抗npt ii蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了特異性識(shí)別轉(zhuǎn)基因植物中抗生素類(lèi)安全篩選標(biāo)記NPT II(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因,neomycin phosphotransferase gene II)單克隆抗體及其制備方法和用途,目的是為免疫學(xué)方法檢測(cè)天然轉(zhuǎn)基因物種(玉米、水稻、棉花等)中是否存在篩選標(biāo)記NPT II蛋白提供關(guān)鍵試劑材料。制備該抗體的抗原為由經(jīng)化學(xué)合成的特征性多肽片段經(jīng)半胱氨酸與KLH載體蛋白偶聯(lián)后免疫小鼠,最終獲得的抗體均屬于IgG1亞型,編碼其可變區(qū)的序列經(jīng)基因克隆的方式獲得。對(duì)天然轉(zhuǎn)基因水稻材料的免疫印跡(Western Blotting)檢測(cè)和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA),該抗體具有很好的特異性,可以用于對(duì)轉(zhuǎn)基因材料的定性與定量檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
抗NPT I I蛋白的單克隆抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及識(shí)別轉(zhuǎn)基因植物的抗生素類(lèi)篩選標(biāo)記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (neomycin phosphotransferase gene II)的單克隆抗體制備方法以及采用兩種單克隆抗 體組裝為ELISA檢測(cè)試劑盒的方法,以及該試劑盒在水稻和棉花等轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的用 途,屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的不斷涌現(xiàn),隨之而來(lái)的問(wèn)題就是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全評(píng)價(jià)及測(cè) 定。在轉(zhuǎn)基因品種的培養(yǎng)和后期鑒定中,離不開(kāi)針對(duì)轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記和報(bào)告基因,最常用的 篩選標(biāo)記包括抗生素抗性類(lèi)篩選標(biāo)記基因和抗除草劑基因,這類(lèi)抗性篩選標(biāo)記基因有可能 會(huì)通過(guò)基因漂移造成基因污染,對(duì)環(huán)境產(chǎn)生不利影響(魏偉,馬克平.如何面對(duì)基因流和基 因污染[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2002,4(4): 10-15)。另外,含有該種標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因食 物有可能不會(huì)被人類(lèi)的腸道系統(tǒng)吸收利用,還很有可能產(chǎn)生毒副作用。所以,為降低生物安 全風(fēng)險(xiǎn),減少對(duì)環(huán)境和生物的潛在危害,目前對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的篩選標(biāo)記主要包括GUS報(bào)告 基因的生物化學(xué)染色方法,NPT II基因的G418抗生素抗性篩選以及CP4EPSPS -類(lèi)抗除草 劑基因的抗性篩選方法,其中NPT II基因被用在眾多轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)化用載體的構(gòu)建中,該 基因的蛋白產(chǎn)物因此也會(huì)出現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物的植株、葉片及籽粒中。為降低此類(lèi)抗生素抗 性蛋白對(duì)環(huán)境和生態(tài)的不利影響,轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)逐漸向非抗生素抗性篩選過(guò)渡,比如以 PMI基因編碼的磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphomannose isomerase,PMI)替代抗生素抗性,最 終實(shí)現(xiàn)更安全的無(wú)標(biāo)簽(Marker-free)篩選鑒定體系。
[0003] 對(duì)于包含NPT II蛋白轉(zhuǎn)基因植物的鑒定,通常都采用PCR的方法對(duì)植物進(jìn)行檢 測(cè),(Varsha et. al. , Development of a multiplex Polymerase Chain Reaction method for specific detection of Genetically Modified Cotton Events MON 531and MON 15985. International Journal of Basic and Applied Sciences,2012,Vol :45-52),申 請(qǐng)?zhí)枮镃N200410023293的發(fā)明專(zhuān)利"含NPT-II標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因水稻的快速檢測(cè)"方法公 開(kāi)了一種利用不同G418抗生素濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物篩選的方法,該方法對(duì)于生長(zhǎng)的植物 是有效的,但對(duì)于經(jīng)加工的糧食制品,因?yàn)榧庸み^(guò)程的影響,很難檢測(cè)到完整的核酸分子, 因此,檢測(cè)轉(zhuǎn)基因目的蛋白也是一種重要的方法。
[0004] 制備特定蛋白的夾心檢測(cè)用抗體通常的方法為利用重組蛋白或選擇在空間和 序列組成上具有免疫原性和親水性的抗原肽經(jīng)與載體蛋白偶聯(lián)后進(jìn)行動(dòng)物免疫。重組 蛋白的方法簡(jiǎn)單易行,但因優(yōu)勢(shì)抗原的存在,篩選過(guò)程較為繁瑣,且難以篩選到配對(duì)良好 的抗體,而以多肽作為抗原時(shí),經(jīng)結(jié)構(gòu)和序列分析后選擇恰當(dāng)區(qū)域的多肽分別合成與免 疫則可提高實(shí)驗(yàn)的成功率,并可能制得高靈敏度的檢測(cè)抗體。研究論文Development of a chemiluminometric immunosensor array for on-site monitoring of genetically modified organisms(Hye-Jee Jang,Il-Hoon Cho Hee-Soo Kim,Jin-Woo Jeon, Se-Young Hwang,Se-Hwan Paek,Sensors and Actuators B:Chemical,2011,155(2) :598 - 605)中 提供了利用重組蛋白制備N(xiāo)PT II抗體的方法,并將之用于免疫傳感器檢測(cè)。申請(qǐng)?zhí)枮?CN201310365343發(fā)明專(zhuān)利"轉(zhuǎn)基因作物中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPT II )雙抗體夾心ELISA 定量檢測(cè)方法"公開(kāi)了以重組蛋白為免疫原,分別免疫新西蘭大白兔和小鼠制備多克隆抗 體及單克隆抗體,并將其組裝為單抗-多抗夾心ELISA試劑盒的方法。眾所周知,因多克隆 抗體自身的非均一組成特征,其特異性要比單克隆抗體差,且不能連續(xù)生產(chǎn),不同批次免疫 動(dòng)物制備的多抗易產(chǎn)生批間差,造成測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定。因此,通過(guò)獨(dú)特的抗原設(shè)計(jì),制備N(xiāo)PT II的高特異性和高親和力單克隆抗體是檢測(cè)和鑒定帶有NPT II標(biāo)簽轉(zhuǎn)基因植物的得力工 具。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種針對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中常用篩選標(biāo)記NPT II基因產(chǎn) 物NPT II蛋白的單克隆抗體雜交瘤的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一對(duì)特異性好、親和力高,可用于雙抗夾心ELISA檢 測(cè)的抗NPT II單克隆抗體72450-3和72449-13,這兩個(gè)抗體能特異結(jié)合NPT II重組抗原 和轉(zhuǎn)基因植物材料中的NPT II蛋白成分。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種將本抗體用于以水稻為代表的轉(zhuǎn)基因生物的檢 測(cè)方法。
[0008] 解決技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)手段
[0009] 本發(fā)明首先利用合成的多肽抗原制備了兩株分泌抗NPT II抗體的雜交瘤細(xì)胞株, 所述雜交瘤細(xì)胞株的制備方法包括以下步驟:
[0010] 1)按照序列表中Seq ID No:l所示的NPT II蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析,依據(jù)在 細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)、抗原性、組成氨基酸的親疏水性以及二級(jí)結(jié)構(gòu),選擇了兩段在空間上互不 影響、具有良好免疫原性的多肽片段進(jìn)行化學(xué)合成,合成的多肽其C端具有 Cys殘基,可通 過(guò)該Cys與載體蛋白KLH偶聯(lián),免疫Balb/c小鼠。
[0011] 2)從免疫合格小鼠無(wú)菌取其脾細(xì)胞作為抗原致敏的B細(xì)胞,按常規(guī)方法,將B細(xì)胞 與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0株融合,然后利用常規(guī)的融合細(xì)胞HAT篩選方法進(jìn)行篩選,進(jìn)而獲取融 合細(xì)胞生長(zhǎng)克隆。
[0012] 3)以重組NPT II蛋白為抗原,應(yīng)用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學(xué)技 術(shù)篩選和鑒定后,獲得高效分泌單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞系。
[0013] 上述技術(shù)方案中,步驟3)中,制備重組NPT II蛋白的方法可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知的DNA和蛋白質(zhì)表達(dá)操作技術(shù)進(jìn)行基因的分離、核苷酸片段的切割與連接、克隆和 表達(dá)載體的構(gòu)建及擴(kuò)增、核苷酸序列的分析與鑒定、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和培養(yǎng),重組蛋白的純化。 具體地,可參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)》(J.薩姆布魯克,D.W.拉塞爾著,黃培堂等 譯,2009年,科學(xué)出版社)。
[0014] 本發(fā)明同時(shí)要求保護(hù)采用上述技術(shù)方案制備得到的兩株雜交瘤細(xì)胞株及其抗體 72450-3和72449-13。其中72450-3的抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID No: 5和SEQ ID No :7所示,72449-13為SEQ ID No :9和SEQ ID No :11所示。兩株抗體均為 鼠源IgGl亞型單克隆抗體。
[0015] 本發(fā)明從上述雜交瘤細(xì)胞株制備了單克隆抗體,所述制備方法有以下兩種:
[0016] 1)在體外用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,收獲培養(yǎng)上清經(jīng)免疫親和層析法分離 純化所需單克隆抗體;
[0017] 2)在動(dòng)物腹腔內(nèi)接種上述雜交瘤細(xì)胞,收獲動(dòng)物腹水后分離純化所需單克隆抗 體。本發(fā)明用腹水法制備的抗體經(jīng)Protein A/G柱親和層析純化得到的NPT II單抗,用 ELISA技術(shù)測(cè)定72450-3和72449-13分泌的抗體親和常數(shù)分別為1. 79 X 109和2. 27 X 10 9。
[0018] 本發(fā)明的這兩株抗體可以共同或單一地對(duì)生物樣品中的NPT II蛋白進(jìn)行免疫學(xué) 檢測(cè)??梢詰?yīng)用的免疫學(xué)檢測(cè)方法包括但不限于利用抗體直接和抗原結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸 附檢測(cè)(ELISA)、免疫印跡(Western Blot)、流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、免疫組織化學(xué)(IHC)檢 測(cè)或者免疫PCR檢測(cè)方法。在免疫學(xué)檢測(cè)中,該抗體可單獨(dú)或與通過(guò)化學(xué)鍵偶聯(lián),靜電吸 附或者親疏水性吸附,而連接綴合物包括辣根過(guò)氧化物酶(HRP),堿性磷酸酶(AP),生物 素(Biotin),異硫氰酸熒光素(FITC),Cy3、Cy5、磁珠和瓊脂糖等綴合物連接。免疫印記 (Western blotting)實(shí)驗(yàn)顯示這兩株抗體均能特異識(shí)別重組的NPT II蛋白以及天然水稻 葉片材料中的轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記基因 NPT II。
[0019] 本發(fā)明中的單克隆抗體,可以用作檢測(cè)試劑用于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)試劑盒的制備。 本發(fā)明的這兩株抗體還可以共同或單一地對(duì)含NPT II標(biāo)簽的生物樣品進(jìn)行基于免疫學(xué)的 生物分離中。該基于免疫學(xué)的分離方法包括但不限于利用瓊脂糖免疫、免疫磁珠吸附或流 式細(xì)胞術(shù)完成生物分離方法或陽(yáng)性細(xì)胞分選。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果
[0021] 本發(fā)明獲得的可由雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體72450-3和72449-13,能識(shí)別重 組和天然NPT II蛋白,具有極強(qiáng)特異性和敏感性。能用于轉(zhuǎn)基因植物的檢測(cè)與篩查。
[0022] 因兩種抗體的免疫原為特殊設(shè)計(jì),位于NPT II蛋白不同空間位置,且其序列具備 適當(dāng)?shù)摩?-轉(zhuǎn)角等二級(jí)結(jié)構(gòu),因此不僅可單獨(dú)使用,也便于組合為雙抗夾心ELISA試劑盒。
【附圖說(shuō)明】:
[0023] 圖1 :在大腸桿菌中表達(dá)和純化的NPT II重組蛋白。U :未誘導(dǎo)的對(duì)照;S:誘導(dǎo)菌 的超聲上清;Pe:誘導(dǎo)菌的沉淀;Pu:經(jīng)鎳柱純化后的NPT II蛋白;Marker為分子量蛋白, 表達(dá)產(chǎn)物的大小約為35kDa,使用12% SDS-PAGE凝膠。
[0024] 圖2.單克隆抗體72450-3以免疫印跡法檢測(cè)重組NPT II蛋白和水稻葉片蛋白的 結(jié)果。Re-NPT-II:純化的重組大腸桿菌NPT II蛋白,帶有His標(biāo)簽;Rice-:非轉(zhuǎn)基因水 稻葉片蛋白;不含NPT II蛋白;Rice+:轉(zhuǎn)基因水稻葉片,含NPT II蛋白;HSP:以HSP蛋白 作為內(nèi)參蛋白用于確定非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因水稻蛋白的載量一致。.
[0025] 圖3 :單克隆抗體72450-3對(duì)非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白的免疫印跡檢測(cè)結(jié) 果,樣本1-4為轉(zhuǎn)基因水稻材料,其中1 :根部蛋白提取物;2 :莖部蛋白提取物;3:葉片蛋白 提取物;4 :穗子蛋白提取物,Μ為分子量標(biāo)記物;5-8為非轉(zhuǎn)基因水稻kasalath的蛋白樣 本,其中5 :根部蛋白提取物;6 :莖部蛋白提取物;7:葉片蛋白提取物;8 :穗子蛋白提取物。 一抗為lmg/ml的單克隆抗體,按1 :1000稀釋?zhuān)篂镠RP酶標(biāo)羊抗鼠,稀釋比例1:5000。
[0026] 圖4 :單克隆抗體72449-13對(duì)非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因水稻葉片蛋白的免疫印跡檢測(cè)結(jié) 果,樣本1-4為轉(zhuǎn)基因水稻材料,其中1 :根部蛋白提取物;2 :莖部蛋白提取物;3:葉片蛋白 提取物;4 :穗子蛋白提取物,Μ為分子量標(biāo)記物;5-8為非轉(zhuǎn)基因水稻kasalath的蛋白樣 本,其中5 :根部蛋白提取物;6 :莖部蛋白提取物;7:葉片蛋白提取物;8 :穗子蛋白提取物。 一抗為lmg/ml的單克隆抗體,按1 :1000稀釋?zhuān)篂镠RP酶標(biāo)羊抗鼠,稀釋比例1:5000。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合圖表和具體實(shí)施的方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述,以使本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以更清楚地得知本發(fā)明的技術(shù)方案,并非對(duì)本發(fā)明的限制。
[0028] 實(shí)施例1重組PMI蛋白的制備
[0029] 一、基因克隆和表達(dá)純化
[0030] 根據(jù)npt ii基因的序列設(shè)計(jì)PCR引物,以大腸桿菌基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò) 增(圖1),將擴(kuò)增產(chǎn)物定向插入到pET30a(+)載體相應(yīng)的酶切位點(diǎn)上,構(gòu)建重組表達(dá)載 體pET30a-npt載體,雙酶切后得到約5. 4k的pET30a(+)線(xiàn)性片段和約790bp的插入片 段,根據(jù)測(cè)序結(jié)果選擇無(wú)堿基突變的質(zhì)粒,獲得npt II基因的原核表達(dá)載體。將重組載體 pET30a-npt II轉(zhuǎn)入表達(dá)菌中,挑取單菌落后培養(yǎng)放大,按1:100的比例將單菌落培養(yǎng)的過(guò) 夜菌轉(zhuǎn)接至l〇〇ml LB培養(yǎng)基,加入終濃度為50 μ g/ml的卡那霉素,37°C振蕩培養(yǎng)至0D6。。 為0.6~0.8。加入0. lmol/L的IPTG,25°C震蕩培養(yǎng)8h,收菌后超聲破碎。該重組蛋白 帶有組氨酸標(biāo)簽,細(xì)菌超聲破碎后離心分離上清和沉淀,用Ni 2+-NTA親和層析柱純化,進(jìn)行 SDS-PAGE分析.由圖1可見(jiàn),在大腸桿菌的上清和沉淀中均能清楚地觀(guān)測(cè)到目的條帶,純化 后獲得了分子質(zhì)量約為38kDa。
[0031 ] 實(shí)施例2雜交瘤細(xì)胞系的建立
[0032] -、免疫
[0033] 將按照序列表中Seq ID No :2及Seq ID No :3的氨基酸序列化學(xué)合成的兩條多 肽NPT II-p印1和ΝΡΤΠ -ρ印2分別與KLH載體蛋白(Thermo公司)偶聯(lián)。交聯(lián)后的多肽 用弗氏完全佐劑(Sigma公司)乳化,免疫4-6周齡雌性Balb/c小鼠(購(gòu)自北京維通利華 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),腹部皮下注射每只小鼠6點(diǎn),劑量為60 μ g/只。每14天加強(qiáng)免 疫一次,抗原使用弗氏非完全佐劑(Sigma公司)乳化,劑量為30yg/只。第3次加強(qiáng)免疫 后7天以間接ELISA(波長(zhǎng)450nm)檢測(cè)小鼠血清中抗免疫原的多抗效價(jià),效價(jià)最高的小鼠 以尾靜脈注射沖擊免疫,抗原用生理鹽水混勻,劑量為50 μ g/只。
[0034] 二、細(xì)胞融合
[0035] 無(wú)菌制備免疫達(dá)標(biāo)的小鼠脾細(xì)胞懸液,與小鼠骨髓瘤細(xì)胞sp2/0 (ATCC)以5:1比 例混合,離心1500rpm,5min。棄上清后離心管放入37°C水浴中,在1分鐘內(nèi)緩慢加入lml的 PEG1500(Roche公司),并攪動(dòng)細(xì)胞。在溫水中靜置lmin后,加入10ml無(wú)血清的頂DM(Sigma 公司),混勾,離心lOOOrpm,5min。棄上清后,加入10ml血清(PAA公司)小心的將細(xì)胞吹 打起來(lái),并加入5ml混合10 X HAT (Sigma公司)的胸腺細(xì)胞,混勻。再加入25ml含有2. 1 % 硝基纖維素(Sigma公司)的半固體培養(yǎng)基充分混勻,然后均勻的倒入20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)皿中。 將細(xì)胞培養(yǎng)皿放入到濕盒中,放入37°C 5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0036] 三、陽(yáng)性雜交瘤篩選及保存
[0037] 融合后7天克隆細(xì)胞團(tuán)大小密度適中,在解剖鏡下,吸取圓、實(shí)、大的克隆團(tuán)打入 事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中,放入37 °C 5 % 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0038] 四、ELISA篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞
[0039] 3天后,細(xì)胞量大約占底面積2/3,取100 μ 1上清用免疫原和合成多肽分別進(jìn)行 ELISA篩選。陽(yáng)性克隆完全換液,加入200 μ 1含飼養(yǎng)細(xì)胞和1% HT (Sigma公司)的完全 培養(yǎng)基。兩天后進(jìn)行第二次ELISA篩選,陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)入事先準(zhǔn)備好培養(yǎng)基(含飼養(yǎng)細(xì)胞和 HT)的24孔板培養(yǎng)。五天后取100 μ 1上清進(jìn)行第三次ELISA篩選,陽(yáng)性克隆逐次轉(zhuǎn)入6孔 板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。
[0040] 實(shí)施例3腹水誘生法制備單克隆抗體
[0041] 一、腹水制備
[0042] 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌并懸起,計(jì)數(shù)~5X 105,1ml。懸浮的細(xì)胞腹 腔注射事先用石蠟油致敏的小鼠。7天后開(kāi)始收集腹水。取出的腹水于4°C離心4000rpm, lOmin。小心吸出中間的腹水收集于離心管中,4°C或-20°C保存。二、單克隆抗體的純化
[0043] 用HiTrap rProtein A FF(GE公司)親和層析法按說(shuō)明書(shū)從腹水中純化抗體。 SDS-PAGE膠鑒定純度,Bradford法測(cè)定濃度。純化的抗體保存于-20°C。
[0044] 實(shí)施例4單克隆抗體亞類(lèi)鑒定及親和力測(cè)定
[0045] 一、亞類(lèi)鑒定
[0046] 用lOOmM PBS(pH7. 4)稀釋包被羊抗鼠 IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)至 0. 5 μ g/ml,每孔加 100 μ 1,4°C,過(guò)夜。傾空液體,用含 0. 05 % Tween 的 PBS (PBS-T)洗 3 次, 每孔加入200 μ 1封閉液(含2% BSA和3%蔗糖的PBS),37°C孵育lh。傾空液體,用PBS-T 清洗3次。每孔加入0. lml雜交瘤上清,37°C孵育lh。傾空液體用PBS-T清洗3次。用封 閉液1 :1000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(κ,λ )抗體或1 :2000稀釋HRP標(biāo)記的羊抗鼠(IgM, IgGl,IgG2a,IgG2b,IgG3, IgA)抗體(Southern Biotech 公司)0· lml 每孔分別加入適當(dāng)?shù)?孔中,37°C孵育lh。傾空液體,用PBS-T清洗3次。每孔加50μ1含0· 15%ABTS(Southern Biotech公司)和0. 03%氏02的檸檬酸緩沖液(PH4. 0)進(jìn)行顯色反應(yīng),10-20min內(nèi)測(cè)定 405nm波長(zhǎng)下的0D值。結(jié)果顯示,本發(fā)明單克隆抗體72450-3和72449-13均為IgGl型鼠 源單克隆抗體。
[0047] 二、親和常數(shù)測(cè)定
[0048] 包被重組NPT II蛋白,包被濃度為2μg/ml,100μ1/孔,4°C包被過(guò)夜,PBS-T洗3 次。每孔加200 μ 1封閉液37°C封閉2h,PBS-T洗3次。實(shí)施例4中純化的單克隆抗體,從 1 :200開(kāi)始2倍梯度稀釋?zhuān)詈?孔留空白對(duì)照,37°C孵育lh,PBS-T洗3次。HRP標(biāo)記的 羊抗鼠二抗1 :20000稀釋?zhuān)靠?00 μ 1,37°C孵育lh,PBS-T洗3次。每孔加入100 μ 1含 0· 1 % TMB (Sigma公司)和0· 03% Η202的檸檬酸-磷酸緩沖液顯色10min,加50 μ 1 0· 5Μ 硫酸溶液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm的吸光值。畫(huà)出0D值對(duì)應(yīng)抗體稀釋倍數(shù)的曲 線(xiàn),找出彡1/2"平臺(tái)0D值"對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)A。利用下列公式計(jì)算出72450-3和72449-13 分泌的抗體親和常數(shù)分別為1. 79X 109和2. 27X 10 9。
[0049]
[0050] 實(shí)施例5本發(fā)明單克隆抗體的應(yīng)用效果
[0051] 以純化的重組NPT II作為抗原,同時(shí)從轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻kasalath葉片、 根、莖和穗中提取蛋白,用免疫印跡的方法檢測(cè)本發(fā)明的單克隆抗體識(shí)別特異性及在檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用效果。免疫印跡實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下:每種蛋白上樣5-10ng,進(jìn)行12%聚 丙烯酰胺凝膠電泳。按常規(guī)方法在Bio-Rad電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中將凝膠蛋白帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上 (1^111?〇^公司)。將膜置于含5%脫脂奶粉的185-1'封閉液中4°(:過(guò)夜。加入單克隆抗 體70450-3及70449-13(1 :1000稀釋?zhuān)?°C孵育過(guò)夜。用TBS-T洗膜后,加入1 :5000稀釋 的羊抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),室溫孵育1小時(shí)。再次TBST洗膜,加 入ECL超敏顯色液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司),以ChemiDoc MP多色熒光成像系統(tǒng) (Bio-Rad)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光圖像數(shù)據(jù)的采集。
[0052] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2可見(jiàn),72450-3可特異性識(shí)別重組NPT II蛋白和轉(zhuǎn)基因水稻中的 NPT II蛋白成分,而不識(shí)別非轉(zhuǎn)基因的水稻。圖3和圖4結(jié)果可見(jiàn),72450-3和72449-13 均能特異性地識(shí)別轉(zhuǎn)基因水稻中的NPT II蛋白,在轉(zhuǎn)基因水稻的不同部位,NPT II分布的 情況也有不同,其中根部含量最低,幾乎不可檢出,莖部次之,而葉片和穗子中的蛋白含量 很高。
[0053] 實(shí)施例6抗體的可變區(qū)序列測(cè)定
[0054] 培養(yǎng)新鮮的雜交瘤細(xì)胞,取上清進(jìn)行抗原結(jié)合特性驗(yàn)證,證實(shí)用于克隆的細(xì)胞株 的確能分泌需要的抗體,結(jié)果確認(rèn)后,離心收集1〇 6以上雜交瘤細(xì)胞。Trizol法提取雜交瘤 細(xì)胞總 RNA,取 9 μ L 總 RNA,加入 2. 5 μ L oligo (dT) 12 - 18primer (10mM),及 5 μ L dNTPs, 混合均勻,70°C保溫5分鐘后置冰上5分鐘,或依照使用的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行變性操作。隨后加 入 5yL RT buffer(5X),2.5yL DTT(O.IM)及 lyL 逆轉(zhuǎn)錄酶,42°C 反應(yīng) 1 小時(shí)。70°C 孵 育15分鐘以終止反應(yīng),獲得的cDNA保存在-20°C。將獲得的第一鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 在50 yL反應(yīng)體系中加入引物各25pmol,重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增用引物的序列按 照沈倍奮主編的《重組抗體》(科學(xué)出版社,2005年出版)一書(shū)中鼠單抗引物序列設(shè)計(jì)和合 成。用于擴(kuò)增重鏈可變區(qū)的引物如下,其中MHV. B1直至MHV. B12的11條引物為上游引物, 可分別與重鏈下游引物MHC. F組合用于擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因。
[0067] 用于擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)的引物如下,其中MKV.B1直至MKV.B10的10條引物為上游 引物,可分別與輕鏈下游引物MKC. F組合用于擴(kuò)增Kappa輕鏈的可變區(qū)基因。
[0079] 其余dNTPs及緩沖液均按照常規(guī)加入,最后加入cDNA模板1 μ L和1U熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶。設(shè)置PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 40秒,52 °C 40秒,72 °C 40秒,進(jìn)行20至25個(gè)循環(huán), 最后72 °C延伸3分鐘,產(chǎn)物可置于4°C備用或直接電泳。取20 μ L PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析, 在1. 5%瓊脂糖凝膠上分離切膠回收,克隆至Τ載體測(cè)序。
[0080] 實(shí)施例7 ΝΡΤ II的單克隆抗體用于ELISA的效果
[0081] 與CP4 EPSPS多克隆抗體配對(duì),用重組的ΝΡΤ II蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,檢測(cè)兩種NPTII 單克隆抗體72450-3和72449-13用于雙抗夾心ELISA的效果。實(shí)驗(yàn)步驟如下:
[0082] 將單克隆抗體72450-3,100 μ 1/孔,4°C包被過(guò)夜,包被的抗體濃度為1 μ g/ml至 5 48/1111均是有效的。用1%834在37°(:,封閉211。取純化后的即1'11蛋白用?831'稀釋 成 10 μ g/ml、1 μ g/ml、100ng/ml、10ng/ml、lng/ml、100pg/ml、10pg/ml 的蛋白稀釋液,以 100 μ 1/孔(2個(gè)重復(fù))加入不同的孔作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),同時(shí)加入轉(zhuǎn)基因水稻及非轉(zhuǎn)基因水稻 葉片中提取的蛋白質(zhì),37°C孵育lh。每孔加入100 μ 1稀釋的經(jīng)HRP標(biāo)記的72449-13單克 隆抗體作為檢測(cè)抗體,該抗體的原始濃度為lmg/ml,稀釋500-1000倍使用,此時(shí)其終濃度 為lμg/ml至2μg/ml,37°C孵育lh。以上每步完成后均用0.05% PBST清洗酶標(biāo)板5-8 次,吸水紙徹底拍干。每孔加100 μ 1 TMB顯色液,反應(yīng)3-5分鐘,加入50 μ 1終止液終止反 應(yīng)。測(cè)定405nm波長(zhǎng)下讀取各孔0D值。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種結(jié)合NPT II蛋白的免疫組合物,其特征在于包含由小鼠雜交瘤細(xì)胞系72450-3 和/或72449-13分泌的單克隆抗體。2. 權(quán)利要求1所述的兩種單克隆抗體,其免疫小鼠用的抗原分別具有SEQ ID No :2和 SEQ ID No :3所示的氨基酸序列,該多肽經(jīng)化學(xué)合成后與KLH載體蛋白偶聯(lián),用于免疫小 £3 邱U3. 權(quán)利要求1所述的72450-3單克隆抗體,其重鏈可變區(qū)的DNA編碼序列和氨基酸序 列分別為SEQ ID No:4和SEQ ID No:5,其輕鏈可變區(qū)的DNA編碼序列和氨基酸序列分別 為 SEQ ID No :6 和 SEQ ID No :7。4. 權(quán)利要求1所述的72449-13單克隆抗體,其重鏈可變區(qū)的DNA編碼序列和氨基酸序 列分別為SEQ ID No:8和SEQ ID No:9,其輕鏈可變區(qū)的DNA編碼序列和氨基酸序列分別 為 SEQ ID No :10 和 SEQ ID No :11。5. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體,其為小鼠 IgGl亞型單克隆抗體。6. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體,其可單獨(dú)或與其它綴合物連接完成含NPT II蛋白的 生物樣本的免疫學(xué)檢測(cè)和生物分離。7. 權(quán)利要求6所述連接綴合物包括辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、生物素 (Biotin)、異硫氰酸熒光素(FITC)、Cy3、Cy5、磁珠和瓊脂糖。8. 權(quán)利要求5所述的免疫學(xué)檢測(cè)方法包括利用抗體直接和抗原結(jié)合的酶聯(lián)免疫吸附 檢測(cè)(ELISA)、免疫印跡(Western Blot)、流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)或 者免疫PCR檢測(cè)方法。9. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體,其特征在于可作為檢測(cè)試劑用于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)雙 抗夾心ELISA試劑盒的制備。10. 權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)基因植物NPT II蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒,其特征在于抗體的 包被濃度為1 μ g/ml到5 μ g/ml濃度范圍,檢測(cè)抗體的使用濃度為1 μ g/ml-2 μ g/ml濃度 范圍。
【文檔編號(hào)】C07K16/40GK105985438SQ201510097938
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年3月5日
【發(fā)明人】尹長(zhǎng)城, 劉國(guó)振, 蘭金蘋(píng), 武鵬程, 郭美岑, 史佳楠, 韋漢福, 榮瑞娟, 郝育杰, 李莉云, 吳 琳, 劉斯奇
【申請(qǐng)人】北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司