自罹患神經(jīng)管缺陷胎兒羊水分離人類神經(jīng)干細(xì)胞的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供一種自胎兒羊水分離人類神經(jīng)干細(xì)胞的方法，所述胎兒經(jīng)診斷為罹患神經(jīng)管缺陷。本發(fā)明亦提供所述經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞于治療神經(jīng)疾病的用途?！緦＠f(shuō)明】自罹患神經(jīng)管缺陷胎兒羊水分離人類神經(jīng)干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明系關(guān)于人類神經(jīng)干細(xì)胞。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供一種自胎兒的羊水分離人類神經(jīng)干細(xì)胞的方法，和所述經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞的用途，其中所述的胎兒經(jīng)診斷為罹患神經(jīng)管缺陷?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]目前已發(fā)現(xiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)可同時(shí)具有自我更新和分化成大腦中每一種主要細(xì)胞類型的能力。自從在小鼠大腦中發(fā)現(xiàn)NSC在治療神經(jīng)退化病癥上的潛在治療用途后，NSC已成為深入研究的主題[1，2]。具體而言，NSC的移植可在損傷或病變的CNS中誘發(fā)細(xì)胞修復(fù)和恢復(fù)功能[3-6]。先前研究已證明植入CNS中的NSC不僅可形成新的神經(jīng)元，亦可表現(xiàn)保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)因子并將其釋放至受損區(qū)。[0003]先前在成年哺乳動(dòng)物CNS中發(fā)現(xiàn)NSC的來(lái)源包括海馬顆粒下區(qū)和前腦腹側(cè)的室管膜下區(qū)[7]。人類NSC通常系由夭折胎兒、死者大腦或手術(shù)樣品中獲得[7-9]。然而，此等樣本的供體年齡、儲(chǔ)存、存活率和潛在污染的變數(shù)使得其難以在醫(yī)療用途中使用[10]。其他的障礙包括:檢體的取得來(lái)源有限、采集的技術(shù)困難和倫理問(wèn)題。最后，于初級(jí)培養(yǎng)中，人類NSC的生長(zhǎng)速度緩慢，對(duì)獲得在臨床應(yīng)用上需要高數(shù)量細(xì)胞的需求造成嚴(yán)重限制。近年來(lái)已建立了一些永生的神經(jīng)干/祖細(xì)胞株[11，12]，相較于典型的NSC，此等細(xì)胞株具有相對(duì)較高的增殖力，同時(shí)仍保持可分化成不同神經(jīng)細(xì)胞類型的能力。然而，在建立此等細(xì)胞株的過(guò)程中使用了致癌基因和病毒感染，因此引發(fā)其在醫(yī)療目的應(yīng)用中的風(fēng)險(xiǎn)疑慮。此外目前已有建立自多能性干細(xì)胞(諸如胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)性多能性干細(xì)胞)的NSC[13-15]。雖然此等方法確實(shí)可引入新的NSC來(lái)源，但仍具有于群體中存留未分化細(xì)胞且因此形成畸胎瘤的可能性[16]。因此，若要將源自多能性干細(xì)胞的NSC應(yīng)用于醫(yī)療用途，亦受到倫理問(wèn)題、安全問(wèn)題和不良效率的限制。[0004]神經(jīng)管缺陷(NTD)為神經(jīng)管發(fā)育異常時(shí)最常見(jiàn)的缺陷，且其影響大約1/1000的懷孕者[17]。神經(jīng)管系在胚胎發(fā)育期間形成且最終產(chǎn)生整個(gè)CNS。當(dāng)神經(jīng)管在任一端未完全閉合時(shí)，即會(huì)造成NTD。在人類中，最常見(jiàn)的NTD為無(wú)腦癥和脊髓膜膨出。前者因神經(jīng)管的頭端閉合失敗造成，且其特征在于顱頂和大腦半球全部或部分不存在，而后者為尾部神經(jīng)管和脊柱的缺陷性閉合[18-20]。無(wú)腦癥導(dǎo)致大腦和顱骨的形成不完全，且因此致死。大多數(shù)患有脊髓膜膨出的個(gè)體具有多系統(tǒng)障礙和有限的壽命。超音波技術(shù)或母體血清胎兒蛋白含量的量測(cè)可在胎兒尚未出生前即偵測(cè)出NTD[21]。后續(xù)通常藉由量測(cè)羊水中α-胎兒蛋白和乙酰膽堿酯酶的含量來(lái)證實(shí)NTD的存在[22]。[0005]羊水(AF)已知含有多種源于胎兒發(fā)育的細(xì)胞類型，且先前研究已證明多潛能干細(xì)胞可經(jīng)由羊膜穿刺術(shù)而分離。這些來(lái)自AF所分離出的干細(xì)胞(AFSC)可表現(xiàn)一些多能性標(biāo)志，且可在誘導(dǎo)條件下分化成間質(zhì)或神經(jīng)譜系的細(xì)胞[23-25]。雖然AFSC在體內(nèi)與體外均展現(xiàn)神經(jīng)潛能，但其仍缺乏一些典型的NSC特性，諸如NSC的生長(zhǎng)特性、形態(tài)和形成神經(jīng)球的潛力。迄今為止，尚無(wú)能夠直接自任何物種的正常羊水樣本中分離出NSC的報(bào)告。最近，則有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)可自胎兒患有NTD的懷孕大鼠的羊水中建立NSC[26]。[0006]人類神經(jīng)干細(xì)胞為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與成人神經(jīng)生成功能特別有價(jià)值的工具。NSC在治療神經(jīng)退化病癥中亦具有極大治療潛能。然而，人類NSC的當(dāng)前來(lái)源因技術(shù)原因（諸如分離的難度和增殖所需的時(shí)間）而受限。因此，仍需要發(fā)展一種分離并建立人類神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其中所述人類神經(jīng)干細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)展且不會(huì)損失干細(xì)胞特性。【
發(fā)明內(nèi)容】[0007]本發(fā)明一方面系關(guān)于一種自懷孕人類個(gè)體的羊水獲得人類神經(jīng)干細(xì)胞的方法，所述懷孕人類個(gè)體的胎兒經(jīng)診斷為罹患神經(jīng)管缺陷，其中所述經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞可表現(xiàn)巢蛋白（Nestin)、Sox2、Musashi_l、和ATP結(jié)合匣G2(ATP_bindingcassetteG2，ABCG2)標(biāo)志，但不表現(xiàn)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和TRA-1-81。[0008]本發(fā)明另一方面系關(guān)于一種經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物，其系由根據(jù)本發(fā)明的方法獲得。[0009]本發(fā)明再一方面系關(guān)于一種醫(yī)藥組合物，其包含自本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物，和醫(yī)藥上可接受的載劑。[0010]本發(fā)明又一方面系關(guān)于一種于有需要的哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)狀態(tài)的方法，其包含給予本發(fā)明的醫(yī)藥組合物至所述哺乳動(dòng)物。[0011]本發(fā)明更一方面系關(guān)于一種篩選藥物候選物的方法，其中所述方法包含下列步驟:使自本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞與一藥物候選物接觸;和測(cè)定所述細(xì)胞的一或多個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，如經(jīng)測(cè)定的一或多個(gè)細(xì)胞狀態(tài)與未接觸所述藥物候選物的細(xì)胞的相同狀態(tài)相比更好，則表示所述藥物候選物具有治療神經(jīng)狀態(tài)的潛力。[0012]本發(fā)明另一方面系關(guān)于一種測(cè)試一藥物候選物的細(xì)胞毒性的方法，其中所述方法包含下列步驟:使自本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞與一藥物候選物接觸；和測(cè)定所述細(xì)胞的一或多個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，如經(jīng)測(cè)定的一或多個(gè)細(xì)胞狀態(tài)與未接觸所述藥物候選物的細(xì)胞的相同狀態(tài)相比更差，則表示所述藥物候選物可能具有細(xì)胞毒性?！靖綀D說(shuō)明】[0013]圖1A顯示AF-NSC的培養(yǎng)物特性。在NeuroCult?NS-A增殖培養(yǎng)基中初始接種羊水細(xì)胞后，神經(jīng)樣細(xì)胞開始附著至培養(yǎng)盤(左方組）。隨后，此等細(xì)胞增殖且聚攏而形成懸浮初級(jí)神經(jīng)球(右方組）。縮寫:DIV:體外天數(shù)。[0014]圖1B顯示AF-NSC的培養(yǎng)物特性。當(dāng)神經(jīng)球的分散為單細(xì)胞懸浮液后，所述細(xì)胞會(huì)持續(xù)分裂且再形成神經(jīng)球。成熟AF-NSC衍生神經(jīng)球在外表面含有典型的微突起結(jié)構(gòu)(micro-spike)(右側(cè)，黑色箭頭）。比例尺:ΙΟμπι?？s寫:DIV:體外天數(shù)。[0015]圖1C顯示AF-NSC的培養(yǎng)物特性。AF-NSC的倍增時(shí)間受接種密度影響。*:ρ<0·05;:p<0·01〇[0016]圖1D顯示AF-NSC的培養(yǎng)物特性。長(zhǎng)期體外培養(yǎng)物的AF-NSC細(xì)胞計(jì)數(shù)。由繼代5開始，將兩種不同AF-NSC細(xì)胞株用于此分析，且計(jì)算累積于每一繼代的總細(xì)胞數(shù)目。兩種AF-NSC細(xì)胞株（100和106)分別培養(yǎng)18和23繼代。（黑正方形:AF-NSC細(xì)胞株#100;黑圓：AF-NSC細(xì)胞株#106)。[0017]圖2A顯示NSC特異性標(biāo)志在AF-NSC中的表現(xiàn)。免疫染色成熟神經(jīng)球的共輒焦影像(第14天)顯示特異性NSC標(biāo)志的表現(xiàn)(巢蛋白、Musashi-Ι、和Sox2)。比例尺:20μηι。[0018]圖2Β顯示NSC特異性標(biāo)志在AF-NSC中的表現(xiàn)。以流式細(xì)胞儀測(cè)定較早和較晚繼代數(shù)的AF-NSC中NSC特異性細(xì)胞標(biāo)志的表現(xiàn)。點(diǎn)線：同源抗體對(duì)照;灰線:較早繼代#(10-12);黑線:較晚繼代#(20-22)?？s寫:SSEA:階段特異性胚胎抗原;ABCG2:ΑΤΡ結(jié)合匣子族G2;HLA:人類白細(xì)胞抗原。[0019]圖2C顯示NSC特異性標(biāo)志在AF-NSC中的表現(xiàn)。qPCR用于確定較早和較晚繼代數(shù)的NSC特異性基因的mRNA含量。白條:較早繼代#10;灰條:較晚繼代#20。[0020]圖2D顯示AF-NSC的端粒酶活性的量測(cè)。端粒酶的活性于不同培養(yǎng)時(shí)間下量測(cè)（繼代#6、10和17)。三角形表示藉由熱去活化處理的樣本?？s寫:N:陰性對(duì)照;P:陽(yáng)性對(duì)照。[0021]圖3A顯示AF-NSC的體外分化。AF-NSC系培養(yǎng)于神經(jīng)分化培養(yǎng)基中，且藉由免疫細(xì)胞化學(xué)誘發(fā)2天后偵測(cè)成熟神經(jīng)元的標(biāo)志。比例尺:20μπι?？s寫:DAPI:"，6_二甲脒基-2-苯基吲哚。[0022]圖3Β顯示AF-NSC的體外分化。AF-NSC系培養(yǎng)于神經(jīng)分化培養(yǎng)基中，且藉由免疫細(xì)胞化學(xué)誘發(fā)7天后偵測(cè)成熟神經(jīng)元的標(biāo)志。比例尺:20μπι?？s寫:DAPI:"，6_二甲脒基-2-苯基吲哚。[0023]圖3C顯示AF-NSC在體外分化后神經(jīng)元標(biāo)志基因的表現(xiàn)。以qPCR量測(cè)此等神經(jīng)元標(biāo)志的表現(xiàn)量。白條:未分化的細(xì)胞;灰條:第2天分化的細(xì)胞;黑條:第7天分化的細(xì)胞。*:p<0·05;:p<0·01〇[0024]圖4A顯示AF-NSC會(huì)定向分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞、寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元。AF-NSC系培養(yǎng)于特異性分化培養(yǎng)基中，且使用免疫染色特異性標(biāo)志以證實(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(04)和多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元(TH和AADC)的存在。比例尺:20μπι?？s寫:GFAP:膠質(zhì)原纖維酸性蛋白；TH:酪胺酸羥化酶;AADC:芳族L-胺基酸去羧酶;和DAPL·^，6_二甲脒基-2-苯基吲哚。[0025]圖4B顯示分化后AF-NSC的特異性標(biāo)志的表現(xiàn)。以qPCR分析星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)、寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(CNP，MBP和02)(左方)和多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元(AADC，Pax2，Lmx-lb和Nurr-Ι)(右方)特異性標(biāo)志的基因表現(xiàn)。白條：分化前；黑條：分化后。*:p<0.05;**:p<0.01。縮寫:GFAP:膠質(zhì)原纖維酸性蛋白。[0026]圖5A顯示將AF-NSC移植入MCA0缺血性中風(fēng)大鼠中具有治療效果。移植AF-NSC后，缺血性中風(fēng)大鼠經(jīng)歷旋桿測(cè)試。黑條:健康對(duì)照；白條:假注射(僅注射不含AF-NSC細(xì)胞的培養(yǎng)液)對(duì)照;灰條:MCA0后的AF-NSC移植。[0027]圖5B顯示將AF-NSC移植入MCA0缺血性中風(fēng)大鼠中具有治療效果。移植AF-NSC后，缺血性中風(fēng)大鼠經(jīng)歷握力測(cè)試。黑條:健康對(duì)照；白條:假注射(僅注射不含AF-NSC細(xì)胞的培養(yǎng)液)對(duì)照;灰條:MCA0后的AF-NSC移植。[0028]圖5C顯示將AF-NSC移植入MCA0缺血性中風(fēng)大鼠中具有治療效果。AF-NSC移植4周后，藉由TTC的定量半球形損傷區(qū)。[0029]圖5D顯示將AF-NSC移植入MCA0缺血性中風(fēng)大鼠中具有治療效果。頂部:免疫組織化學(xué)顯示巢蛋白（綠色）在注射區(qū)域中表現(xiàn)。底部:此區(qū)域的較高放大率顯示經(jīng)移植的AF-NSC在受損區(qū)中共表現(xiàn)巢蛋白（綠色)和人類細(xì)胞核(humanNuclei)(紅色，箭頭）。比例尺：50μπι〇[0030]圖6顯示此研究中建立的4個(gè)AF-NSC細(xì)胞株的核型。所有4個(gè)AF-NSC細(xì)胞株皆具有正常核型，包括一個(gè)46XX且三個(gè)46XY?！揪唧w實(shí)施方式】[0031]參考以下對(duì)本發(fā)明的各態(tài)樣、實(shí)例、和伴隨相關(guān)描述和表格的詳細(xì)描述，可更容易地了解本發(fā)明。除非另外特別地指出，本文中所使用的所有用語(yǔ)(包含技術(shù)和科學(xué)用語(yǔ))與本領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解者具有相同意義。應(yīng)進(jìn)一步了解者，如通常使用字典中所定義的用語(yǔ)應(yīng)解釋為與其在相關(guān)領(lǐng)域的上下文中一致，且不解釋為在理想化或過(guò)于正式的意義，除非于本文中明確地如此定義。另應(yīng)了解者，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定態(tài)樣的目的而不意欲用于限制性本發(fā)明的范疇。[0032]必須指出，除非上下文另外清楚規(guī)定，否則如本說(shuō)明書和隨附申請(qǐng)專利范圍中所用的單數(shù)形式"一"和"所述"包括復(fù)數(shù)個(gè)所指標(biāo)的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。[0033]范圍在本文中通常表述為"約"一個(gè)特定值和/或至"約"另一個(gè)特定值。當(dāng)表述此類范圍時(shí)，一態(tài)樣為包括一個(gè)特定值和/或至另一個(gè)特定值的范圍。類似地，當(dāng)值藉由使用字"約"表述為近似值時(shí)，應(yīng)了解特定值可形成另一態(tài)樣。另外應(yīng)了解，每一范圍的各端點(diǎn)皆有顯著性，一端點(diǎn)與另一端點(diǎn)既有相關(guān)性，亦彼此獨(dú)立。本文所用的術(shù)語(yǔ)"約"的范圍為±20%;優(yōu)選為±10%，更優(yōu)選為±5%。[0034]本發(fā)明揭示分離和繁殖人類神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)的方法，所述NSC系獲自一胎兒的羊水，而所述的胎兒經(jīng)診斷為罹患神經(jīng)管缺陷(NTD)。這些羊水源性神經(jīng)干細(xì)胞(AF-NSC)會(huì)形成神經(jīng)球，并可于體外進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)增。此外，他們表現(xiàn)NSC特異性標(biāo)志，包含巢蛋白、Sox2、Musashi-l和、ATP結(jié)合匣G2(ABCG2)，且亦會(huì)顯現(xiàn)端粒酶活性。當(dāng)于體外經(jīng)誘導(dǎo)分化后，羊水源性神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)顯現(xiàn)典型的型態(tài)模式并表現(xiàn)與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元一致的特異性標(biāo)志。再者，羊水源性干細(xì)胞可移植至動(dòng)物中來(lái)治療神經(jīng)狀態(tài)。[0035]因此，本發(fā)明提供一種獲得經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞的方法，其包含：[0036](a)由獲自懷孕人類個(gè)體的羊水中收集細(xì)胞，所述懷孕個(gè)體的胎兒經(jīng)診斷為罹患神經(jīng)管缺陷(NTD);[0037](b)以培養(yǎng)基培養(yǎng)所述細(xì)胞;和[0038](c)自所述培養(yǎng)基分離人類神經(jīng)干細(xì)胞，[0039]其中所述經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)巢蛋白（Nestin)、Sox2、Musashi_l、和ATP結(jié)合匣G2(ABCG2)標(biāo)志，且會(huì)顯現(xiàn)端粒酶活性，但不會(huì)表現(xiàn)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和TRA-1-81〇[0040]神經(jīng)干細(xì)胞為一種未分化的神經(jīng)細(xì)胞，其可經(jīng)誘導(dǎo)而增殖。神經(jīng)干細(xì)胞具有自我維持的能力，其意指每次細(xì)胞分裂，其子細(xì)胞仍為一干細(xì)胞。因此，本文中所使用的"神經(jīng)干細(xì)胞"乙詞，在適當(dāng)情況下，應(yīng)了解為可包含真正的干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞（neuralprogenitorcell)。[0041]根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)管缺陷包含，但不限于為無(wú)腦（anencephaly)和脊髓膜膨出(myelomeningocele)。更特定言的，神經(jīng)管缺陷為無(wú)腦。[0042]本發(fā)明的步驟(a)，所述細(xì)胞可經(jīng)由任何本領(lǐng)域的已知方法而收集。例如，可將羊水離心和/或過(guò)濾。[0043]根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基可為任何可容許神經(jīng)干細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可為，但不限于NeuroCult?NS-A增殖培養(yǎng)基（StemCel1Technologies，溫哥華，BC，加拿大）、Stemline?神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)張培養(yǎng)基(Sigma)(附帶加入20ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(Sigma)和10ng/ml白血病抑制因子(Chemicon))、NS_A培養(yǎng)基(Euroclone)(附帶加入1χΝ2和10ng/mlEGF(PeproTech)和10ng/mlbFGF)、NS-A基底無(wú)血清培養(yǎng)基（Euroclone)(附帶加入20人類重組EGFng/ml、10ng/ml人類重組FGF2、2mML-麩酰胺酸、0.6%葡萄糖、9.6μg/ml腐胺(putrescine)、6·3ng/ml孕酬、5·2ng/mls亞砸酸納、0.025mg/ml膜島素和0·lmg/ml轉(zhuǎn)鐵(納鹽，II等級(jí)；Sigma;控制培養(yǎng)基））、Dulbecco's基本必需培養(yǎng)基(DMEM)/F12(1:1)(附帶加入B27補(bǔ)充劑（1:50)、2mM麩酰胺酸、50單位/ml盤尼西林、50μg/ml鏈霉素(Gibco)、20ng/ml人類重組EGF和20ng/mlbFGF(R&DSystems))、Dulbecco's改質(zhì)Eagle'8培養(yǎng)基(01^]\〇/撤1^-F12(3:1，Gibco)(附帶加入盤尼西林G/鏈霉素/兩性霉素B(1%v/v;Gibco)、B27補(bǔ)充劑(2%v/v;Gibco)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF，20ng/ml，Sigma)、纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF-2,20ng/ml，R&DSystems)和肝素（5mg/ml，Sigma))。[0044]本發(fā)明亦提供經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞或其衍生物，其具有與自本發(fā)明的方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞全部相同的特性。所述細(xì)胞可用作細(xì)胞治療時(shí)的細(xì)胞來(lái)源。例如，所述細(xì)胞可移植以回復(fù)受損的神經(jīng)回路和/或回復(fù)大腦功能。[0045]于某些實(shí)施例中，所述經(jīng)分離的細(xì)胞或其衍生物系存在于醫(yī)藥組合物中。據(jù)此，所述包含此等神經(jīng)干細(xì)胞的醫(yī)藥組合物另包含醫(yī)藥上可接受的載劑，例如一或多個(gè)緩沖劑(中性緩沖鹽水或磷酸緩沖鹽水）、使制劑呈等滲透的溶質(zhì)、接受者的低滲透或弱高滲透血液、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑。[0046]在某些實(shí)施例中，所述醫(yī)藥組合物系調(diào)配成單位劑量可注射型式，例如溶液、懸浮液或乳液。適于注射細(xì)胞的醫(yī)藥組合物通常為無(wú)菌的水溶液和分散劑?？勺⑸渲苿┑妮d體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含，例如水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等），和其混合物。[0047]本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地確定于本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中細(xì)胞和任選的添加劑、賦型劑和/或載劑的含量。通常地，任何添加劑(除所述細(xì)胞)在例如磷酸鹽緩沖鹽水的溶液中的存在量為約0.001至約50重量％?；钚猿煞值拇嬖诹繛槲⒖酥梁量?，例如約0.0001至約5重量％;優(yōu)選為約0.0001至約1重量％;更優(yōu)選為約0.0001至約0.05重量;或約0.001至約20重量％;優(yōu)選為約0.01至約10重量％;更優(yōu)選為約0.05至約5重量％。[0048]神經(jīng)干細(xì)胞可用來(lái)移植至異源、自體或異種的宿主。所述神經(jīng)干細(xì)胞的后代可施用于任何罹患因任何方式導(dǎo)致的不正常神經(jīng)或神經(jīng)退化性癥狀的動(dòng)物，包含導(dǎo)因于機(jī)械、化學(xué)或電解病變，或?yàn)榫植咳毖蛏窠?jīng)區(qū)域缺氧，或?yàn)槔匣^(guò)程的結(jié)果。[0049]因此，本發(fā)明又關(guān)于一種于有需要的哺乳動(dòng)物中治療神經(jīng)狀態(tài)的方法，其包含給予本發(fā)明的醫(yī)藥組合物至所述哺乳動(dòng)物。[0050]如本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療"表示減緩、中斷、阻止或終止疾病或癥狀的進(jìn)展，但不一定要求完全消除所有疾病的癥狀和表征。"預(yù)防"意指包括所述神經(jīng)狀態(tài)的預(yù)防，其中"預(yù)防"應(yīng)理解為可任何程度地抑制發(fā)病時(shí)間或疾病或狀態(tài)的表征或癥狀嚴(yán)重性，其包含但不限于完全防止疾病或狀態(tài)。[0051]根據(jù)本發(fā)明可治療的神經(jīng)狀態(tài)可大致分為三類:具有缺血性或缺氧機(jī)制的疾病、神經(jīng)退化性疾病和與神經(jīng)細(xì)胞死亡相關(guān)的神經(jīng)和精神疾病。根據(jù)本發(fā)明可治療的其他神經(jīng)狀態(tài)包含增強(qiáng)認(rèn)知能力和腦腫瘤（如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（glioblastomas)、星形細(xì)胞瘤(astrocytomas)、腦膜瘤(meningiomas)和神經(jīng)鞘瘤(neurinomas))的治療。[0052]具有缺血性或缺氧機(jī)制的疾病可進(jìn)一步分為一般疾病和大腦缺血。涉和缺血性或缺氧機(jī)制的所述一般疾病的實(shí)例包括心肌梗塞、心機(jī)能不全、心臟衰竭、充血性心臟衰竭、心肌炎、心包炎、心包心肌炎、冠心病(冠狀動(dòng)脈狹窄）、心絞痛、先天性心臟病、休克、肢端缺血、腎動(dòng)脈狹窄、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、與瘧疾相關(guān)的血塞、人工心臟瓣膜、貧血、脾性癥候群、氣腫、肺纖維化、和肺水腫。大腦缺血疾病的實(shí)例包括中風(fēng)（以和出血性中風(fēng)）、大腦微血管病變(小血管疾?。?、分娩中大腦缺血、心跳驟?；驈?fù)蘇期間/后大腦缺血、由于手術(shù)中問(wèn)題所致的大腦缺血、頸動(dòng)脈手術(shù)期間的大腦缺血、由于至大腦的供血?jiǎng)用}狹窄所致的慢性大腦缺血、大腦靜脈的竇血塞或血塞、大腦血管畸形、和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。[0053]神經(jīng)退化性疾病的實(shí)例包括肌肉萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、帕金森氏病(Parkinson7sdisease)、亨廷頓氏?。℉untingtor/sdisease)、威爾遜氏疾（Wilsor/sdisease)、多系統(tǒng)萎縮、阿茲海默氏癥(Alzheimer'sdisease)、皮克氏病(Pick'sdisease)、路易體病(Lewy-bodydisease)、哈勒沃登-施帕茨病（Hallervorden-Spatzdisease)、扭轉(zhuǎn)張力障礙、遺傳感覺(jué)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病（HMSN)、格斯特曼氏病（GcrsUnann-Suiiuss丨cr-Schankei·disease)、克雅氏?。?amp;6此2€61(1-如1?)13-(1丨86&86)、馬查多-約瑟夫病(]\^(3]1&(1〇-】086。]1(1丨86&86)、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥（Friedreichataxia)、非弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥、妥瑞癥候群(GillesdelaTourettesyndrome)、家族性震顫、橄欖體腦橋小腦變性、副腫瘤大腦癥候群、遺傳痙攣性截癱、遺傳眼神經(jīng)病變(Leber)、色素性視網(wǎng)膜炎、施塔加特病（Stargardtdisease)、和卡-賽癥候群(Kearns-Sayresyndrome)。[0054]與神經(jīng)細(xì)胞死亡相關(guān)的神經(jīng)和精神疾病的實(shí)例包括敗血性休克、腦內(nèi)出血、蛛膜下出血、多發(fā)性硬化癡呆、發(fā)炎疾?。ㄖT如血管炎、多發(fā)性硬化癥和格林-巴利-癥候群(Guillain-Barre-syndrome))、神經(jīng)外傷(諸如脊髓外傷和大腦外傷）、周邊神經(jīng)病、多發(fā)性神經(jīng)病、癲癇、精神分裂癥、憂郁癥、代謝腦病、和中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染(病毒、細(xì)菌、真菌）。[0055]因由本發(fā)明所分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞可于體外形成神經(jīng)球、進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)展和分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞、寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、和多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元，所述經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞適于藥物研發(fā)和神經(jīng)毒性測(cè)試。[0056]因此，本發(fā)明更關(guān)于一種體外篩選藥物候選物的方法，其中所述方法包含使自本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞與一藥物候選物接觸;和測(cè)定所述細(xì)胞的一或多個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，如經(jīng)測(cè)定的一或多個(gè)細(xì)胞狀態(tài)與未接觸所述藥物候選物的細(xì)胞的相同狀態(tài)相比更好，則表示所述藥物候選物具有治療神經(jīng)狀態(tài)的潛力。[0057]此外，本發(fā)明可包含一種細(xì)胞毒性測(cè)試方法，所述方法于體外實(shí)施，并包含下列步驟:使自本發(fā)明的方法獲得的經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞與一藥物候選物接觸;和測(cè)定所述細(xì)胞的一或多個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，如經(jīng)測(cè)定的一或多個(gè)細(xì)胞狀態(tài)與未接觸所述藥物候選物的細(xì)胞的相同狀態(tài)相比更差，則表示所述藥物候選物可能具有細(xì)胞毒性。[0058]根據(jù)本發(fā)明，所述經(jīng)分離的人類神經(jīng)干細(xì)胞可以神經(jīng)球培養(yǎng)物或單層培養(yǎng)物的型態(tài)提供，且所述測(cè)試藥物候選物可為有機(jī)或有機(jī)物、勝肽、聚肽或蛋白質(zhì);且所述測(cè)定的細(xì)胞狀態(tài)可包含，但不限于神經(jīng)球形成、細(xì)胞凋亡、增殖、分化、移行、和其任意的組合。[0059]所述細(xì)胞狀態(tài)可以本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)測(cè)定，以觀察其細(xì)胞的表型和/或基因型的變化。舉例而言，神經(jīng)球形成、細(xì)胞凋亡、增殖、分化、和移行可使用相位差顯微鏡觀察。也可使用比色法或基于免疫熒光的分析法。再者，例如基因表現(xiàn)、電活動(dòng)測(cè)量、和代謝組學(xué)(metabonomics)等技術(shù)亦可作為使用工具。舉例而言，可使用量測(cè)一細(xì)胞標(biāo)志的mRNA量來(lái)代表細(xì)胞發(fā)育和成熟的特定階段。[0060]根據(jù)本發(fā)明，"更好"乙詞系指經(jīng)與藥物候選物接觸的人類神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)的程度(例如細(xì)胞計(jì)數(shù)、神經(jīng)球直徑和/或隨時(shí)間測(cè)量的代謝活性）"高于"未與藥物候選物接觸的人類神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)；"更差"乙詞系指經(jīng)與藥物候選物接觸的人類神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)的程度(例如細(xì)胞計(jì)數(shù)、神經(jīng)球直徑和/或隨時(shí)間測(cè)量的代謝活性）"低于"未與藥物候選物接觸的人類神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)。于本發(fā)明的實(shí)施例中，"更好"乙詞代表至少0.5倍高，優(yōu)選為至少1倍高;而"更差"表示0.5倍以下;優(yōu)選為至少1倍以下。[0061]以下的非限制性的實(shí)例有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。所述實(shí)例不應(yīng)視為過(guò)度地限制本發(fā)明。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可在不背離本發(fā)明的精神或范疇的情況下對(duì)本文所討論的實(shí)施例進(jìn)行修改和變化，而仍屬于本發(fā)明的范圍。[0062]實(shí)施例[0063]材料與方法[0064]樣本收集[0065]用于此研究的羊水樣本系獲得自臺(tái)灣臺(tái)北的國(guó)泰綜合醫(yī)院（CathayGeneralHospital)和臺(tái)灣桃園的長(zhǎng)庚紀(jì)念醫(yī)院（ChangGungMemorialHospital)。年齡為25至35歲，16周與20周的間妊娠的懷孕女性經(jīng)歷基于診斷目的而執(zhí)行的羊水取樣，并藉由超音波和篩選母體血清來(lái)診斷胎兒患有無(wú)腦NTD或未患有NTD。所有程序經(jīng)國(guó)泰綜合醫(yī)院和長(zhǎng)庚紀(jì)念醫(yī)院的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(InstitutionalReviewBoard)批準(zhǔn)，且所有參與者提供書面知情同意以參與此研究。[0066]AF-NSC的培養(yǎng)[0067]以l，000rpm離心各羊水樣本5分鐘，且在37°C下于5%⑶2潮濕大氣中使細(xì)胞集結(jié)粒再懸浮于T25燒瓶中的NeuroCult?NS-A增殖培養(yǎng)基(StemCellTechnologies，溫哥華，BC，加拿大）中。3-5天后，可自NTD樣本觀察到一些附著的神經(jīng)樣細(xì)胞，接著藉由更換培養(yǎng)基來(lái)移除懸浮細(xì)胞和殘?jiān)Ｌ砑有抡{(diào)制的NeuroCult?NS-A增殖培養(yǎng)基后，使附著的神經(jīng)樣細(xì)胞復(fù)制且聚攏以形成初級(jí)神經(jīng)球。為了維持此等細(xì)胞，每2-3天添加1/5體積的額外培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)(plating)3-4周后可觀察到初始成熟神經(jīng)球。此等細(xì)胞即為人類羊水衍生神經(jīng)干細(xì)胞(AF-NSC)。[0068]當(dāng)神經(jīng)球直徑生長(zhǎng)至50-100μπι時(shí)，使此等細(xì)胞繼代。首先，以800rpm離心細(xì)胞5min，且在37°C下用TrypLE(LifeTechnologies，蓋瑟斯堡，MD，USA)處理3分鐘。在移除TrypLE溶液的離心步驟后，將細(xì)胞再懸浮于NeuroCultNS-A增殖培養(yǎng)基中，小心地混合(pipetting)獲得單一細(xì)胞懸浮液并避免氣泡形成。以0.5-1X104/cm2的密度接種AF-NSC且維持在如上文所描述的條件。神經(jīng)球每10-14天繼代，且AF-NSC在體外可擴(kuò)展大于8個(gè)月。亦可冷凍保存神經(jīng)球以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。[0069]為了確定最佳的接種密度，在T25培養(yǎng)盤中以1，000_20,000細(xì)胞/平方公分的密度分散AF-NSC，且以如先前所描述的條件培養(yǎng)。10天后，收集神經(jīng)球且使其以胰蛋白酶處理。用血球計(jì)執(zhí)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，且計(jì)算每個(gè)繼代的倍增時(shí)間。所描述的每一實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三重復(fù)。[0070]在累積細(xì)胞數(shù)目測(cè)試中，在T25燒瓶中以5，000細(xì)胞/平方公分接種AF-NSC，且以如先前所描述的條件培養(yǎng)。細(xì)胞每10-14天繼代，且將各繼代執(zhí)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞的增加倍數(shù)以和總細(xì)胞數(shù)目。[00川流式細(xì)胞儀[0072]將AF-NSC以胰蛋白酶處理使其呈單一細(xì)胞形式后再懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。于直接分析時(shí)，將經(jīng)或未經(jīng)透化處理（permeabi1ization)的細(xì)胞以Cytofix?(BDBiosciences，SanJose，CA，USA)固定，且用以下抗人類抗體免疫標(biāo)記所述細(xì)胞:CD73-藻紅素(PE)、CD105-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD117-PE、HLA-I-PE、HLA-DR-PE、Nanog-PE、0ct-4-FITC、Sox2-PE、ABCG2-PE(均來(lái)自BDBiosciences)、SSEA-1-PE、SSEA-3-FITC、SSEA-4-PE、TRA-1-60-PE、TRA-1-81-PE、巢蛋白-FITC(均來(lái)自R&DSystems，Minneapolis，MN，USA)或CD133-PE(MerckMillipore，Billerica，MA，USA)。于間接分析時(shí)，將所述細(xì)胞固定、用Perm緩沖液Π(BDBiosciences)透化處理、阻斷、用Musashi_l(R&DSystems)免疫標(biāo)記細(xì)胞、和用AlexaFluor488染料（Lifetechnologies)染色。使用FACSCantoII流式細(xì)胞儀（BDBiosciences)處理所有樣本，且于每個(gè)樣本收集至少30,000個(gè)細(xì)胞資料。使用FACSDiva6.0(BDBiosciences)和FCSExpressV3.00(DeNovoSoftware，Thornhill，Canada)執(zhí)行數(shù)據(jù)采集和分析。[0073]免疫細(xì)胞化學(xué)[0074]用4%多聚甲酸（MerckMillipore)固定細(xì)胞，且用0·1%TritonX_100(Sigma-Aldrich，StLouis，M0)進(jìn)行細(xì)胞膜穿透。用10%特異性正常血清在PBS中阻斷30min后，用以下適當(dāng)初級(jí)抗體培育所述細(xì)胞1小時(shí)：Tuj-1(Sigma)、巢蛋白、Sox2、微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、神經(jīng)微絲重鏈（NFH)、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP)、人類神經(jīng)元特異性核蛋白(hNeuN)、酪胺酸輕化酶(TH)(均來(lái)自MerckMillipore)、Musashi_l、04或芳族L-胺基酸去羧酶(AADC)(均來(lái)自R&Dsystem)。洗滌兩次后，在室溫下隨后用經(jīng)AlexaFluor488或AlexaFluor546共輒的二級(jí)抗體(LifeTechnologies)與所述細(xì)胞培育1小時(shí)。在共輒焦顯微鏡（TCS-SP5-XA0BS，Leica，Solms，Germany)或焚光顯微鏡（AxioObserver·Zl，CarlZeiss，0berkochen，Germany)下觀測(cè)所得免疫反應(yīng)性細(xì)胞。[0075]端粒酶活性分析[0076]使用市售可得的TRAPezeRT套組(Millipore)，藉由端粒重復(fù)擴(kuò)增(TRAP)量測(cè)端粒酶活性。在12.5%聚丙烯酰胺凝膠上分離擴(kuò)增TRAP反應(yīng)產(chǎn)物且觀察TRAP梯級(jí)分布。[0077]定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)[0078]用TRIzol試劑（11^丨廿〇8611，0&48匕&(1，04，1^4)萃取總1?祖，且根據(jù)制造商提供的方法，使用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(ThermoScientific，SanJose，CA，USA)和寡聚-dT引物，合成第一股cDNA。藉由SYBRGreenPCR主混合物（ThermoScientific)，使用ABIPrism7700序列偵測(cè)系統(tǒng)(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)執(zhí)行qPCRj-肌動(dòng)蛋白的相對(duì)表現(xiàn)量用作內(nèi)部對(duì)照以使各樣本中的基因表現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù)AACt方法測(cè)量標(biāo)記基因的相對(duì)定量。用于此研究的引物對(duì)列舉于表1。[0079]表1.用于此研究的寡核苷酸引物.[0082]AF-NSC分化[0083]使AF-NSC衍生神經(jīng)球(繼代#10-12)經(jīng)胰蛋白酶處理，且培養(yǎng)于涂布100μg/ml聚-L-離胺酸（Sigma-Aldrich)和10μg/ml層黏連蛋白（Sigma-Aldrich)的培養(yǎng)皿上，以5X104細(xì)胞/平方公分的密度將其接種于NeuroCult?NS-A增殖培養(yǎng)基中。細(xì)胞附著至培養(yǎng)皿底部后，根據(jù)制造商提供的方法，藉由添加NeuroCult?NS-A分化培養(yǎng)基（StemCellTechnologies)來(lái)誘發(fā)神經(jīng)分化。誘發(fā)后，用4%多聚甲醛固定分化細(xì)胞以用于免疫細(xì)胞化學(xué)，或收集以用于mRNA萃取和后續(xù)的qPCR。為了誘導(dǎo)特異性細(xì)胞類型的分化，在NS-A增殖培養(yǎng)基存在下，將AF-NSC以5X104細(xì)胞/平方公分的密度接種于涂布有100μg/ml聚-L-離胺酸的平盤上。附著后，根據(jù)先前公開的方法[27]，將培養(yǎng)基改成特異性誘發(fā)培養(yǎng)基來(lái)產(chǎn)生星形膠質(zhì)細(xì)胞、寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元。[0084]局部缺血和AF-NSC移植[0085]所有史泊格多利大白鼠（Sprague-Dawleyrat)(8周齡，250_300g)系獲自Lasco(宜蘭，臺(tái)灣），且將其圈養(yǎng)于中興大學(xué)(NationalChungHsingUniversity)的動(dòng)物機(jī)構(gòu)中。所有實(shí)驗(yàn)程序均以動(dòng)物福利出發(fā)點(diǎn)設(shè)計(jì)且經(jīng)中興大學(xué)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照護(hù)和使用委員會(huì)(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批準(zhǔn)。使大鼠（n=12)的大腦右半球接受1.5小時(shí)長(zhǎng)時(shí)間的中大腦動(dòng)脈閉塞（MCA0)后縫合[28]。手術(shù)后第一天，在AP:-0.4R:3.40￥:5的位置將1\10*^-吧(：(繼代#10-12，1(^，以1711^11)移植入受損波紋體(11=6)。手術(shù)后4周處死動(dòng)物，且藉由灌注4%多聚甲醛來(lái)固定其大腦。[0086]行為分析[0087]將MCA0大鼠進(jìn)行旋桿和握力分析。于MCA0前，旋桿測(cè)試中，當(dāng)旋桿在300s內(nèi)自4rpm加速至40rpm時(shí)，大鼠需仍可保持于圓柱上。于測(cè)試其握力時(shí)，大鼠需能以其前腳抓握拉桿，其握力藉由連接至所述拉桿的電子傳感器來(lái)定量。在訓(xùn)練一周后，所有實(shí)驗(yàn)大鼠于二設(shè)備的表現(xiàn)需具有相近的結(jié)果始可納入試驗(yàn)。MCA0處理后，移植AF-NSC與未移植的對(duì)照組，皆同時(shí)進(jìn)行旋桿和握力測(cè)試，并分別記錄各大鼠的三重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。[0088]TTC染色和免疫組織化學(xué)染色[0089]將MCA0大鼠大腦以冠向切割（sectionedcoronally)成6個(gè)切片，隨后在37°C下將其浸泡于2%2,3,5_氯化三苯四銼（TTC)中30分鐘，接著再用福爾馬林固定（formalinfixation)。梗塞區(qū)為淺色，而正常大腦組織則被染成紅色。為與健康腦半球區(qū)比較，將中風(fēng)腦半球的剩余部分中淺梗塞、空心液化和已變小的正常組織區(qū)域指定為萎縮區(qū)。用計(jì)算機(jī)影像分析系統(tǒng)（Image-ProPlus，MediaCybernetics，Carlsbad，CA，USA)估算梗塞和萎縮區(qū)，且組織損傷的程度的計(jì)算為對(duì)側(cè)健康半球的總面積的百分比。[0090]于免疫組織化學(xué)分析中，使用蔗糖梯度使大腦脫水，并浸潤(rùn)于0CT(SakuraFineTechnical，Tokyo,Japan)，將大腦在_70°C下冷凍且以40μηι厚度冰凍切片。于免疫染色中，將切片在含有〇.1%Tween-20(PBST)的roS中沖洗，用0.1%TritonΧ-100透化且用于roS中的10%特異性正常血清阻斷30min，隨后將其與初級(jí)抗體（包括人類細(xì)胞核（MerckMi11ipore)和巢蛋白（MerckMi11ipore))培育隔夜。然后，將切片用PBST洗滌兩次，且將其與經(jīng)若丹明（rhodamine)或FITC共輒的適當(dāng)二級(jí)抗體(ThermoScientific)在室溫下培育1小時(shí)。最后，使用焚光顯微鏡觀察標(biāo)記細(xì)胞的分布。[0091]統(tǒng)計(jì)分析[0092]實(shí)例中的所有結(jié)果均呈現(xiàn)為平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD)。使用史都登氏t_測(cè)試(Student^t-test)比較兩個(gè)平均值的間的顯著差異。若比較兩個(gè)以上組，則使用單因子變異數(shù)分析的Scheff^sposthoc測(cè)試評(píng)定顯著差異。當(dāng)p<0.05時(shí)，認(rèn)為結(jié)果為統(tǒng)計(jì)顯著的。[0093]實(shí)例1:自羊水分離NSC[0094]為了自羊水分離NSC，藉由羊膜穿刺術(shù)收集正常(n=7)和NTD(無(wú)腦癥n=6,非無(wú)腦癥n=6)衍生的羊水樣本。當(dāng)在NeuroCult?NS-A增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)自此等樣本中分離的細(xì)胞時(shí)，在前3-5天期間僅于的無(wú)腦癥樣本產(chǎn)生一些略微附著的神經(jīng)樣細(xì)胞和群落(圖1A)。謹(jǐn)慎移除未附著的細(xì)胞和細(xì)胞殘?jiān)?，?周后此神經(jīng)樣細(xì)胞可增殖且聚集并懸浮生長(zhǎng)而形成的初級(jí)神經(jīng)球（圖1A)。繼代后，將神經(jīng)球經(jīng)胰蛋白酶處理成單一細(xì)胞，且在各繼代中，細(xì)胞可在懸浮液中增殖并再形成神經(jīng)球（圖1B)。神經(jīng)球的直徑范圍為約50μπι至100μπι，且其在其外表面上具有典型的微突起(microspikes)(圖1Β)。此等AF-NSC可藉由連續(xù)繼代擴(kuò)展。重要的是，應(yīng)注意AF-NSC僅可自診斷有無(wú)腦的NTD病患的羊水樣本中建立并獲得(表2)。八卩_NSC細(xì)胞株可自6個(gè)無(wú)腦樣本中的4個(gè)建立(成功率67%)，且所有4個(gè)細(xì)胞株皆具有正常核型(圖6)。[0095]表2.羊水樣本的來(lái)源和結(jié)果.[0096][0097]神經(jīng)球生長(zhǎng)速率受接種的AF-NSC的密度影響。最佳的接種密度經(jīng)測(cè)定為5,000_10，000細(xì)胞/平方公分（圖1C)，當(dāng)密度低于2，500細(xì)胞/平方公分時(shí)幾乎零生長(zhǎng)。當(dāng)將細(xì)胞以10，000細(xì)胞/平方公分密度分布時(shí)，AF-NSC以109.4±14.8小時(shí)的速率倍增。[0098]為了測(cè)試AF-NSC的長(zhǎng)期增殖潛能，吾人將2個(gè)不同細(xì)胞株（以繼代5起始)于體外生長(zhǎng)幾個(gè)月。兩個(gè)細(xì)胞株皆能維持恒定生長(zhǎng)達(dá)至少5個(gè)月（圖1D)，且其中一個(gè)細(xì)胞株可繁殖超過(guò)8個(gè)月。此兩個(gè)細(xì)胞株可增殖超過(guò)105-101()倍。[0099]實(shí)例2:AF-NSC的表征[0100]為了鑒定AF-NSC的表征，使用免疫細(xì)胞化學(xué)和流式細(xì)胞儀來(lái)偵測(cè)NSC特異性標(biāo)志的表現(xiàn)。共輒焦顯微鏡顯示AF-NSC衍生神經(jīng)球的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)會(huì)大量地表現(xiàn)巢蛋白與Musashi-1。Sox2(-種細(xì)胞核蛋白）亦可在神經(jīng)球中觀察到（圖2A)。[0101]流式細(xì)胞儀顯示AF-NSC會(huì)表現(xiàn)巢蛋白、Sox2、Musashi-l、和ABCG2NSC特異性標(biāo)志(圖2BKCD133首先以低量表現(xiàn)，但信號(hào)強(qiáng)度隨著后續(xù)繼代增加。吾人亦分析胚胎干(ES)細(xì)胞特異性標(biāo)志的表現(xiàn)，且確定吾人的AF-NSC與ES細(xì)胞皆會(huì)表現(xiàn)類似的轉(zhuǎn)錄因子組，包括Nanog、0ct-4、和Sox2,和低量的SSEA-1;然而，其皆不表現(xiàn)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、和TRA-81。此外，AF-NSC中的人類白細(xì)胞抗原(HLA)的表現(xiàn)模式與大多數(shù)基質(zhì)細(xì)胞類似，其表現(xiàn)HLA-I但不表現(xiàn)HLA-II。當(dāng)與來(lái)自先前研究中所得的羊水的干細(xì)胞(AFSC，其表現(xiàn)CD73、CD105和部分表現(xiàn)CD117)相比時(shí)，吾人的AF-NSC不表現(xiàn)CD105和CD117,而僅會(huì)偶爾表現(xiàn)CD73。特別引起關(guān)注的是，吾人所偵測(cè)AF-NSC的所有標(biāo)志，在其體外時(shí)間內(nèi)（經(jīng)由繼代#20-22)皆維持其的表現(xiàn)模式。[0102]吾人亦使用qPCR量測(cè)多個(gè)繼代中此等標(biāo)志的表現(xiàn)量，且發(fā)現(xiàn)巢蛋白、S〇X2、0ct-4、Nanog、和hTERT均一致地在20個(gè)繼代過(guò)程中表現(xiàn)（圖2C)，此結(jié)果亦證實(shí)了吾人先前藉由流式細(xì)胞儀的觀察結(jié)果。最后，評(píng)定吾人的AF-NSC的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)即使在增加繼代數(shù)的長(zhǎng)期培養(yǎng)物中，AF-NSC仍能維持端粒酶的活性程度(圖2D)。[0103]實(shí)例3:AF_NSC的體外神經(jīng)分化[0104]為了確定AF-NSC是否可分化成神經(jīng)元，將細(xì)胞解離成單個(gè)細(xì)胞懸浮液，在NeuroCult?分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)且隨后藉由免疫細(xì)胞化學(xué)分析。2天誘發(fā)后，AF-NSC開始進(jìn)行形態(tài)變化，且巢蛋白和Tuj-Ι在此階段會(huì)在細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)（圖3AK7天誘發(fā)后，可偵測(cè)到額外的神經(jīng)元特異性標(biāo)志，其包括巢蛋白、Tuj-1、MAP2、hNeuN和NFH(圖3B)。吾人亦使用qPCR來(lái)測(cè)定此等神經(jīng)元特異性基因的轉(zhuǎn)錄程度，并發(fā)現(xiàn)7天分化后Tuj-Ι和MAP2分別上調(diào)5.2倍和6.2倍。相反地，巢蛋白（NSC特異性基因）的表現(xiàn)在此相同期間則顯著地降低（圖3C)。[0105]然后，吾人藉由將AF-NSC暴露于經(jīng)定義分化培養(yǎng)基來(lái)使其誘發(fā)為星形膠質(zhì)細(xì)胞、寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、和多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元。大多數(shù)（>80%)AF-NSC可經(jīng)誘發(fā)而變?yōu)镚FAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖4A)，此可由誘發(fā)2周后GFAP的表現(xiàn)顯著增加4,700倍來(lái)確定（圖4B)。04抗原的免疫染色可用來(lái)偵測(cè)寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（圖4A)。與未分化AF-NSC相比，經(jīng)定義培養(yǎng)基中的誘發(fā)引起寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因CNP、MBP、和02的表現(xiàn)分別升高至2.15倍、4.97倍和1.9倍。另外，1個(gè)月后TH陽(yáng)性細(xì)胞和AADC陽(yáng)性細(xì)胞的存在表示AF-NSC可產(chǎn)生多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元（圖4A)。此觀察結(jié)果可藉由qPCR分析驗(yàn)證，確定對(duì)多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元所具有的特異性標(biāo)志（包括4400、？312、1^1^-113、和1'1111'1-1)在分化后顯著上升（圖4B)〇[0106]實(shí)例4:將AF-NSC移植入缺血性中風(fēng)大鼠中且誘導(dǎo)功能恢復(fù)[0107]為了確定AF-NSC是否能在體內(nèi)誘導(dǎo)中風(fēng)的功能恢復(fù)，將IX106個(gè)細(xì)胞移植入已經(jīng)MCA0處理的大鼠腦的缺血性邊界區(qū)中。藉由旋轉(zhuǎn)桿和握力測(cè)試評(píng)估，與健康對(duì)照組相較下，MCA0假注射(僅注射不含細(xì)胞的培養(yǎng)液)大鼠一致地顯示較弱的運(yùn)動(dòng)效能。[0108]在旋桿測(cè)試中，當(dāng)與假注射的MCA0對(duì)照大鼠相比時(shí)，移植了AF-NSC的MCA0組顯示復(fù)原了43±18%的時(shí)間，此表示AF-NSC的存在改善了缺血性中風(fēng)大鼠中所觀察到的運(yùn)動(dòng)缺陷。值得注意的是，AF-NSC在注射后的第一周期間即可使運(yùn)動(dòng)功能迅速恢復(fù)(85±26%)，且此改善可維持到移植后4周(98±18%;圖5A)。[0109]利用握力測(cè)試觀察到類似的功能改善（圖5BKMCA0顯著地降低大鼠的最大握力。在其接受AF-NSC移植一周后，此等缺血性中風(fēng)大鼠的最大握力與假注射對(duì)照組的最大握力相當(dāng)。然而，接受AF-NSC的大鼠可在移植3至4周后可恢復(fù)其正常握力，而假注射對(duì)照組仍較弱。[0110]為了確定MCA0后的損傷程度，在AF-NSC移植4周后用TTC將經(jīng)移植的大腦染色。移植后梗塞區(qū)的尺寸顯著減?。僮⑸?22.17±1.12%;AF-NSC移植:0.62±0.15%)，而萎縮區(qū)域仍相同（假注射：7.21±0.48%;厶?-奶(：移植：5.26±0.57%;圖5〇。隨后，吾人使用免疫組織化學(xué)分析，藉由用針對(duì)巢蛋白的抗體和人類細(xì)胞核抗體對(duì)冷凍切片進(jìn)行雙重標(biāo)記來(lái)確定移植后AF-NSC是否在大鼠腦中存活。結(jié)果顯示，巢蛋白/人類核雙重陽(yáng)性細(xì)胞緊密靠近注射區(qū)（圖，此顯示移植的AF-NSC可存活且嵌入入宿主大腦細(xì)胞間。[0川]討論[0112]在過(guò)去的二十年，已可自胎兒與成人CNS中分離出初級(jí)神經(jīng)干細(xì)胞。最新研究建議，具有成為神經(jīng)元的潛能的細(xì)胞亦可于羊水中發(fā)現(xiàn)[23,25,29];然而，卻尚未有自羊水分離且培養(yǎng)出人類神經(jīng)干細(xì)胞的相關(guān)研究。Turner等人報(bào)導(dǎo)，NSC可自經(jīng)歷產(chǎn)前暴露于網(wǎng)膜酸(Retinoicacid)而導(dǎo)致NTD的史泊格多利大白鼠的羊水中分離且培養(yǎng);然而，此等細(xì)胞并不存在于健康對(duì)照大鼠中[26]。此等AF衍生細(xì)胞展現(xiàn)典型的神經(jīng)祖細(xì)胞形態(tài)且穩(wěn)健地表現(xiàn)NSC特異性標(biāo)志巢蛋白和Sox-2。先前研究亦已報(bào)導(dǎo)，當(dāng)與僅患有露腦畸形或患有脊柱裂(spinabifida)與露腦畸形的彼等動(dòng)物相比時(shí)，衍生自患有脊柱裂的大鼠羊水的神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)目具有統(tǒng)計(jì)上顯著增加[30]。在此研究中，吾人能夠自已診斷罹患無(wú)腦癥的人類胎兒的羊水中分離出AF-NSC(67%)，但未能自正常病患或自罹患非無(wú)腦癥NTD的彼等病患分離出AF-NSC。此等結(jié)果顯示罹患NTD的彼等胎兒羊水中，神經(jīng)干細(xì)胞的比例較高。前神經(jīng)管未能閉合時(shí)出現(xiàn)無(wú)腦，且導(dǎo)致顱頂和大腦半球完全或部分不存在，閉合不全使腦脊髓液朝外流入羊水中，而此發(fā)現(xiàn)目前亦已用于診斷NTD[30-32]，因此神經(jīng)干細(xì)胞存在于羊水中可能由暴露神經(jīng)組織和/或腦脊髓液滲漏入羊膜腔中所引起。[0113]神經(jīng)干細(xì)胞可自我更新分化成所有CNS細(xì)胞類型，且在體外無(wú)血清條件下通常會(huì)生長(zhǎng)成神經(jīng)球[33]。在吾人的研究中，吾人建立的所有4個(gè)AF-NSC細(xì)胞株皆可呈神經(jīng)球形式并維持大于5個(gè)月，且在其表面上發(fā)育出典型的微突起結(jié)構(gòu)。先前研究已表明，自人類胚胎分離的神經(jīng)前驅(qū)物細(xì)胞具有降低的端粒酶活性，其在族群倍增20次后會(huì)降低至不可偵測(cè)的程度[34]。反的，吾人的AF-NSC可擴(kuò)展幾個(gè)月，且甚至在后續(xù)繼代數(shù)下維持其端粒酶活性。雖然AF-NSC可維持其端粒酶活性，但其在體內(nèi)不會(huì)形成畸胎瘤。自6-14.5周齡人類胎兒的各種CNS結(jié)構(gòu)中分離出的典型人類NSC細(xì)胞，其在體外的倍增時(shí)間長(zhǎng)(8-10天）[35]。相對(duì)而言，吾人的AF-NSC每4-5天即可分裂。由于NSC的生長(zhǎng)會(huì)受額外細(xì)胞-細(xì)胞相互作用而影響細(xì)胞密度，因此神經(jīng)球數(shù)目在較高細(xì)胞密度下比在較低細(xì)胞密度下為大[36,37]。吾人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以較低密度（<2，500細(xì)胞/平方公分)接種時(shí)，AF-NSC仍處于靜止?fàn)顟B(tài)（<1倍增/繼代），而其將在較高細(xì)胞密度培養(yǎng)物(5,000_10,000細(xì)胞/平方公分)條件下繼續(xù)增殖。然而，當(dāng)密度過(guò)高U20，000細(xì)胞/平方公分)時(shí)，細(xì)胞反而無(wú)法生長(zhǎng)。[0114]巢蛋白、Sox2、ABCG2、SSEA-l和Musashi-Ι先前已經(jīng)建立為NSC特異性標(biāo)志[38，39]。吾人的AF-NSC在長(zhǎng)期體外培養(yǎng)期間下可維持其此等標(biāo)志的表現(xiàn)。CD133為可用于分離造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志[40]。在此研究中，在其培養(yǎng)時(shí)間，CD133在AF-NSC中的表現(xiàn)增加。羊水已被認(rèn)定為分離胎兒多潛能干細(xì)胞(AFSC)的理想來(lái)源[24,41]。AFSC與間質(zhì)干細(xì)胞共享一些標(biāo)志，諸如⑶73、⑶105和⑶117,且與多能性干細(xì)胞共享一些標(biāo)志，諸如0ct-4、Nanog和Sox2等。然而，AF-NSC不表現(xiàn)CD105和CD117,其僅在表面上表現(xiàn)CD73。雖然AF-NSC確實(shí)會(huì)表現(xiàn)Nanog和Oct-4，但任何胚胎干細(xì)胞標(biāo)志，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81都不會(huì)在其上被染色。綜合而言，此等結(jié)果顯示AF-NSC不同于先前已鑒別出的AFSC。[0115]NSC的另一特點(diǎn)為其能夠分化成多種CNS細(xì)胞類型。吾人已證明，AF-NSC具有體外變?yōu)樯窠?jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、和多巴胺激導(dǎo)性神經(jīng)元的潛能。在寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育期間，04在寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前驅(qū)物與成熟寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表現(xiàn)，而CNP和MBP僅在成熟髓鞘化寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表現(xiàn)[42]AF-NSC可成功地在體外誘發(fā)成04免疫反應(yīng)性細(xì)胞;然而，此等細(xì)胞不以蛋白層次表現(xiàn)CNP或MBP(數(shù)據(jù)中未顯示），但可藉由多AF-NSC細(xì)胞株中的qPCR偵測(cè)出其mRNA的顯著增加。此不一致性可反映AF-NSC需要進(jìn)一步體外刺激以產(chǎn)生成熟寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。先前研究已證明，大腦衍生NSC可分化成神經(jīng)元且提供缺血性中風(fēng)大鼠行為改善的功能[43-44]。如同胎兒NSC，在大鼠中風(fēng)模型中，未分化AF-NSC可有效地移植接近至損害區(qū)域。此外，AF-NSC可誘發(fā)因缺血導(dǎo)致握力和旋桿效能減少的恢復(fù)。另一個(gè)假設(shè)為，NSC移植可能系由于此等細(xì)胞可減弱發(fā)炎反應(yīng)、增加抗凋亡活性或減小梗塞尺寸而誘發(fā)組織修復(fù)[43,45]。此處，吾人觀察到注射4?-吧(：后，缺血性大鼠大腦中所標(biāo)記的梗塞尺寸減小。綜上所述，上述結(jié)果顯示AF-NSC不僅具有體外分化的潛能，且亦具有對(duì)缺血性大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。[0116]將人類NSC用于細(xì)胞療法中的主要障礙通常為可獲得來(lái)源的限制、復(fù)雜的分離方法和耗時(shí)的擴(kuò)展。在此研究中，吾人已證明，衍生自患有NTD的病患的AF-NSC可有效率地于體外分離和增殖，且展現(xiàn)與其他NSC來(lái)源類似的生理特征。使用高分辨率超音波檢查和羊水穿刺術(shù)偵測(cè)懷孕期間的NTD將允許人類AF-NSC的有效收集。因此，人類AF-NSC庫(kù)可為臨床和臨床前測(cè)試的目的而建立。[0117]結(jié)論[0118]總結(jié)而言，自罹患NTD胎兒的AF-NSC與其他來(lái)源的人類NSC具有共同的特征，包含形成神經(jīng)球的能力、表現(xiàn)干細(xì)胞特異標(biāo)志、經(jīng)歷長(zhǎng)時(shí)間增殖的能力、于體外分化的潛力、和在中風(fēng)大鼠模式中具有醫(yī)療效果。因此此新穎人類NSC來(lái)源于未來(lái)移植和治療研究中具有顯著的影響。[0119]參考文獻(xiàn)：[0120]l.OkanoH.Neuralstemcells：progressionofbasicresearchandperspectiveforclinicalapplication.TheKeiojournalofmedicine.2002；51：115-128.[0121]2.ReynoldsBA，WeissS.Generationofneuronsandastrocytesfromisolatedcellsoftheadultmammaliancentralnervoussystem.Science.1992；255:1707-1710.[0122]3.KordowerJH?FreemanTB，SnowBJetal.NeuropathologicalevidenceofgraftsurvivalandstriatalreinnervationafterthetransplantationoffetalmesencephalictissueinapatientwithParkinson7sdisease.TheNewEnglandjournalofmedicine.1995;332:1118-1124.[0123]4.HwangDH，LeeHJ，ParkIHetal.IntrathecaltransplantationofhumanneuralstemcellsoverexpressingVEGFprovidebehavioralimprovement?diseaseonsetdelayandsurvivalextensionintransgenicALSmice.Genetherapy.2009；16:1234-1244.[0124]5.AndresRH，HorieN，SlikkerWetal.Humanneuralstemcellsenhancestructuralplasticityandaxonaltransportintheischaemicbrain.Brain：ajournalofneurology.2011；134：1777-1789.[0125]6.AbematsuM，TsujimuraK，YamanoMetal.Neuronsderivedfromtransplantedneuralstemcellsrestoredisruptedneuronalcircuitryinamousemodelofspinalcordinjury.TheJournalofclinicalinvestigation.2010；120:3255-3266.[0126]7·Gonzalez-Perez0.Neura1stemcellsintheadulthumanbrain.Biologicalandbiomedicalreports.2012；2：59-69.[0127]8.SchwartzPH?BryantPJ，F(xiàn)ujaTJetal.Isolationandcharacterizationofneuralprogenitorcellsfrompost-mortemhumancortex.Journalofneuroscienceresearch.2003；74：838-851.[0128]9.VescoviAL，ParatiEA，GrittiAetal.IsolationandcloningofmultipotentialstemcellsfromtheembryonichumanCNSandestablishmentoftransplantablehumanneuralstemcelllinesbyepigeneticstimulation.Experimentalneurology.1999；156:71-83.[0129]10.EarlCD，ReumT，XieJXetal.Foetalnigralcellsuspensiongraftsinfluencedopaminereleaseinthenon-graftedsideinthe6-hydroxydopamineratmodelofParkinson7sdisease：invivovoltammetricdata.Experimentalbrainresearch.1996；109：179-184.[0130]11.RyderEF?SnyderEY?CepkoCL.Establishmentandcharacterizationofmultipotentneuralcelllinesusingretrovirusvector-mediatedoncogenetransfer.Journalofneurobiology.1990；21：356-375.[0131]12.DeFilippisL，F(xiàn)errariD，RotaNodariLetal.Immortalizationofhumanneuralstemcellswiththec-mycmutantT58A.PloSone.2008；3：e3310.[0132]13.ZhangSC，WernigM，DuncanIDetal.Invitrodifferentiationoftransplantableneuralprecursorsfromhumanembryonicstemcells.Naturebiotechnology.2001;19:1129-1133.[0133]14.ReubinoffBE?ItsyksonP，TuretskyTetal.Neuralprogenitorsfromhumanembryonicstemcells.Naturebiotechnology.2001；19：1134-1140.[0134]15.ChambersSM，F(xiàn)asanoCA，PapapetrouEPetal.HighlyefficientneuralconversionofhumanESandiPScellsbydualinhibitionofSMADsignaling.Naturebiotechnology.2009；27：275-280.[0135]16.MiuraK，0kadaY，AoiTetal.Variationinthesafetyofinducedpluripotentstemcelllines.Naturebiotechnology·2009;27:743-745·[0136]17·BottoLD，MooreCA，KhouryMJetal·Neural-tubedefects·TheNewEnglandjournalofmedicine.1999；341：1509-1519.[0137]18.CoppAJ?GreeneND.Geneticsanddevelopmentofneuraltubedefects.TheJournalofpathology.2010；220：217-230.[0138]19.CoppAJ?StanierP?GreeneND.Neuraltubedefects：recentadvances?unsolvedquestions，andcontroversies.Lancetneurology.2013；12:799-810.[0139]20.YamaguchiY?MiuraM.Howtoformandclosethebrain：insightintothemechanismofcranialneuraltubeclosureinmammals.Cellularandmolecularlifesciences:CMLS.2013;70:3171-3186.[0140]21.KennedyD，ChitayatD，WinsorEJetal.Prenatallydiagnosedneuraltubedefects：ultrasound?chromosome?andautopsyorpostnatalfindingsin212cases.Americanjournalofmedicalgenetics.1998；77:317-321.[0141]22.WaldN，CuckleH，NanchahalK.Amnioticfluidacetylcholinesterasemeasurementintheprenataldiagnosisofopenneuraltubedefects.SecondreportoftheCollaborativeAcetylcholinesteraseStudy.Prenataldiagnosis.1989;9:813-829.[0142]23.TsaiMS?LeeJL?ChangYJetal.Isolationofhumanmultipotentmesenchymalstemcellsfromsecond-trimesteramnioticfluidusinganoveltwo-stagecultureprotocol.HumReprod.2004；19：1450-1456.[0143]24.DeCoppiP，BartschG，Jr.，SiddiquiMMetal·Isolationofamnioticstemcelllineswithpotentialfortherapy.Naturebiotechnology.2007；25：100-106.[0144]25.PrusaAR，MartonE，RosnerMetal.NeurogeniccelIsinhumanamnioticfluid.Americanjournalofobstetricsandgynecology.2004；191：309-314.[0145]26.TurnerCG，KleinJD，WangJetal.Theamnioticfluidasasourceofneuralstemcellsinthesettingofexperimentalneuraltubedefects.Stemcellsanddevelopment.2013;22:548-553·[0146]27.SwistowskiA，PengJ，LiuQetal.Efficientgenerationoffunctionaldopaminergicneuronsfromhumaninducedpluripotentstemcellsunderdefinedconditions.StemCells.2010;28:1893-1904.[0147]28.LongaEZ?ffeinsteinPR，CarlsonSetal.Reversiblemiddlecerebralarteryocclusionwithoutcraniectomyinrats.Stroke；ajournalofcerebralcirculation.1989;20:84-91.[0148]29.McLaughlinD，TsirimonakiE，VallianatosGetal.Stableexpressionofaneuronaldopaminergicprogenitorphenoty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