一項(xiàng)所述的化咯賴氨酸類似物。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的突變體蛋白，該突變體蛋白含有作為非天然氨基酸的一種 根據(jù)權(quán)利要求1到22中任一項(xiàng)所述的化咯賴氨酸類似物。25. 根據(jù)權(quán)利要求23或權(quán)利要求24所述的突變體蛋白，該突變體蛋白通過(guò)該一種或多 種非天然氨基酸偶聯(lián)至一個(gè)或多個(gè)選自蛋白質(zhì)、細(xì)胞毒性劑、藥物和聚合物的部分。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的突變體蛋白，該突變體蛋白偶聯(lián)至PEG部分。27. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的突變體蛋白，該突變體蛋白偶聯(lián)至抗體部分。28. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的突變體蛋白，該突變體蛋白偶聯(lián)至細(xì)胞毒性劑部分。29. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的突變體蛋白，該突變體蛋白偶聯(lián)至藥物部分。30. 根據(jù)權(quán)利要求1到22中任一項(xiàng)所述的化咯賴氨酸類似物在制造含有一種或多種非 天然氨基酸的突變體蛋白中的用途。
【文檔編號(hào)】C07C275/10GK105980350SQ201480041770
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2014年8月4日
【發(fā)明人】M·馬瑞利, M·V·布倫特, K·H·格拉布斯坦
【申請(qǐng)人】米迪繆尼有限公司