豬鏈球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突變鏈球菌菌株SS3ST3 ΔaroC及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬鏈球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突變鏈球菌菌株SS3ST3ΔaroC及其制備方法和應(yīng)用。有助于控制病原體感染。本發(fā)明是使用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一種芳香簇氨基酸合成缺失突變菌株SS3ST3ΔaroC，該突變株由于aroC基因的功能缺失而不能正常合成芳香簇氨基酸。SS3ST3ΔaroC突變菌作為一種活疫苗，在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)為弱毒性，并有100％的免疫保護(hù)能力。本發(fā)明的弱毒疫苗，用于預(yù)防豬鏈球菌血清3型感染，安全性強(qiáng)、保護(hù)效果好、易大規(guī)模生產(chǎn)、具備推廣使用的潛力。
【專利說明】
豬鏈球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突變鏈球菌菌株 SS3ST3 Aar〇C及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及鏈球菌菌株，具體地指一種豬鏈球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突 變鏈球菌菌株SS3ST3 △ aroC及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS)導(dǎo)致豬一系列的癥狀，包括腦膜炎，敗血癥， 多漿膜炎，關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎和肺炎。到目前為止，豬鏈球菌分為33個血清型，不同血清型以 及同型的不同菌株的致病力都有差異。我國豬群中最流行是血清2型豬鏈球菌，其次就是血 清3型豬鏈球菌。由于對SS3毒力因素和保護(hù)性抗原一直缺乏全面了解，從而很難有效控制 SS3的感染。因此，預(yù)防這種病菌的傳播依賴于嚴(yán)格的控制措施。鑒于這種微生物對整個世 界養(yǎng)豬行業(yè)的威脅，研制有效疫苗預(yù)防SS3感染是非常必要的。然而，關(guān)于這種病原的毒性 因子研究太少，從而阻礙弱毒疫苗的研發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的是為了有效控制SS3的感染，提供了一種豬鏈球菌血清3型aroC基因功 能缺陷的突變鏈球菌菌株SS3ST3 △ aroC及其制備方法和應(yīng)用。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種豬鏈球菌血清3型aroC基因功能缺陷的 突變鏈球菌菌株SS3ST3 AaroC，其特征在于:其命名為SS3ST3 AaroC，其SS3ST3 AaroC 為所述鏈球菌菌株SS3ST3缺少Δ ar〇C基因。
[0005] 本發(fā)明提供了一種豬鏈球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突變鏈球菌菌株 SS3ST3 Aar〇C制備方法，包括以下步驟：
[0006] 1)以SS3ST3基因組DNA為模板，使用Primer Premier5.0設(shè)計擴(kuò)增目的片段aroC基 因的引物對，
[0007] aroCLL:5 '-AAAGAAGCTTCAACGCTTTATCAG-3 '，
[0008] aroCLR:5 '-TTCAGTCGACATACGACTACCACGAC-3 '；
[0009] aroCRL:5 '-GGAGGGATCCAGACTGTTGTTGGAGGAG-3 '，
[0010] aroCRR:5 '-TCGCGAATTCTGGCTACCGCAGCTTTC-3 '；
[0011] 2)PCR擴(kuò)增目的基因
[0012] a.aroCL基因片段擴(kuò)增體系：

[0014] aroCL基因片段PCR的條件為：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C 45s、72°C 45s、 30cycle；72〇C 5min,一次；[0015] aroCR基因片段的擴(kuò)增體系：
[0018] aroCR基因片段條件：95°C 5min，一次；94Γ 1π?η、55Γ458、72Γ 45s、30cycle; 72°C 5min，一次；
[0019] 3)SS3ST3 AaroC的構(gòu)建
[0020] 以SS3ST3基因組作為模板，aroCLL、aroCLR和aroCRL、aroCRR作為引物擴(kuò)增DNA片 段，PCR產(chǎn)物使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶康钠闻cpG+h〇st5連接，從而獲得重組質(zhì)粒pGA aroGpG Δ ar〇C經(jīng)過電轉(zhuǎn)化進(jìn)入SS3ST3，28°C紅霉素平板上篩選陽性克??；
[0021] 4)陽性克隆的保存
[0022]陽性克隆轉(zhuǎn)接TSB后生長到對數(shù)中期時用不含有紅霉素的TSB稀釋后在28°C生長 到對數(shù)初期，把培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至37 °C孵育4h;隨后，把細(xì)菌均勻涂布在TSA平板上37 °C生長，挑 選紅霉素敏感克隆用PCR鑒定；鑒定正確的重組克隆于TSB中37°C搖床培養(yǎng)，得到菌液，置 于-80°C冰箱保存。
[0023] 突變鏈球菌菌株SS3ST3 Aar〇C在制備豬鏈球菌血清3型弱毒疫苗中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明一種突變鏈球菌菌株SS3ST3 Aar〇C制備豬鏈球菌血清3型弱毒疫苗的方 法，包括以下步驟：
[0025] 1)把成功的菌種SS3ST3 Aar〇C復(fù)蘇于5mlTSB中，37°C搖床培養(yǎng)過夜；
[0026] 2)取搖床過夜的菌種2ml于350ml TSB的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C搖床培養(yǎng)6-8h;
[0027] 3)把培養(yǎng)瓶中的菌液8000rpm，離心3min，去上清；
[0028] 4)收獲的細(xì)菌與滅菌的20%脫脂乳混合，使用冷凍真空干燥器制作成細(xì)菌凍干活 疫苗，-20 °C低溫冰箱保存。
[0029] 本發(fā)明的原理
[0030]關(guān)于細(xì)菌合成芳香族氨基酸需要經(jīng)歷的共同途徑如下所示，通過這條途徑合成 分支酸。然后又分支酸合成苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸。缺失aroC基因后，芳香簇氨基酸合 成途徑中斷圖6所示。
[0031] 在哺乳動物中，葉酸的前體，p-氨基苯甲酸(PABA)不能被動物自身合成。同樣，細(xì) 菌芳香族氨基酸代謝途徑阻斷后不能合成PABA，而細(xì)菌不能攝取外源葉酸鹽，而動物體內(nèi) PABA的量是有限的，因此在宿主體內(nèi)，芳香族氨基酸營養(yǎng)缺陷型的生成受到限制從而表現(xiàn) 出低毒力。
[0032] 通過對豬鏈球菌SS3ST3的aroC基因經(jīng)過等位基因置換而使該基因失活，使該菌株 毒力減弱，從而研發(fā)相關(guān)的弱毒疫苗。
[0033]本發(fā)明的有益效果在于：
[0034] 1)本發(fā)明的疫苗制作工藝簡單，疫苗菌株可大量培養(yǎng)，成本低，周期短，能在全世 界推廣使用；
[0035] 2)本發(fā)明的疫苗既表現(xiàn)細(xì)胞免疫又有體液免疫；
[0036] 3)本發(fā)明的疫苗用量小，安全性高，毒力小，使用方便。
[0037]綜上所述，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)構(gòu)建豬鏈球菌菌株SS3ST3 Aar〇C，此缺陷株 毒力減弱。實(shí)驗(yàn)已證明該突變株對小鼠是無毒性的，用其免疫小鼠，小鼠100%得到保護(hù)。
[0038] 圖1為突變菌SS3ST3 AaroC的構(gòu)建。用PCR方法鑒定突變菌SS3ST3 AaroC的構(gòu) 建；
【附圖說明】
[0039] 圖中，LaneM: DNA marker
[0040] Lane l:SS3TZ-5用aroCLL和aroCRR擴(kuò)增片段
[0041 ] Lane 2: SS3TZ-5 Δ aroC用aroCLL和aroCRR擴(kuò)增的片段
[0042] Lane 3:SS3TZ_5用 Aarol和 Aaro2擴(kuò)增的片段
[0043] Lane 4:SS3TZ-5AaroC用 Aarol和 Aaro2擴(kuò)增的片段
[0044] 圖2為BALB/c小鼠經(jīng)過腹腔注射野生菌和突變菌SS3ST3 Aar〇C之后的生存曲線 圖；圖中，4-6周齡小鼠腹腔接種細(xì)菌10 X 108CFU，持續(xù)觀察12天，數(shù)據(jù)用每組小鼠的存活率 來表示。
[0045] 圖3表示使用SS3ST3 Δ ar〇C突變菌、滅活的野生菌疫苗（陽性對照）、佐劑（陰性對 照）、PBS(空白對照)分別免疫小鼠，然后使用野生菌對四組小鼠分別進(jìn)行攻毒，攻毒的小鼠 持續(xù)觀察12天，數(shù)據(jù)用每組存活小鼠的百分比來表示。
[0046] 圖4是小鼠脾臟細(xì)胞中IFN-γ和IL-4的mRNA水平:使用突變菌SS3ST3 Aar〇C免疫 小鼠后，然后通過定量PCR的方法檢測免疫小鼠脾臟細(xì)胞IFN- γ和IL-4的mRNA水平；
[0047]圖5為定量PCR分析結(jié)果顯示免疫后96小時后的小鼠脾臟細(xì)胞中的IL-4和IFN- γ mRNA水平顯著增加圖； 圖6為芳香簇氨基酸合成途徑圖。
[0048]為了更好地解釋本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的主要內(nèi)容，但 本發(fā)明的內(nèi)容不僅僅局限于以下實(shí)施例。
[0049] 實(shí)施例1:突變菌株SS3ST3 Aar〇C的構(gòu)建
[0050]( -）引物的設(shè)計合成
[0051 ] 以SS3ST3基因組DNA為模板，使用Primer Premier5.0設(shè)計擴(kuò)增目的片段aroC基因 的引物，引物由上海生工合成。
[0052] aroCLL：AAAGAAGCTTCAACGCTTTATCAG
[0053] aroCLR：TTCAGTCGACATACGACTACCACGAC
[0054] aroCRL：GGAGGGATCCAGACTGTTGTTGGAGGAG
[0055] aroCRR：TCGCGAATTCTGGCTACCGCAGCTTTC
[0056] (二)PCR擴(kuò)增目的基因
[0057] aroCL基因片段擴(kuò)增體系：
[0059] PCR條件：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C 458、72Γ458、3〇εγ(：1θ;72Γ 5min， 一次。
[0060] aroCR基因片段的擴(kuò)增體系：
[0062] PCR條件：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C 458、72Γ458、3(^γ(：1θ;72Γ 5min， 一次。
[0063] (三）SS3ST3 AaroC的構(gòu)建
[0064] 以SS3ST3基因組作為模板，aroCLL、aroCLR和aroCRL、aroCRR作為引物擴(kuò)增DNA片 段。PCR產(chǎn)物使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶?，目的片段與pG+h 〇st5連接，從而獲得重組質(zhì)粒pGA aroGpG Δ ar〇C經(jīng)過電轉(zhuǎn)化進(jìn)入SS3ST3，28°C紅霉素平板上篩選陽性克隆。陽性克隆轉(zhuǎn)接 TSB后生長到對數(shù)中期時用不含有紅霉素的TSB稀釋后在28 °C生長到對數(shù)初期。把培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn) 移至37°C孵育4h。隨后，把細(xì)菌均勻涂布在TSA平板上37°C生長，挑選紅霉素敏感克隆用PCR 鑒定。鑒定正確的重組克隆于TSB中37 °C搖床培養(yǎng)，得到一定濃度菌液后，-80 °C冰箱保存。 [0065](四）缺陷型突變菌Aar〇C的鑒定：
[0066] 首先，分別以野生菌SS3ST3與突變菌SS3ST3 Aar〇C為模板，
[0067] Δ arο1(ATATTATGGCAGTTGAGGACATCG)、
[0068] Δ aro2(CTTCTGACTGGGCTGCACGCTCT)為引物，PCR得到片段電泳結(jié)果(見附圖1)。訂 代表野生菌SS3ST3，此泳道擴(kuò)增出309bp左右的目的片段，而突變菌Δ ar〇C和陰性對照的泳 道未擴(kuò)增出目的片段。然后，分別以野生菌SS3ST3與突變菌Δ ar〇C為模板，ar〇CLL、ar〇CRR 為引物，PCR的方法獲得目的片段，結(jié)果（見附圖lhWT代表野生菌SS3ST3,此泳道擴(kuò)增出 1400bp左右的目的片段，突變菌Δ ar〇C的泳道擴(kuò)增出llOObp左右的目的片段。
[0069] 綜合PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以表明突變菌株Aar〇C的aroC基因缺失了300bp左右的基 因片段，突變菌株A aroC構(gòu)建成功。
[0070] 實(shí)施例2突變株與野生株對比培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
[0071] 將構(gòu)建好的突變株和野生株復(fù)蘇接種含有THB培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)6h。細(xì)菌計數(shù)，然后 分別取l〇4CFU的細(xì)菌接種于20ml含有添加芳香簇氨基酸（酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸各 100mg/L)和不添加芳香簇氨基酸的THB培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)，每小時取200μ1測量菌液的 0D600值，繪制生長曲線。觀察結(jié)果(見附圖2):由于缺失了aroC基因，導(dǎo)致該菌為芳香簇氨 基酸營養(yǎng)缺陷型，因此在未補(bǔ)加芳香簇氨基酸的培養(yǎng)基中生長速度顯著下降，但是當(dāng)培養(yǎng) 基中添加三種芳香簇氨基酸后，其生長速度和野生株在未補(bǔ)加芳香簇氨基酸的培養(yǎng)基中生 長速度一致。
[0072]實(shí)施例3小鼠毒力實(shí)驗(yàn)
[0073] 20只4-6周齡BALB/c小鼠，隨機(jī)分為2組，一組注射野生菌SS3ST3,另一組注射突變 菌SS3ST3 AaroC，用于對比兩種菌株的毒力大小。
[0074] 細(xì)菌使用PBS重懸后，菌液適當(dāng)稀釋到10 X 108CFU/ml，小鼠腹腔注射500μ1，觀察 小鼠存活狀態(tài)，記錄小鼠的死亡時間，并對結(jié)果進(jìn)行分析，小鼠持續(xù)觀察12天。
[0075]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:野生菌一組的小鼠9天內(nèi)死亡率達(dá)80%，并表現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀，突變 菌SS3ST3 Δ ar〇C-組小鼠12天內(nèi)100 %存活，且沒有任何臨床癥狀。
[0076]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：缺陷菌株AhasB的毒力顯著下降。
[0077]實(shí)施例4 Δ ar〇C主動免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)
[0078] 把40只4-6周齡雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。第1組小鼠，第一次腹腔 注射500μ1突變菌SS3ST3 AaroC進(jìn)行免疫，菌液濃度為2xl06CFU/ml，14天后以同樣的劑量 再次免疫;第2組小鼠作為陽性對照以同樣的方法注射滅活的疫苗進(jìn)行免疫，該滅活苗是滅 活野生菌與弗氏佐劑乳化的混合滅活疫苗，第一次腹腔注射500μ1，后續(xù)免疫為每2周1次。 第3組小鼠使用相同的弗氏佐劑乳化的PBS以同樣的方法注射小鼠作為陰性對照，第4組小 鼠使用PBS以同樣的方法注射小鼠作為空白對照。
[0079] 4組小鼠全部免疫完成后，每組小鼠腹腔注射致死劑量的野生菌，觀察每組小鼠的 存活率，并記錄結(jié)果。
[0080] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：由于沒有疫苗的免疫保護(hù)，第3組與第4組小鼠在接入致死劑量的野生 菌后，5天內(nèi)全部死亡。第2組小鼠在野生菌滅活疫苗的免疫保護(hù)下，存活率達(dá)80 %。第4組小 鼠得到突變菌株SS3ST3 Δ ar〇C的免疫保護(hù)，直到研究結(jié)束小鼠存活率為100%。除此之外， 所有陰性對照和空白對照的小鼠都表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，例如被毛粗糙零亂，刺激反應(yīng) 遲緩等現(xiàn)象，然而使用突變菌SS3ST3 △ aroC免疫的小鼠沒有表現(xiàn)任何臨床癥狀。
[0081] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：突變菌SS3ST3 △ aroC的免疫效果比野生菌滅活疫苗的免疫效果 好，經(jīng)過突變菌SS3ST3 △ aroC免疫過的小鼠抵抗力強(qiáng)，再次受到野毒感染后保護(hù)率達(dá)到 100%〇
[0082]實(shí)施例5誘導(dǎo)免疫反應(yīng)類型
[0083] T細(xì)胞群由兩個亞群組成，分別是Thl亞群和Th2亞群。Thl亞群表達(dá)IFN-γ，能夠激 活K細(xì)胞細(xì)胞毒作用，引起遲發(fā)型超敏反應(yīng)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)。Th2亞群表達(dá)IF-4，促進(jìn)抗 體的產(chǎn)生，引起體液免疫。小鼠經(jīng)突變菌SS3ST3 Aar〇C免疫后，可以通過檢測小鼠脾臟細(xì) 胞內(nèi)IFN- γ和IL-4的mRNA水平間接的評價這兩個細(xì)胞亞群的活性。
[0084] 6只BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組，一組腹腔注射1 X 106CFU Aar〇C，另一組注射PBS， 劑量都為〇. 5ml。注射96h后，對每只小鼠的脾臟細(xì)胞分別進(jìn)行提取RNA。使用定量PCR的方法 鑒定IFN- γ和IL-4的轉(zhuǎn)錄水平。
[0085] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：定量PCR分析結(jié)果顯示免疫后96小時后的小鼠脾臟細(xì)胞中的IL-4和 IFN- γ mRNA水平顯著增加。除此之外，IFN- γ的mRNA水平顯著高于IL-4的mRNA水平(見附圖 5)〇
[0086]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：突變菌株AaroC可以激活小鼠體內(nèi)Thl和Th2兩個細(xì)胞群的免疫反 應(yīng)，同時表現(xiàn)細(xì)胞免疫和體液免疫，并且細(xì)胞免疫水平顯著高于體液免疫水平。
[0087]上述使用的材料均購于市面。
[0088]其它未詳細(xì)說明的部分均為現(xiàn)有技術(shù)。盡管上述實(shí)施例對本發(fā)明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部實(shí)施例，人們還可以根據(jù)本實(shí)施例在不經(jīng) 創(chuàng)造性前提下獲得其他實(shí)施例，這些實(shí)施例都屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種豬鏈球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突變鏈球菌菌株SS3ST3 A aroC，其特征 在于：其命名為SS3ST3 AaroC，其SS3ST3 AaroC為所述鏈球菌菌株SS3ST3缺少AaroC基 因。2. -種權(quán)利要求1所述豬鏈球菌血清3型aroC基因功能缺陷的突變鏈球菌菌株SS3ST3 A aroC制備方法，其特征在于:包括W下步驟： 1. WSS3ST3基因組DNA為模板，使用Primer Premie;r5.0設(shè)計擴(kuò)增目的片段aroC基因的 引物對， aro化L:5 '-AAAGAAGCTTCAACGCTTTATCAG-3 '， aroCLR:5 '-TTCAGTCGACATACGACTACCACGAC-3 '； aroC化：5 '-GGAGGGATCCAGACTGTTGTTGGAGGAG-3 '， aroCRR:5 '-TCGCGAATTCTGGCTACCGCAGCTTTC-3 '； 2. PCR擴(kuò)增目的基因 。。^nPT丑：曲t±?鉛由^牛騎"C玄.aro化基因片段PCR的條件為：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C 45s、72°C 45s、 30巧cle;72°C 5min，一次； aroCR基因片段的擴(kuò)增體系：aroCR基因片段條件：95°C 5min，一次；94°C lmin、55°C45s、72°C 45s、30巧cle;72°C 5min，一次； 3. SS3ST3AaroC的構(gòu)建 WSS3ST3基因組作為模板，aro化Uaro化R和aroCRUaroCRR作為引物擴(kuò)增DNA片段， PCR產(chǎn)物使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶?，目的片段與pG、ost5連接，從而獲得重組質(zhì)粒pG A aroC;pG A aroC經(jīng)過電轉(zhuǎn)化進(jìn)入SS3ST3,28°C紅霉素平板上篩選陽性克隆； 4) 陽性克隆的保存 陽性克隆轉(zhuǎn)接TSB后生長到對數(shù)中期時用不含有紅霉素的TSB稀釋后在28°C生長到對 數(shù)初期，把培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至37 °C解育4h;隨后，把細(xì)菌均勻涂布在TSA平板上37 °C生長，挑選紅 霉素敏感克隆用PCR鑒定；鑒定正確的重組克隆于TSB中37°C搖床培養(yǎng)，得到菌液，置于-80 °C冰箱保存。3. 突變鏈球菌菌株SS3ST3 A aroC在制備豬鏈球菌血清3型弱毒疫苗中的應(yīng)用。4. 一種突變鏈球菌菌株SS3ST3 A aroC制備豬鏈球菌血清3型弱毒疫苗的方法，其特征 在于:包括W下步驟： 1) 把權(quán)利要求2構(gòu)建成功的菌種SS3ST3 A aroC復(fù)蘇于SmUSB中，37°C搖床培養(yǎng)過夜； 2) 取搖床過夜的菌種2ml于350ml TSB的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37°C搖床培養(yǎng)6-8h; 3) 把培養(yǎng)瓶中的菌液SOOOrpm，離屯、3min，去上清； 4) 收獲的細(xì)菌與滅菌的20%脫脂乳混合，使用冷凍真空干燥器制作成細(xì)菌凍干活疫 苗，-20°C低溫冰箱保存。
【文檔編號】C12R1/46GK105985920SQ201510825069
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年11月24日
【發(fā)明人】章紅軍, 趙祖凱, 魏子貢, 樊翠華, 羅小鋒
【申請人】武漢天種畜牧股份有限公司