針對(duì)h7n9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及針對(duì)H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段，和它們的應(yīng)用。所述抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)特異性基因序列決定的，并在原核和真核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)的抗體。利用此抗體CDR區(qū)或部分或全基因，可在原核和真核細(xì)胞及任何表達(dá)系統(tǒng)中改造和生產(chǎn)不同形式的基因工程抗體，可用于制備預(yù)防或治療H7N9亞型禽流感病毒相關(guān)疾病的制劑。
【專利說(shuō)明】
針對(duì)H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
:
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及針對(duì)H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體、其抗原結(jié)合片段，和它們的應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】:
[0002]據(jù)報(bào)道，禽流感病毒是感染鳥(niǎo)類的流感病毒，通常不會(huì)感染人類。然而，1997年我國(guó)香港首次報(bào)告了人類感染禽流感病例。這種高致病性禽流感病毒為H5N1亞型，截止 2013年12月10日已造成全球15個(gè)國(guó)家和地區(qū)共648例病例報(bào)告，其中384例死亡。隨后，H9N2等多個(gè)禽流感病毒亞型也相繼被發(fā)現(xiàn)具有感染人類的能力。特別是2013年3月， 我國(guó)上海和安徽兩地第一次發(fā)現(xiàn)人感染新型H7N9亞型禽流感病毒病例。目前H7N9疫情仍處于散發(fā)狀態(tài)，截止2014年10月2日已至少確診453例病例，其中175例死亡。病毒囊膜表面的跨膜糖蛋白血凝素蛋白(HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)是流感病毒的主要免疫原性抗原。HA識(shí)別靶細(xì)胞表面受體并與受體相結(jié)合，具有與宿主細(xì)胞膜融合活性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。由于HA基因突變而引起的HA抗原變異往往會(huì)導(dǎo)致免疫失敗和變異毒株流行，流感病毒頻繁并且持續(xù)的發(fā)生抗原性變異，目前尚無(wú)有效的針對(duì)H7N9等新型禽流感病毒的疫苗，也沒(méi)有特效的治療藥物。作為一類新型特異性抗病毒感染的生物工程制劑， 抗體在抗感染治療及緊急被動(dòng)免疫預(yù)防方面一直扮演著重要的角色。因此，研制特異性針對(duì)H7N9亞型禽流感病毒的抗體，用于緊急預(yù)防和治療是十分必要和可行的。
[0003]通過(guò)抗體分子基因水平的重組可獲得多種多樣的特異性鼠源、人源化及全人源抗體，使對(duì)單克隆抗體的研究有了突破性進(jìn)展并越來(lái)越顯示出其重要意義及實(shí)際應(yīng)用前景。 上世紀(jì)80年代末90年代初興起的噬菌體抗體基因庫(kù)技術(shù)興起和整個(gè)基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，使當(dāng)今世界全人源單克隆抗體及新結(jié)構(gòu)抗體的開(kāi)發(fā)研究取得很大進(jìn)展并已由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開(kāi)發(fā)階段。含有特異性抗體的人源或動(dòng)物血清免疫球蛋白用以預(yù)防和治療傳染病已歷史悠久。而全人源單克隆抗體的發(fā)展，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來(lái)了新的希望和遠(yuǎn)大前景。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)機(jī)體抵抗病毒攻擊已獲得許多實(shí)驗(yàn)證明，如抗甲肝病毒、漢坦病毒、RSV病毒、SARS病毒、亨尼帕病毒、埃博拉病毒等單克隆抗體可以在體內(nèi)100%保護(hù)動(dòng)物免受病毒攻擊(2)。我們相信特異性單克隆抗體，及其抗原結(jié)合片段，對(duì)人感染H7N9亞型禽流感應(yīng)當(dāng)具有良好的預(yù)防和治療效應(yīng)。
[0004]因此，研發(fā)高效、特異性的抗H7N9亞型禽流感病毒的抗體意義重大。這些抗體可以用于人感染H7N9亞型禽流感的預(yù)防和治療。
[0005]與本發(fā)明相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)有:
[0006]1.Gao, R.et al.Human infect1n with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus.N Engl J Med 368, 1888-97 (2013).
[0007]2.Dimitrov, D.S.Therapeutic antibodies, vaccines and antibodyomes.MAbs 2, 347-56(2010).
[0008]3.Ying, T.et al.Except1nally potent neutralizat1n of Middle East respiratory syndrome coronavirus by human monoclonal antibodies.J Virol 88, 7796-805(2014).。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]本發(fā)明的目的是提供針對(duì)H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體及應(yīng)用，具體涉及特異性結(jié)合H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的全人源單克隆抗體。本發(fā)明的全人源單克隆抗體包括克隆m826和克隆m827。
[0010]本發(fā)明還公開(kāi)了所述抗體的抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，及與效應(yīng)分子的偶聯(lián)物。本發(fā)明公開(kāi)的抗體和組合物可以用于，比如說(shuō)，人感染H7N9亞型禽流感的預(yù)防和治療。
[0011]在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，單克隆抗體，或抗原結(jié)合片段的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和/或重鏈可變區(qū)的氨基酸序列，包含至少一個(gè)(比如三個(gè))克隆m826或克隆m827 的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。
[0012]本發(fā)明中，
[0013]m826輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；
[0014]m826重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0015]m826輕鏈可變區(qū)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示；
[0016]m826輕鏈可變區(qū)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示；
[0017]m826輕鏈可變區(qū)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示；
[0018]m826重鏈可變區(qū)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示；
[0019]m826重鏈可變區(qū)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示；
[0020]m826重鏈可變區(qū)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示；
[0021]m827輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示；
[0022]m827重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；
[0023]m827輕鏈可變區(qū)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11所示；
[0024]m827輕鏈可變區(qū)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 12所示；
[0025]m827輕鏈可變區(qū)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示；
[0026]m827重鏈可變區(qū)CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；
[0027]m827重鏈可變區(qū)CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；
[0028]m827重鏈可變區(qū)CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示。
[0029]此外，本發(fā)明還公開(kāi)了編碼這些單克隆抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，及偶聯(lián)物的核酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，公開(kāi)了包含這些核酸的載體，及包含這些載體的宿主細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，公開(kāi)了包含這些單克隆抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，偶聯(lián)物，核酸，和載體的藥用組合物。
[0030]在本發(fā)明其它實(shí)施方案中，所述的單克隆抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，偶聯(lián)物，核酸，和載體被用來(lái)檢測(cè)，預(yù)防，或治療H7N9亞型禽流感。
[0031]更具體的，本發(fā)明提供了一種全人源單克隆抗體，或抗原結(jié)合片段，其特征在于， 其包含:抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸，及抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸；或抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:9的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸殘基， 及抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸殘基，其中，所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合H7N9亞型禽流感病毒。
[0032]本發(fā)明中，所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其包含:抗體的輕鏈可變區(qū)含有 SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸，及抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸；或抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID N0:9 的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸殘基，及抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 10的 26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸殘基。
[0033]本發(fā)明中，所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中:所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1具有至少90%的相同性，且所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0:2具有至少90%的相同性；或所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0:9具有至少 90%的相同性，且所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO: 10具有至少90%的相同性。
[0034]本發(fā)明中，所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其中的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段是全人源的。
[0035]本發(fā)明中，單克隆抗體為IgG ;抗原結(jié)合片段是scFv, Fv, Fab或F(ab)2。
[0036]本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體，其含有上述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段。
[0037]本發(fā)明中，上述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，或雙特異性抗體，與一種效應(yīng)分子偶聯(lián)；所述的偶聯(lián)物，其中的效應(yīng)分子是可檢測(cè)標(biāo)記；所述的可選自檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記， 放射性標(biāo)記，親和素，生物素，或酶；其中的效應(yīng)分子是毒素如綠膿桿菌外毒素，或化療劑；
[0038]本發(fā)明還提供了一種核酸分子，其編碼所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，所述的核酸分子，可操作地連接至啟動(dòng)子。
[0039]本發(fā)明還提供了一種質(zhì)粒，含有所述的核酸分子；所述的質(zhì)粒是一種病毒質(zhì)粒。
[0040]本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，含有所述的質(zhì)粒。
[0041]本發(fā)明還提供了一種在生物樣品中檢測(cè)H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，其中:
[0042]含有生物樣品，所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，所述的雙特異性抗體，或所述的偶聯(lián)物，在足以形成免疫復(fù)合物的條件下，檢測(cè)免疫復(fù)合物的存在與否，其中免疫復(fù)合物的存在表示生物樣品中存在H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白；
[0043]所述的方法中，樣品來(lái)源于人類或來(lái)源于禽類。
[0044]本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)受試者是否患有H7N9亞型禽流感的方法，其特征在于， 其中:
[0045]含有來(lái)源于疑似感染H7N9亞型禽流感的受試者的生物樣品，及有效劑量的所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，所述的雙特異性抗體，或所述的偶聯(lián)物，并檢測(cè)單克隆抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，或偶聯(lián)物的結(jié)合，其中單克隆抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，或偶聯(lián)物的結(jié)合相比陰性對(duì)照增加表示受試者患有H7N9亞型禽流感；
[0046]所述的方法中，陰性對(duì)照是一個(gè)參比標(biāo)準(zhǔn)，或單克隆抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，或偶聯(lián)物與來(lái)源于健康受試者的樣品的結(jié)合；其中的樣品選自血液，血清，血漿，痰液，或活檢樣品。
[0047]本發(fā)明還提供了一種藥用組合物，其含有有效預(yù)防劑量的所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，所述的雙特異性抗體，所述的偶聯(lián)物，所述的核酸，或所述的質(zhì)粒，和一種藥學(xué)可接受載體。
[0048]本發(fā)明同時(shí)提供了一種藥用組合物，其含有有效治療劑量的所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，所述的雙特異性抗體，所述的偶聯(lián)物，所述的核酸，或所述的質(zhì)粒，和一種藥學(xué)可接受載體。
[0049]本發(fā)明在國(guó)際上首次獲得了針對(duì)H7N9亞型禽流感病毒的全人源單克隆抗體，及其抗原結(jié)合片段。并經(jīng)試驗(yàn)表明，利用此抗體CDR區(qū)或部分或全基因，可在原核和真核細(xì)胞及任何表達(dá)系統(tǒng)中改造和生產(chǎn)不同形式的基因工程抗體，可用于制備在臨床上預(yù)防或治療 H7N9亞型禽流感病毒相關(guān)疾病的制劑。
[0050]為了便于理解，以下將通過(guò)具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。另外，本發(fā)明引用了公開(kāi)文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣?！靖綀D說(shuō)明】
[0051]圖1.利用多克隆噬菌體ELISA檢測(cè)針對(duì)H7N9亞型禽流感病毒HA的抗體富集。
[0052]圖2.利用ELISA檢測(cè)特異性抗原結(jié)合片段(Fab)與H7N9亞型禽流感病毒HA的結(jié)合能力。
[0053]圖3.利用ELISA檢測(cè)特異性單克隆抗體(IgGl)與H7N9亞型禽流感病毒HA的結(jié)合能力。
[0054]圖4.m826抗體對(duì)H7N9亞型禽流感病毒中和能力的檢測(cè)。
[0055]圖5.m826抗體能夠有效的誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)作用。【具體實(shí)施方式】
[0056]實(shí)施例1
[0057]1)制備H7N9亞型禽流感病毒HA蛋白
[0058]將合成的H7N9亞型禽流感病毒HA基因(SH2)與IgGIFc融合到一起，插入到表達(dá)質(zhì)粒中，將表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293FREESTYLE細(xì)胞，表達(dá)HA1 (SH2) -Fc蛋白并進(jìn)行純化；用同樣的方法表達(dá)沒(méi)有IgGl Fc標(biāo)簽的HA1蛋白，及三聚體形式的HA1蛋白；
[0059]2)篩選H7N9亞型禽流感病毒特異性抗原結(jié)合片段(Fab)[〇〇6〇] 使用利用40個(gè)健康志愿者的外周血單核細(xì)胞cDNA構(gòu)建的大型噬菌體展示抗體文庫(kù)，針對(duì)生物素標(biāo)記的HA1(SH2)-Fc蛋白，及商業(yè)化的HA-SH1、HA-SH2蛋白篩選抗體； 1012個(gè)噬菌體展示的Fab在常溫下于1，2, 3, 4輪分別與5, 3, 3, 1微克抗原孵育兩小時(shí)，將 HA1 (SH2)-Fc，HA-SH1，HA-SH2蛋白包被在ELISA板上，用多克隆噬菌體ELISA檢測(cè)抗體的富集；第1，2, 3, 4輪的噬菌體與包被的蛋白孵育，用抗噬菌體的HRP耦合抗體檢測(cè)噬菌體與蛋白的結(jié)合(如圖1所示)，多克隆噬菌體ELISA結(jié)果顯示，利用表達(dá)的HA1(SH2)-Fc蛋白作為抗原進(jìn)行的抗體篩選，在第4輪篩選后得到了非常顯著的富集；利用商業(yè)化的HA-SH1、HA-SH2蛋白作為抗原進(jìn)行的篩選，在第4輪篩選后得到一定富集，但程度遠(yuǎn)弱于利用所述的表達(dá)的HA1 (SH2)-Fc蛋白作為抗原進(jìn)行的篩選，因此，本發(fā)明中選用HA1 (SH2)-Fc蛋白第 3, 4輪篩選獲得的噬菌體，感染TG1細(xì)胞并隨機(jī)挑選克隆進(jìn)行單克隆噬菌體ELISA，進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序鑒定富集的Fab ;
[0061]3)檢測(cè)特異性抗原結(jié)合片段(Fab)與H7N9亞型禽流感病毒HA的結(jié)合能力
[0062]根據(jù)測(cè)序結(jié)果選擇十個(gè)克隆，命名為m820-m829,它們的可溶性表達(dá)產(chǎn)物的制備基本按現(xiàn)有技術(shù)的方法進(jìn)行；具體為:將含有克隆m820-m829的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HB2151感受態(tài)細(xì)胞，從過(guò)夜生長(zhǎng)的氨芐平皿中挑取單個(gè)菌落，接種SB細(xì)菌培養(yǎng)液，在30度IPTG誘導(dǎo)條件下表達(dá)10-12小時(shí)，收獲細(xì)菌并從中提取純化Fab ;將HA1 (SH2) -Fc，HA-SH1，HA-SH2蛋白包被在ELISA板上，加入梯度濃度稀釋的m820-m829 Fab孵育，用抗FLAG標(biāo)簽抗體檢測(cè)Fab與 H7N9亞型禽流感病毒HA的結(jié)合能力(如圖2所示)，ELISA結(jié)果顯示，十個(gè)Fab克隆中有兩個(gè)不能結(jié)合HA，有八個(gè)能結(jié)合HA，其中有三個(gè)與HA結(jié)合能力較弱，另五個(gè)與HA結(jié)合能力很強(qiáng)，本發(fā)明從中挑選兩個(gè)結(jié)合能力最強(qiáng)的克隆，m826和m827,轉(zhuǎn)換成單克隆抗體IgGl的形式并進(jìn)行進(jìn)一步表征；
[0063]4)檢測(cè)單克隆抗體(IgGl)與H7N9亞型禽流感病毒HA的結(jié)合能力
[0064]按現(xiàn)有技術(shù)的方法進(jìn)行Fab轉(zhuǎn)換成IgGl并進(jìn)行表達(dá)純化，具體為:將Fab的輕鏈與重鏈可變區(qū)分別用PCR擴(kuò)增，并插入到IgGl的表達(dá)載體中，構(gòu)建成單克隆抗體表達(dá)載體， 將表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293 FREESTYLE細(xì)胞，表達(dá)IgGl并利用Protein G樹(shù)脂進(jìn)行純化，將 HA蛋白包被在ELISA板上，加入梯度濃度稀釋的m820或m827 IgGl孵育，用抗IgGIFc標(biāo)簽抗體檢測(cè)IgGl與H7N9亞型禽流感病毒HA的結(jié)合能力(如圖3所示)，ELISA結(jié)果顯示， 單克隆抗體m826和m827均能高親和力結(jié)合H7N9亞型禽流感病毒HA，親和力約為InM (如圖3左所示)，單克隆抗體m826能特異性結(jié)合H7N9和H7N7亞型禽流感病毒HA，而不結(jié)合 H1N1和H3N2亞型禽流感病毒HA(如圖3右所示)，作為陰性對(duì)照的無(wú)關(guān)抗體ml02.4不結(jié)合任一種禽流感病毒HA ;
[0065]5)檢測(cè)m826抗體對(duì)H7N9亞型禽流感病毒中和能力
[0066]將H7N9亞型禽流感病毒HA蛋白，NA蛋白，和表達(dá)熒光素酶作為報(bào)告基因缺陷的 HIV-1基因，共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝H7N9亞型禽流感假病毒；將m826和無(wú)關(guān)抗體m610.27 梯度稀釋，與假病毒一起感染MDCK細(xì)胞，孵育后檢測(cè)細(xì)胞裂解液luciferase ;初步結(jié)果如圖4所示，m826抗體與對(duì)照抗體m610.27相比，能夠中和H7N9亞型禽流感假病毒；
[0067]6)m826誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)作用實(shí)驗(yàn)
[0068]將25微升的H9/IIIB(2.5X 104個(gè))細(xì)胞鋪至96孔板，然后將m826，m827和無(wú)關(guān)抗體M梯度稀釋，加入到表達(dá)H7N9亞型禽流感病毒HA的H9/IIIB細(xì)胞中(50 y 1)，然后將 ADCC效應(yīng)細(xì)胞(promega) 25微升(1.5X 105個(gè))加入到H9/IIIB中，37度溫育24h后測(cè)其 luciferase，結(jié)果如圖5所示，m826抗體能有效誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)的ADCC作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種全人源單克隆抗體，或抗原結(jié)合片段，其特征在于，其包含:抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸，及 抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID N0:2的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸；或 抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO:9的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸殘 基，及抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和/或97-110位氨基酸 殘基，其中，所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合H7N9亞型禽流感病毒。2.按權(quán)利要求1所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于，其包含:抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 1的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸，及抗體 的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 2的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸；或抗體的輕鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 9的27-32位，50-52位，和89-97位氨基酸殘基，及 抗體的重鏈可變區(qū)含有SEQ ID NO: 10的26-33位，51-58位，和97-110位氨基酸殘基。3.按權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于，其中:所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1具有至少90%的相同性，且所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0:2具有至少90%的相同性；或所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID N0:9具有至少90%的相同性，且所述的重 鏈可變區(qū)的氨基酸序列與SEQ ID NO: 10具有至少90%的相同性。4.按權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于，其中的 單克隆抗體或抗原結(jié)合片段是全人源的。5.按權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于，其中的 單克隆抗體為IgG。6.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，其特征在于，其中抗原 結(jié)合片段是scFv, Fv, Fab或F (ab) 2。7.—種雙特異性抗體，含有權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段。8.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，或權(quán)利要求7所述的雙 特異性抗體，與一種效應(yīng)分子偶聯(lián)。9.權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其中的效應(yīng)分子是可檢測(cè)標(biāo)記。10.權(quán)利要求9所述的偶聯(lián)物，其中的可檢測(cè)標(biāo)記是熒光標(biāo)記，放射性標(biāo)記，親和素，生 物素，或酶。11.權(quán)利要求8所述的偶聯(lián)物，其中的效應(yīng)分子是毒素或化療劑。12.權(quán)利要求11所述的偶聯(lián)物，其中的毒素是綠膿桿菌外毒素。13.—種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段， 權(quán)利要求7所述的雙特異性抗體，或權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物。14.權(quán)利要求13所述的核酸分子，可操作地連接至啟動(dòng)子。15.—種質(zhì)粒，含有權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的核酸分子。16.權(quán)利要求15所述的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒是一種病毒質(zhì)粒。17.—種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的質(zhì)粒。18.—種在生物樣品中檢測(cè)H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白的方法，其特征在于，其中:含有生物樣品，及權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，權(quán)利要 求7所述的雙特異性抗體，或權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，在足以形成免疫復(fù) 合物的條件下，檢測(cè)免疫復(fù)合物的存在與否，其中免疫復(fù)合物的存在表示生物樣品中存在 H7N9亞型禽流感病毒血凝素蛋白。19.按權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，其中樣品來(lái)源于人類。20.按權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，其中樣品來(lái)源于禽類。21.—種檢測(cè)受試者是否患有H7N9亞型禽流感的方法，其特征在于，其中:含有來(lái)源于疑似感染H7N9亞型禽流感的受試者的生物樣品，及有效劑量的權(quán)利要求 1-6中任一項(xiàng)所述的單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，權(quán)利要求7所述的雙特異性抗體，或權(quán)利 要求8-12中任一項(xiàng)所述的偶聯(lián)物，并檢測(cè)單克隆抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，或偶 聯(lián)物的結(jié)合，其中單克隆抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，或偶聯(lián)物的結(jié)合相比陰性對(duì) 照增加表示受試者患有H7N9亞型禽流感。22.按權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，其中陰性對(duì)照是一個(gè)參比標(biāo)準(zhǔn)，或單克隆 抗體，抗原結(jié)合片段，雙特異性抗體，或偶聯(lián)物與來(lái)源于健康受試者的樣品的結(jié)合。23.按權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，其中的樣品選自血液，血 清，血漿，痰液，或活檢樣品。24.—種藥用組合物，其特征在于，含有有效預(yù)防劑量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的 單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，權(quán)利要求7所述的雙特異性抗體，權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)所 述的偶聯(lián)物，權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)所述的核酸，或權(quán)利要求15-16中任一項(xiàng)所述的質(zhì) 粒，和一種藥學(xué)可接受載體。25.—種藥用組合物，其特征在于，含有有效治療劑量的權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的 單克隆抗體或抗原結(jié)合片段，權(quán)利要求7所述的雙特異性抗體，權(quán)利要求8-12中任一項(xiàng)所 述的偶聯(lián)物，權(quán)利要求13-14中任一項(xiàng)所述的核酸，或權(quán)利要求15-16中任一項(xiàng)所述的質(zhì) 粒，和一種藥學(xué)可接受載體。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105985433SQ201510064906
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日
【發(fā)明人】應(yīng)天雷, 姜世勃, 陸路, 賀彪, 孫志武
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)