二氧化硅囊泡的合成方法及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明部分涉及產(chǎn)生二氧化硅囊泡的方法，其包括在受控的條件下以從而主要影響囊泡的形態(tài)和特性。所述囊泡被顯示可有效用作用于化學(xué)和生物試劑的遞送試劑。它們還被顯示可用于治療方法和用作免疫原性組合物的成分。
【專利說明】二氧化硅囊泡的合成方法及其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及化學(xué)合成領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及合成中空二氧化硅囊泡的方法、 由此產(chǎn)生的二氧化硅囊泡及其在藥物遞送中和作為免疫原性組合物的一部分的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 在本文中對【背景技術(shù)】的任何引述不應(yīng)被解釋為承認(rèn)這樣的技術(shù)構(gòu)成澳大利亞或 其它地方的公知常識。
[0004] 無機(jī)中空球體由于其獨(dú)特的形態(tài)和在廣泛應(yīng)用中的潛在用途而已經(jīng)吸引了相當(dāng) 多的注意。它們顯示出在溶劑和體液中的良好穩(wěn)定性，具有優(yōu)異的熱性能并且相較于它們 的有機(jī)對應(yīng)物還具有高的機(jī)械強(qiáng)度。這些性質(zhì)已預(yù)見到它們在多種應(yīng)用諸如催化、藥物/基 因遞送、生物成像、作為納米反應(yīng)器、低介電常數(shù)材料以及在分離技術(shù)中的使用。
[0005]已開發(fā)了方法來利用預(yù)先形成的模板合成無機(jī)中空球體以產(chǎn)生所期望的特性。一 些技術(shù)涉及軟模板法，包括微膠粒、乳劑、微乳劑等。這種方法有許多缺點(diǎn)，包括需要顯著量 的基于化學(xué)品的有機(jī)溶劑或有機(jī)添加劑。硬模板法，包括單晶和膠體球體，也被用于產(chǎn)生具 有所需孔徑的球體，隨后進(jìn)行蝕刻步驟以除去硬模板。這樣的方法是昂貴的、耗時的和環(huán)境 不友好的，并且已被顯示提供相對低的產(chǎn)物產(chǎn)率。
[0006] 二氧化硅囊泡是通過在預(yù)先形成的模板不存在的情況下通過超分子組裝構(gòu)建的 中空球體類型。具有小粒徑(直徑通常小于200nm)的二氧化硅囊泡由于它們的低毒性和生 物可降解性而具有潛在的基于細(xì)胞的和/或動物應(yīng)用。中空形態(tài)內(nèi)部的空隙空間可用作用 于貨物分子的高容量存儲和隨后的受控釋放的儲存器。壁結(jié)構(gòu)(包括壁的厚度和多孔性質(zhì)） 對于貨物分子的固定和釋放是至關(guān)重要的。然而，對二氧化硅囊泡的壁內(nèi)的孔徑和入口尺 寸的精細(xì)控制已經(jīng)被證明是一個艱難的挑戰(zhàn)。
[0007] 提供克服或繞開一個或多個這些問題的具有受控結(jié)構(gòu)的二氧化硅囊泡（SV)用于 以相同方式遞送小分子和較大生物分子會是有用的。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了形成二氧化硅囊泡的方法，其包括以下步驟：
[0010] (a)通過將可水解的二氧化硅源添加至包含嵌段共聚物的水溶液來產(chǎn)生二氧化硅 制劑，將所述二氧化硅制劑保持在低于20°C的溫度，并攪動所述制劑直至形成二氧化硅-聚 合物復(fù)合囊泡，隨后進(jìn)行步驟(b)或步驟(c);
[0011] (b)升高含有二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡的二氧化硅制劑的溫度至25°C至100°C， 并攪動混合物以形成在囊泡壁內(nèi)具有球形結(jié)構(gòu)的二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡；
[0012] (c)使所述囊泡暴露于水熱處理;和
[0013] (d)煅燒所述囊泡，
[0014] 以由此產(chǎn)生二氧化硅囊泡。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種二氧化硅囊泡，其具有：
[0016] (a)30 至 70nm 的粒徑；
[0017] (b)通過球形孔穿孔的壁結(jié)構(gòu);和
[0018] (C)在壁中形成的4至40nm的平均孔入口尺寸。
[0019] 優(yōu)選地，孔徑為40至60nm，更優(yōu)選為約45至55nm，更優(yōu)選為約50nm。
[0020] 本發(fā)明的第三方面在于通過第一方面的方法產(chǎn)生的二氧化硅囊泡。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了藥物或化學(xué)品遞送系統(tǒng)，其包含第二或第三方面 的二氧化硅囊泡和包封在囊泡內(nèi)或結(jié)合至其外表面的藥物或化學(xué)劑。
[0022] 優(yōu)選地，藥物是有機(jī)藥物分子以及化學(xué)劑是殺蟲劑。
[0023]本發(fā)明的第五方面在于包含一個或多個根據(jù)第二或第三方面的二氧化硅囊泡和 一個或多個免疫原和/或抗原的免疫原性組合物。
[0024] 優(yōu)選地，免疫原是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的免疫原性片段。更優(yōu)選地，免疫原 和/或抗原是BVDV的E2蛋白或其片段。
[0025] 本發(fā)明的第六方面在于在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，其包括施用治療有效量 的第五方面的免疫原性組合物的步驟。
[0026] 本發(fā)明的第七方面在于預(yù)防或治療疾病或病況的方法，其包括給有此需要的受試 者施用治療有效量的第五方面的免疫原性組合物的步驟。
[0027] 在一個實(shí)施方案中，所述疾病或病況是牛病毒性腹瀉。
[0028] 本發(fā)明的第八方面在于第二或第三方面的二氧化硅囊泡以及免疫原在制備用于 治療疾病或病況的藥物中的用途。
[0029]本發(fā)明的第九方面在于第二或第三方面的二氧化硅囊泡用作佐劑的用途。
[0030] 在上文各個方面中提及的本發(fā)明的各種特征和實(shí)施方案中視情況而定適應(yīng)于其 它方面，細(xì)節(jié)上作必要的修改。因此，視情況而定，在一個方面指定的特征可以與在其它方 面中指定的特征相組合。
[0031] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將通過下面的詳細(xì)描述而變得明顯。
[0032] 附圖簡述
[0033]為了使本發(fā)明可以被容易地理解并付諸實(shí)踐，現(xiàn)在將通過示例的方式參考附圖描 述優(yōu)選的實(shí)施方案，其中：
[0034] 圖1是新型二氧化硅囊泡(A)SV-10-50和(B)SV-10-50-140在煅燒后的一系列FE- SEM圖像；
[0035]圖2A-B顯示了煅燒之前所合成的SV-10-X-100的一系列TEM圖像；
[0036]圖3是顯示在整個三步合成步驟中二氧化硅囊泡的形成的構(gòu)設(shè)圖；
[0037]圖 4A-D 顯示在煅燒后(A，B)SV-10-50 和(C，D)SV-10-50-140 的一系列 TEM 圖像； [0038]圖5顯示在煅燒后SV-10-T2(A)和SV-10-x-T3(B)的氮吸附等溫線圖，從N2吸附等 溫線計算的孔徑分布曲線，（C) sv-l0-T2的1 -30nm范圍的從吸附分支的BdB孔徑分布曲線， (D) SV-10-X-T3的從脫附分支的B JH孔徑分布曲線；
[0039] 圖6是SV-10-T2(A)和SV-10-x-T3(B)的l-180nm范圍的從吸附分支的BdB孔徑分 布；
[0040] 圖 7 是在煅燒后分別地(AWV-lO-TOjBWV-lO-x-lOOJOSV-lO-x-nOjDWV-iO-x-lSO 的一系列 TEM 圖像；
[0041 ]圖 8 是在煅燒后(A)SV-lO-x-lOO-I(水層）、（B)SV-10-x-100-u(TE0S層)和(E)SV-20-x-lOO的一系列TEM圖像，（C，D)是在連續(xù)攪拌下（C)或在僅10分鐘的攪拌和24小時的靜 置條件下(D)的步驟1后的反應(yīng)混合物的圖像
[0042] 圖9是在(A)添加 TE0S之前和(B-D)在添加 TE0S之后和分別地在12、15和24小時之 后在10°C下反應(yīng)溶液的一系列低溫TEM圖像；
[0043] 圖10A是在步驟(a)中加入TE0S后在10°C下反應(yīng)混合物的ATR-FTIR光譜，圖10B是 在步驟(b)中在隨后的70°C處理中沉淀物的ATR-FTIR光譜，其是在作為時間的函數(shù)SV-10-70反應(yīng)系統(tǒng)中的；
[0044]圖11是在煅燒后二氧化硅囊泡中細(xì)胞色素 c的吸附量作為時間的函數(shù)(T = 25°C) 的圖示；
[0045] 圖12是分別地(A)純SV-10-50-140在煅燒后和(B-D)無傾斜(B)和具有+50°(C)和- 50°(D)的X軸中的單一傾斜角的細(xì)胞色素 c的SV-10-50-140裝載的一系列TEM圖像；
[0046]圖13是細(xì)胞色素 c的SV-10-50裝載的TEM圖像；
[0047]圖 14 是分別地(A)純液體 n-〇DMS、（B 和 C)SV-10-50 和(D 和 E)SV-10-50-140 在煅燒 后(B和D)或在疏水性修飾后(C和E)的FTIR光譜；
[0048]圖15是在疏水性修飾后純SV-10-50在裝載核糖核酸酶A之前(A)和之后(B)的一系 列TEM圖像；
[0049] 圖16是對照組(A-D)中的、已在24小時內(nèi)用FITC標(biāo)記的SV-10-50(E-H)或用SV-10-50-140(I-L)以25ug/ml處理的SCC25細(xì)胞的一系列共焦顯微鏡圖像；
[0050] 圖17是具有16yg劑量的核糖核酸酶A的SCC25細(xì)胞系在24小時和72小時的細(xì)胞存 活性的圖示；
[0051 ]圖18是顯示使用MDBK細(xì)胞的臺盼藍(lán)染色(0.2%)的半定量測定以確定中空二氧化 硅囊泡的細(xì)胞毒性的結(jié)果的一系列圖像；（&)0.511^/11113￥-103-1004;(13)0.111^/11113￥-10-x-100-A;(c)0.01mg/ml SV-10-x-100-A;(d)0.5mg/ml SV-10-x-140;(e)0.1mg/ml SV-lO-x-140; (f)0 ·01mg/ml SV-lO-x-140; (g)0 · 5mg/ml MCM-41 合成的囊泡；（h)單獨(dú)的不具 有二氧化硅囊泡的MDBK細(xì)胞；
[0052]圖19是二氧化硅囊泡的吸附和脫附特征的凝膠分析；
[0053]圖20是指示小鼠對可能的免疫原性組合物的注射的響應(yīng)的一系列ELISA測定的結(jié) 果的圖示；
[0054]圖21是來自經(jīng)免疫的小鼠的鼠脾細(xì)胞的抗原特異性IFN- γ分泌的ELISP0T測定的 結(jié)果的圖示；
[0055]圖22是顯示SV-140上的οΕ2的吸附的SDS-PAGE凝膠的圖像;泳道1-標(biāo)記物，泳道2-〇Ε2蛋白，泳道3-OE2/SV-140上清液，泳道4-OE2/SV-140沉淀物；
[0056]圖23是顯示8只動物在第一和第二次免疫后測試血清出血的終點(diǎn)滴定數(shù)據(jù)的圖 示。所有的小鼠以3周間隔對尾基部施用100yL劑量。個體動物的血清從1:100稀釋至1: 6400。圖中的各個圖線代表各組中的個體動物(Ml至M8);
[0057]圖24是顯示在第二次免疫后維持長期抗體應(yīng)答的四只動物的血清出血的終點(diǎn)滴 定數(shù)據(jù)的圖示。個體動物的血清從1:100稀釋至1:6400。圖中的圖線代表各組中的四只個體 動物(M5到M8);
[0058]圖25是顯示通過ELISP0T測定對來自經(jīng)免疫的小鼠的鼠脾細(xì)胞的抗原特異性IFN-γ分泌的檢測的圖示。Ml至M4是各處理組中的個體小鼠。圖中的柱指示在針對 〇E2抗原的應(yīng) 答中產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞的數(shù)目；
[0059]圖26是顯示通過ELISP0T測定對來自經(jīng)免疫的小鼠的鼠脾細(xì)胞的抗原特異性IFN-γ分泌的檢測的圖示。Μ5至Μ8是各處理組中的個體小鼠。圖中的柱指示在針對ΟΕ2抗原的應(yīng) 答中產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞的數(shù)目；
[0060] 圖27是顯示免疫組織化學(xué)分析以測定經(jīng)免疫的動物的脾切片中的總IgG的誘導(dǎo)的 一系列圖像;〇E2+Quil A陽性處理組a)最終免疫后3周，b)最終免疫后25周；OE2/SV-140納 米疫苗處理組c)最終免疫后3周，d)最終免疫后25周；未經(jīng)免疫的組e)最終免疫后3周，f)最 終免疫后25周；
[0061] 圖28是顯示組織病理學(xué)測定以確定納米疫苗免疫的作用的結(jié)果的一系列圖像;最 終免疫后3周收集的i)心臟、ii)腎、iii)注射部位、iv)肝臟樣品，a) 〇E2+Quil A，c)oE2/SV-140，e)未經(jīng)免疫的，和最終免疫后25周收集的樣品，b)oE2+Quil A，d)oE2/SV-140，f)未經(jīng) 免疫的；
[0062]圖29是顯示吸附在4種類型的SV顆粒上的VirB9.2的凝膠圖像。吸附后的上清液顯 示很少的蛋白殘余，表明完全吸附。顆粒泳道顯示蛋白吸附。M，SeeBlUe 2標(biāo)記物。1; VirB9.2蛋白。2; SV100吸附上清液。3; SV100顆粒。4; SV100NH2吸附上清液。5; SV100NH2顆粒。 6; SV140吸附上清液。7; SV140顆粒。8; SV140NH2吸附上清液。9; SV140NH2顆粒；
[0063] 圖30是顯示在0·l%SLS、37°C過夜下VirB9·2從SV顆粒的脫附的圖示。SV100和SV- l40顯示最好的脫附。SV100和SV140顯示100%脫附；
[0064]圖31是顯示在以1:4000的稀釋度第二次免疫后2周針對VirB9.1蛋白的體液免疫 應(yīng)答的圖示。良好的應(yīng)答在用具有Quil-A以及SV100的VirB9.1免疫的動物中見到。具有 Quil A的以及混合納米制劑的兩種蛋白的混合注射也產(chǎn)生了類似的特異于VirB9.1的高抗 體應(yīng)答。在只用VirB9.2蛋白免疫的動物中沒有見到交叉反應(yīng)；
[0065]圖32是顯示在第二次免疫后針對VirB9.2蛋白的體液免疫應(yīng)答的圖示。良好的應(yīng) 答在用具有Quil-A以及SV100的VirB9.2免疫的動物中見到。具有Quil A的以及混合納米制 劑的兩種蛋白的混合注射也產(chǎn)生了類似的特異于VirB9.2的高抗體應(yīng)答。在只用VirB9.1蛋 白免疫的動物中沒有見到交叉反應(yīng)；
[0066]圖33是顯示針對1:4000稀釋的VirB9.1蛋白的體液應(yīng)答的圖示。來自5只小鼠在實(shí) 驗過程中的平均應(yīng)答顯示測試組的相對免疫應(yīng)答。免疫前測試出血呈陰性并且抗體應(yīng)答顯 示隨注射的增加的趨勢。對于單一的和混合的納米-制劑均觀察到該趨勢；
[0067]圖34是顯示針對VirB9.1蛋白的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的圖示。來自5只個體小鼠的 鼠脾細(xì)胞的抗原特異性IFN-γ分泌通過ELISP0T測定來測定。（A)用VirB9.1+Quil-A注射的 小鼠顯示與VirB9 · 1+SV100以及與多價注射VirB9 · 1/9 · 2+Qui 1-A和VirB9 · 1/9 · 2+SV100相 當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。ConA是內(nèi)部對照。用VirB9.2+QuilA和VirB9.2+SV100注射的動物(B)和（C)單獨(dú) 的SV100注射的動物和未經(jīng)免疫的應(yīng)答顯示最小的應(yīng)答；
[0068]圖35是顯示針對VirB9.2蛋白的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的圖示。來自5只個體小鼠的 鼠脾細(xì)胞的抗原特異性IFN- γ分泌通過ELISP0T測定來測定。（A)用VirB9.2+Quil-A注射的 小鼠顯示與VirB9 · 2+SV100以及與多價注射VirB9 · 1/9 · 2+Qui 1-A和VirB9 · 1/9 · 2+SV100相 當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。ConA是內(nèi)部對照。用VirB9.1+QuilA和VirB9.1+SV100注射的動物(B)和(C)單獨(dú) 的SV100注射的動物和未經(jīng)免疫的應(yīng)答顯示最小的應(yīng)答；
[0069] 圖36是顯示經(jīng)煅燒的二氧化硅囊泡（圓形）的壁厚度、疏水性修飾之前(菱形)和之 后（正方形）的入口尺寸、未修飾的二氧化硅囊泡上的細(xì)胞色素 c吸附容量(倒三角形）和修 飾的二氧化硅囊泡上的核糖核酸酶a(下面的線，三角形)作為T的函數(shù)的關(guān)系。T是最后合成 步驟的溫度；
[0070] 圖37是顯示溶解或分散于10mM PBS溶液中的游離RNA酶A和裝載在疏水性修飾的 二氧化硅囊泡中的RNA酶A(0.5mg/ml RNA酶A)的差示掃描量熱曲線的圖示，加熱速率是60 °C/h；
[0071] 圖38是顯示用0.01M HCl(pH 2)于65°C處理40分鐘并用0.01M NaOH中和至pH 7的 RNA酶A/二氧化硅囊泡的圓二色光譜的圖示。最終的RNA酶A濃度為mg/ml。
[0072] 圖39是顯示用RNA酶A以6μg/ml的劑量處理的（A)SCC25和(B)HCT116細(xì)胞在24、48 和7 2小時后的細(xì)胞存活性的圖示。游離的R N A酶A和在二氧化硅囊泡中裝載的R N A酶A用 0.01M HCl(pH2)在65°C下處理40分鐘并用0.01M NaOH中和至pH 7,隨后添加至細(xì)胞；以及 [0073] 圖40是顯示裝載在(A)無修飾的SV-10-120和(B)具有疏水性修飾的SV-10-120-C18 中的RNA酶A在胰蛋白酶消化的處理后的質(zhì)譜的圖示。
[0074] 詳述
[0075] 本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn):對具有高純度(>98%)和產(chǎn)率、獨(dú)特的孔壁結(jié)構(gòu)和 可控的孔入口尺寸的相對大孔隙的中空二氧化硅囊泡的形成精確控制通過包括以下步驟 的方法實(shí)現(xiàn):在低溫協(xié)同自組裝以形成二氧化硅-聚合物復(fù)合材料的單層囊泡的第一步驟； 第二步驟包括在中等/中間溫度下在復(fù)合壁內(nèi)的第二受控自組裝過程以形成和定形孔壁結(jié) 構(gòu)；和在需要時，任選的第三步驟，其是在高溫下的水熱處理過程，其允許對孔入口尺寸的 進(jìn)一步調(diào)整。所提供的新型二氧化硅囊泡已被發(fā)現(xiàn)有許多期望的性質(zhì)，包括高的蛋白裝載 能力，優(yōu)良的細(xì)胞攝取和作為藥物/化學(xué)劑遞送系統(tǒng)和作為用于疫苗目的的免疫原性組合 物的一部分的功效。
[0076] 在本專利說明書中，形容詞例如第一和第二，左和右，前和后，頂部和底部等，僅用 于從另一元件或方法步驟定義一個元件或方法步驟，而不一定需要由該形容詞描述的特定 的相對位置或順序，除非這從上下文中是清楚的。
[0077] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有如將由本發(fā)明所屬的領(lǐng) 域中普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。
[0078]如本文所用，術(shù)語"二氧化硅囊泡"（SV)或"中空二氧化硅囊泡"（HSV)通常是指包 含圍繞內(nèi)腔的基于二氧化硅的壁的囊泡。具體地，本文所述的SV具有介孔范圍（即在2至 50nm)的腔，并具有單層二氧化硅-空隙-二氧化硅壁并且可以被分類為小單層囊泡(SUV)， 因為它們的直徑小于lOOnm。囊泡壁中的孔隙率通過囊泡壁中的球形穿孔提供。這些球形孔 可以互連，以形成橋接囊泡壁的內(nèi)表面和外表面的連續(xù)孔路徑。在其中球形孔的直徑類似 于囊泡的壁的厚度的情況下，單個球形孔可以橋接壁的內(nèi)表面和外表面，從而提供至囊泡 的內(nèi)腔的大的孔入口。
[0079] 如本文所用，單詞"攪動"可指引起試劑在各自反應(yīng)過程中的混合、擾動或其它動 態(tài)移動的任何手段。攪拌是攪動反應(yīng)混合物的優(yōu)選手段，雖然超聲處理、搖動和其他手段可 以是可接受的。
[0080] 在本文所述的實(shí)驗工作中，合成的二氧化硅囊泡通常通過它們在合成期間已經(jīng)歷 的處理溫度步驟來表示。例如，SV-Tl-T2-T3-n，其中T1、T2和T3分別表示所采用的三個合成 步驟的每一個的溫度。后綴η代表特定的樣品，例如，"c"代表煅燒后，"a"代表已在樣品上進(jìn) 行了氨基修飾，以及"u"或T指示樣品在其中反應(yīng)混合物包含多于一個相的那些特定情況 下是取自上層還是取自下層。字母"X"表示特定步驟的不存在，取決于"X"在注釋中的位置。 例如，SV-lO-x-140表示二氧化硅囊泡通過在10°C下的第一步驟合成，不進(jìn)行第二步驟而是 將囊泡在第三步驟中經(jīng)歷在140°C下的水熱處理，如本文所定義的。
[0081] 在本發(fā)明的第一方面，提供了產(chǎn)生中空二氧化硅囊泡的方法，其包括以下步驟：
[0082] (a)通過將可水解的二氧化硅源添加至包含嵌段共聚物的水溶液來產(chǎn)生二氧化硅 制劑，將所述二氧化硅制劑保持在低于20°C的溫度，并攪動所述制劑直至形成二氧化硅-聚 合物復(fù)合囊泡，隨后進(jìn)行步驟(b)或步驟(c);
[0083] (b)升高含有二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡的二氧化硅制劑的溫度至25°C至100°C， 并攪動混合物以形成在囊泡壁內(nèi)具有球形結(jié)構(gòu)的二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡；
[0084] (c)使所述囊泡暴露于水熱處理;和
[0085] (d)煅燒所述囊泡，
[0086]以由此產(chǎn)生二氧化硅囊泡。
[0087] 可水解的二氧化硅源適當(dāng)?shù)鼐哂型ㄊ絒01)(辦)31(心）04)]。每個乂基團(tuán)沒有特別 的限制，除了至少兩個是可水解的。優(yōu)選地，四個X基團(tuán)中的三個是可水解的并且，更優(yōu)選 地，所有X基團(tuán)是可水解的。每個X可以是不同的，但是選自以下的有機(jī)基團(tuán)：取代或未取代 的&-&0烷氧基，取代或未取代的芳氧基，取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳 基，取代的或未取代的烯基。優(yōu)選地，烷氧基、烯基和烷基是指&-C8基團(tuán)，包括c 2-c8基 團(tuán)，c3-c8基團(tuán)，C4-C8基團(tuán)，c 5-c8基團(tuán)，c6-c8基團(tuán)和C7或C8基團(tuán)。更優(yōu)選地，烷氧基、烯基和烷 基是&-C6基團(tuán)，包括c 2-c6基團(tuán)，c3-c6基團(tuán)，C4-C6基團(tuán)和(： 5和〇5基團(tuán)。甚至更優(yōu)選地，烷氧基、 烯基和烷基是d-C4基團(tuán)，包括C2-C4基團(tuán)和C3和C4基團(tuán)。更優(yōu)選地，烷氧基、烯基和烷基可以 是C1-C3,包括Cl、C2和C3基團(tuán)。還更優(yōu)選地，烷氧基、烯基和烷基可選自甲基，乙基，丙基，異丙 基，丁基，仲丁基和叔丁基。
[0088] 在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，可水解的二氧化硅源是這樣的:所有四個X基團(tuán)是Ci_C6 烷氧基，包括c2-c6，c3-c6，C4-C6和(： 5和〇5以及Ci-C4，C2-C4和C3和C4和&和(：2基團(tuán)。優(yōu)選地，可 水解的二氧化硅源是可任選取代的烷基正硅酸鹽。優(yōu)選地，烷基正硅酸鹽選自四甲基正硅 酸鹽、四乙基正硅酸鹽、四丙基正硅酸鹽和四丁基正硅酸鹽，所有這些可被任選地取代。
[0089] 術(shù)語"烷基"是指具有1至10個碳原子的任選取代的直鏈和支鏈烴基。在適當(dāng)情況 下，烷基可具有指定數(shù)目的碳原子，例如，Ci-Cs烷基，或Q-C6烷基，其包括具有以直鏈或支 鏈排列的1、2、3、4、5或6個碳原子的烷基。烷基的非限制性實(shí)例包括甲基，乙基，丙基，異丙 基，丁基，仲丁基和叔丁基，戊基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，己基，庚基，2-甲基戊基，3-甲基 戊基，4-甲基戊基，2-乙基丁基，3-乙基丁基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基，十三烷 基，十四烷基，十五烷基。
[0090] 術(shù)語"烯基"是指任選取代的不飽和的直鏈或支鏈烴基，碳原子數(shù)為2至10并且具 有至少一個碳-碳雙鍵。在適當(dāng)情況下，烯基可以具有指定數(shù)目的碳原子，例如，C 2-C8烯基， 或(：2-〇5烯基，其包括具有以直鏈或支鏈排列的2、3、4、5或6個碳原子的烯基。烯基的非限制 性實(shí)例包括，乙烯基，丙烯基，異丙烯基，丁烯基，仲丁烯基和叔丁烯基，戊烯基，己烯基，庚 - 1,3-一稀，己 _1，3-一稀，壬 _1，3，5-二稀等。
[0091] 如本文所用的術(shù)語"烷氧基"意指通過氧原子（即，-0-烷基)連接至硅原子的直鏈 或支鏈烷基，其中烷基是如上文所述的。如本文所用的術(shù)語"芳氧基"具有與替換烷基的下 文所定義的芳基類似的含義。
[0092] 如本文所用的術(shù)語"芳基"是指在每個環(huán)中具有最多8個成員的穩(wěn)定的單環(huán)、雙環(huán) 或三環(huán)碳環(huán)，其中至少一個環(huán)是如Hiickel 4n+2規(guī)則所定義的芳族的。
[0093] 術(shù)語"任選取代的"包括用選自但不限于烷基、烯基、芳基、胺、氨基、鹵化物、硫、羥 基和羧基的一種或多種基團(tuán)對所提及的基團(tuán)的取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到其它基團(tuán)可 以用于取代。
[0094] 僅以非限制性實(shí)例的方式，可水解的二氧化硅源可選自以下的一種或多種：甲基 三甲氧基硅烷，甲基三乙氧基硅烷，甲基三正丙氧基硅烷，甲基三異丙氧基硅烷，甲基三正 丁氧基硅烷，甲基三仲丁氧基硅烷，甲基三叔丁氧基硅烷，乙基三甲氧基硅烷，乙基三乙氧 基硅烷，乙基三正丙氧基硅烷，乙基三異丙氧基硅烷，乙基三正丁氧基硅烷，乙基三仲丁氧 基硅烷，乙基三叔丁氧基硅烷，正丙基三甲氧基硅烷，正丙基三乙氧基硅烷，正丙基三正丙 氧基硅烷，正丙基三異丙氧基硅烷，正丙基三正丁氧基硅烷，正丙基三仲丁氧基硅烷，正丙 基二叔丁氧基硅烷，異丙基二甲氧基硅烷，異丙基二乙氧基硅烷，異丙基二正丙氧基硅烷， 異丙基二異丙氧基硅烷，異丙基二正丁氧基硅烷，異丙基二仲丁氧基硅烷，異丙基二叔丁氧 基硅烷，正丁基三甲氧基硅烷，正丁基三乙氧基硅烷，正丁基三正丙氧基硅烷，正丁基三異 丙氧基硅烷，正丁基三正丁氧基硅烷，正丁基三仲丁氧基硅烷，正丁基三叔丁氧基硅烷，仲 丁基三甲氧基硅烷，仲丁基三乙氧基硅烷，仲丁基三正丙氧基硅烷，仲丁基三異丙氧基硅 烷，仲丁基三正丁氧基硅烷，仲丁基三仲丁氧基硅烷，仲丁基三叔丁氧基硅烷，叔丁基三甲 氧基硅烷，叔丁基三乙氧基硅烷，叔丁基三正丙氧基硅烷，叔丁基三異丙氧基硅烷，叔丁基 三正丁氧基硅烷，叔丁基三仲丁氧基硅烷，叔丁基三叔丁氧基硅烷，異丁基三甲氧基硅烷， 異丁基三乙氧基硅烷，異丁基三正丙氧基硅烷，異丁基三異丙氧基硅烷，異丁基三正丁氧基 硅烷，異丁基三仲丁氧基硅烷，異丁基三叔丁氧基硅烷，正戊基三甲氧基硅烷，正戊基三乙 氧基硅烷，正戊基三正丙氧基硅烷，正戊基三異丙氧基硅烷，正戊基三正丁氧基硅烷，正戊 基三仲丁氧基硅烷，正戊基三叔丁氧基硅烷，仲戊基三甲氧基硅烷，仲戊基三乙氧基硅烷， 仲戊基三正丙氧基硅烷，仲戊基三異丙氧基硅烷，仲戊基三正丁氧基硅烷，仲戊基三仲丁氧 基硅烷，仲戊基三叔丁氧基硅烷，叔戊基三甲氧基硅烷，叔戊基三乙氧基硅烷，叔戊基三正 丙氧基硅烷，叔戊基二異丙氧基硅烷，叔戊基二正丁氧基硅烷，叔戊基二仲丁氧基硅烷，叔 戊基二叔丁氧基硅烷，異戊基二甲氧基硅烷，異戊基二乙氧基硅烷，異戊基二正丙氧基娃 燒，異戊基二異丙氧基硅烷，異戊基二正丁氧基硅烷，異戊基二仲丁氧基硅烷，異戊基二叔 丁氧基硅烷，新戊基二甲氧基硅烷，新戊基二乙氧基硅烷，新戊基二正丙氧基硅烷，新戊基 三異丙氧基硅烷，新戊基三正丁氧基硅烷，新戊基三仲丁氧基硅烷，新戊基三叔丁氧基硅 烷，苯基三甲氧基硅烷，苯基三乙氧基硅烷，苯基三正丙氧基硅烷，苯基三異丙氧基硅烷，苯 基三正丁氧基硅烷，苯基三仲丁氧基硅烷，苯基三叔丁氧基硅烷，二甲基二甲氧基硅烷，二 甲基二乙氧基硅烷，二甲基二正丙氧基硅烷，二甲基二異丙氧基硅烷，二甲基二正丁氧基硅 燒，^甲基^仲丁氧基硅烷，^甲基^叔丁氧基硅烷，^乙基^甲氧基硅烷，^乙基^乙氧 基硅烷，^乙基^正丙氧基硅烷，^乙基^異丙氧基硅烷，^乙基^正丁氧基硅烷，^乙基 二仲丁氧基硅烷，二乙基二叔丁氧基硅烷，二正丙基二甲氧基硅烷，二正丙基二乙氧基硅 烷，二正丙基二正丙氧基硅烷，二正丙基二異丙氧基硅烷，二正丙基二正丁氧基硅烷，二正 丙基^仲丁氧基硅烷，^正丙基^叔丁氧基硅烷，^異丙基^甲氧基硅烷，^異丙基^乙氧 基硅烷，^異丙基^正丙氧基硅烷，^異丙基^異丙氧基硅烷，^異丙基^正丁氧基硅烷， 二異丙基二仲丁氧基硅烷，二異丙基二叔丁氧基硅烷，二正丁基二甲氧基硅烷，二正丁基二 乙氧基硅烷，二正丁基二正丙氧基硅烷，二正丁基二異丙氧基硅烷，二正丁基二正丁氧基硅 烷，二正丁基二仲丁氧基硅烷，二正丁基二叔丁氧基硅烷，二仲丁基二甲氧基硅烷，二仲丁 基二乙氧基硅烷，二仲丁基二正丙氧基硅烷，二仲丁基二異丙氧基硅烷，二仲丁基二正丁氧 基硅烷，二仲丁基二仲丁氧基硅烷，二仲丁基二叔丁氧基硅烷，二叔丁基二甲氧基硅烷，二 叔丁基二乙氧基硅烷，二叔丁基二正丙氧基硅烷，二叔丁基二異丙氧基硅烷，二叔丁基二正 丁氧基硅烷，二叔丁基二仲丁氧基硅烷，二叔丁基二叔丁氧基硅烷，二苯基二甲氧基硅烷， ^苯基^乙氧基硅烷，^苯基^正丙氧基硅烷，^苯基^異丙氧基硅烷，^苯基^正丁氧基 硅烷，^苯基^仲丁氧基硅烷，^苯基^叔丁氧基硅烷，甲基新戊基^甲氧基硅烷，甲基新 戊基二乙氧基硅烷，甲基二甲氧基硅烷，乙基二甲氧基硅烷，正丙基二甲氧基硅烷，異丙基 二甲氧基硅烷，正丁基二甲氧基硅烷，仲丁基二甲氧基硅烷，叔丁基二甲氧基硅烷，異丁基 ^甲氧基硅烷，正戊基^甲氧基硅烷，仲戊基^甲氧基硅烷，叔戊基^甲氧基硅烷，異戊基 二甲氧基硅烷，新戊基二甲氧基硅烷，新己基二甲氧基硅烷，環(huán)己基二甲氧基硅烷，苯基二 甲氧基硅烷，甲基^乙氧基硅烷，乙基^乙氧基硅烷，正丙基^乙氧基硅烷，異丙基^乙氧 基硅烷，正丁基二乙氧基硅烷，仲丁基二乙氧基硅烷，叔丁基二乙氧基硅烷，異丁基二乙氧 基硅烷，正戊基^乙氧基硅烷，仲戊基^乙氧基硅烷，叔戊基^乙氧基硅烷，異戊基^乙氧 基硅烷，新戊基^乙氧基硅烷，新己基^乙氧基硅烷，環(huán)己基^乙氧基硅烷，苯基^乙氧基 硅烷，二甲氧基硅烷，二乙氧基硅烷，二正丙氧基硅烷，二異丙氧基硅烷，二正丁氧基硅烷， 三仲丁氧基硅烷，三叔丁氧基硅烷。在上述化合物中，優(yōu)選的化合物是甲基三甲氧基硅烷， 甲基三乙氧基硅烷，甲基三正丙氧基硅烷，甲基三異丙氧基硅烷，乙基三甲氧基硅烷，乙基 三乙氧基硅烷，二甲基二甲氧基硅烷，二甲基二乙氧基硅烷，二乙基二甲氧基硅烷和二乙基 二乙氧基硅烷。
[0095] 可水解的二氧化硅源可以是由上述式描述或上面列出的單體的一種或多種類型 的反應(yīng)而形成的低聚物。
[0096] 優(yōu)選地，水溶液是含水緩沖溶液。
[0097] 合適地，含水緩沖溶液是酸性緩沖溶液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，含水緩沖溶液的pH 為3至6,或3至5,優(yōu)選4至5。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，含水緩沖溶液是乙酸鈉/乙酸緩沖溶 液。
[0098] 優(yōu)選地，無機(jī)鹽也存在于二氧化硅制劑中。合適的無機(jī)鹽包括鈉和鉀鹽。硫酸鈉和 氯化鈉是優(yōu)選的鹽的兩個例子。據(jù)推測，制劑中的高離子強(qiáng)度改善較大的囊泡穩(wěn)定性并且 幫助維持均勻性。這基于以下實(shí)驗觀察:在鹽不存在的情況下，雖然仍然是商業(yè)上有用的， 但囊泡將變得相對小(30nm)并顯示減少的均勻性。
[0099] 優(yōu)選地，嵌段共聚物是烯烴嵌段共聚物。廣泛多樣的烯烴嵌段共聚物是商購可得 的。更優(yōu)選地，嵌段共聚物是三嵌段共聚物，即，A-B-A結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物。在一個實(shí)施方案 中，三嵌段共聚物為聚(氧化烯0-聚(氧化烯 2)_聚(氧化烯:)嵌段共聚物，其中烯基i和烯基2 成分可獨(dú)立地選自乙烯，丙烯，丁烯，戊烯，己烯及其衍生物，例如二醇衍生物。
[0100]甚至更優(yōu)選地，嵌段共聚物是聚(氧化乙烯)_聚(氧化烯烴)_聚(氧化乙烯)嵌段共 聚物，其中烯基是如上文對于烯基:和烯基2成分所描述的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌段共聚 物是聚(氧化乙烯)-聚(氧化丙烯)-聚(氧化乙烯)或聚(氧化乙烯)-聚(氧化丁烯)-聚(氧化 乙烯)嵌段共聚物。
[0101]優(yōu)選地，在步驟(a)中，二氧化硅制劑被保持在0至20°C的溫度下，優(yōu)選在5°C至15 °C，更優(yōu)選在約 10°(：。0至20°C可包括0°C至 15°C、0°C至 12°C、5°C至20°C、5°C至 15°C、7°C至 13°C的范圍，并且包括約0°C，1°C，2°C，3°C，4°C，5°C，6°C，7°C，8°C，9°C，10°C，11°C，12°C， 13 °C，14 °C，15 °C，16 °C，17 °C，18 °C，19 °C和20 °C或從這些值中的任何一個到這些值中的另 一個的范圍的溫度。
[0102]合適地，步驟(a)中混合物的攪動是攪拌。優(yōu)選地，攪拌直到發(fā)生二氧化硅-聚合物 復(fù)合囊泡的形成是第一預(yù)定時間段的連續(xù)攪拌。第一預(yù)定時間段可以通過已知的技術(shù)例如 TEM觀察反應(yīng)混合物直到觀察到二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡的形成來實(shí)驗地確定。未能連續(xù) 攪拌制劑可導(dǎo)致制劑相分離至層，這擾亂囊泡的形成。
[0103] 合適地，將二氧化硅制劑攪拌第一預(yù)定時間段的顯著部分，優(yōu)選大部分，更優(yōu)選實(shí) 質(zhì)部分和甚至更優(yōu)選基本上所有的第一預(yù)定時間段。
[0104] "顯著部分"意指攪拌在第一預(yù)定時間段的至少前20%是連續(xù)的。"大部分"意指攪 拌在第一預(yù)定時間段的至少前50%是連續(xù)的。"實(shí)質(zhì)部分"意指攪拌在第一預(yù)定時間段的至 少前75%是連續(xù)的。"基本上所有的"意指攪拌在第一預(yù)定時間段的至少前80%，優(yōu)選90% 是連續(xù)的。
[0105]本發(fā)明人已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，連續(xù)攪拌是至少第一步驟的關(guān)鍵方面，并且重要的 是保持連續(xù)攪拌直到大部分的初始二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡已形成。本發(fā)明人已實(shí)驗地 顯示，在其它條件保持相同的情況下，如果反應(yīng)在不攪拌的情況下進(jìn)行，那么所需的囊泡不 能形成并導(dǎo)致無定形二氧化娃。這在實(shí)驗部分中進(jìn)行了描述。
[0106] 優(yōu)選地，第一預(yù)定時間段是至少5小時，更優(yōu)選至少10小時，甚至更優(yōu)選至少15小 時，還更優(yōu)選至少20小時。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一預(yù)定時間段是約24小時或更長時 間。
[0107] 合適地，在步驟(b)中，將溫度升高到30°C至90°C，優(yōu)選30°C至85°C，更優(yōu)選35°C至 80°(：。30°(：至90°(：可以包括30°(：至80°(：，30°(：至75°(：，30°(：至70°(：，40°(：至90°(：，40°(：至85 °C，40°C至80°C，40°C至75 °C，40 °C至70°C 的范圍并且包括約30°C，35°C，40°C，45°C，50 °C， 55°C，60°C，65°C，70°C，75°C，80°C，85°C和90°C或從這些值中的任何一個到這些值中的另 一個的范圍的溫度。
[0108] 合適地，步驟(b)中混合物的攪動是攪拌。優(yōu)選地，持續(xù)攪拌直到球形結(jié)構(gòu)的形成 在二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡的壁內(nèi)產(chǎn)生。該形成可在連續(xù)攪拌持續(xù)第二預(yù)定時間段之后 發(fā)生。
[0109] 優(yōu)選地，第二預(yù)定時間段為約0.1至約6.0小時，優(yōu)選約0.5至約5.0小時，更優(yōu)選約 1.0至約4.0小時，甚至更優(yōu)選約2.0至約3.0小時。第二預(yù)定時間段也可以通過實(shí)驗確定，如 對于第一預(yù)定時間段的那樣，并且可以被視為在形成合適百分比的具有壁球形結(jié)構(gòu)的囊泡 時結(jié)束，例如在大于所述囊泡的90%、95%或98%時結(jié)束。
[0110] 本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，步驟(b)中在中等/中間溫度下的加熱是孔壁結(jié)構(gòu)形成發(fā)生（即 在壁結(jié)構(gòu)內(nèi)形成中空球形體)的時期，并且升高溫度超過步驟(a)中的溫度是實(shí)現(xiàn)所需囊泡 壁形態(tài)至關(guān)重要的。不希望受到理論的限制，本發(fā)明人認(rèn)為，在步驟(a)結(jié)束時，二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡中的二氧化硅物質(zhì)可能不是充分水解的，而是仍然保留一些它們的二氧化 硅前體有機(jī)基團(tuán)和因此一定程度的疏水性。在這些條件下，嵌段共聚物的層狀結(jié)構(gòu)是有利 的。然而在步驟(b)的情況下，二氧化硅前體的水解程度增加，以使得二氧化硅的表面變得 更由二氧化硅表面典型的羥端基占主導(dǎo)地位，并因此更具親水性。在壁的疏水性這樣的減 小的情況下，表面活性劑構(gòu)象可改變成更彎曲的結(jié)構(gòu)，例如親水性條件下有利的球形膠束。 這導(dǎo)致形成具有球形結(jié)構(gòu)的囊泡壁孔。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，取決于表面活性劑的 選擇、溫度、含水量、二氧化硅前體水解的程度和其它因素，可在步驟(b)形成彎曲的表面活 性劑結(jié)構(gòu)而非球形膠束，并且像這樣，囊泡壁的多孔性可呈現(xiàn)這些彎曲表面活性劑結(jié)構(gòu)的 形狀?？梢孕纬勺鳛榍蛐文z束的替代物的彎曲表面活性劑結(jié)構(gòu)包括不限于六角形棒和立方 相，包括雙連續(xù)立方相?？梢孕纬傻膹澢砻婊钚詣┙Y(jié)構(gòu)的程度將由表面活性劑液晶行為 的本領(lǐng)域技術(shù)人員很好的理解。
[0111] 然而，在一個實(shí)施方案中，方法包括步驟(a)，隨后步驟(c)，然后煅燒囊泡。在這 里，步驟(c)(水熱步驟)對于在囊泡壁中形成較大的球形孔是關(guān)鍵的。在僅期望通過本發(fā)明 的方法所提供的范圍的較大端點(diǎn)的孔徑的情況下，步驟(b)(其在無隨后的水熱步驟的情況 下產(chǎn)生較小的孔徑)可以從方法中省去。
[0112] 在一個高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，方法包括步驟(a)，隨后步驟(b)，隨后步驟(c)，然 后煅燒囊泡。即，步驟(a)的二氧化硅制劑被暴露于步驟(b)，并且作為步驟(b)的產(chǎn)物的具 有囊泡壁內(nèi)的球形結(jié)構(gòu)的二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡然后被暴露于步驟(c)。
[0113] 優(yōu)選地，對于所有實(shí)施方案，步驟(c)的水熱處理在大于90°C且小于200°C的溫度 下進(jìn)行，優(yōu)選大于90°C并小于180°C，更優(yōu)選大于95°C并小于160°C，例如約100°C至約160 °C。在某些實(shí)施方案中，水熱處理可以在100°C至200°C的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選100°C至180°C， 更優(yōu)選 l〇(TC 至 16(TC。約 100。(：，105。(：，110。(：，115。(：，120。(：，125。(：，130。(：，135。(：，140。(：， 145 °C，150 °C，155 °C和160 °C的溫度被認(rèn)為是有用的。
[0114] 優(yōu)選地，進(jìn)行水熱處理步驟持續(xù)第三預(yù)定時間段，直到形成具有在整個硅質(zhì)壁中 形成的入口的二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡。
[0115] 優(yōu)選地，第三時間段通常等于對于第一時間段所述的那些時間段。
[0116]適當(dāng)?shù)?，水熱步驟(c)在升高的壓力下進(jìn)行。優(yōu)選地，升高的壓力大于0.7巴并小于 15.5巴，包括1.1巴至15.0巴，1.5巴至12.0巴，1.5巴至10.0巴，1.5巴至8.0巴，1.5巴至6.0 巴和1.5巴至5.0巴。在一個實(shí)施方案中，升高的壓力大于0.7巴并小于10巴，更優(yōu)選大于0.8 巴并小于6巴，例如約1巴至約6巴。
[0117] 如圖3所示，進(jìn)行步驟(b)而不進(jìn)行附加的水熱步驟可導(dǎo)致在囊泡壁中形成相對小 的孔，通常直徑小于4nm。這些孔主要是由囊泡壁中的微裂紋形成，并且微裂紋可以與囊泡 壁中的小的內(nèi)部球形腔相關(guān)聯(lián)，以使得這些腔與囊泡的內(nèi)部腔和囊泡的外部連接，從而形 成通過囊泡壁的連續(xù)孔道。在包括或不包括步驟(b)的情況下進(jìn)行水熱步驟（即，在步驟(a) 或步驟(b)之后)可導(dǎo)致如圖3所示的在囊泡壁中形成較大的孔。因此，雖然步驟(b)或步驟 (c)可以直接在步驟(a)之后并且隨后進(jìn)行煅燒以產(chǎn)生可用的和具有商業(yè)價值的產(chǎn)品，優(yōu)選 的是在步驟(a)之后進(jìn)行步驟(b)，隨后進(jìn)行步驟(c)，并且然后，最后進(jìn)行煅燒以產(chǎn)生形態(tài) 精細(xì)控制的二氧化硅囊泡。
[0118] 適當(dāng)?shù)?，煅燒在適合除去共聚物模板的任何溫度下進(jìn)行，并且通常將在大于400 °C，優(yōu)選大于500°C下進(jìn)行，甚至更優(yōu)選約550°C的溫度下進(jìn)行。
[0119] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，對在本發(fā)明的方法的各個階段形成的二氧化硅的提及可 以指基于硅-氧的材料，例如基于硅-氧的物質(zhì)的部分濃縮和水合的形式，因為近似組成 Si02的二氧化硅不會期望被完全形成直到進(jìn)行煅燒。在本發(fā)明的方法的不同階段形成的基 于硅-氧的材料對于知曉使用已知的途徑例如水解和縮合從本文描述的二氧化硅前體形成 二氧化硅的技術(shù)人員而言是熟知的。
[0120] 二氧化硅囊泡的表面修飾可以任選地按照下列煅燒步驟進(jìn)行。這通常涉及增加二 氧化硅囊泡的表面的疏水性，這已被發(fā)現(xiàn)增加某些蛋白和藥物化合物的可裝載量。表面修 飾可以被應(yīng)用于二氧化硅囊泡的外表面或內(nèi)表面或兩者。在一個高度優(yōu)選的實(shí)施方案中， 方法包括，在二氧化硅囊泡的煅燒后，用適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)修飾二氧化硅囊泡的步驟。優(yōu)選地， 表面修飾為疏水性修飾。
[0121] 用于修飾二氧化硅囊泡表面的化學(xué)劑可以是具有通式[(XdUdSUXdUJ]的可 水解的二氧化硅源。每個X基團(tuán)沒有特別的限制，除了至少一個是可水解的并且至少一個是 疏水性官能團(tuán)。每個可水解的X可以是不同的，但為選自取代或未取代的C1-C4烷氧基和鹵素 取代基的有機(jī)基團(tuán)。優(yōu)選地，所提及的烷氧基是甲氧基和乙氧基。更優(yōu)選地，烷氧基是甲氧 基。優(yōu)選地，所提及的鹵素基團(tuán)是氯化物和溴化物基團(tuán)。更優(yōu)選地，鹵素基團(tuán)是氯化物基團(tuán)。 或者，每個疏水性官能X基團(tuán)可以是不同的，但為選自取代或未取代的Q-C20烷基的有機(jī)基 團(tuán)。用于對二氧化硅囊泡施加表面修飾的可水解的二氧化硅源可以包括但不限于一種下列 化合物或兩種或多種下列化合物的組合：甲基三甲氧基硅烷，甲基三乙氧基硅烷，乙基三甲 氧基硅烷，乙基二乙氧基硅烷，丙基二甲氧基硅烷，丙基二乙氧基硅烷，丁基二甲氧基硅烷， 丁基三乙氧基硅烷，戊基三甲氧基硅烷，戊基三乙氧基硅烷，己基三甲氧基硅烷，己基三乙 氧基硅烷，庚基三甲氧基硅烷，庚基三乙氧基硅烷，辛基三甲氧基硅烷，辛基三乙氧基硅烷， 壬基三甲氧基硅烷，壬基三乙氧基硅烷，癸基三甲氧基硅烷，癸基三乙氧基硅烷，十一烷基 三甲氧基硅烷，十一烷基三乙氧基硅烷，十二烷基三甲氧基硅烷，十二烷基三乙氧基硅烷， 十三烷基三甲氧基硅烷，十三烷基三乙氧基硅烷，十四烷基三甲氧基硅烷，十四烷基三乙氧 基硅烷，十五烷基二甲氧基硅烷，十五烷基二乙氧基硅烷，十八烷基二甲氧基硅烷，十八燒 基三乙氧基硅烷，十七烷基三甲氧基硅烷，十七烷基三乙氧基硅烷，十八烷基三甲氧基硅 烷，十八烷基三乙氧基硅烷，苯基三甲氧基硅烷，苯基三乙氧基硅烷，二甲基二甲氧基硅烷， ^甲基^乙氧基硅烷，^乙基^甲氧基硅烷，^乙基^乙氧基硅烷，^丙基^甲氧基硅烷， ^丙基^乙氧基硅烷，^丁基^甲氧基硅烷，^丁基^乙氧基硅烷，^戊基^甲氧基硅烷， ^?戊基^乙氧基硅烷，^己基^甲氧基硅烷，^己基^乙氧基硅烷，^庚基^甲氧基硅烷， 二庚基二乙氧基硅烷，二辛基二甲氧基硅烷，二辛基二乙氧基硅烷，二壬基二甲氧基硅烷， 二壬基二乙氧基硅烷，二癸基二甲氧基硅烷，二癸基二乙氧基硅烷，二-十一烷基二甲氧基 硅烷，^十一烷基^乙氧基硅烷，^十^烷基^甲氧基硅烷，^十^烷基^乙氧基硅烷， 二-十三烷基二甲氧基硅烷，二-十三烷基二乙氧基硅烷，二-十四烷基二甲氧基硅烷，二-十 四烷基^乙氧基硅烷，^十五烷基^甲氧基硅烷，^十五烷基^乙氧基硅烷，^十八燒 基^甲氧基硅烷，^·_十八烷基^乙氧基硅烷，^十七烷基^甲氧基硅烷，^十七烷基^-乙氧基硅烷，二-十八烷基二甲氧基硅烷，二-十八烷基二乙氧基硅烷，二苯基二甲氧基硅 烷，二苯基二乙氧基硅烷，乙基甲基二甲氧基硅烷，乙基甲基二乙氧基硅烷，丙基甲基二甲 氧基硅烷，丙基甲基二乙氧基硅烷，丁基甲基二甲氧基硅烷，丁基甲基二乙氧基硅烷，戊基 甲基二甲氧基硅烷，戊基甲基二乙氧基硅烷，己基甲基二甲氧基硅烷，己基甲基二乙氧基硅 烷，庚基甲基二甲氧基硅烷，庚基甲基二乙氧基硅烷，辛基甲基二甲氧基硅烷，辛基甲基二 乙氧基硅烷，壬基甲基二甲氧基硅烷，壬基甲基二乙氧基硅烷，癸基甲基二甲氧基硅烷，癸 基甲基^乙氧基硅烷，十一烷基甲基^甲氧基硅烷，十一烷基甲基^乙氧基硅烷，十^烷基 甲基二甲氧基硅烷，十二烷基甲基二乙氧基硅烷，十三烷基甲基二甲氧基硅烷，十三烷基甲 基^乙氧基硅烷，十四烷基甲基^甲氧基硅烷，十四烷基甲基^乙氧基硅烷，十五烷基甲基 ^甲氧基硅烷，十五烷基甲基^乙氧基硅烷，十八烷基甲基^甲氧基硅烷，十八烷基甲基^-乙氧基硅烷，十七烷基甲基^甲氧基硅烷，十七烷基甲基^乙氧基硅烷，十八烷基甲基^甲 氧基硅烷，十八烷基甲基^乙氧基硅烷，苯基甲基^甲氧基硅烷，苯基甲基^乙氧基硅烷， 三甲基氯硅烷，乙基二甲基氯硅烷，丙基二甲基氯硅烷，丁基二甲基氯硅烷，戊基二甲基氯 硅烷，己基二甲基氯硅烷，庚基二甲基氯硅烷，辛基甲基二乙氧基硅烷，壬基二甲基氯硅烷， 癸基二甲基氯硅烷，十一烷基二甲基氯硅烷，十二烷基二甲基氯硅烷，十三烷基二甲基氯硅 燒，十四烷基^甲基氣硅烷，十五烷基^甲基氣硅烷，十八烷基^甲基氣硅烷，十七烷基^-甲基氯硅烷，十八烷基二甲基氯硅烷，苯基二甲基氯硅烷，苯乙基二甲基氯硅烷，二甲基二 氯硅烷，乙基甲基二氯硅烷，丙基甲基二氯硅烷，丁基甲基二氯硅烷，戊基甲基二氯硅烷，己 基二甲基二氯硅烷，庚基甲基二氯硅烷，辛基甲基二乙氧基硅烷，壬基甲基二氯硅烷，癸基 甲基二氯硅烷，十一烷基甲基二氯硅烷，十二烷基甲基二氯硅烷，十三烷基甲基二氯硅烷， 十四烷基甲基二氯硅烷，十五烷基甲基二氯硅烷，十六烷基甲基二氯硅烷，十七烷基甲基二 氯硅烷，十八烷基甲基二氯硅烷，苯基甲基二氯硅烷，苯乙基甲基二氯硅烷，甲基三氯硅烷， 乙基三氯硅烷，丙基三氯硅烷，丁基三氯硅烷，戊基三氯硅烷，己基三氯硅烷，庚基三氯硅 烷，辛基甲基二乙氧基硅烷，壬基三氯硅烷，癸基三氯硅烷，十一烷基三氯硅烷，十二烷基三 氣硅烷，十二烷基二氣硅烷，十四烷基二氣硅烷，十五烷基二氣硅烷，十八烷基二氣硅烷，十 七烷基三氯硅烷，十八烷基三氯硅烷，苯基三氯硅烷，苯乙基三氯硅烷。
[0122] 合適地，二氧化硅囊泡的表面修飾通過將二氧化硅囊泡與用于表面修飾的可水解 試劑在合適的介質(zhì)中組合以促進(jìn)氣相或液相反應(yīng)來進(jìn)行。在表面修飾在液相介質(zhì)中進(jìn)行的 情況下，二氧化硅囊泡被加入到適當(dāng)?shù)娜軇?對于可水解的二氧化硅源）中并且含有二氧化 硅囊泡的混合物的攪動可以在添加用于表面修飾的可水解試劑之前和/或之后進(jìn)行?；蛘?， 二氧化硅囊泡可以加入到已含有將用于實(shí)現(xiàn)疏水性修飾的試劑的溶劑中。優(yōu)選地，在表面 修飾步驟中混合物的攪動通過攪拌或超聲處理進(jìn)行。更優(yōu)選地，在表面修飾步驟中混合物 的攪動通過攪拌進(jìn)行。
[0123] 合適地，在表面修飾步驟中，溫度可以升高到80°C至120°C，優(yōu)選100°C至120°C，更 優(yōu)選 105°C 至 115°C。
[0124] 合適地，表面修飾步驟可在一種有機(jī)溶劑或兩種或更多種有機(jī)溶劑的組合中進(jìn) 行。可以使用的溶劑包括，但不限于下述的一種或下述的兩種或更多種的組合:戊烷，2-甲 基丁烷，新戊烷，正己烷，2-甲基戊烷，3-甲基戊烷，2，2-二甲基丁烷，2，3-二甲基丁烷，正庚 烷，2-甲基己烷，3-甲基己烷，2,2_二甲基戊烷，2,3_二甲基戊烷，2,4_二甲基戊烷，3,3_二 甲基戊烷，3-乙基戊烷，2,2,3_三甲基丁烷，辛烷，2-甲基庚烷，3-甲基庚烷，4-甲基庚烷，3-乙基己燒，2，2_二甲基己燒，2，3_二甲基己燒，2，4_二甲基己燒，2，5_二甲基己燒，3，3_二甲 基己燒，3，4_二甲基己燒，3_乙基_2_甲基戊燒，3_乙基_3_甲基戊燒，2，2，3_二甲基戊燒，2， 2,4_三甲基戊烷，2,3,3_三甲基戊烷，2,3,4_三甲基戊烷，四甲基丁烷，壬烷，癸烷，十一烷， 十二烷，乙醇，丙-1-醇，異丙醇，丁醇，戊醇，己-1-醇，庚-1-醇，辛-1-醇，壬-1-醇，癸-1-醇， ^ 碳-I-醇，十二燒-I-醇，苯，甲苯，乙苯，1,2-二甲苯，1,3-二甲苯，1,4-二甲苯，正丙苯， 1，2，3-三甲苯，1，3，5-三甲苯，1，2，4-三甲苯，芐醇。優(yōu)選地，溶劑是取代或未取代的C 5-C16 烷烴或C2-C12醇，或芳族化合物，其是取代或未取代的&-(：3。更優(yōu)選地，溶劑是(： 2-(：8醇，或芳 族化合物，其是取代的&-C3,甚至更優(yōu)選地是&-(： 5醇或&-C3取代的苯。溶劑優(yōu)選是辛烷，乙 醇，丙-1-醇，異丙醇或甲苯或這些的一種或多種的組合。
[0125] 對于二氧化硅囊泡的形成，在實(shí)驗部分呈現(xiàn)的結(jié)果，特別是在圖8中所示的那些， 清楚地表明，連續(xù)攪拌直到形成二氧化硅聚合物囊泡以及低溫是囊狀結(jié)構(gòu)的形成和高產(chǎn)率 的兩個關(guān)鍵參數(shù)。
[0126] 在表面活性劑的自組裝中，超分子聚集體的結(jié)構(gòu)主要通過有機(jī)表面活性劑分子的 g因子預(yù)測。本發(fā)明人已經(jīng)證明，在ΡΕ0-ΡΒ0-ΡΕ0型嵌段共聚物模板系統(tǒng)中，協(xié)同地自組織的 嵌段共聚物/硅酸鹽復(fù)合結(jié)構(gòu)可以被二氧化硅前體的疏水性/親水性影響。具體地，本發(fā)明 人推測溫度，在該實(shí)例中第一步驟的相對低的溫度，將影響TE0S的水解率，這進(jìn)而影響成形 二氧化硅低聚物的疏水性/親水性并因此影響囊狀結(jié)構(gòu)的自組裝。在合成步驟(a)中，較高 的溫度導(dǎo)致較快的TE0S水解率，這產(chǎn)生親水性二氧化硅低聚物，因此不期望地生成管狀的 和無定形的二氧化硅結(jié)構(gòu)，而如前所定義的較低溫度可產(chǎn)生所需的囊泡結(jié)構(gòu)。雖然高溫水 熱處理可以改變孔入口尺寸，但在步驟(a)后的直接水熱處理阻止孔壁結(jié)構(gòu)內(nèi)球形體的形 成，從而產(chǎn)生仍然商業(yè)上有用的但不太優(yōu)選的囊泡結(jié)構(gòu)。在中等或"中間"溫度，如在步驟 (b)中，夾心狀二氧化硅/表面活性劑復(fù)合結(jié)構(gòu)提供了直接的證據(jù)表明TE0S沉積在表面活性 劑層的兩側(cè)，從而在隨后煅燒期間除去聚合物后產(chǎn)生二氧化硅-空隙-二氧化硅壁結(jié)構(gòu)。
[0127] 為了可視化SV形成機(jī)制，低溫TEM被用來研究在整個過程中在不同時間的成形囊 泡結(jié)構(gòu)。如圖9A中所示，在添加二氧化硅源（TE0S)前，嵌段共聚物表面活性劑為直徑小于 lOnm的膠束形式。這表明，本發(fā)明的方法在合成中不使用預(yù)先形成的囊泡模板，而是二氧化 硅囊泡的形成是表面活性劑和二氧化硅低聚物的協(xié)同自組裝。添加 TE0S后15小時，可以觀 察到自組裝的二氧化硅-表面活性劑囊泡（圖9C)，但是，在步驟1結(jié)束時沒有觀察到孔壁結(jié) 構(gòu)（圖9D)。還清楚的是孔壁結(jié)構(gòu)中的球形體僅在中等溫度下的后續(xù)處理即步驟(b)或T2中 形成(如在圖3所示的）。
[0128] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種二氧化硅囊泡，其具有：
[0129] (a)30 至 70nm 的粒徑；
[0130] (b)通過球形孔穿孔的壁結(jié)構(gòu);和
[0131] (c)在壁中形成的4至40nm的平均孔入口尺寸。
[0132] 優(yōu)選地，孔徑為40至60nm，更優(yōu)選為約45至55nm，更優(yōu)選為約50nm。這是促進(jìn)囊泡 和伴隨的化學(xué)或生物試劑通過內(nèi)吞作用的細(xì)胞攝取的理想尺寸。
[0133] 合適地，平均孔入口尺寸是5至38nm，更優(yōu)選約6至約34nm。優(yōu)選的孔入口尺寸將取 決于待容納的蛋白或其它藥物或生物分子的尺寸。例如，對于均具有約3nm尺寸的細(xì)胞色素 c和核糖核酸酶A，具有約6nm的平均孔入口尺寸的SV將是優(yōu)選的。對于其中較大的分子需要 被容納的應(yīng)用，具有8、12、16、24或34歷的平均孔入口尺寸的3￥可以是更合適的。
[0134]二氧化硅囊泡是中空二氧化硅囊泡。
[0135] 優(yōu)選地，中空二氧化娃囊泡具有4至15nm，更優(yōu)選5至14nm，甚至更優(yōu)選7至13nm的 壁厚度。
[0136] 本發(fā)明的第三方面在于通過第一方面的方法產(chǎn)生的二氧化硅囊泡。二氧化硅囊泡 將具有已對于第二方面的那些所概述的物理特性。
[0137] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了藥物或化學(xué)品遞送系統(tǒng)，其包含第二或第三方面 的二氧化硅囊泡和包封在囊泡內(nèi)或結(jié)合至其外表面的藥物或化學(xué)劑
[0138] 優(yōu)選地，藥物是有機(jī)分子并且可包括"生物"分子例如蛋白和肽及其片段。
[0139] 優(yōu)選地，化學(xué)劑是殺蟲劑例如殺白蟻劑。
[0140] 藥物或化學(xué)劑可被吸附或結(jié)合到中空二氧化硅囊泡的外表面，捕獲在孔內(nèi)或包封 在囊泡腔內(nèi)。它可以是共價鍵合的，但優(yōu)選是可釋放地結(jié)合，例如通過離子吸引或靜電相互 作用或簡單地物理陷入在孔結(jié)構(gòu)內(nèi)從而提供緩慢釋放特性。
[0141] 本發(fā)明的第五方面在于包含一個或多個根據(jù)第二或第三方面的二氧化硅囊泡和 一個或多個免疫原和/或抗原的免疫原性組合物。
[0142] 免疫原可以是任何分子、蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)或任何這些物質(zhì)的片 段，其可以在施用給受試者時后在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，免疫應(yīng)答可 以是保護(hù)性免疫應(yīng)答。免疫原可來源于病原體、細(xì)胞、組織或器官，可以是純化的抗原、細(xì)胞 裂解物或培養(yǎng)濾液，或者可以是重組或合成來源的。
[0143] 在一個實(shí)施方案中，免疫原或抗原可以是免疫原或抗原的組合。
[0144] 在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物是疫苗組合物。
[0145] 在一個實(shí)施方案中，免疫原性疫苗組合物是多價疫苗組合物。
[0146] 在一個實(shí)施方案中，免疫原來源于病原性病毒、細(xì)菌或其它生物體。適當(dāng)?shù)?，免?原所來源于的病原體是單鏈RNA病毒。優(yōu)選地，病毒選自黃病毒科，肝炎病毒，Pegivirus，短 暫熱病毒屬，彈狀病毒科和痕病毒屬。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，病毒是痕病毒。
[0147] 當(dāng)病毒是短暫熱病毒屬或彈狀病毒科病毒時，它可以是牛流行熱致病病毒。牛流 行熱(BEF)也被稱為牛中的三日熱病。它是牛的節(jié)肢動物媒介傳播疾病。BEF病毒是具有脂 質(zhì)包膜和5種結(jié)構(gòu)蛋白的負(fù)單鏈RNA基因組。包膜糖蛋白G包含類型特異性和中和性抗原位 點(diǎn)。
[0148] 在某些實(shí)施方案中，免疫原可來源于巴貝蟲屬(Babesia)的物種。這樣的寄生生物 可以是，例如，牛巴貝蟲或二聯(lián)巴貝蟲。
[0149] 在某些實(shí)施方案中，免疫原可來源于立克次體目（Rickettsiales)的物種。該物種 可以是無形體屬(Anap 1 asma)的，例如，邊緣無形體(Anap 1 asma margina 1 e)。邊緣無形原體 對牛的感染導(dǎo)致通常被稱為無形體病的疾病。
[0150] 將理解的是，本發(fā)明的免疫原性組合物不限于它可以與其使用的免疫原/抗原的 類型。可與HSV藥物遞送系統(tǒng)使用的抗原的實(shí)例包括但不限于，在治療或預(yù)防以下的過程中 使用的那些:腺病毒4型和7型，炭疽，肺結(jié)核，白喉和破傷風(fēng)，百日咳，乙型肝炎，脊髓灰質(zhì)炎 病毒，流感嗜血桿菌，腦膜炎球菌病，甲型肝炎，人乳頭瘤病毒，流感，日本腦炎，麻疹，腮腺 炎和風(fēng)疹，肺炎球菌病，狂犬病，輪狀病毒，天花，傷寒，水痘，黃熱病，豬圓環(huán)病毒，豬瘟病 毒，馬流感病毒，手足口病病毒，新城疫病毒，呼吸道合胞病毒，副流感病毒3，馬流感病毒， 狂犬病毒，犬瘟熱病毒，豬傳染性胸膜肺炎（由胸膜炎肺炎放線桿菌引起），犬巴貝蟲病和犬 內(nèi)臟利什曼病。
[0151 ]在使用本發(fā)明的二氧化硅囊泡的產(chǎn)品的任何一種制劑或本文描述的與二氧化硅 囊泡的使用相關(guān)的任何組合物或方面中，可以存在多于一種藥物分子或免疫原。這里，不同 免疫原的組合、不同藥物分子的組合或免疫原和藥物的組合可以在單一制劑中使用。這使 得能夠開發(fā)多價疫苗、多藥物組合和藥物疫苗組合。多藥物組合、多價疫苗和藥物疫苗組合 可以通過將藥學(xué)活性分子(即，藥物分子，免疫原或其它分子)混合在一起，然后將這些裝載 到二氧化硅囊泡以使得個體囊泡可包含多于一種類型的活性分子，或可替代地，單一類型 的活性分子可以單獨(dú)吸附(加載)到單獨(dú)批次的二氧化硅囊泡，然后用不同活性分子裝載的 二氧化硅囊泡可以被組合到單一制劑中。該后一種方法允許不同二氧化硅囊泡設(shè)計與不同 的活性分子一起使用，以使得每個活性分子在制劑中的釋放可以相對于制劑中其它活性分 子的釋放特征來獨(dú)立地定制。例如，在單一制劑中，具有大的孔入口開口的二氧化硅囊泡可 用于裝載大分子例如蛋白質(zhì)，而相同制劑中的小有機(jī)藥物分子可容納在具有較小孔入口開 口的二氧化硅囊泡內(nèi)以更好地進(jìn)行這些小分子的受控釋放，如果需要的話。作為另一個例 子，多價疫苗制劑可使用疏水修飾的二氧化硅囊泡構(gòu)建以最大化具有強(qiáng)疏水性特征的蛋白 免疫原的裝載，而未修飾的囊泡可用于在相同制劑中容納更親水性的免疫原。作為構(gòu)建組 合產(chǎn)品的替代策略，二氧化硅囊泡可以用不同的活性分子相繼裝載。
[0152] 在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物包括多個具有基本上相同特征的二氧化硅囊 泡，其呈遞或包封多個具有彼此不同的結(jié)構(gòu)和/或功能特性的免疫原。
[0153] 在一個實(shí)施方案中，免疫原性組合物包括多個具有不同結(jié)構(gòu)特征的二氧化硅囊 泡，其呈遞或包封具有基本上相同的結(jié)構(gòu)和/或功能特性的免疫原。
[0154] 本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，本發(fā)明的免疫原性組合物可以使用任何數(shù)量或組合的 賦形劑材料來配制。這些賦形劑材料可以被包括在制劑中用于任何數(shù)目的本領(lǐng)域技術(shù)人員 公知的原因，包括但不限于，提供穩(wěn)定的制劑，改善流動性，調(diào)整pH，允許容易的重建，穩(wěn)定 抗原物質(zhì)，最小化不良毒理學(xué)反應(yīng)，改善可制造性，增加穩(wěn)定性或使用壽命或允許更容易的 管理、儲存或運(yùn)輸?？捎糜谂渲瓢景l(fā)明的免疫原性組合物的藥物產(chǎn)品的賦形劑包括但 不限于，丙酮，醇，無水乳糖，蓖麻油，乙酸鄰苯二甲酸纖維素，葡萄糖，D-果糖，D-甘露糖， FD&C Yellow#6鋁色淀染料，胎牛血清，人血清白蛋白，硬脂酸鎂，微晶纖維素，聚維酮C，波 拉克林鉀，碳酸氫鈉，蔗糖，氫氧化鋁，氨基酸，芐索氯銨，甲醛，無機(jī)鹽和糖，維生素，天冬酰 胺，檸檬酸，乳糖，甘油，檸檬酸鐵銨，硫酸鎂，磷酸鉀，磷酸鋁，甲醛，戊二醛，2-苯氧基乙醇， 戊二醛，聚山梨醇酯80，硫酸鋁鉀，硫酸銨，牛提取物，明膠，蛋白胨，磷酸鈉，硫柳汞，小牛血 清，戊二醛，乳清蛋白水解物，新霉素硫酸鹽，多粘菌素 B，乳清蛋白水解物，酵母提取物， MRC-5細(xì)胞蛋白，新霉素，多粘菌素 B硫酸鹽，羥基磷酸鋁硫酸鹽，氯化血紅素，礦物鹽，煙酰 胺腺噪呤二核苷酸，硫酸錯鉀，硼酸鈉，大豆蛋白胨，磷酸鹽緩沖劑，polsorbate 20，硼酸 鈉，脂類，磷酸二氫鈉脫水物，碳水化合物，L-組氨酸，β-丙內(nèi)酯，氯化鈣，磷酸氫二鈉，雞蛋 蛋白，磷酸二氫鉀，磷酸二氫鈉，多粘菌素 Β，氯化鉀，?；敲撗跄懰徕c，硫酸慶大霉素，氫化 可的松，辛苯昔醇l〇，a-生育酚琥珀酸氫酯，脫氧膽酸鈉，卵清蛋白，壬基苯酚乙氧基化物， 辛基苯酚乙氧基化物(Triton X-100)，精氨酸，磷酸氫二鉀，雞蛋蛋白，乙二胺四乙酸，硫酸 慶大霉素，水解豬明膠，磷酸二氫鉀，谷氨酸一鈉，硫酸魚精蛋白，焦亞硫酸鈉，苯酚，酪蛋白 氨基酸，檸檬酸鈉，磷酸二氫鈉一水合物，氫氧化鈉，碳酸鈣，葡聚糖，山梨糖醇，海藻糖，糖 醇，多糖，葡糖胺，甘露糖醇，聚合物和黃原膠。
[0155] 優(yōu)選地，免疫原是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的免疫原性片段。更優(yōu)選地，免疫原是 BVDV的E2蛋白，或其片段。結(jié)構(gòu)包膜糖蛋白E2是主要的免疫原決定簇，并且是作為亞單位疫 苗的理想候選物，因為用E2的免疫引起中和抗體的產(chǎn)生。在天然感染或疫苗接種后E2產(chǎn)生 的中和抗體被視為針對后續(xù)BVDV感染最重要的保護(hù)介質(zhì)。優(yōu)選地，在免疫原性組合物中使 用的E2蛋白是使用大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)生的可溶的、無內(nèi)毒素的E2。以這種方式表達(dá)的E2蛋白 已被證明在小鼠和羊中是免疫原性的并且通過幾個BVDV-E2特異性抗體是可檢測的。它在 本文被稱為0ptiE2蛋白。
[0156] 牛病毒性腹瀉(BVD)是一種常見的牛疾病，導(dǎo)致嚴(yán)重的粘膜病變和臨床疾病諸如 生殖、先天缺陷和持續(xù)感染。BVDV，俗稱牛瘟病毒，是一種單鏈RNA病毒，其主要感染牛和一 些綿羊。關(guān)于瘟病毒的主要擔(dān)憂不僅限于所發(fā)生的顯著的經(jīng)濟(jì)損失，而且在于這樣的事實(shí)， 這些病毒不是宿主特異性的，表明它們能容易地在家畜例如綿羊、豬和山羊中傳播。已公認(rèn) 的是綿羊和山羊可感染BVDV，然后將病毒傳播回到牛。BVDV還已被發(fā)現(xiàn)在本地野牛和水牛 群體中。
[0157] 目前，現(xiàn)有的活的和滅活的BVDV疫苗在防止大多數(shù)與急性感染相關(guān)的臨床疾病上 是相對有效的，但是這些疫苗不能完全保護(hù)避免由持續(xù)感染的動物導(dǎo)致的傳播。迄今為止， Pestigard? (Pfizer)是被批準(zhǔn)在澳大利亞使用的唯一 bvdv疫苗。它是一種滅活病毒疫 苗，具有兩個抗原上不同的1型BVDV株，其已在澳大利亞(Trangie和Bega)分離。這種疫苗需 要以兩個劑量施用，間隔6-8周，此后需要每年加強(qiáng)注射。一旦打開，疫苗只有一個月的短貯 藏壽命，且需要冷凍。BVDV疫苗Bovi 1 i s BVD (Merck)，可在英國獲得并且包括C-86株的滅活 BVDV抗原。它保護(hù)胎兒避免BVDV的經(jīng)胎盤感染并且動物需要每年加強(qiáng)劑量用于保護(hù)。它在+ 2°C至+8°C有18個月的貯藏壽命。一旦打開，疫苗的貯藏壽命減少到10小時。
[0158] 亞單位疫苗包含高度純化的重組抗原，例如蛋白和肽，這些疫苗是更穩(wěn)定的，并且 比常規(guī)疫苗具有更好的安全性特征。然而，亞單位疫苗可具有不良的免疫原性，并且通常由 于代謝酶的降解而無法穿過腸粘膜組織。為了提高亞單位疫苗的免疫原性，通常加入佐劑 到制劑中。佐劑被定義為被添加到疫苗制劑中以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞(DC)的活化和產(chǎn)生強(qiáng)抗原 特異性免疫應(yīng)答的化合物。
[0159]本發(fā)明的二氧化硅囊泡還適合于與DNA疫苗一起使用。雖然DNA疫苗能夠引發(fā)強(qiáng)烈 的免疫應(yīng)答和高特異性，但它們常常遭受低效率的體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。由于它們通過內(nèi)吞作用 有效穿透細(xì)胞壁和釋放生物活性有效載荷的能力，本發(fā)明的免疫原性組合物還可用于開發(fā) 具有高轉(zhuǎn)染效率的有效DNA疫苗。
[0160] 基于QuilA皂苷的佐劑已知刺激Thl細(xì)胞免疫應(yīng)答和針對抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì) 胞的產(chǎn)生，使其理想用于針對傳染性疾病和癌癥免疫治療的亞單位疫苗。然而，缺點(diǎn)例如注 射部位的疼痛、嚴(yán)重的局部反應(yīng)和這些佐劑的毒性特征使得它們不適于人類使用。
[0161] 在實(shí)驗部分中使用本發(fā)明的中空二氧化硅囊泡SV-10-x_140(是未經(jīng)修飾的二氧 化硅囊泡）和SV-lO-x-lOO-A(是氨基修飾的二氧化硅囊泡）來測試對MDBK細(xì)胞的體外細(xì)胞 毒性作為測試它們用作納米疫苗制劑中的遞送劑的前序。在細(xì)胞培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)〇.5mg/ml 濃度的氨基官能化的SV-lO-x-lOO-A相較于未官能化的SV-10-x-140(圖18)是具有毒性的。 然而，0 · lmg/ml和0 · 01mg/ml的較低濃度的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A均是低毒性的。因 此，基于體外細(xì)胞毒性結(jié)果，SV-lO-x-140和SV-10-x-lOO-A均被選擇用于進(jìn)一步研究。 0ptiE2蛋白裝載的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A的濃度在過夜吸附后為200yg蛋白/mg二 氧化硅囊泡，如通過蛋白測定法測定的。這代表了抗原組分的優(yōu)異裝載水平并且是本發(fā)明 的中空二氧化硅囊泡的有利特征。
[0162] 在37°C下對不同緩沖液中的0ptiE2裝載的SV的體外脫附研究表明一旦結(jié)合至本 發(fā)明的SV，蛋白不容易解離，這是進(jìn)一步有利的。當(dāng)用0.1N HCL和檸檬酸鹽緩沖液pH 4.0進(jìn) 行實(shí)驗時，OptiE2蛋白沒有解離，然而，在0.1 %SLS中發(fā)生蛋白的最小脫附。
[0163] 為了測定未官能化和氨基官能化的囊泡所需的最佳特性諸如孔徑、表面積和官能 化，兩種囊泡在體內(nèi)動物研究中進(jìn)行了研究。用0ptiE2(50yg)裝載的SV-10-x-140(250yg) 和0ptiE2(50yg)裝載的SV-10-x-100-A(250yg)免疫原性組合物注射的處理組誘導(dǎo)優(yōu)秀的 抗體應(yīng)答，這與用Opt iE2 (50yg) +Qui 1 A(10yg)施用的陽性對照組是相當(dāng)?shù)?。然而，傳統(tǒng)的 佐劑Quil A的共施用沒有增強(qiáng)總IgG滴度和針對0ptiE2的IFN- γ應(yīng)答，因為用Quil A+HSV 納米疫苗注射的處理組看起來類似于陽性對照組和0ptiE2蛋白裝載的HSV組。佐劑類似于 免疫刺激劑或作為抗原運(yùn)載媒介物發(fā)揮作用，Quil A已知引發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答并且 本發(fā)明人已經(jīng)證明，二氧化硅囊泡具有誘導(dǎo)抗體和T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的能力。佐劑和納米顆 粒的共施用將引起強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答的假設(shè)基于抗原的免疫刺激作用和"貯庫效應(yīng)"緩慢釋 放，其中Quil A會增強(qiáng)免疫應(yīng)答并且抗原裝載的納米顆粒會用作遞送媒介物和免疫刺激 劑。然而，從這個實(shí)驗中得到的結(jié)果表明，二氧化硅HSV與傳統(tǒng)佐劑Quil A的共同施用不引 起強(qiáng)健的免疫應(yīng)答。
[0164] 這突出顯示了本發(fā)明的二氧化硅囊泡的佐劑性質(zhì)，因為它們充當(dāng)優(yōu)良的免疫刺激 劑以及抗原遞送載體，施用蛋白加 SV納米制劑的小組相較于陽性對照組誘導(dǎo)針對0ptiE2表 位的較好的IFN-γ應(yīng)答?？乖b載的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A引起良好抗體和細(xì)胞介 導(dǎo)的免疫應(yīng)答。小鼠在整個實(shí)驗中保持健康，并且在注射部位沒有明顯的局部應(yīng)答。傳統(tǒng)佐 劑Quil A至蛋白/納米顆粒制劑的添加沒有增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這表明，SV本身充當(dāng)優(yōu)良佐劑并 因此當(dāng)用作納米疫苗或免疫原性組合物的一部分時呈現(xiàn)許多優(yōu)點(diǎn)。
[0165] 優(yōu)良的結(jié)合性質(zhì)、低毒性、相對高的細(xì)胞攝取水平和孔壁結(jié)構(gòu)導(dǎo)致作為免疫原性 組合物的一部分具有高度有利的性質(zhì)的HSV。這些性質(zhì)，特別是與HSV的大的內(nèi)部腔組合的 孔壁結(jié)構(gòu)，使此遞送系統(tǒng)特別適合用于單劑量疫苗產(chǎn)品的開發(fā)和制造。更具體地，HSV的大 的內(nèi)部腔允許大量的藥物被裝載到HSV中和大于正常劑量的藥物被遞送至患者或受試者。 由于HSV的孔壁結(jié)構(gòu)提供藥物從HSV的有限釋放速率，這種大劑量不會立即全部成為生物可 利用的，從而防止過量的發(fā)生。相反，藥物被釋放緩慢，以使得可以在延長的時間段引發(fā)免 疫應(yīng)答。以這種方式，使用多劑量方案(例如初免-加強(qiáng)方案)常規(guī)遞送的藥物可通過使用在 如本文所述的制劑中的HSV被開發(fā)為單劑量藥物。藥物的給藥方案從多劑量到單劑量的轉(zhuǎn) 化具有許多優(yōu)點(diǎn)，包括較低的管理成本和潛在的較高遵從性，因為以多劑量遞送的一些藥 物的現(xiàn)實(shí)世界效力受到對多劑量方案的不良遵從的限制。
[0166] 此外，疫苗免疫原/抗原和更一般地蛋白長期以來遭受不佳的熱穩(wěn)定性，從而需要 從生產(chǎn)位置到使用地點(diǎn)的冷藏（即"冷藏鏈"）以避免疫苗抗原或蛋白的降解和性能降低。在 藥物研究中的一個主要目標(biāo)是提高熱穩(wěn)定性，因為這將極大地改善可用性并降低疫苗和蛋 白療法的成本，特別是在偏遠(yuǎn)地區(qū)例如一些農(nóng)場和發(fā)展中國家。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，包含在 本發(fā)明的二氧化硅囊泡內(nèi)的蛋白具有顯著改善的熱穩(wěn)定性，以使得收容在二氧化硅囊泡內(nèi) 的蛋白可暴露于比室溫高不少的溫度而不顯著變性蛋白和影響其生物活性。可以暴露于升 高的溫度，而二氧化硅囊泡/蛋白系統(tǒng)是在液體載體中或為干燥粉末的形式。后者是可能 的，因為如果需要，含蛋白的二氧化硅囊泡可以被干燥并重構(gòu)(重懸浮)在液體載體中。
[0167] 本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的二氧化硅囊泡內(nèi)包封蛋白改善了蛋白對酸導(dǎo)致的分 解的抗性。這對于其中二氧化硅囊泡可用于通過口服遞送途徑遞送蛋白或其它酸敏感性分 子的情況是特別有用的特性。蛋白難以通過口服途徑遞送，因為由于高酸性環(huán)境它們在胃 中通常被分解，使得它們較不藥學(xué)上有效。本發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，包含在二氧化硅囊泡 內(nèi)的蛋白在暴露于模擬胃的環(huán)境的酸性條件時不顯著變性。因此，當(dāng)酸敏感分子例如蛋白 需要被遞送時，可行的是將二氧化硅囊泡用于開發(fā)口服劑型。也提供了針對胰蛋白酶和其 他消化劑的類似的保護(hù)。
[0168] 本發(fā)明的第六方面在于在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，其包括施用治療有效量 的第五方面的免疫原性組合物的步驟。
[0169] 應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的免疫原性組合物不限于它被用來預(yù)防（在預(yù)防性疫苗的 情況下）或治療(在用于治療的疫苗的情況下）的疾病的類型?？赡芡ㄟ^使用本發(fā)明的免疫 原性組合物治療或預(yù)防的疾病的實(shí)例包括，但不限于，腺病毒4型和7型，炭疽，結(jié)核，白喉和 破傷風(fēng)，百日咳，乙型肝炎，脊髓灰質(zhì)炎病毒，嗜血菌屬，腦膜炎球菌病，甲型肝炎，人乳頭瘤 病毒，流感，日本腦炎，麻疹，腮腺炎和風(fēng)疹，肺炎球菌病，狂犬病，輪狀病毒，天花，傷寒，水 痘和黃熱病。
[0170] 免疫應(yīng)答可以是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或抗體免疫應(yīng)答。
[0171] 本發(fā)明的第七方面在于在受試者中預(yù)防或治療疾病或病況的方法，其包括施用治 療有效量的第五方面的免疫原性組合物的步驟。
[0172] 在一個實(shí)施方案中，疾病或病況可以是牛病毒性腹瀉，牛流行熱，無形體病，人乳 頭瘤病毒(HPV)，乙型肝炎病毒和流感以及在上文第五和第六方面相關(guān)列出的那些疾病或 病況。
[0173] 如本文中所使用的，術(shù)語"受試者"或"個體"或"患者"可指對于其治療或預(yù)防是期 望的任何受試者，特別是脊椎動物受試者，甚至更特別地哺乳動物或魚受試者。合適的脊椎 動物包括但不限于，靈長類動物，鳥類，家畜動物(例如，綿羊，牛，馬，驢，豬，魚），實(shí)驗室試 驗動物(例如，兔，小鼠，大鼠，豚鼠，倉鼠），伴侶動物(如貓，狗)和捕獲的野生動物(如狐貍， 鹿，澳洲野狗）。優(yōu)選的受試者是選自牛、綿羊、豬、魚或山羊的家畜動物。
[0174] 本發(fā)明的第八方面在于第二或第三方面的二氧化硅囊泡以及免疫原在制備用于 治療疾病或病況的藥物中的用途。
[0175] 疾病或病況可以是上文關(guān)于本發(fā)明的第五至第七方面中描述那些中疾病或的任 何一個或多個。
[0176] 本發(fā)明的第九方面在于第二或第三方面的二氧化硅囊泡用作佐劑的用途。
[0177] 第六、第七、第八和第九方面的所有組分包括免疫原、二氧化硅囊泡、用于治療的 疾病或病況等可以是如第一至第五方面的任一方面中所描述的。
[0178] 如以上所討論的，已實(shí)驗證明，通過本文描述的方法合成的二氧化硅囊泡用作優(yōu) 良的免疫刺激劑以及抗原遞送載體。在SV的存在下已顯示出改善的針對0ptiE2表位的IFN-γ應(yīng)答。
[0179] 實(shí)驗
[0180] 材料
[0181] 嵌段共聚物Ε039Β〇47Ε039，商業(yè)名稱Β50-6600，[Ε0是聚（氧化乙烯），Β0是聚(氧化丁 烯）]從Dow公司購買。原硅酸四乙酯(TE0S，彡98 % )，（ 3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)和 熒光素-5-異硫氰酸酯(FITC)均購自Sigma-Aldrich。其它試劑均為分析試劑級的。
[0182]
[0183] 利用在1.5kV運(yùn)行的JEOL JSM 7800F場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM)觀察HSV的 形態(tài)。為了FE-SEM測量，通過在乙醇中分散粉末樣品來制備樣品，之后將其滴到鋁箱片上并 附著至SEM支架上的導(dǎo)電性碳膜。
[0184] 透射電子顯微鏡(TEM)圖像用分別在200kV和100kV運(yùn)行的JE0L 2100和JE0L 1010 獲得。為了 TEM測量，通過在Cu網(wǎng)格上的碳膜上于乙醇中分散粉末樣品并干燥來制備樣品。 [0185] 氮吸附/脫附等溫線使用Micromeritics Tristar II系統(tǒng)在77K測量。將樣品在 453K于真空管線上脫氣過夜?？左w積和腔尺寸分布曲線衍生自使用Broekhoff和de Boer (BdB)模型的等溫線吸附分支。Barrett-Joyner-Halanda(BJH)方法被用來計算來自脫附分 支的入口尺寸，并且Brunauer-Emme tt - Te 11 er (BET)方法被用來計算比表面積?？偪左w積從 在0.99的最大相對壓力(P/Ρο)上吸附的量來計算。
[0186] 傅立葉變換紅外（FTIR)光譜在配備有Diamond ATR(衰減全反射）晶體的 ThermoNicolet Nexus 6700 FTIR光譜儀上收集。對于每個光譜，在4CHT1的分辨率在范圍 400-40000^1上收集32個掃描。
[0187] 反應(yīng)混合物的低溫-TEM和ATR-FTIR在不同的反應(yīng)時間進(jìn)行，以使得能夠?qū)崟r監(jiān)控 二氧化硅囊泡的形成。對于低溫-TEM樣品制備，添加 TE0S到含有嵌段共聚物的緩沖液之前 和之后，將一滴的反應(yīng)混合物滴到Cu TEM網(wǎng)格上的碳膜上，隨后在15小時和24小時分析樣 品。用液氮處理TEM網(wǎng)格10分鐘，然后冷凍干燥至少2天。
[0188] 對于ATR-FTIR研究，在步驟1中的加入TE0S到緩沖溶液后不同的反應(yīng)時間（3，6，9， 12，15和24小時)收集一系列的411?41'11?光譜。針對使用具有等量似 25〇4的相同緩沖溶液測 量的背景獲得各光譜。在步驟2中對于反應(yīng)混合物進(jìn)行進(jìn)一步的兩個分析，其在70°C進(jìn)行。 分析分別在3和6小時進(jìn)行。
[0189] 中空二氧化硅囊泡的制備
[0190] 步驟1:0 · 5g EO39BO47EO39被溶解于30g的pH = 4 · 7NaAc-HAc緩沖液（[NaAc] = [HAc] =0.40M)，在10°C下在攪拌下加入0.852g Na2S〇4(0.20M)，以形成均勻的溶液。向此溶液加 入3.33g TE0S，在連續(xù)攪拌下持續(xù)24小時。
[0191] 為了研究步驟1中溫度的影響，在20°C進(jìn)行第二實(shí)驗，所有其它參數(shù)保持相同。
[0192] 進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗以研究步驟1中攪拌的影響，所有其它參數(shù)保持相同，但只進(jìn)行 10分鐘的攪拌，隨后將反應(yīng)混合物在靜態(tài)條件下靜置24小時。在無攪拌的情況下出現(xiàn)的反 應(yīng)混合物的不同相將被分離到不同的容器中以進(jìn)行后續(xù)步驟。
[0193] 步驟2:在步驟2中，將來自步驟1的反應(yīng)混合物升溫至中等溫度(40，50，60或70°C 均在單獨(dú)的實(shí)驗中試驗)并持續(xù)攪拌另外24小時。
[0194] 步驟3:將來自步驟2的反應(yīng)混合物分別暴露在不同溫度下的水熱處理(HT)。為了 實(shí)現(xiàn)此，將合適的樣品從它們的反應(yīng)容器取出并放入高壓滅菌器并在100、120、130、140、 150、170或180°(：之一下分別以1、2、2.5、3.5、5、8和10巴的壓力水熱處理進(jìn)行另外24小時。 該處理步驟后，將沉淀物濾出，用水反復(fù)洗滌以除去添加的鹽，并隨后在空氣中干燥(在本 文被稱為"合成的樣品"）。由合成的樣品在550Γ在空氣中煅燒5小時得到最終產(chǎn)物。為了指 示在步驟2之后中空二氧化硅囊泡的可用性，將若干這些樣品濾出沉淀物、洗滌并煅燒準(zhǔn)備 用于分析而不經(jīng)受步驟3。
[0195] HSV的氨基和FITC修飾
[0196] 在HSV氨基修飾過程中，將1.5g經(jīng)煅燒的SV-10-50和SV-10-50-140加入到單獨(dú)的 燒瓶中。將60ml甲苯加入到每個燒瓶中，將反應(yīng)物在加入1.0ml APTES之前攪拌6h。在110°C 攪拌12小時后，將HSV用甲苯和乙醇充分洗滌隨后在室溫下在通風(fēng)櫥中干燥。氨基修飾的樣 品相應(yīng)地用 SV-10-50-A 或 SV-10-50-140-A 表示。
[0197] 為了用FITC修飾HSV，將游離的-NH2部分用于以FITC標(biāo)記。FITC的官能團(tuán)硫氰酸酯 是高度氨基反應(yīng)性的。將20mg粉狀SV-A即氨基修飾的二氧化硅囊泡分散在3ml去離子水中 并混合5ml的FITC乙醇溶液(0.3mg/ml)。在室溫下在黑暗中攪拌6小時后，將SV離心并用乙 醇洗滌三次直至上清液變?yōu)闊o色。在SCC25細(xì)胞攝取實(shí)驗中使用之后將FITC標(biāo)記的SV用于 共聚焦顯微鏡觀察。
[0198] HSV的疏水性修飾
[0199] 為了實(shí)現(xiàn)SV的疏水性修飾，將48mg經(jīng)煅燒的SV-10-50和SV-10-50-140分別加入兩 個50ml三頸燒瓶中。各樣品置于6ml甲苯中并將反應(yīng)混合物攪拌6小時隨后加入0.12ml(2% v/v)正-十八烷基三甲氧基硅烷(n-〇DMS)。在110 °C攪拌12小時后，將疏水性修飾的SV用甲 苯和乙醇充分洗滌隨后在室溫下在通風(fēng)櫥中干燥。疏水性修飾的SV產(chǎn)物相應(yīng)地表示為SV-10-50-C18或SV-10-50-140-C18。
[0200] 細(xì)胞培養(yǎng)和吸收
[0201] SCC25細(xì)胞在5 %⑶2 37°C下保持在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中并補(bǔ)充有 胎牛血清（10%，Sigma，M0)、L-谷氨酰胺（1 % )、青霉素（1 % )和鏈霉素（1 % )。將培養(yǎng)基于隔 日常規(guī)更換并將細(xì)胞在達(dá)到匯合之前通過胰蛋白酶消化分離。SCC25細(xì)胞在6孔板中接種于 玻璃蓋玻片（5xl05細(xì)胞/孔)并溫育24小時。在用PBS洗滌兩次后，將細(xì)胞用2ml補(bǔ)充血清的 DMEM培養(yǎng)基中的lug/ml FITC標(biāo)記的SV-10-50或SV-10-50-140溫育24小時。隨后，將細(xì)胞用 PBS洗滌兩次以除去剩余的SV和死細(xì)胞。然后將細(xì)胞在4°C下用2ml 4%PFA溶液固定30分 鐘，它們的細(xì)胞核用DAPI染色，并安裝在玻璃載玻片上。最后，將細(xì)胞共聚焦顯微鏡（LSM Zeiss 710)下觀察并捕獲圖像。
[0202] 細(xì)胞色素 c的裝載和染色
[0203] 將含有l(wèi)mg的煅燒后或氨基修飾后的SV-10-50或SV-10-50-140的0·5ml PBS溶液 與0.5ml細(xì)胞色素 c-PBS溶液(2mg/ml)混合。在25°C溫育不同的時間范圍后(5、15、30分鐘， 1、2、3、8和12小時），將混合物離心。為了評估細(xì)胞色素 c的裝載效率，收集上清液并在480nm 的波長使用UV-2450(UV-Vis分光光度計，Shimadzu)測量殘留的細(xì)胞色素c含量。細(xì)胞色素c 的裝載量可以基于原始和殘余的細(xì)胞色素 c的濃度和體積來計算。細(xì)胞色素 c裝載的SV被重 新分散到lml中。此懸浮液的一滴可以滴到Cu TEM網(wǎng)格上的碳膜上并在空氣中干燥。然后在 60 °C用在50 %乙醇溶液中的染色劑5 %乙酸雙氧鈾(UAT)處理TEM網(wǎng)格6分鐘。經(jīng)染色的TEM 網(wǎng)格用去離子水洗滌并在空氣中干燥。
[0204] 核糖核酸酶A的裝載和染色
[0205] 將含有 lmg的 SV-10-50-C18 或SV-10-50-140-C18 的0.5ml 磷酸緩沖鹽水(PBS)溶液 使用超聲波浴制備為懸浮液。各懸浮液與〇.5ml核糖核酸酶A(RNA酶A)-PBS溶液(2mg/ml)混 合。在25 °C的培養(yǎng)箱中以200rpm搖動18小時后，將混合物離心。為了評估RNA酶A裝載效率， 將上清液通過200nm的過濾器收集，殘余的RNA酶A含量在277.5nm波長使用UV-2450(UV-Vis 分光光度計，Shimadzu)測量。RNA酶A的裝載量可以基于原始和殘余的RNA酶A濃度和體積來 計算。RNA酶A裝載的SV被重新分散到lml中。此懸浮液的一滴可以滴到Cu TEM網(wǎng)格上的碳膜 上并在空氣中干燥。然后在60°C用在50%乙醇溶液中的染色劑5%乙酸雙氧鈾（UAT)處理 TEM網(wǎng)格6分鐘。經(jīng)染色的TEM網(wǎng)格用去離子水洗滌并在空氣中干燥。
[0206] 細(xì)胞毒性和RNA酶A變性
[0207] SCC25細(xì)胞以2xl04細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中并在37°C下在5%C0 2中培養(yǎng)24 小時。然后，將游離的RNA酶A、SV、RNA酶A裝載的SV和對應(yīng)的變性樣品以4-16μg/ml的RNA酶A 劑量加入到DMEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞，將細(xì)胞在37 °C下在5 % C02中溫育24和72h。接著，將MTT試 劑(來自roS中5mg/ml溶液的10μ1/孔體積)加入到各孔，振蕩10秒，然后在37 °C溫育4小時。 對于上述細(xì)胞毒性實(shí)驗在離心后在除去上清液后收集沉淀。然后將DMSO(lOOyl)加入到每 個孔中，以溶解甲臜晶體，光密度(0D)用微板讀數(shù)器(SpectraMax M5,Bio-Strategy，Ltd) 在570nm下記錄。在不存在SV和RNA酶A的情況下溫育的細(xì)胞用作為對照。所有實(shí)驗以一式三 份對各組進(jìn)行。
[0208] 另一系列對照組在RNA酶A的熱和酸變性后制備，包括游離的RNA酶A和RNA酶A裝載 的SV。在變性過程中，將50μ1 !1(：1(0.0謂，？!12.0)溶液加入到111^游離1?熟酶4或6-911^的3￥ (裝載有l(wèi)mg RNA酶Α)?；旌衔镌?5°C溫育40分鐘，冷卻并離心。將NaOH(O.OlM)溶液逐滴添 加到該混合物中，直到pH達(dá)到~7,通過精確pH試紙指示并用作本實(shí)驗的變性RNA酶A組。
[0209] 中空二氧化娃囊泡作為疫苗遞送系統(tǒng)
[0210] HSV 特征
[0211] 在"納米疫苗"實(shí)驗中使用的SV是具有如下面的表1中所示的特征的未修飾的"SV-ΙΟ-χ-140" 和氨基修飾的 "SV-10-X-100-A"。
[0212] 表l:SV-10-x-140 和 SV-10-X-100-A 的特征
[0215] 用于體外細(xì)胞毒性測定的臺盼藍(lán)染色
[0216] 將Madin-Darby牛腎（MDBK)細(xì)胞(ATCC)以80-90%匯合在24孔板中接種到蓋玻片 上，并允許在37°C，5%C02培養(yǎng)箱中貼壁過夜。為了研究納米顆粒濃度對細(xì)胞的效果，制備 在Earle最小必需培養(yǎng)基（含有5%胎牛血清（Life Technologies))中的一定稀釋范圍 (0 · 5mg/ml，0 · lmg/ml和0 ·01mg/ml)的SV-10-X-140和SV-ΙΟ-χ-ΙΟΟ-Α顆粒并輕輕逐滴加至 貼壁細(xì)胞。將細(xì)胞在未官能化的合成的納米顆粒SV-10-x-140、SV-10-x-100-A和MCM-41(可 商購的介孔二氧化硅）的存在下在37°(：，5%〇) 2溫育20小時。小心去除培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗 滌孔三次以除去SV/納米顆粒。為了測定細(xì)胞存活性，將0.2 %臺盼藍(lán)染色劑（Life Technologies)加入進(jìn)行2分鐘。將臺盼藍(lán)染色劑小心去除并用PBS洗滌孔一次。將細(xì)胞固定 在4 %多聚甲醛(PFA)pH 7.4中進(jìn)行15分鐘，然后用roS洗滌三次。蓋玻片用5μ1的M0WI0L (Sigma)安裝。細(xì)胞存活性通過用Zeiss HAL100顯微鏡在亮視野下成像來測定。
[0217] 0ptiE2吸附至SV和SV-A納米顆粒
[0218] 吸附反應(yīng)使用在2ml最終體積中2.5mg/ml的無菌Tris緩沖液中的1.5mg具有300yg 0ptiE2的SV-lO-x-140和SV-ΙΟ-χ-ΙΟΟ-Α顆粒。該顆粒-蛋白漿液放置在室溫(RT)的搖床上， 24小時后移出顆粒-蛋白漿液的樣品（50μ1)，并在16.2g下離心1分鐘。未結(jié)合的0ptiE2蛋白 的量通過在SDS-PAGE凝膠上的上清液的電泳評估。
[0219] 脫附研究
[0220] 0ptiE2裝載的SV-lO-x-140和SV-ΙΟ-χ-ΙΟΟ-Α納米顆粒沉淀物重懸浮于1000μ1的 PBS加0.1 % SLS(月桂基醚硫酸鈉)或0.1 N HCL或pH為4.0的檸檬酸鹽緩沖液中，并將樣品在 室溫下以200rpm留在搖床上進(jìn)行120分鐘。上清液通過在SDS-PAGE凝膠上的電泳評估脫附 的蛋白。
[0221] 蛋白測定
[0222] 吸附樣品的上清液按照制造商的說明通過蛋白測定法(BioRad DC試劑盒)定量。
[0223] 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)
[0224] 將二氧化硅囊泡/納米顆粒樣品重懸浮在15μ1 PBS和5μ1 SRB(SDS還原緩沖液，由 62.5111]\11^8-!1(：1(口!1為6.8)，117111101'1'，10%甘油，2%505,0.02%溴酚藍(lán)組成）中，在85 1€ 下溫育2分鐘，然后在10%的1'1^8-甘氨酸凝膠（1]1￥；[1：1'(^611)上進(jìn)行電泳。凝膠通過在50% 甲醇，10%乙酸，0.25%考馬斯藍(lán)R250中染色30分鐘，隨后在30%甲醇，10%乙酸中進(jìn)行三 次30分鐘洗滌進(jìn)行脫色來可視化。
[0225] 在小鼠中進(jìn)行的免疫研究
[0226] C57BL/6J小鼠購自且在無特定病原體條件下飼養(yǎng)于Biological Resource Facility,The University of Queensland,Brisbane,Australia。八周大的雌性小鼠以每 組4只動物在環(huán)境控制的區(qū)域以12小時白天和12小時黑暗的循環(huán)飼養(yǎng)在HEPA過濾的籠中。 自由取用食物和水。所有的程序由University of Queensland Ethics Committee批準(zhǔn)。動 物在整個研究中密切監(jiān)測。所有的動物在研究過程中保持良好的健康且無可見的有害健康 的影響。免疫前血液樣品通過使用肝素涂覆的血細(xì)胞比容管(HirschmannLaborgerSte，： Heilbronn，Germany)的眼眶后出血收集。在首次免疫之前收集的免疫前血液樣品被稱為免 疫前(PI)樣品。下面的表2顯示了研究中的不同處理組。如上所述在無菌條件下制備吸附反 應(yīng)物。將QuilA(Superfos Biosector，Vedback,Denmark)以2mg/ml重懸浮在無菌注射用水 (Pfizer, Brooklyn , USA)中?？勺⑸涞膭┝客ㄟ^四次皮下注射施用至尾基部以研究通過 0ptiE2 裝載的 SV-10-x-140、0ptiE2 裝載的 SV-10-x-140+QuilA、0ptiE2 裝載的 SV-10-x-100-A和0ptiE2裝載的SV-10-X-100-A+QuilA產(chǎn)生的免疫應(yīng)答之間的差異。小鼠的陽性對照 組接受50yg 0ptiE2蛋白和 10yg QuilA。陰性對照組接受SV-lO-x-140和SV-10-X-100-A (250yg)囊泡+Quil A(10yg)的注射。100μ1的劑量體積(在0.9%鹽水中，Pfizer)通過使用 無菌27號針頭(Terumo, Tokyo, Japan)在尾基部皮下注射施用。三次注射以2周間隔向所有 的處理組施用，除未免疫組以外；在最終免疫后14天處死小鼠。使用酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)研究0ptiE2特異性抗體應(yīng)答和使用ELIS0PT測定研究細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。
[0227] 表2:小鼠試驗中的免疫組。所有劑量在尾基部施用。
[0229] ELISA 方案
[0230] 0ptiE2特異性抗體應(yīng)答的檢測：用于檢測0ptiE2特異性抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)通過用PBS中的0ptiE2抗原溶液(2ngyL-l，50yL)在4°C對微量滴定板(96孔，Nunc， Maxisorb，Roskilde，Denmark)涂覆過夜來進(jìn)行。除去涂覆溶液，將板用PBS-T(PBS(1 X )， Tween_20(0 · 1 % )，Sigma-Aldrich)洗滌一次，并用PBS(200yL)中的牛血清白蛋白（BSA， 5%，Sigma-Aldrich)和脫脂乳（5%，F(xiàn)onterra,Auckland,New Zealand)在RT輕輕搖動封閉 1小時。板用PBS-T洗滌三次。小鼠血清樣品在roS( 50yL)中從1:100稀釋至1:6400，將各稀釋 液加入到經(jīng)封閉的板的孔中隨后在室溫下溫育2小時。為了檢測小鼠抗體，將在PBS中稀釋 至1:1000的HRP綴合的多克隆綿羊抗小鼠 IgG抗體(Chemicon Australia，Melbourne，VIC, Australia)加入到每個孔中，并在室溫下輕輕搖動溫育1小時。將板在roS-T中洗滌三次。將 TMB底物（100yL，Sigma-Aldrich)加入到每個孔中，并在室溫下溫育15分鐘;將HCl(lN，100y L)加入到孔中以停止生色反應(yīng)。在Labsystems Multiskan RC板掃描儀上以450nm讀板。
[0231] 鼠脾細(xì)胞的分離和ELISP0T測定
[0232] 在安樂死后無菌取出脾臟并置于補(bǔ)充有胎牛血清（FBS，10% )、Hepes(20mM，pH 7.3)、丙酮酸鈉（1M)、Glutamax(lM)、青霉素 G、鏈霉素、兩性霉素 B(計算各自的最終量)的冰 冷的DMEM培養(yǎng)基(5mL)中。將脾臟輕輕破碎，并使用注射器柱塞通過尼龍網(wǎng)（100mm，Be Ct〇n Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)。細(xì)胞用DMEM(5mL)洗滌并離心（800g，5min，4°C )，然后重 懸浮于裂解緩沖液(NH4C1(0.15M)，KHC03(10mM)，Na2-EDTA(0.1 mM)，lmL)中，在室溫下 5 分 鐘。重復(fù)兩次洗滌步驟，每次用DMEM(9mL和5mL)。細(xì)胞沉淀重懸浮于DMEM(2mL)中并且細(xì)胞 數(shù)目通過用臺盼藍(lán)(0.2%)染色來測定。來自每只小鼠脾臟的細(xì)胞以1.0-1.5xl0 5細(xì)胞/孔 一式三份接種在用單克隆干擾素-g(IFN- γ )(Mabtech)捕獲抗體預(yù)涂覆的聚偏二氟乙稀 (PVDF)ELISPOT板中。細(xì)胞在完全DMEM培養(yǎng)基中在37°C和5%⑶ 2在0ptiE2抗原（lmg/mL， SIINFEKL，Auspep，Parkvi lie，VIC, Australia)或作為陽性對照的多克隆活化劑伴刀豆球 蛋白A( Con A，lmg/mL, Sigma Aldrich)的存在或不存在下溫育40小時。IFN- γ ELI SPOT測定 根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。ELISPOT平板在ELISPOT讀數(shù)儀（Autoimmun Diagnostika， Strassburg，Germany)上讀取。
[0233] 莖里
[0234] SV的特征
[0235] 圖1顯示了兩個場發(fā)射SEM圖像(A和B)，顯示SV-10-50(圖像A)和SV-10-50-140(圖 像B)均具有低于100nm的均勻粒度的球形形態(tài)。在圖2中，合成的SV-10-X-100的TEM圖像顯 示具有約50nm直徑和約5nm壁厚度的單層囊泡（圖2A)。從更高的放大倍率的TEM圖像（圖 2B)，可以看出，在囊泡壁中形成二氧化硅-空隙-二氧化硅的夾心樣單層結(jié)構(gòu)，表明如在圖3 中所示的二氧化硅-表面活性劑復(fù)合物的存在。在煅燒后，SV-10-50保持單層囊泡結(jié)構(gòu)，如 圖4A中所示的，并且球形體可以在囊泡壁內(nèi)部清楚地觀察到，表明二氧化硅囊泡具有由這 些球形體構(gòu)成的囊泡壁結(jié)構(gòu)，為在硅質(zhì)壁中的氣泡狀空隙，其可以是彼此分開的或者可以 相互連接以形成從外部到SV的內(nèi)部腔的通路。這在圖4B中清楚地看到。SV-10-50-140也保 持單層囊泡結(jié)構(gòu)（圖4C)，并且約15nm的入口尺寸可以在壁上觀察到，如圖4D中所示的。
[0236] 在二氧化硅囊泡壁中空隙的存在通過犯吸附分析進(jìn)一步證實(shí)。圖5A顯示了在步驟 (b)中的40-70°C的熱處理的SV樣品的氮吸附-脫附等溫線，其均顯示具有H2型滯后回線的 IV型等溫線，表明已被暴露于第二步驟中的"中間"溫度處理的這四個樣本顯示出類似的孔 結(jié)構(gòu)。來自N2吸附結(jié)果的更多結(jié)構(gòu)信息示于表1中。圖5B顯示了已被暴露于2、2.5、3.5、5、8 和10巴壓力下的120、130、140、150、170和180 °C的水熱處理溫度的SV樣品的氮吸附等溫線， 這些被發(fā)現(xiàn)是典型的IV型等溫線，其中隨著水熱處理溫度的升高脫附分支迀移至較高的相 對壓力。BdB方法被用來從氮吸附等溫線的吸附分支計算腔尺寸，并且入口尺寸使用BJH法 從脫附分支計算。圖5C中的BdB孔徑分布曲線顯示以40-70Γ進(jìn)行的步驟(b)的SV樣品中以 約2和15nm為中心的峰，并且對于經(jīng)受1-10巴壓力下100-180 °C的水熱處理溫度的SV樣品， 如圖5D中所示，從脫附分支計算的BJH孔徑分布曲線顯示峰隨著溫度的升高迀移至右邊，這 表明增加的入口尺寸。
[0237] 值得注意的是，所有的SV樣品顯示40-50nm的BdB計算的內(nèi)腔尺寸（圖6)，這表明所 有的SV樣品具有在此范圍內(nèi)的類似腔尺寸。如總結(jié)于下表3中的，SV的孔入口尺寸可以在6-16nm的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。
[0238] 表3:來自N2吸附結(jié)果的結(jié)構(gòu)信息
[0239]
[0240] X:在10°C下連續(xù)攪拌后進(jìn)行直接水熱處理的樣品。VP:總的孔體積；SBET: BET表面 積。
[0241] 煅燒后的SV-10-70的TEM圖像（圖7A)顯示具有符合已對SV-10-50所觀察的孔壁結(jié) 構(gòu)的類似的囊泡結(jié)構(gòu)。相反，在煅燒之后的SV-10-x-100、SV-10-x-130和SV-x-180的TEM圖 像(圖7B-D)中沒有觀察到孔壁結(jié)構(gòu)，表明中等或中間溫度的第二處理步驟對于適當(dāng)?shù)目妆?結(jié)構(gòu)形成是必不可少的。具有約10和30nm的尺寸的孔入口也可分別觀察到（圖7C和D)，這是 符合N 2吸附結(jié)果的。
[0242] 相比較而言，僅用10分鐘攪拌隨后24小時靜態(tài)處理產(chǎn)生的SV樣品的TEM圖像顯示 沒有囊泡結(jié)構(gòu)。相反，分別如圖8A和B中顯示的，觀察到短的管狀結(jié)構(gòu)和無定形二氧化硅結(jié) 構(gòu)。相較于在連續(xù)攪拌下實(shí)現(xiàn)的均勻白色反應(yīng)混合物，如圖8C中所示，不進(jìn)行連續(xù)攪拌的反 應(yīng)混合物分離成透明下層相和白色凝膠狀上層相，如圖8D中所示。SV-20-X-100的TEM圖像 顯示囊泡和管狀結(jié)構(gòu)的混合物，圖8E。從這個結(jié)果清楚的是，某種形式的攪拌對于形成所需 囊泡形態(tài)是至關(guān)重要的。
[0243] 低溫-TEM和ATR-FTIR觀察結(jié)果
[0244]為了理解SV形成機(jī)制，低溫-TEM被用于研究在步驟(a)(圖3中的T1)期間不同時間 點(diǎn)形成的囊泡結(jié)構(gòu)。如圖9A中所示，在添加二氧化硅源(TE0S)前，嵌段共聚物B50-6600表面 活性劑是直徑小于20nm的膠束形式。這表明在12小時沒有預(yù)成形的囊泡模板在合成中使用 (圖9B)，并且SV的形成是表面活性劑和二氧化硅低聚物的協(xié)作自組裝。加入TE0S后15小時 后，自組裝的二氧化硅-表面活性劑囊泡可以被觀察到（圖9C)，但是，沒有孔壁結(jié)構(gòu)可在步 驟1的結(jié)束時被觀察到（圖9D)。因此顯而易見的是，孔壁結(jié)構(gòu)僅在中等溫度下的后續(xù)處理中 形成。
[0245] 除了上面所討論的低溫TEM，ATR_FTIR光譜也被用于監(jiān)測反應(yīng)混合物中形成的化 學(xué)物質(zhì)。如圖3所示的，對步驟(a)或T1的不同反應(yīng)時間（3，6，9，12，15和24小時）的反應(yīng)混合 物的ATR-FTIR光譜進(jìn)行了測量。圖10A顯示了出現(xiàn)在877、1045和1272〇11_ 1的三個特征峰，這 可以分別歸因于Et0H(v(C-0)+v(C_C))和(p'（CH3)+p(CH 2))。在964CHT1觀察到的弱和寬的 帶與Si-ΟΗ基團(tuán)的Si-Ο拉伸相關(guān)聯(lián)。Si-0-Si在凝聚的二氧化硅中的振動表現(xiàn)出1050-WOOcnf 1區(qū)域中的寬峰，其分配是復(fù)雜的。來自步驟一的所有光譜顯示在783，960(p(CH3))， 1084(v(C-0)/(C-0) + (C-C))，1105(p，（CH3))，1167(p(CH3))，1272(t(CH2))，1396(S s(CH3)) cnf1的相同特征帶，其可以被分配至-S i -OCH2CH3基團(tuán)。
[0246] 在如圖3中所示的步驟(a)或T1中整個24小時反應(yīng)期間-Si-〇CH2CH 3基團(tuán)的存在顯 示TE0S的水解速率是緩慢的，這可歸因于烷氧基的空間位阻效應(yīng)。在878和1045cnf1 (均歸因 于乙醇）上條帶的強(qiáng)度隨反應(yīng)時間緩慢增加，這表明TE0S的水解速率是緩慢的并且乙氧基 的水解反應(yīng)在步驟(a)或T1的時間窗口中持續(xù)。值得注意的是，來源于乙氧基的水解的硅醇 基團(tuán)也應(yīng)顯示約960CHT 1的特征帶(Si-Ο拉伸）。但是，考慮到釋放的乙醇的量有限和因而產(chǎn) 生少量硅醇，硅醇的峰可以與與SiOCH 2CH3相關(guān)聯(lián)的帶重疊，因此可能不被觀察到。此外，通 過比較在1050-12000^ 1范圍內(nèi)的特征峰，在TE0S系統(tǒng)中沒有觀察到此區(qū)域中的明顯的帶變 寬（指示-Si-0-Si的形成），即TE0S的縮合速率也很慢。因此，在步驟(a)或Τ1中占主導(dǎo)地位 的硅質(zhì)物質(zhì)均為部分水解的硅醇和未反應(yīng)的疏水乙氧基。在步驟(a)或T1中的疏水性二氧 化硅低聚物導(dǎo)致二氧化硅/表面活性劑復(fù)合物的高g因子。囊泡的形成被假定為來自復(fù)合層 的彎曲和閉合，這類似于表面活性劑囊泡的形成。
[0247] 在如圖3中所示的步驟(b)或T2中3和6小時的反應(yīng)產(chǎn)物的ATR-FTIR光譜也進(jìn)行了 測量并顯示于圖10B中。所有特征峰(876，1045，1086，1277，1348，1413和1452cm-〇可分別歸 因于Et0H(v(C-0)+v(C_C))和(p'（CH 3)+p(CH2))。沒有峰可以被分配至-Si-0CH2CH3基團(tuán)，表 明TE0S在這個步驟中具有快得多的水解速度，和在二氧化硅囊泡-表面活性劑復(fù)合物內(nèi)在 步驟(b)中從-Si -0CH2CH3基團(tuán)至硅醇在中等溫度下的低凝縮率。在步驟(b)中的該疏水性二 氧化硅低聚物導(dǎo)致二氧化硅/表面活性劑復(fù)合物的低g因子，這產(chǎn)生二氧化硅/表面活性劑 復(fù)合物的高彎曲變化而不改變囊泡骨架以在硅質(zhì)壁內(nèi)形成孔壁結(jié)構(gòu)。這些二氧化硅囊泡的 所提出的形成機(jī)制在圖3中描述。
[0248] 細(xì)胞色素 c的裝載和染色
[0249] 圖11顯示在測試的中空二氧化硅囊泡中第5分鐘的細(xì)胞色素 c的高吸附量，這表明 煅燒后SV-10-50和SV-10-50-140的非?？焖俚奈?。吸附水平在5分鐘后保持相對穩(wěn)定，表 明已在該短時間段達(dá)到最大吸附量。裝載的細(xì)胞色素 C的量對于SV-10-50、SV-10-50-140分 別為620、642mg/g。
[0250] 50 %乙醇溶液中的5 % UAT被用作針對HSV中裝載的細(xì)胞色素 c的染色劑。相同的染 色方法適用于作為對照的純SV-10-50-140-C(即煅燒后），圖12A中所示的TEM圖像與沒有染 色的HSV的圖像是相似的，表明硅質(zhì)材料不會被UAT染色。圖12B顯示了具有較高對比度的腔 (較暗的腔，由白色箭頭指示）的幾個二氧化硅囊泡，所述腔是染色的細(xì)胞色素 c。腔的高對 比度隨著高傾斜角保持平均，如圖12C和D中所見的，這表明細(xì)胞色素 c是由HSV均勻吸附的。 此染色方法也適用于SV-10-50囊泡（圖13)。
[0251] 核糖核酸酶A的裝載和染色
[0252] 圖14中所見的FTIR光譜顯示在疏水性修飾后囊泡上十八烷基的特征峰，表明疏水 性基團(tuán)成功移植到二氧化硅囊泡上。對于SV-10-50和SV-10-50-140在疏水性修飾后在18小 時的RNA酶A的吸附量分別是206 ± 6和276 ± 8mg/g。50 %乙醇溶液中的5 % UAT被用作針對SV 中裝載的細(xì)胞色素 c的染色劑。相同的染色方法適用于疏水性修飾后的純SV-10-50,并且 TEM圖像（圖15)與沒有染色的SV的圖像是相似的，表明硅質(zhì)材料不會被UAT染色。圖15B顯示 了具有較高對比度的腔(較暗的腔）的單個二氧化硅囊泡，所述腔被認(rèn)為代表染色的RNA酶 A。RNA酶A已被顯示由SV均勻地吸附。
[0253] 細(xì)胞培養(yǎng)和攝取
[0254] 如上所述的已用FITC標(biāo)記的二氧化硅囊泡通過共聚焦顯微鏡研究來可視化細(xì)胞 攝取。如在圖16中所示，當(dāng)將細(xì)胞與FITC標(biāo)記的SV-10-50和SV-10-50-140溫育時，源自FITC 的強(qiáng)綠色熒光信號在細(xì)胞內(nèi)檢測到，表明HSV容易被SCC25癌細(xì)胞吸收（圖16H和L) AITC標(biāo) 記的SV-10-50-140顯示出更強(qiáng)的信號，表明由SCC25細(xì)胞內(nèi)化的增加的量的SV-10-50-140。
[0255] 細(xì)胞毒性
[0256] RNA酶A被視為強(qiáng)的蛋白合成破壞劑，其可降解mRNA和tRNA來影響細(xì)胞存活性。據(jù) 報道，RNA酶A的熱變性減少M(fèi)CF-7細(xì)胞系中的細(xì)胞毒性，其中RNA酶A綴合在致密的二氧化硅 納米顆粒的外表面上。游離的RNA酶A、RNA酶A裝載的SV、SV和相應(yīng)的變性樣品的抗癌效應(yīng)在 人皮膚癌SCC25細(xì)胞中進(jìn)行了研究。細(xì)胞用游離的RNA酶A、RNA酶A-SV、變性RNA酶A或變性 RNA酶A-SV以相同濃度的RNA酶A進(jìn)行處理。SV濃度從SV中RNA酶A的吸附量計算。
[0257] 圖17中的結(jié)果表明，SV-10-50和SV-10-50-140在24小時在分別78和58μg/ml的濃 度下均顯示出對SCC25細(xì)胞幾乎沒有毒性。SV-10-50-140顯示在72小時的低毒性（17 %抑 制），這表明這兩種SV種類均是生物相容的納米載體。游離的RNA酶A和變性后的游離RNA酶A 表現(xiàn)出對SCC25細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。相較于游離的RNA酶A，RNA酶A裝載的SV-10-50和疏水性 修飾后的SV-10-50-140在很長一段時間范圍內(nèi)顯示出最高的細(xì)胞毒性（分別地在24小時 17 %、26%和在72小時54%、43%的抑制）。有趣的是，相較于游離的RNA酶A，加熱和強(qiáng)酸變 性后的RNA酶A裝載的SV表現(xiàn)出對SCC25細(xì)胞高的細(xì)胞毒性，對于SV-10-50和SV-10-140分別 為在24小時14%、22%和在72小時48%、38%的抑制。變性后的1?嫩酶4-3￥顯示比未變性的 RNA酶A-SV的略低的細(xì)胞毒性。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的SV可以提供對RNA酶A的保護(hù)，RNA酶 A被證明吸附在二氧化硅囊泡內(nèi)，從而避免惡劣的條件。RNA酶A裝載的SV-10-50-140由于其 較高的細(xì)胞內(nèi)化效率而表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性。
[0258]疫苗遞送系統(tǒng)相關(guān)結(jié)果
[0259] 體外細(xì)胞毒性研究
[0260] 對SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α囊泡的體外細(xì)胞毒性通過MDBK細(xì)胞的臺盼藍(lán)染 料排除染色來測定。將細(xì)胞用不同濃度(0.5,0.1和0.01mg/ml)的SV-10-χ-140和SV-10-χ-100 -A囊泡處理。死細(xì)胞由于染料通過透化的細(xì)胞膜的吸收而呈藍(lán)色，而活細(xì)胞保持完整并 不吸收染料。〇.lmg/ml和0.01mg/ml的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α沒有顯示出對細(xì)胞存 活性的任何毒性作用（圖18，b，c，e和f)。然而，0.5mg/ml的SV-lO-x-lOO-Α在20小時溫育后 對MDBK細(xì)胞具有毒性作用（圖18a)。用較低濃度的SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α囊泡溫育 的細(xì)胞看起來與無囊泡的單獨(dú)溫育的細(xì)胞是相當(dāng)?shù)模虼?，所有進(jìn)一步的實(shí)驗研究使用SV-10-x-l 40 和 SV-lO-x-lOO-Α 囊泡進(jìn)行。
[0261] 吸附和脫附分析
[0262] 0ptiE2蛋白裝載到SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α囊泡上，如上所述。0ptiE2的分 子量為ASkDaADS-PAGE分析用于測定是否存在至顆粒的吸附。結(jié)合上清液的蛋白測定和質(zhì) 量平衡方程的應(yīng)用用于測定至SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-Α囊泡的0ptiE2吸附量。200yg OptiE2結(jié)合至lmg SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A囊泡，如通過蛋白測定法測定的。脫附研 究對 0ptiE2 裝載的 SV-lO-x-140 和 SV-lO-x-lOO-Α 進(jìn)行。
[0263] 為了研究脫附，將0ptiE2裝載的囊泡沉淀物重懸浮于不同的緩沖液，其包括0.1N HCL、0.1 % SLS和pH 4.0的檸檬酸鹽緩沖液。將樣品在37 °C在搖床上溫育120分鐘。對脫附的 上清液和顆粒級分的凝膠分析表明，在〇. IN HCL和pH 4.0檸檬酸鹽緩沖液的存在下，蛋白 仍然強(qiáng)烈地結(jié)合至囊泡并且它沒有從SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A脫附（圖19)。
[0264] 圖19中呈現(xiàn)的分析結(jié)果的詳細(xì)內(nèi)容如下：（a)0ptiE2裝載的納米顆粒的評估，泳道 1: 0ptiE2蛋白；泳道 2: 0ptiE2 裝載的 SV-lO-x-lOO-A 上清液;泳道 3: 0ptiE2 裝載的 SV-10-x-100-A-納米顆粒沉淀;泳道4: 0ptiE2裝載的SV-lO-x-140上清液;泳道5: 0ptiE2裝的SV-10-x-140納米顆粒沉淀；（b)0ptiE2裝載的納米顆粒的脫附研究，泳道1:在0.1N HCL中脫附的 0ptiE2裝載的SV-lO-x-lOO-A上清液;泳道2:在0 · IN HCL中脫附的0ptiE2裝載的SV-10-x-100-A納米顆粒沉淀;泳道3:在0.1 % SLS中脫附的0ptiE2裝載的SV-lO-x-lOO-A上清液;泳 道4:在0.1 % SLS中脫附的0ptiE2裝載的SV-lO-x-lOO-A納米顆粒沉淀;泳道5:在檸檬酸鹽 緩沖液(pH-4.0)中脫附的0ptiE2裝載的SV-lO-x-lOO-A上清液;泳道6:在檸檬酸鹽緩沖液 (pH-4.0)中脫附的0ptiE2裝載的SV-lO-x-lOO-A納米顆粒沉淀;泳道7:在0.1 N HCL中脫附 的0ptiE2裝載的SV-lO-x-140上清液;泳道8:在0.1N HCL中脫附的0ptiE2裝載的SV-10-x-140納米顆粒沉淀;泳道9:在0.1 % SLS中脫附的0ptiE2裝載的SV-lO-x-140上清液;泳道10: 在0.1 % SLS中脫附的0ptiE2裝載的SV-lO-x-140納米顆粒沉淀;泳道11:在檸檬酸鹽緩沖液 (pH-4.0)中脫附的0ptiE2裝載的SV-lO-x-140上清液;泳道12:在檸檬酸鹽緩沖液(pH-4.0) 中脫附的0ptiE2裝載的SV-lO-x-140納米顆粒沉淀。
[0265] 在0.1%SLS的存在下觀察到從囊泡脫附的非常低的量的蛋白。SV-lO-x-140和SV-10-X-100-A顯示類似的吸附和脫附特性。SV-lO-x-140和SV-lO-x-lOO-A具有不同的孔徑， 因此為了研究當(dāng)與傳統(tǒng)的佐劑Quil A共同施用時0ptiE2蛋白是否不同地結(jié)合至這些顆粒 (內(nèi)部地或外部地），并且是否具有對免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的效應(yīng)，使用SV-lO-x-140和SV-10-x-100-A囊泡進(jìn)行了體內(nèi)實(shí)驗。
[0266] ELISA 數(shù)據(jù)
[0267] 小鼠用如表2中所述的疫苗制劑免疫。經(jīng)免疫的小鼠的總I gG應(yīng)答通過抗-Opt iE2 特異性ELISA測定在3次皮下疫苗注射后進(jìn)行分析。0ptiE2裝載的HSV疫苗制劑在注射前新 鮮制備。來自小鼠的PI血清樣品在試驗開始時收集，隨后的血清樣品在6周時期以兩個星期 的間隔在每次注射后收集。所有小鼠在整個實(shí)驗保持正常的體重范圍。來自末端出血的 ELISA 結(jié)果（圖 20)表明免疫原性組合物處理組(0ptiE2+SV-10-x-140,0ptiE2+SV-10-x-140 +Quil A，0ptiE2+SV-10-x-100-A，0ptiE2+SV-10-x-100-A+Quil A)和陽性對照組（0ptiE2 +Qui 1 A)顯示高達(dá)1:6400稀釋度的優(yōu)良的抗體滴度，其平均0D450nm為1.20。在沒有任何傳 統(tǒng)佐劑的情況下用0ptiE2+HSV(SV)施用的處理組引起與對于陽性對照組所見的相當(dāng)?shù)目?體應(yīng)答。用BVDV 0ptiE2裝載的未修飾的或官能化的HSV+Quil A注射小鼠組顯示出幾乎相 似的應(yīng)答。HSV和傳統(tǒng)佐劑的共施用不導(dǎo)致強(qiáng)健的免疫應(yīng)答，因為Qui 1 A在疫苗制劑中的存 在沒有顯著增加應(yīng)答?？贵w應(yīng)答的變化在接受0ptiE2+SV-10-x-100-A納米制劑的四只小鼠 之間觀察到。接受SV-10-x-140和SV-10-x-100-A HSV+Qui 1 A的陰性對照組顯示出對 0ptiE2表位的低背景抗體應(yīng)答。
[0268] ELISP0T 測定
[0269] 為了測定對0ptiE2抗原的T細(xì)胞介導(dǎo)的IFN-γ應(yīng)答，使用ELISP0T測定。在最后一 次免疫后兩周，收集和收獲來自處死小鼠的脾臟以獲得脾細(xì)胞群。接受納米疫苗制劑 0ptiE2+SV-10-x-140、0ptiE2+SV-10-x-140+Quil A、0ptiE2+SV-10-x-100-A以及0ptiE2+ SV-10-x-100-A+Quil A的小鼠顯示針對0ptiE2表位的優(yōu)良的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。來自 ELISP0T測定的結(jié)果（圖21，其中Ml至M4是每個組中的個體小鼠，黑條表示響應(yīng)于0ptiE2抗 原產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞的數(shù)目）表明接受抗原+中空二氧化硅囊泡的組看起來與用抗原裝載 的HSV+傳統(tǒng)佐劑施用的組差不多相似。然而，接受納米疫苗制劑的組顯示相較于陽性對照 組(OptiE2+Qui 1 A)更好的IFN- γ應(yīng)答，突出顯示了二氧化硅囊泡憑自身性質(zhì)作為優(yōu)秀佐 劑的效能。此外，用抗原裝載的HSV處理的組相較于用抗原裝載的HSV+傳統(tǒng)佐劑處理的組引 起更好的Τ細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。SV+傳統(tǒng)佐劑的共施用沒有顯著增加抗體應(yīng)答以及IFN-γ應(yīng) 答。陰性對照組、SV-10-x-140+Quil A、SV-10-x-100-A+Quil A和免疫組產(chǎn)生IFN-γ 應(yīng)答。 但是，反應(yīng)不是特異于0ptiE2抗原的，因為未免疫組也產(chǎn)生響應(yīng)于0ptiE2表位的IFN-γ應(yīng) 答。
[0270] 進(jìn)一步的納米疫苗實(shí)驗
[0271] 前述實(shí)驗清楚地表明，本發(fā)明的具有薄的殼壁、大的腔和入口尺寸的二氧化硅囊 泡改善了 0ptiE2蛋白吸附和釋放。此外，0ptiE2(50yg)/SV-140(250yg)制劑相較于陽性對 照組0ptiE2(50yg)+Quil A(10yg)誘導(dǎo)更高的抗-0ptiE2IgG以及IFN-γ應(yīng)答并用作自身佐 劑。在表明商業(yè)上有用的功效的同時，注意到為了獲得良好水平的抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫 應(yīng)答，動物接受三次納米疫注射的施用。這一成功導(dǎo)致本發(fā)明人開發(fā)出可以使用BVDV E2作 為模型病毒抗原產(chǎn)生長期免疫應(yīng)答的有效納米疫苗。
[0272] 一般討論;
[0273] 通常地，0ptiE2裝載的二氧化硅囊泡(SV)_140的長期體內(nèi)功能性在小鼠模型中通 過用0ptiE2+Quil A(100yg 0ptiE2+10yg Quil A)施用陽性對照組并用0ptiE2/SV-140 (100yg 0ptiE2吸附至500yg SV-140)施用納米疫苗處理組進(jìn)行測試。小鼠用兩次注射接 種，并在六個月的時期在八個不同的時間點(diǎn)采集血樣以分析抗體應(yīng)答。在最后一次免疫后 在第3周（四只小鼠）和25周（四只小鼠）的兩個不同的時間點(diǎn)收集來自處死小鼠的脾臟以測 定IFN- γ應(yīng)答。納米疫苗處理組0ptiE2/SV-140產(chǎn)生的BVDV特異性抗體應(yīng)答在全部8個時間 點(diǎn)與常規(guī)佐劑Quil A是相當(dāng)?shù)?。此外，?5周細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答(這對于識別和消除侵入的病 原體是必需的）在用0ptiE2/SV-140免疫的所有四只小鼠中相較于用OptiE2+Quil A免疫的 小鼠（473-1500斑點(diǎn)形成單位(SFU)/百萬個細(xì)胞)更高[1500斑點(diǎn)形成單位(SFU)/百萬個細(xì) 胞]。這些實(shí)驗證明SV誘導(dǎo)長期體液以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的能力。免疫組化研究也顯示 相較于BVDV E2Quil A，用BVDV E2SV制劑注射的小鼠中更高的應(yīng)答。此外，組織病理學(xué)分析 在3周和25周對動物的所有主要器官進(jìn)行以確保SV不具有有害效應(yīng)。在研究中使用的所有 動物在整個實(shí)驗期間保持健康。
[0274] 實(shí)驗
[0275] 0ptiE2 在 SV-140 上的吸附
[0276] 吸附反應(yīng)使用在2ml最終體積中含有0.2%Igepal CA630的無菌50mM Tris緩沖液 (ρΗ7·0)中的具有500yg 0ptiE2的2mg SV-140。該顆粒-蛋白漿液放置在室溫(RT)的200rpm 搖床上。24小時后移出顆粒-蛋白漿液的樣品（50μ1 )，并在16.2g下離心1分鐘。未結(jié)合的 Opt iE2蛋白的量通過在SDS-PAGE凝膠上的上清液和顆粒的電泳評估。
[0277] 在小鼠中進(jìn)行的免疫研究
[0278] C57BL/6J小鼠購自且在無特定病原體條件下飼養(yǎng)于Biological Resource Facility,The University of Queensland,Brisbane,Australia。八周大的雌性小鼠以每 組8只動物在環(huán)境控制的區(qū)域以12小時白天和12小時黑暗的循環(huán)飼養(yǎng)在HEPA過濾的籠中。 自由取用食物和水。動物在整個研究中密切監(jiān)測。所有的動物在研究過程中保持良好的健 康且無可見的有害健康的影響。
[0279] 免疫前血液樣品通過使用肝素涂覆的血細(xì)胞比容管（H i r s c h m a η η Lab〇rgerSte,Hei lbronn，Germany)的眼眶后出血收集。在首次免疫之前收集的免疫前 血液樣品被稱為免疫前(PI)樣品。如上所述在無菌條件下制備吸附反應(yīng)物，并且在制備最 終可注射劑量之前在lmL鹽水中洗滌吸附的0ptiE2/SV沉淀。將QuilA(Superf〇S Biosector，Vedback，Denmark)以2mg/mL重懸浮在無菌注射用水（Pfizer，Brooklyn，USA) 中。施用可注射的劑量以研究通過0ptiE2+Quil A、0ptiE2/SV-140和未免疫組產(chǎn)生的免疫 應(yīng)答之間的差異。小鼠的陽性對照組接受l〇〇yg OptiE2蛋白和10yg Qui 1A。處理組接受 0ptiE2(100yg)裝載的SV-140(500yg)注射（下表ShlOOyL的劑量體積（在0.9%鹽水中， Pfizer)通過使用無菌27號針頭(Terumo, Tokyo，Japan)在尾基部皮下注射施用。兩次注射 以3周間隔向所有的處理組施用，除未免疫組以外。在最終免疫后21天處死各組的四只小 鼠。來自剩余的四只小鼠的血液樣品每4周收集多至25周，并且在試驗期結(jié)束時處死動物。 每周一次對動物稱重并監(jiān)測其健康。此外，還觀察它們的臨床體征，并將疾病的任何體征如 下轉(zhuǎn)換成數(shù)字評分:〇 =正常，1-4=中等變化，動物需要每日檢測，5-10 =重大變化：由顧 問-動物設(shè)施的首席獸醫(yī)官每日兩次監(jiān)測，>10 =安樂死。
[0280] 表3:進(jìn)一步的小鼠試驗中的免疫組。所有劑量在尾基部施用。
[0282] 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方案
[0283] 0ptiE2特異性抗體應(yīng)答的檢測：用于檢測0ptiE2特異性抗體的ELISA通過用PBS中 的0ptiE2抗原溶液（2ng/μL，50μL)在4°C對微量滴定板（96孔，Nunc，Maxisorb，Roskilde， Denmark)涂覆過夜。除去涂覆溶液，將板用PBS-T( 1 X PBS，0.1 % Tween-20，Sigma-Aldrich) 洗滌一次，并用200yL PBS中的牛血清白蛋白（5%，Sigma-Aldrich)和脫脂乳（5%， Fonterra,Auckland,New Zealand)在RT輕輕搖動封閉1小時。板用PBS-T洗滌三次。
[0284] 小鼠血清樣品在50yL PBS中從1:100稀釋至1:6400,將各稀釋液加入到經(jīng)封閉的 板的孔中隨后在室溫下溫育2小時。為了檢測小鼠抗體，將在PBS中稀釋至1:50000的HRP綴 合的多克隆綿羊抗小鼠 IgG抗體(Chemicon Australia,Melbourne，VIC,Australia)加入到 每個孔中，并在室溫下輕輕搖動溫育1小時。將板在PBS-T中洗滌三次。將TMB底物（100yL， Life Technologies)加入到每個孔中，并在室溫下溫育10分鐘；將100yL IN HC1加入到孔 中以停止生色反應(yīng)。在BioTek微板讀數(shù)儀(Winooski，US)上以450nm讀板。
[0285] 鼠脾細(xì)胞的分離和酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)(ELISP0T)測定
[0286] 在安樂死后從在最終免疫后3周處死的4只動物和25周處死的另外四只動物無菌 取出脾臟，將收集的脾臟置于補(bǔ)充有10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)、20mM Hepes (pH 7 · 3)、1M丙酮酸鈉、1M Glutamax、100單位/mL青霉素 G、100yg/mL鏈霉素、0 · 25yg/mL兩 性霉素 B的5mL冰冷的DMEM培養(yǎng)基中。將脾臟輕輕破碎，并使用注射器柱塞通過100μπι尼龍網(wǎng) (Becton Dickinson)。細(xì)胞用5mL DMEM洗滌并離心（800g, 5min，4°C )，然后重懸浮于lmL裂 解緩沖液(0.15M NH4Cl，10mM KHC03,0.1mM Na2-EDTA)中，在室溫下5分鐘。重復(fù)兩次每次用 DMEM(9mL和5mL)的洗滌步驟。細(xì)胞沉淀重懸浮于2mL DMEM中并且細(xì)胞數(shù)目通過用0.2%臺 盼藍(lán)染色來測定。來自每個小鼠脾臟的細(xì)胞以1.0-1.5xl05細(xì)胞/孔一式三份接種在用單克 隆干擾素 _γ (IFN-γ )(MabteCh，Sweden)捕獲抗體預(yù)涂覆的聚偏二氟乙烯(PVDF)ELISPOT 板中。細(xì)胞在完全DMEM培養(yǎng)基中在37°C和5 %⑶2在lyg/mL OptiE2抗原或作為陽性對照的 多克隆活化劑伴刀豆球蛋白A(Con A, lyg/mL,Sigma Aldrich)的存在或不存在下溫育40小 時。IFN-yELISPOT測定根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。ELISP0T平板在ELISP0T讀數(shù)儀 (Autoimmun Diagnostika,Strassburg,Germany)上讀取。
[0287] 免疫組織化學(xué)
[0288] 脾臟切片在3周和25周的時間點(diǎn)從處死的小鼠收集。將脾臟的一部分解剖并在OCT 中冷凍，使用Hyrax C60低溫恒溫器切割5μπι切片。將具有冷凍切片的載玻片固定于冰上的 冷乙醇中進(jìn)行8分鐘，然后在室溫干燥20分鐘。然后將載玻片在PBS中洗滌3 X 5分鐘，在RT干 燥20分鐘，并使用Dako筆在切片周圍標(biāo)記圓圈。切片然后在4°C用封閉緩沖液（l%BSA+5% FBS+PBS)溫育過夜。第二天，為了除去封閉液，將載玻片在PBS中洗滌3 X 5分鐘。切片然后用 Alexa Fluor 488山羊抗小鼠 IgG以1:500在室溫在黑暗中溫育1小時，然后在roS中洗滌載 玻片3X5分鐘。為了染色細(xì)胞核，隨后將切片用DAPI溫育5分鐘并在PBS中快速洗滌。將切片 用Pr〇Ij〇Il:g?Gold Antifade安裝介質(zhì)安裝并在顯微鏡下檢查。
[0289] 組織病理學(xué)
[0290]收集來自處死小鼠的心臟、腎臟、肝臟和注射部位并固定在10%福爾馬林中48小 時。進(jìn)一步處理器官并包埋在石錯中，用Leica RM 2245 Rotary Microtome切割8μηι切片。 然后使用下列蘇木精和曙紅染色程序?qū)⑶衅旧?。切片首先在二甲苯中脫?每次2分鐘， 換液3次），然后在無水乙醇中再水化(每次2分鐘，換液2次），在90 %乙醇中進(jìn)行2分鐘，在 70%乙醇中進(jìn)行2分鐘。然后在流動的自來水中洗滌2分鐘，并在蘇木精中染色3分鐘，并再 次在流動的自來水中洗滌2分鐘。然后將切片在70%的乙醇中洗滌2分鐘，在曙紅中染色3分 鐘。然后將切片在95 %乙醇中洗滌2分鐘，然后在無水乙醇中洗滌(每次2分鐘，換液3次）。最 后，將切片迅速脫水并固定在二甲苯中（每次2分鐘，換液3次)并安裝在DePeX中。然后將切 片在顯微鏡下觀察。
[0291] 莖里
[0292] 堅歷
[0293] 吸附測試通過用2mg SV-140溫育500yg 0ptiE2蛋白24小時來進(jìn)行。表達(dá)的0ptiE2 (下文被稱為Opt iE2或oE2，該術(shù)語可互換使用）的分子量為42kDa。收集蛋白和顆粒漿液并 分離至上清液和顆粒樣品，并通過SDS-PAGE分析以測定蛋白的吸附。凝膠分析表明在24小 時的結(jié)合后在上清液中沒有檢測到蛋白（圖22-泳道3)，在顆粒沉淀中觀察到0ptiE2與SV-140的完全結(jié)合(圖22-泳道4)。
[0294] ELISA 數(shù)據(jù)
[0295] 小鼠用oE2+Quil A和OE2/SV-140疫苗制劑(如表3中所示）以兩次皮下疫苗注射進(jìn) 行免疫，在25周時期以3星期的間隔在每次注射后收集血清樣品。在所有處理組中的動物保 持健康，并在整個實(shí)驗保持正常的體重范圍。免疫小鼠的總IgG應(yīng)答通過抗-〇E2特異性 ELISA測定進(jìn)行分析。在兩個時間點(diǎn)3周和25周的來自末端出血的ELISA結(jié)果(顯示于圖23和 24中）顯示用OE2/SV-140注射的納米疫苗處理組和陽性對照組oE2+Quil A顯示相似的減少 趨勢，如對于抗體應(yīng)答所預(yù)期的。未接受疫苗接種的陰性對照組沒有顯示特異于〇E2表位的 抗體應(yīng)答。
[0296] 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生
[0297] ELISP0T測定法用于測定響應(yīng)于oE2抗原的T輔助1型(Th 1)細(xì)胞介導(dǎo)的干擾素 -γ (IFN-γ )應(yīng)答。最終免疫后3周和25周后，收集和收獲來自各組的處死小鼠的脾臟以獲得脾 細(xì)胞群。接受納米疫苗制劑〇E2/SV-140的小鼠即使在最終免疫后25周也顯示針對 〇Ε2抗原 的優(yōu)異的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，如通過產(chǎn)生斑點(diǎn)形成單位(SFU)的細(xì)胞的數(shù)量所指示的。在 第3周，從四只處死小鼠（來自三個處理組)收集脾臟樣品。6周數(shù)據(jù)表明，OE2/SV-140誘導(dǎo)的 細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答(599-1500SFU/百萬個細(xì)胞）與oE2+Quil A(551-1500SFU/百萬細(xì)胞)是相 當(dāng)?shù)模驗槊總€處理組中的兩只小鼠顯示出低應(yīng)答并且另外兩只顯示高應(yīng)答(圖25)。
[0298] 在25周處死的四只小鼠顯示，相較于陽性對照組（473-1500SFU/百萬個細(xì)胞）， OE2/SV-140誘導(dǎo)更強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答（1500SFU/百萬個細(xì)胞）（圖26)<^ν-140囊泡在3周 以及25周后誘導(dǎo)抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答的能力突出顯示了其作為優(yōu)良的自身佐劑和疫苗 遞送載體的潛力。
[0299] 免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)
[0300] 免疫組織化學(xué)研究對小鼠脾臟切片進(jìn)行。將切片用Alexa Fluor488山羊抗小鼠 IgG染色，并用DAPI染色核。脾臟切片中的綠色代表抗體應(yīng)答的存在。〇E2/SV-140(圖27c和 d)不僅在最終免疫后3周產(chǎn)生抗體應(yīng)答，還在最終免疫后25周產(chǎn)生抗體應(yīng)答。相較于陽性對 照〇E2+Quil A，〇E2/SV-140的IgG應(yīng)答在兩個時間點(diǎn)（3周和25周）上顯示更強(qiáng)。在未免疫處 理組的切片中綠色的不存在確認(rèn)陰性對照組中的小鼠沒有產(chǎn)生抗體應(yīng)答。
[0301] 組織病理學(xué)數(shù)據(jù)
[0302]收集來自處死小鼠的心臟、腎臟、肝臟和注射部位并固定在10%福爾馬林中；對其 進(jìn)一步處理并用蘇木精和曙紅染料染色。組織病理學(xué)結(jié)果表明，OE2/SV-140納米疫苗的施 用在最終免疫后的時間點(diǎn)3周和25周對于心臟、腎臟、肝臟和注射部位不具有有害效應(yīng)，因 為用OE2/SV-140注射的小鼠的切片看起來與陰性處理組（未免疫的）相似（圖28i，ii，iii (比較c和d與e和f))。用〇E2+Quil A處理的動物的切片也看起來與未免疫組相似。這表明， 500yg的50nm SV-140的施用在動物中非常良好地耐受，并且其對于動物的主要器官不具有 任何有害效應(yīng)。
[0303] 使用BVDV E2的納米疫苗實(shí)驗的結(jié)論
[0304] 吸附在合理設(shè)計的SV-140上的〇E2即使在最終免疫后的25周后也誘導(dǎo)抗-〇E2IgG 以及IFN-γ應(yīng)答，表明SV用作有效的疫苗遞送媒介物和強(qiáng)力佐劑的潛力。以三周間隔用兩 個疫苗劑量施用動物，〇E2(100yg)+Quil A(10yg)和oE2(100yg)/SV-140(500yg)顯示抗體 應(yīng)答的相似減少趨勢。OE2/SV-140相較于陽性對照 〇E2+Quil A產(chǎn)生強(qiáng)健的長期的細(xì)胞介導(dǎo) 的應(yīng)答。免疫組織化學(xué)的結(jié)果證實(shí)，用OE2/SV-140處理的動物產(chǎn)生強(qiáng)烈的總IgG應(yīng)答并且組 織病理學(xué)研究顯示該注射較高劑量納米疫苗（500yg)對于動物的主要器官不具有衰弱效 應(yīng)。這些結(jié)果表明了 SV針對開發(fā)用于更安全和更有效的具有誘導(dǎo)長期體液以及細(xì)胞介導(dǎo)的 應(yīng)答的能力的亞單位疫苗的新平臺技術(shù)的開發(fā)是有用的。
[0305] 對無形體屬的納米疫苗實(shí)驗
[0306] 接下來，從以200yg/mg顆粒的高吸附率將BVDV-E2吸附至二氧化硅囊泡(SV)(特別 是SV-140)相關(guān)的實(shí)驗開始，決定將同樣的方法用于來自邊緣無形體(其是牛蜱熱的致病生 物體)的2種不同的蛋白，VirB9.1(56KDa)和VirB9.2(44kDa)。蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)。 VirB9.1使用GST標(biāo)簽在Rosetta(DE3)pLysS細(xì)胞中表達(dá)，通過在15°C下用0.2mM IPTG誘導(dǎo) 17小時。將所得的可溶性蛋白通過色譜法分別使用GST親和柱和Superdex 200 10/300 GL 尺寸排阻柱從細(xì)菌細(xì)胞裂解物純化。純化后，收集VirB9.1級分，濃縮并透析至PBS中用于進(jìn) 一步的工作。VirB9.2使用pET-SUMO在BL21(DE3)細(xì)胞中表達(dá)，通過在37°C下用ImM IPTG誘 導(dǎo)5小時。所得的蛋白從不溶性包涵體級分純化。增溶后，將VirB9.2透析至roS中用于進(jìn)一 步的工作。
[0307] VirB9.1和VirB9.2的吸附在lxTOS緩沖液中分別在4°C和室溫下進(jìn)行。在SV100顆 粒上的吸附率對于VirB9.1 為200yg/mg，對于VirB9.2為 ^Oyg/mgJirBg.l 在SV100-NH2、 SV140 和 SV140-NH2 上的吸附率也約為 SOOyg/mgJirBgj在 SV100-NH2、SV140 和 SV140-NH2 上 顯示相似的吸附（圖29)。這個數(shù)據(jù)證實(shí)SV顆粒用作除BVDV E2以外的抗原性重要的蛋白的 載體的能力。VirB9.2從SV100和SV140的脫附被發(fā)現(xiàn)比氨基官能化的顆粒更好（圖30)?；?這些觀察結(jié)果，將裝載有VirB蛋白的SV100用于小鼠試驗實(shí)驗。VirB9.1和VirB9.2均被吸附 至SV100顆粒用于在小鼠試驗中檢查其誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。將蛋白單獨(dú)吸附至顆粒上并 制備含有各個體蛋白和組合的兩種蛋白的納米制劑的顆粒(表4)。
[0308] 表4:小鼠試驗實(shí)驗組。
[0311] VirB9.1和VirB9.2已被顯示是連接蛋白并且連接蛋白的免疫可增加 T細(xì)胞依賴的 IgG應(yīng)答(連接識別）以及呈遞多于一個免疫原性蛋白（Morse等人.2012)。該實(shí)驗的初步數(shù) 據(jù)顯示吸附至SV100顆粒的VirB9.1和VirB9.2成功誘導(dǎo)體液免疫（圖31和32)。
[0312] 來自針對VirB9.1的末端血清(最后一次注射后3周）的ELISA結(jié)果也顯示出良好的 抗體應(yīng)答（圖33)。針對VirB9.2的末端血清的ELISA結(jié)果遵循關(guān)于VirB9.1的相似趨勢。在三 次注射后獲得的優(yōu)良的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答（圖34和35)還顯示與SV 100注射的VirB9.1和 ViRB9.2產(chǎn)生與作為傳統(tǒng)佐劑的Quil-A相當(dāng)?shù)囊恢聭?yīng)答。
[0313] 在試驗中，兩組小鼠還用VirB9.1和VirB9.2的組合注射(表4)。組3(表4)采用了傳 統(tǒng)的佐劑Quil-A，而組6包括含有在吸附后組合的單獨(dú)吸附的VirB9.1/9.2的注射制劑(作 為混合納米制劑）。用組合的VirB9.1和VirB9.2納米制劑免疫的動物表現(xiàn)出良好的體液（圖 31至33)和細(xì)胞介導(dǎo)的（圖34和35)免疫應(yīng)答，其與用個體VirB/SV制劑注射的小鼠的免疫應(yīng) 答是相當(dāng)?shù)?。更重要的是，用VirB9.1/SV單獨(dú)接種的動物顯示在ELISA(體液免疫應(yīng)答，圖31 至33)和ELI SPOT測定(細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，圖34b和35b)中極小的與VirB9.2蛋白的反應(yīng)性，反 之亦然。
[0314] 除了確認(rèn)SV用作體內(nèi)佐劑和載體蛋白的能力，來自組合免疫的免疫應(yīng)答還顯示， 各蛋白被免疫系統(tǒng)獨(dú)立地加工，這表明SV可用于產(chǎn)生多價疫苗，其可以能夠以單一劑量靶 向多種疾病。
[0315] 模型治療蛋白通過二氧化硅囊泡的吸附容量和蛋白穩(wěn)定性測試 [0316] 蛋白裝載量和二氧化硅囊泡的入口尺寸的相關(guān)性
[0317]本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的二氧化硅囊泡（SV)的入口尺寸可以從〈3.9調(diào)整至34nm (圖36中的菱形），而壁厚度保持在~6nm(圖36中的圓形）。在用- C18鏈?zhǔn)杷孕揎椇螅琒V的入 口尺寸在所有情況下減小l_2nm(圖36中的方形）。治療蛋白的裝載量與SV的入口尺寸的關(guān) 系已使用這些系列的SV進(jìn)行了研究。細(xì)胞色素 c(圖36中的倒置三角形）和核糖核酸酶A(由 三角形表示的RNA酶A)已被用作模型治療蛋白并且先前已討論過結(jié)果。
[0318]如在圖36中所示，這兩個系列的SV的顯示針對兩種模型蛋白隨入口尺寸增加的相 似的吸附容量趨勢：當(dāng)SV的入口尺寸等于壁度時，裝載能力達(dá)到最大(對于疏水性修飾的SV 上的RNA酶A為563mg/g，對于未修飾的SV上的細(xì)胞色素 c為840mg/g)。
[0319] 為了進(jìn)一步預(yù)測在官能化的SV樣品上吸附的RNA酶A的位置，計算了 RNA酶A吸附容 量/每單位表面積(mg/m2)(表5)，用吸附容量除以BET表面積，排除了用于蛋白吸附的不可 用微孔面積。具有相同的疏水性修飾和~50nm粒度的固體Stdber球體也被用于RNA酶A吸 附以與sv進(jìn)行比較，其顯示18小時后的rna酶A的89mg/g裝載量。對于修飾的Stdber球體， 清楚的是RNA酶A的吸附以單層吸附行為發(fā)生在外表面上。相較于5 0 nm的固體Stdb er球 體，SV-10-50-C18具有相同的尺寸但較弱的0.64mg/m2的吸附容量，其是Stdber球體 (1 · 13mg/m2)的一半。與固體StSber球體的情況下類似，RNA酶A只能被吸附到SV-10-50-C18的外表面上，因為它的入口尺寸比蛋白尺寸小。然而，排除微孔面積的BET表面積由通過 氮吸附測量的中空sv-io-5〇-c 18的內(nèi)部和外部表面積組成，其是固體Stdber球體的表面 積的兩倍，從而導(dǎo)致較低的吸附容量。s V -10 -10 0 - C i 8顯示1.51 m g / m2的容量，這比固體 Stdber球體中的容量稍高。SV-10-100-C18的入口尺寸在疏水性修飾后<3.9nm。雖然確切 的入口尺寸不能從氮吸附技術(shù)測定，但考慮到SV-10-100具有6nm的入口尺寸并且修飾后的 入口尺寸減小在l_2nm的范圍內(nèi)，可以推斷出，入口尺寸接近3 · 9nm。該入口尺寸接近蛋白尺 寸，從而RNA酶A可以裝載到腔中，從而導(dǎo)致相對高的吸附容量。具有比RNA酶A的尺寸大得多 的入口尺寸的sv-io-wo-c^psv-io-ho-Cm顯示兩倍于Sidber球體的每單位面積吸附 容量，表明RNA酶A不僅吸附在二氧化硅殼的表面上，還通過多層吸附進(jìn)入腔內(nèi)。
[0320] 表5:二氧化硅納米顆粒的計算的核糖核酸酶A吸附容量
[0322] SBET : BET表面積；SMicr。: t-曲線微孔面積；SBET-Micro : BET表面積-t-曲線微孔面積； CrNARA : RNA酶A吸附容量;(/ RNase A: RNA酶A吸附容量/m2 ( CRNA釀/SBET-Micro )
[0323] 疏水性修飾的SV中裝載的RNA酶A的熱穩(wěn)定性
[0324] RNA酶A的熱解折疊通過在10-130°C的范圍內(nèi)的差示掃描量熱法(DSC)測定。DSC使 用VP DSC微量熱計(MicroCal Company，USA)以60°C/h的加熱速率進(jìn)行。在典型的程序中， 將RNA酶A/SV以0.5mg/ml的RNA酶A濃度懸浮于1 OmM PBS溶液中。還僅使用SV以相同濃度制 備參考懸浮液。將參考和樣品懸浮液注射在相應(yīng)的細(xì)胞中用于DSC測量。還獲得游離RNA酶A 的DSC曲線。圖37顯示了以RNA酶A/SV懸浮液的溫度為X軸且表觀摩爾熱容(Cp)為y軸(其是 基線基底并且通過RNA酶A的濃度標(biāo)準(zhǔn)化）的一系列DSC曲線。游離RNA酶A的DSC曲線顯示了 指示RNA酶A的熱解折疊的吸熱峰。RNA酶A熱解折疊的中點(diǎn)溫度(T m)還被測量為以63.6°C為 中心，與文獻(xiàn)報道一致。裝載在SV-10-120-C18中的RNA酶A增加至~119°C，比RNA酶A/SV-10-50-Cis(71 · 9°C)和RNA酶A/SV-10-140-Ci8(74 · 9，118°C )的Im高得多。DSC結(jié)果顯示，相較于在 外表面上吸附RNA酶A的SV-10-50-C18和具有大入口尺寸的RNA酶A/SV-10-140-C 18,裝載在 具有~6nm的入口尺寸的疏水性修飾的SV中的RNA酶A顯示在PBS中最高的熱穩(wěn)定性。
[0325] 裝載在疏水性修飾的SV中的RNA酶A在酸和熱處理后的活性
[0326] 裝載在疏水性修飾的SV中的RNA酶A的穩(wěn)定性和活性用酸和熱處理進(jìn)行進(jìn)一步研 究。在處理程序中，將50μ1 0.01M HCl(pH 2)添加至裝載在SV中的~lmg RNA酶A。混合物保 持在65 °C40分鐘，然后用0.01M NaOH溶液(pH 12)中和直到pH達(dá)到7。最終的RNA酶A濃度隨 后稀釋至〇.5mg/ml。游離的RNA酶A也相應(yīng)處理作為對照組。為了研究處理后RNA酶A的二級 結(jié)構(gòu)變化，RNA酶A/SV懸浮液的圓二色(CD)光譜以SV懸浮液作為參考進(jìn)行測量。圖38顯示在 波長范圍 200-230nm 中的 CD 光譜的強(qiáng)度是 RNA 酶 A/SV-10-120-Ci8>RNA 酶 A/SV-10-140-Ci8> RNA酶A/SV-10-50-C18>RNA酶A/SV-10-120。更高的強(qiáng)度指示更多的二級結(jié)構(gòu)在處理后得到 維持。因此，裝載在SV-10-120-C 18中的RNA酶A顯示在酸和熱處理后的最高含量的二級結(jié)構(gòu)。
[0327] 酸和熱處理后的RNA酶A/SV-10-120-C18隨后用于細(xì)胞遞送以進(jìn)一步測試RNA酶A的 活性。采用先前描述的程序。如圖39中所示的，SV-10-120-C 18即使在72小時后仍顯示對 SCC25和HCT116細(xì)胞的最小化的細(xì)胞毒性，表明了官能化的SV樣品的優(yōu)異的生物相容性。當(dāng) SCC25和HCT116細(xì)胞用游離的RNA酶A處理時，沒有看到抑制，因為裸露的蛋白不能進(jìn)入細(xì) 胞。通過SV-10-120-C 18遞送的RNA酶A顯示時間依賴性細(xì)胞毒性，其中細(xì)胞抑制能力隨著暴 露時間從16μg/ml的RNA酶A濃度逐漸增加而增加（圖39A)。同樣的趨勢可在HCT 116細(xì)胞中觀 察到，其中細(xì)胞抑制為24小時的33%至48小時的48%，最后在72小時為69% ANA酶A/SV-10-120-C18的細(xì)胞抑制能力證實(shí)了在酸和熱處理后RNA酶A的穩(wěn)定性和保留的活性。
[0328]大多數(shù)治療蛋白具有脆弱的結(jié)構(gòu)，很容易經(jīng)歷變性或被蛋白酶消化。例如，蛋白需 要在口服遞送期間避免胃蛋白酶或胰蛋白酶消化，并在靜脈內(nèi)注射中避免纖溶酶。在本實(shí) 驗中，RNA酶六/3￥-10-120-(： 18用胰蛋白酶消化，并且剩余的完整RNA酶的量通過質(zhì)譜(MS)來 定量檢測。首先裝載在SV中的lmg RNA酶A用二硫蘇糖醇在60°C處理30分鐘。該過程是為了 打破游離RNA酶A中的二硫鍵。其次，將RNA酶A/SV在37 °C添加至roS溶液中的lmg/ml胰蛋白 酶（1: 50 )，振蕩約12h。然后將混合物離心，并將上清液從沉淀物中移除。將沉淀物點(diǎn)到 MALDI MPT 384板上，并在測試前與ΙμL CHCA溶液混合。樣品在Bruker Autoflex T0F/T0F III Smart光束上分析。在LP-PepMix模式中通過累積10個不同部位上在39%激光強(qiáng)度下的 200個激光射擊來獲得質(zhì)譜用于數(shù)據(jù)收集并進(jìn)行校準(zhǔn)。三個標(biāo)準(zhǔn)肽，血管緊張素 II(Mw = 1046.5Da)、ACTH-Clip(Mw = 2465.2Da)和促生長素抑制素28(Mw 3147.5Da)被用于校準(zhǔn)目 的，以減少可變性。圖40A顯示了RNA酶A/SV-10-120的MS，其顯示了以質(zhì)荷比從1000-5000變 化的一系列峰。這些峰可全歸因于胰蛋白酶對完整的RNA酶A的消化產(chǎn)生的肽。相比較而言， RNA酶A/SV-lO-WO-Ci^MS顯示在13.7k的質(zhì)荷比上的小峰，其是完整的RNA酶A的質(zhì)量。因 此，當(dāng)通過疏水性修飾的SV吸附時，RNA酶A的量在胰蛋白酶消化處理后得到保留，而在無修 飾的情況下裝載的RNA酶A被完全消化。
[0329]本文中所呈現(xiàn)的結(jié)果顯示，具有接近蛋白尺寸的入口尺寸的SV顯示出模型治療蛋 白的最高裝載量。通過用RNA酶A作為例子，可以預(yù)測，在SV-lO-UO-Ci^裝載的RNA酶A的位 置不僅在外表面上還在SV腔中。此外，這些實(shí)驗表明，具有~6nm的入口尺寸和疏水性修飾 的3￥-10-120-& 8顯示保護(hù)RNA酶A免受熱或潛在的酸或胰蛋白酶消化的不利條件。在SV-10-120-&8中裝載的RNA酶A還在即使用熱和強(qiáng)酸處理后顯示對癌細(xì)胞的成功抑制。該發(fā)現(xiàn)是令 人驚訝的，并提供了先前未在本領(lǐng)域中發(fā)現(xiàn)的重要認(rèn)識，其對于設(shè)計用于治療蛋白遞送的 有效的保護(hù)性納米載體將是至關(guān)重要的。
[0330]在以下權(quán)利要求中和在本發(fā)明的前述描述中，除非上下文清楚地要求，否則由于 表達(dá)語言或必要的含義，詞語"包括"，或其變體，包括"包含"或"含有"，以包含性意義使用， 即，指定所陳述的元素的存在，但不排除本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方案中的其它元素的存 在或添加。
【主權(quán)項】
1. 一種產(chǎn)生二氧化硅囊泡的方法，其包括以下步驟： (a) 通過將可水解的二氧化硅源添加至包含嵌段共聚物的水溶液來產(chǎn)生二氧化硅制 劑，將所述二氧化硅制劑保持在低于20°C的溫度，并攪動所述制劑直至形成二氧化硅-聚合 物復(fù)合囊泡，隨后進(jìn)行步驟(b)或步驟(c); (b) 升高含有二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡的二氧化硅制劑的溫度至25°C至100°C，并攪 動混合物以形成在囊泡壁內(nèi)具有球形結(jié)構(gòu)的二氧化硅-聚合物復(fù)合囊泡； (c) 使所述囊泡暴露于水熱處理;和 (d) 煅燒所述囊泡，以由此產(chǎn)生二氧化硅囊泡。2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述可水解的二氧化硅源是烷基正硅酸鹽。3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述嵌段共聚物是烯烴三嵌段共聚物。4. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述嵌段共聚物是聚（氧化乙烯）_聚（氧化烯 烴)_聚(氧化乙烯)嵌段共聚物。5. 前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中在步驟(a)中，將所述二氧化硅制劑保持在5°C 至15 °C的溫度。6. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中在步驟(b)中，將溫度升高至30°C至85°C。7. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中在步驟(a)之后進(jìn)行步驟(b)，隨后進(jìn)行步驟 (c)，隨后進(jìn)行步驟(d)。8. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中所述水熱處理在90°C至200°C的溫度下進(jìn)行。9. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中所述水熱處理在大于0.7巴和小于10巴的升 尚的壓力下進(jìn)行。10. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中步驟(a)和/或步驟(b)中的攪動是攪拌。11. 前述權(quán)利要求中的任一項的方法，其中在煅燒后疏水性地修飾所述二氧化硅囊泡 的表面。12. -種二氧化硅囊泡，其具有： (&)30至7〇]11]1的粒徑； (b) 通過球形孔穿孔的壁結(jié)構(gòu);和 (c) 在壁中形成的4至40nm的平均孔入口尺寸。13. 權(quán)利要求12的二氧化硅囊泡，其中所述二氧化硅囊泡的表面是經(jīng)修飾的。14. 權(quán)利要求13的二氧化硅囊泡，其中所述二氧化硅囊泡的表面比原始二氧化硅囊泡 表面更疏水。15. -種二氧化硅囊泡，其由權(quán)利要求1至11中任一項的方法產(chǎn)生。16. -種藥物或化學(xué)品遞送系統(tǒng)，其包含權(quán)利要求12至權(quán)利要求15中任一項的二氧化 硅囊泡和包封在囊泡內(nèi)和/或結(jié)合至其外表面的藥物和/或化學(xué)劑。17. -種免疫原性組合物，其包含一個或多個根據(jù)權(quán)利要求12至權(quán)利要求15中任一項 的二氧化硅囊泡和一個或多個免疫原。18. 權(quán)利要求17的組合物，其中所述免疫原被包封在二氧化硅囊泡的外部范圍內(nèi)或結(jié) 合至其外表面。19. 權(quán)利要求17或權(quán)利要求18的組合物，其中所述免疫原是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV) 的免疫原性片段。20. 權(quán)利要求17至權(quán)利要求19中任一項的組合物，其中所述免疫原性組合物包含多個 具有基本上相同的特征的二氧化硅囊泡，所述二氧化硅囊泡呈遞或包封多個具有彼此不同 的結(jié)構(gòu)和/或功能特征的免疫原。21. 權(quán)利要求17至權(quán)利要求19中任一項的組合物，其中所述免疫原性組合物包含多個 具有彼此不同的結(jié)構(gòu)特征的二氧化硅囊泡，所述二氧化硅囊泡呈遞或包封具有基本上相同 的結(jié)構(gòu)和/或功能特征的免疫原。22. -種在受試者中引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，其包括給有此需要的受試者施用治療有效 量的權(quán)利要求17至權(quán)利要求19中任一項的免疫原性組合物的步驟。23. 權(quán)利要求22的方法，其中所述免疫應(yīng)答是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答或抗體免疫應(yīng)答。24. -種預(yù)防或治療疾病或病況的方法，其包括給有此需要的受試者施用治療有效量 的權(quán)利要求17至權(quán)利要求21中任一項的免疫原性組合物的步驟。25. 權(quán)利要求12至權(quán)利要求15中任一項的二氧化硅囊泡以及免疫原在制備用于治療疾 病或病況的藥物中的用途。26. 權(quán)利要求25的用途，其中所述免疫原是牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)的免疫原性片段。27. 權(quán)利要求12至權(quán)利要求15中任一項的二氧化硅囊泡用作佐劑的用途。
【文檔編號】A61K9/50GK105980447SQ201480075307
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2014年12月19日
【發(fā)明人】C·于, N·密特爾, J·張
【申請人】昆士蘭大學(xué)