一種細胞內(nèi)位點特異性共價標記rna的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在體外或細胞內(nèi)位點特異性共價標記RNA的新方法。該方法通過在體外或細胞內(nèi)引入tRNAlle2-agmatidine合成酶(簡稱Tias，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)和閃爍古生球菌tRNAlle2(SEQ ID NO：3)或其衍生核苷酸序列，使Tias特異識別轉(zhuǎn)錄組中AftRNAlle2的特定序列，促使含有疊氮化物或炔基官能團的小分子與含有tRNAlle2標簽的目標RNA之間產(chǎn)生序列及位點特異性結(jié)合，進而通過熒光染料與官能團的化學(xué)反應(yīng)來實現(xiàn)目標RNA的特異性標記及成像。本發(fā)明還涉及在細胞內(nèi)位點特異性共價標記靶標RNA的試劑盒，其包含tRNAlle2-agmatidine合成酶和tRNAlle2-3-5。
【專利說明】
一種細胞內(nèi)位點特異性共價標記RNA的新方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明提供一種在體外或細胞內(nèi)位點特異性 共價標記RNA的新方法。更具體地，該發(fā)明通過在體外或細胞內(nèi)引入tRNA Ilf52-agmatidine 合成酶（tRNAIle2_agmatidine synthetase，簡稱 Tias，其核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所不， 氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示）和閃爍古生球菌（Archaeoglobus fulgidus，簡稱Af) tRNAIle2 (核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示），使Tias特異識別轉(zhuǎn)錄組中Af tRNAIle2的特定 序列，促使含有疊氮化物或炔基官能團的小分子與含有tRNAIlE2標簽的目標RNA之間產(chǎn)生序 列及位點特異性結(jié)合，進而通過熒光染料與官能團的化學(xué)反應(yīng)來實現(xiàn)目標RNA的特異性標 記及成像。
【背景技術(shù)】
[0002] RNA是生物體內(nèi)一種重要的生物大分子，其在蛋白質(zhì)翻譯、基因表達調(diào)控等生物學(xué) 過程中扮演著極其重要的角色。隨著科學(xué)研究的深入，RNA的功能越來越多樣化，其重要性 目前已經(jīng)可以媲美蛋白質(zhì)。
[0003] RNA在細胞內(nèi)存在明確的亞細胞定位，RNA的不同亞細胞定位決定著其執(zhí)行不同 生物學(xué)功能。因此，開發(fā)細胞中RNA的特異標記和成像技術(shù)對我們精確理解RNA的生物學(xué) 功能具有十分重要的意義。
[0004] 為了揭示RNA在細胞中的動態(tài)運輸、定位和相互作用，科研人員已經(jīng)開發(fā)出許多 在哺乳動物細胞中非共價標記RNA的新方法，并且取得了一些進展。目前已開發(fā)的細胞內(nèi) RNA標記和成像技術(shù)極大地促進了 RNA的功能研究，加深了我們對RNA功能的認識。但是已 有的細胞內(nèi)RNA標記和成像技術(shù)都存在某種程度上的不足，這阻礙了 RNA功能的廣泛研究。 因此，發(fā)展新的細胞內(nèi)RNA標記和成像技術(shù)將會極大提高RNA功能研究的水平，這對廣大科 研工作者來說也是任重而道遠的。
[0005] 相比于非共價方法，生物正交化學(xué)主要依賴于探針分子的特異性，以及與目標生 物大分子的共價連接。因此，該方法有以下幾種優(yōu)點：1、探針分子和目標生物大分子具有高 度親和性，因此可通過嚴格限制洗脫條件來高度純化目標生物大分子；2、高親和力使得低 豐度的目標生物大分子能夠可視化，而這對于非編碼RNA尤其重要；3、許多含有功能基團 (例如：熒光、核磁共振、紅外光譜、電子順磁共振官能團等）的探針分子都可以結(jié)合到目標 生物大分子上，使得該方法在應(yīng)用上變得非常靈活。由于這些獨特的功能，生物正交化學(xué)已 被成功地應(yīng)用于蛋白質(zhì)和多糖的功能研究，主要用來在哺乳動物細胞中觀察它們的表達、 定位和相互作用。
[0006]目前，將翻譯/翻譯后修飾機制與生物正交化學(xué)相結(jié)合，已經(jīng)能夠以前所未有的 精度和多功能性來標記蛋白質(zhì)，但是卻沒有適宜的方法在哺乳動物細胞中對RNA進行位點 及序列特異性標記。因此，本發(fā)明擬尋找合適的翻譯后修飾組分，將其與生物正交化學(xué)相結(jié) 合，來開發(fā)RNA特異標記的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 1、技術(shù)問題
[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種在體外或細胞內(nèi)位點特異性共價 標記RNA的新方法。
[0009] 本發(fā)明提供一種在體外或細胞內(nèi)位點特異性共價標記RNA的新方法。本發(fā)明涉及 通過在體外或細胞內(nèi)引入 tRNAIle2_agmatidine 合成酶（tRNAIle2_agmatidine synthetase， 簡稱Tias，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示）和閃爍 古生球菌（Archaeoglobus fulgidus，簡稱 Af)tRNAIle2(核苷酸序列如 SEQ ID N0:3 所示）， 使Tias特異識別轉(zhuǎn)錄組中Af tRNAIlE2的特定序列，促使含有疊氮化物或炔基官能團的小分 子與含有tRNAIlE2標簽的目標RNA之間產(chǎn)生序列及位點特異性結(jié)合，進而通過熒光染料與官 能團的化學(xué)反應(yīng)來實現(xiàn)目標RNA的特異性標記及成像。
[0010] 2、技術(shù)方案
[0011] 為了實現(xiàn)RNA的特異性標記，我們首先需要找到一種翻譯后修飾機制中的獨特 組分，用以進行生物正交化學(xué)反應(yīng)。該組分需要具有兩個特征：第一、它必須是一種RNA修 飾酶，能夠在轉(zhuǎn)錄組中識別特定RNA序列中的特定位點；第二、它必須能夠?qū)⒑歇毺毓δ?基團（例如疊氮化物或炔烴官能團）的小分子轉(zhuǎn)移到RNA的特定部位，隨后通過生物正交 化學(xué)反應(yīng)進行共價標記，實現(xiàn)位點特異性結(jié)合，最終進行熒光、核磁共振、電子順磁共振或 者紅外光譜測定。
[0012] 為了找到這種可以在哺乳動物細胞中精確標記RNA的翻譯后修飾組分，本發(fā)明人 將目光轉(zhuǎn)向tRNA修飾酶。眾所周知，tRNA修飾酶可以催化100多種tRNA修飾。遺傳密碼 的忠實翻譯主要依賴于tRNA的化學(xué)修飾，尤其是反密碼子環(huán)的第34位核苷酸。許多作用 于該位點的tRNA修飾酶被發(fā)現(xiàn)僅存在于特定區(qū)域，這意味著它們可能是獨立進化的。
[0013] 值得注意的是，古細菌中tRNAIle2的34位胞啼啶經(jīng)tRNA Ile2_agmatidine合成酶 (tRNAIle2_agmatidine synthetase，簡稱 Tias)催化可被狐丁胺（agmatine，簡稱 AGM，本發(fā) 明中簡稱為化合物1)修飾。根據(jù)以前的報道，在閃爍古生球菌（Archaeoglobus fulgidus， 簡稱Af)中，Tias識別tRNAIle2需要七個核苷酸，分別是：61、62、034、1]36337、071和〇72， 而哺乳動物細胞中既沒有Tias，也沒有含有這七種核苷酸位點的tRNA。因此，本發(fā)明人設(shè) 想，如果將Tias和古細菌的tRNA 1162引入哺乳動物細胞中，而Tias可以將含有疊氮或炔基 官能團的小分子探針轉(zhuǎn)移至目標RNA上，也許會實現(xiàn)RNA的序列及位點特異性標記。
[0014] 要成功實現(xiàn)RNA標記和成像，除了 tRNA修飾酶Tias，還需要含有功能基團的小分 子探針和相應(yīng)的熒光染料進行生物正交化學(xué)反應(yīng)，因此，本發(fā)明人購買/合成了三種胍丁 胺類似物（結(jié)構(gòu)式參見圖1) :N-(4-氨基丁基）-2-疊氮基乙酰胺（N-G-aminobutyDl-azidoacetamide) (簡稱 AGN， 本發(fā)明中簡稱為化合物 2) 、炔丙胺 （2-Propynylamine， 本發(fā) 明中簡稱為化合物3,購自阿法埃莎公司）、丁-3-炔-1-基（4-氨基丁基）氨基甲酸叔丁 酯（but-3-yn-1-yl(4_aminobutyl)carbamate，本發(fā)明中簡稱為化合物4);以及三種焚光 染料：BCN-FITC、Sulf〇-Cy5-azide (購自 Lumiprobe 公司）、BCN-Cy5。同時，購買了古細菌 Archaeoglobus fulgidus (購自ATCC公司，貨號49558)，從其基因組中克隆表達并純化出 RNA修飾酶Tias (核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示，氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示）。 通過設(shè)計一系列實驗，在體外共同孵育Tias，Af tRNA1162或其衍生的核苷酸序列與靶標RNA 的融合核苷酸序列，小分子探針，熒光染料和其他輔助材料，或在細胞內(nèi)共同表達Tias和 Af tRNAIle2S其衍生的核苷酸序列與靶標RNA的融合核苷酸序列，并與小分子探針，熒光染 料和其他輔助材料共同孵育，最終成功實現(xiàn)了目標RNA的特異性標記及熒光成像。其中所 述小分子探針可以是，但不限于，選自胍丁胺或胍丁胺類似物的化合物。
[0015] 本發(fā)明提供下述實施方案：
[0016] 1. -種能夠在細胞內(nèi)位點特異性共價標記靶標RNA的試劑盒，所述試劑盒包括：
[0017] (l)tRNAIle2-agmatidine 合成酶，其氨基酸序列為 SEQ ID N0 :2，
[0018] (2)tRNAIle2或其衍生的核苷酸序列，其中所述tRNAIle2的核苷酸序列為SEQ ID NO : 3，
[0019] (3)底物，所述底物為胍丁胺或胍丁胺類似物，
[0020] (4)反應(yīng)緩沖液；
[0021] (5)ATP 儲液；
[0022] (6) DTT 儲液；
[0023] (7)熒光染料，其選自 BCN-FITC、BCN_Cy5 或 Sulf〇-Cy5_azide〇
[0024] 2.根據(jù)第1項所述的試劑盒，其中所述tRNAIle2衍生的核苷酸序列為tRNA Ile2-3_5， 其核苷酸序列為SEQ ID NO :5,其具有圖11所示的結(jié)構(gòu)。
[0025] 3.根據(jù)第1項所述的試劑盒，其中所述胍丁胺類似物選自N-(4_氨基丁基）-2_疊 氮基乙酰胺、炔丙胺或丁-3-炔-1-基（4-氨基丁基）氨基甲酸叔丁酯。
[0026] 4.根據(jù)第1項所述的試劑盒，其中所述反應(yīng)緩沖液為lOOmM Tris-HCl，pH 8. 0、 10mM KCl，5mM MgCl2。
[0027] 5.根據(jù)第1項所述的試劑盒，所述試劑盒還包括使tRNA1162或其衍生的核苷酸序 列與靶標RNA融合的試劑。
[0028] 6. -種在細胞內(nèi)位點特異性共價標記靶標RNA的方法，所述方法包括下述步驟：
[0029] (1)將tRNAIle2或其衍生的核苷酸序列與所述靶標RNA偶聯(lián)形成融合RNA，其中所 述tRNA Ile2的核苷酸序列為SEQ ID N0 :3 ;
[0030] (2)在所述細胞中共同表達氨基酸序列為SEQ ID NO :2的tRNAIle2-agmatidine合 成酶和步驟（1)得到的融合RNA，細胞培養(yǎng)基中含有選自胍丁胺或胍丁胺類似物的化合物；
[0031] (3)裂解細胞，提取細胞總RNA，加入熒光染料混合孵育，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié) 合熒光成像進行分析，其中所述熒光染料選自BCN-FITC、BCN-Cy5或Sulf〇-Cy5-azid e。
[0032] 6. -種在細胞內(nèi)位點特異性共價標記靶標RNA的方法，所述方法包括下述步驟：
[0033] (1)將tRNAIle2或其衍生的核苷酸序列與所述靶標RNA偶聯(lián)形成融合RNA，其中所 述tRNA Ile2的核苷酸序列為SEQ ID N0 :3 ;
[0034] (2)在所述細胞中共同表達氨基酸序列為SEQ ID NO :2的tRNAIle2_agmatidine合 成酶和步驟（1)得到的融合RNA，細胞培養(yǎng)基中含有選自胍丁胺或胍丁胺類似物的化合物；
[0035] (3)向細胞培養(yǎng)物中加入熒光染料和催化熒光反應(yīng)的催化劑，進行孵育，通過激光 共聚焦顯微鏡分析，其中所述熒光染料選自BCN-FITC、BCN-Cy5或Sulf〇-Cy5-azid e。
[0036] 8. -種在體外位點特異性共價標記革巴標RNA的方法，所述方法包括在體外體系中 共同孵育下列物質(zhì)：Tias，tRNAIle2或其衍生的核苷酸序列與靶標RNA的融合核苷酸序列，小 分子探針，熒光染料和其他輔助材料，其中所述tRNA Ile2的核苷酸序列為SEQ ID N0 :3,所述 小分子探針為選自胍丁胺或胍丁胺類似物的化合物。
[0037] 9.根據(jù)第6-8項中任一項所述的方法，其中所述tRNAIlE2衍生的核苷酸序列為 tRNAIle2-3-5,其核苷酸序列為SEQ ID N0 :5,其具有圖11所示的結(jié)構(gòu)。
[0038] 10.根據(jù)第6-8項中任一項所述項所述的方法，其中所述胍丁胺類似物選自 N-(4_氨基丁基）-2_疊氮基乙酰胺、炔丙胺或丁-3-炔-1-基（4-氨基丁基）氨基甲酸叔 丁酯。
[0039] 3、有益效果
[0040] 目前，許多現(xiàn)代RNA生物學(xué)和RNA生物技術(shù)均涉及通過化學(xué)方法在RNA分子上 位點特異性整合修飾核苷酸，然而，由于整合效率的限制，目標RNA分子的長度通常小于 30-50個核苷酸。我們的新方法主要依賴于RNA的轉(zhuǎn)錄機制和RNA修飾酶Tias的序列特異 性，因此可以在哺乳動物細胞中的任何目標RNA上高度特異性整合生物物理探針。該方法 可以應(yīng)用于體外或哺乳動物細胞內(nèi)的RNA折疊、RNA-蛋白質(zhì)相互作用、RNA轉(zhuǎn)運、RNA修飾 研究以及RNA納米材料構(gòu)建。
[0041] 相比于以前的非共價RNA成像方法，例如菠菜適體，綠色熒光發(fā)光基團和菠菜適 體之間的非共價相互作用僅能在微摩爾范圍內(nèi)具有親和力；而我們的新方法主要依賴于 Tias和Af tRNAIle2的選擇性識別（這兩者均不存在于哺乳動物細胞中），再通過引入疊氮 基或炔基基團，使熒光基團和靶RNA之間形成共價鍵，以實現(xiàn)低豐度RNA的熒光成像，因此 共價標記新方法具有更高的特異性，親和性及通用性。更重要的是，我們的新方法通過引入 含有不同功能基團的小分子，經(jīng)點擊化學(xué)反應(yīng)（click chemistry reaction)后，可以利用 多種方法，例如：熒光、紅外光譜、核磁共振或電子順磁共振等，進行多功能位點特異性RNA 標記，而不需要改變Tias蛋白或Af tRNA11*52序列。
【附圖說明】
[0042] 從下面結(jié)合附圖的詳細描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中：
[0043] 圖1 :左上圖是化合物1 (AGM)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，右上圖是化合物2 (AGN)的化學(xué)結(jié)構(gòu) 式，左下圖是化合物3的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，右下圖是化合物4的化學(xué)結(jié)構(gòu)式；
[0044] 圖2是化合物2的合成路線；
[0045] 圖3是化合物4的合成路線；
[0046] 圖4和圖4(續(xù)）是BCN-FITC的合成路線（由于說明書附圖第2頁沒能顯示完整 的BCN-FITC的合成路線，因此，在圖4(續(xù)）中繼續(xù)顯示）；
[0047] 圖5是BCN_Cy5的合成路線；
[0048] 圖6是本發(fā)明中所用的酶和RNA的核苷酸/氨基酸序列；
[0049] 圖7是Tias修飾RNA的反應(yīng)示意圖；
[0050] 圖8 :A圖是RNA體外修飾的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，B圖是RNA修飾位點驗證的 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，C圖是非修飾tRNA 1162核酸片段質(zhì)譜圖，D圖是經(jīng)化合物1修飾的 tRNA1162核酸片段質(zhì)譜圖，E圖是經(jīng)化合物2修飾的tRNA 1162核酸片段質(zhì)譜圖，F(xiàn)圖是經(jīng)化合 物3修飾的tRNAIle2核酸片段質(zhì)譜圖；
[0051] 圖9是Tias結(jié)合AGN的晶體結(jié)構(gòu)圖，其中A圖是整體結(jié)構(gòu)圖，B圖是局部結(jié)構(gòu)圖；
[0052] 圖10 :A圖是經(jīng)化合物2修飾的tRNAIle2體外特異性標記及熒光成像圖，B圖是經(jīng) 化合物3修飾的tRNAIlE2體外特異性標記及熒光成像圖；
[0053] 圖 11 是 tRNAIle2-3_5 結(jié)構(gòu)圖；
[0054] 圖12是tRNAIle2-3_5體外特異性標記及熒光成像圖；
[0055] 圖13是tRNAIle2-5S融合RNA特異性標記及熒光成像圖；
[0056] 圖14是tRNAIle2-5S融合RNA在U20S細胞內(nèi)特異性標記及熒光成像圖，其中上一 行是未表達tRNA Ile2-5S融合RNA的U20S細胞的顯微成像圖，下一行是表達tRNAIle2-5S融 合RNA的U20S細胞的顯微成像圖（左列是熒光成像圖，中列是通過DAPI通道顯微觀察圖 片，右列是通過DIC通道顯微觀察圖片）。
【具體實施方式】
[0057] 以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實施例只是舉例說明 的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0058] 本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，除非特別說明，下述實施例中所用的化學(xué)試劑均為可 通過商業(yè)途徑購得的分析純級別的試劑。
[0059] 實施例1 :胍丁胺（AGM，化合物1)類似物的化學(xué)合成
[0060] 1、化合物 2 (N-(4-aminobutyl)-2-azidoacetamide，AGN)的合成（圖 2):
[0061] 取656mg B0C-1，4-丁二胺鹽酸鹽和1. 48g碳酸鈉共同溶于80mL、1 : 1 (v/v)的 乙酸乙酯和水混合物中，〇°C冰浴。1小時后往反應(yīng)液中添加10ml溶解702mg 2-溴乙?；?溴的乙酸乙酯溶液，室溫攪拌2小時。取上層有機相，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，然后通過硅膠 色譜法在硅膠（含體積比例為1 : 1的乙酸乙酯：石油醚）上純化，得到320mg白色中間產(chǎn) 物 1 :叔丁基（4-(2-溴乙酰胺基）丁基）氨基甲酸酯（Tert-butyl(4-(2_bromoacetamido) butyl)carbamate)〇
[0062] 取230mg中間產(chǎn)物1溶解于5mL丙酮中，0°C冰浴。30分鐘后添加5mL疊氮化 鈉（250mg)水溶液，室溫攪拌過夜（22小時）。然后將反應(yīng)液濃縮，并通過硅膠色譜法在 硅膠（含體積比例為1 : 1的乙酸乙酯：石油醚）上純化，得到50mg中間產(chǎn)物2 :叔丁基 (4-(2-疊氮乙酰胺基）丁基）氨基甲酸酯（Tert-butyl(4-(2_azidoacetamido)butyl) carbamate)〇
[0063] 取44mg中間產(chǎn)物2重懸于20ml鹽酸/乙酸乙酯（體積比為1 : 1)混合液中，室 溫攪拌過夜（12小時），然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并冷凍干燥，得到29mg終產(chǎn)物N- (4-氨基丁基）-2-疊 氮乙酰胺鹽酸鹽（N-(4-aminobutyl)-2_azidoacetamide hydrochlorate)。
[0064] 2、化合物 4 (but-3-yn-1-yl (4-aminobutyl) carbamate)的合成（圖 3):
[0065] 取140mg 3- 丁炔-1-醇和424mg碳酸鈉共同溶于10mL四氫呋喃溶液中，0°C冰浴。 然后向反應(yīng)液中加入198mg三光氣，并于室溫下攪拌12小時，得到中間產(chǎn)物。取380mg中 間產(chǎn)物溶于50mL乙酸乙酯/水（體積比比為1 : 1)溶液中，室溫攪拌12小時后，分離有 機相，通入HCL氣體。最后收集白色固定，得到終產(chǎn)物。
[0066] 以上合成反應(yīng)所需化學(xué)試劑如無特別說明，均購自北京化工廠或阿法埃莎公司， 均為分析純以上級別。
[0067] 實施例2 :焚光染料的化學(xué)合成
[0068] 1、BCN-FITC 的合成（圖 4):
[0069] 取15.0mL 1，5-環(huán)辛二烯和281mg二聚醋酸銠混合加入lOmL二氯甲烷溶液 中，然后在3小時內(nèi)逐滴加入10mL溶解15mmol重氮乙酸乙酯的二氯甲烷溶液，同時 溫度保持在〇°C。室溫條件下反應(yīng)15小時后，反應(yīng)體系重新置于冰水浴中保持溫度 在〇°C，再次在3小時內(nèi)加入10mL溶解15mmol重氮乙酸乙酯的二氯甲烷溶液，繼續(xù)在 室溫條件下反應(yīng)21小時。隨后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，硅膠柱分離（石油醚：乙 酸乙酯=20:1，￥八）得到2.528中間產(chǎn)物1:(11?，83,91'，2)-61:117113；^5^16[6.1.0] non-4-ene-9-carboxylate(endo 產(chǎn)物）和 2.08g 中間產(chǎn)物 2 :(lR，8S，9s， Z)_ethyl bicycle[6. 1. 0]non-4-ene-9-carboxylate(exo 產(chǎn)物）〇
[0070] 取370mg氫化鋁鋰溶于30mL乙醚，然后置于0°C冰水浴中，并往懸濁液中逐滴加入 30mL溶解2. 23g中間產(chǎn)物1的乙醚溶液。室溫條件下反應(yīng)2小時后冷卻到0°C，隨后逐滴加 入去離子水直至灰色固體變?yōu)榘咨?。再加?g硫酸鈉，而后通過過濾除去固體，并用100mL 乙醚充分洗滌，得到的濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚。在沒有進一步純化的情況下，將得到的 1. 55g醇類化合物溶于30mL二氯甲烷并置于冰水浴中，然后逐滴加入7. 3mL溶解649 μ L溴 的二氯甲烷溶液，直至溶液保持黃色不變。反應(yīng)體系用30mL、10%的硫代硫酸鈉溶液淬滅， 并用2X50mL二氯甲烷萃取。得到的有機相用無水硫酸鈉干燥后，再通過減壓濃縮除去二 氯甲烷，得到2. 80g二溴代混合物。在沒有進一步純化的情況下，將得到的2. 80g二溴代 混合物全部溶于30mL四氫呋喃并置于冰水浴中，然后在10分鐘內(nèi)逐滴加入29. 6mL催化劑 KOtBu。反應(yīng)體系在66°C回流2小時后冷卻到室溫，用100mL飽和氯化銨溶液淬滅，再通過旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃。得到的溶液用3X100mL二氯甲烷萃取，分離出有機層后，用無水硫 酸鈉干燥，隨后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去二氯甲烷，硅膠柱分離（石油醚：乙酸乙酯=4 : l，v/v) 得到 724mg 中間產(chǎn)物 3 白色固體：（lR，8S，9r)_Bicyclo[6· 1. 0]non-4-yn_9-ylmethanol。
[0071] 取222mg中間產(chǎn)物3溶于20mL二氯甲烷溶液中，加入299 yL吡啶和368mg對 硝基苯基氯甲酸酯，反應(yīng)體系在室溫攪拌40分鐘后用35mL飽和氯化銨溶液淬滅。反 應(yīng)液用2X50mL二氯甲烷萃取，分離有機層，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去二氯甲烷，硅膠 柱分離（石油醚：乙酸乙酯=5 : 1，v/v)得到459mg中間產(chǎn)物4白色固體：（1R，8S， 9r)-bicyclo[6. L 0]non-4-yn_9-ylmethyl(4-nitrophenyl)carbonate。
[0072] 將80 μ L四亞甲基二胺逐滴加入到4mL溶解102mg異硫氰酸熒光素（簡稱FITC， 購自sigma公司）的甲醇溶液中，室溫攪拌2小時。待溶液中有紅色沉淀物生成后，過濾 沉淀并干燥，得到 l〇〇mg 中間產(chǎn)物 5 :5_ (3-(4-aminobutyl) thioureido) _2_ (6_hydroxy-3-ox〇-3H-xanthen_9-yl)benzoicacicL
[0073] 取83mg中間產(chǎn)物4和lOOmg中間產(chǎn)物5共同溶于4mL N，N-二甲基甲酰胺溶 液中，加入111 yL三乙胺，然后在室溫條件下攪拌3小時。硅膠柱分離（二氯甲烷： 甲醇=10 : 1，v/v)得到 106mg 終產(chǎn)物：5-(3-(4-((((lR，8S，9r)-bicyclo[6. 1. 0] non-4-yn-9-ylmethoxy)carbonyl)amino)butyl)thioureido)~2~(6-hydroxy-3-〇x〇-3H 3Hxanthen_9-yl) benzoic acid (簡稱 BCN-FITC)。
[0074] 2、BCN_Cy5 的合成（圖 5):
[0075] 取15g 4-肼基苯磺酸半水合物和25. 2mL 3-甲基-2- 丁酮溶于45mL冰醋酸中， 然后110°C回流3小時。通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去醋酸，將得到的殘余物溶于甲醇，并且在含有 氫氧化鉀的異丙醇飽和溶液中攪拌，直至溶液變?yōu)辄S色，最終得到13. 2g黃色中間產(chǎn)物1 : Potassium2, 3, 3-trimethyl-3H-indole-5_sulfonate〇
[0076] 取1. 39g中間產(chǎn)物1和1. 42g 3-溴丙胺氫溴酸鹽共同懸浮于lOmL乙腈溶液，然 后在封管中保持80°C回流24小時。反應(yīng)體系通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮后重新懸浮于乙醚 中。過濾混合物得到固體，并重新溶于甲醇，再次旋干，然后加入2. 35g二碳酸二叔丁酯、 30mL無水三氯甲烷和3. 75mLN，N-二異丙基乙胺?；旌衔锫訜岬交亓鳒囟?5°C后， 繼續(xù)攪拌4小時。經(jīng)過濃縮和硅膠柱分離（二氯甲烷：甲醇=4 : 1)得到中間產(chǎn)物2: 1_(3-((tert-butoxycarbonyl)amino)propyl)-2, 3, 3-trimethyl-3H-indol-1-ium-5_sul fonate〇
[0077] 向lOmL含有1. 39g中間產(chǎn)物1的乙腈溶液中加入0. 828mL碘乙烷，置于一個封管 中，然后在 80°C反應(yīng) 24 小時得到粗產(chǎn)物 l-ethyl-2, 3, 3-trimethyl-3H-indol-1-ium-5-su lfonate。取535mg粗產(chǎn)物和570mg鹽酸-N_(3-苯氨基-2-丙稀亞基）苯胺溶于10mL冰醋 酸和10mL醋酸酐中，110°C反應(yīng)4小時，得到中間產(chǎn)物3 : l-ethyl-3, 3-dimethyl-2- ((1E， 3E)-4-(N-phenylacetamido)buta-1，3-dien-1-yl)-3H-indol-1-ium-5-sulfonate〇
[0078] 取2. OOmmol中間產(chǎn)物2、2. OOmmol中間產(chǎn)物3和2. 29g無水醋酸鈉溶于30mL 乙醇中，然后在80°C回流18小時。經(jīng)過濃縮和硅膠柱分離（二氯甲烷：甲醇=4 : 1， v/v)得到 214mg 產(chǎn)物 sodiuml-(3-((tert-butoxycarbonyl)amino)p;ropyl)-2-((lE， 3E，5Z)-5-(l-ethyl-3,3-dimethyl-5-sulfonatoindolin-2-ylidene)penta_l， 3-dien-1-yl)-3, 3-dimethyl-3H-indol-1-ium-5_sulfonate。隨后將產(chǎn)物溶于 15mL 甲 醇和 10mL、37 % 鹽酸中，60 °C 反應(yīng) 6 小時后，得到 Sodium 1-(3-aminopropyl) _2_((1E， 3E，5Z)-5-(l-ethyl-3,3-dimethyl-5-sulfonatoindolin-2-ylidene)penta_l， 3-dien-1-yl)-3, 3-dimethyl-3H-indol-1-ium-5_sulfonate (簡稱 Cy5_NH2 · HC1) 〇
[0079] 取 99mg Cy5_NH2 · HC1 和 51mg(1R，8S，9r)-bicyclo[6. 1. 0]non-4-yn_9-ylm ethyl (4-nitrophenyl) carbonate 溶于 8mL N，N_ 二甲基甲酰胺，然后加入 86 μ L 三乙 胺溶液，室溫下攪拌6小時，得到終產(chǎn)物Sodium 1-(3-((((1R，8S，9r)-bicyclo[6. 1. 0] non-4-yn_9-ylmethoxy)carbonyl)amino)propyl)-2_((1E，3E，5Z)-5_(l-ethyl-3, 3-dime thy1-5-sulfonatoindolin-2-ylidene)penta-1，3-dien-1-yl)-3, 3-dimethyl-3H_indol-1-ium-5-sulfonate (簡稱 BCN_Cy5)。
[0080] 以上合成反應(yīng)所需化學(xué)試劑如無特別說明，均購自北京化工廠或阿法埃莎公司， 均為分析純以上級別。
[0081] 實施例3 :RNA修飾酶Tias的重組表達
[0082] 本發(fā)明人購買了古細菌Archaeoglobus fulgidus (購自ATCC公司，登記號 49558)，從其基因組中克隆表達并純化出有活性的RNA修飾酶Tias (核苷酸序列如SEQ ID NO :1所不，氣基酸序列如SEQ ID NO :2所不）。
[0083] 具體操作方法為：將pET22b Af Tias質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取單克隆 于含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖菌過夜；再將菌液按照1 : 100體積比例轉(zhuǎn)接 于含氨芐抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖菌至0D600 = 0. 6,加入ImM IPTG，37°C誘導(dǎo)4 小時，離心收菌，棄培養(yǎng)基后，用含50mM Tris，500mM NaCl，5%甘油，10mM咪唑，pH8. 0的溶 液重懸，超聲波破碎，再用His標簽純化柱（購自南京金斯瑞公司）進行純化，純化后的蛋 白繼續(xù)用s印hadex G200(購自GE公司）進一步純化，得到的蛋白即為具有活性的RNA修 飾酶 Tias，將其保存在 100mMTris-HCl，pH 8· 0, lOmM KC1 溶液中。
[0084] 實施例4 :Af tRNAIle2的制備
[0085] Af tRNAIle2 (SEQ ID NO :3)的制備用 Promega 公司的 T7 Ribomax Express Large Scale RNA production System (P1320)試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μ L， 內(nèi)含 10yL RiboMAX? Express T7 2X Buffer、3yL T7Af tRNAIle2轉(zhuǎn)錄模板、2yL T7 Express Enzyme Mix、3yL RNase inhibitor，置 37°C 水浴鍋反應(yīng) 30 分鐘，再加 lyL RQ1 RNase-Free DNase入反應(yīng)體系，置37°C水浴鍋反應(yīng)15分鐘。
[0086] 實施例5 :RNA體外修飾及驗證
[0087] 在反應(yīng)緩沖液（100mM Tris-HCl，pH 8.0、10mM KCl，5mM MgCl2)中加入8yg實施 例 3 純化的 Tias (SEQ ID NO :2)，20pmol 體外轉(zhuǎn)錄的 Af tRNAIle2 (SEQ ID NO :3)，ImMATP， 5mM DTT，最后分別加入ImM化合物1、2、3或4。37°C孵育2小時后，通過醋酸-尿素聚丙 稀酰胺凝膠（acid-urea PAGE gel)電泳來分離修飾RNA和非修飾RNA。如圖8A所示，當 tRNAIle2被修飾后，在凝膠中的移動速度會變慢。本發(fā)明人很高興地看到，三種化合物1的 類似物：化合物2、3和4均能共價修飾tRNA 1162,導(dǎo)致其在醋酸-尿素聚丙烯酰胺凝膠中移 動速度變慢。但相比之下，化合物3修飾的tRNAIle2比化合物2修飾的tRNA 1162展現(xiàn)出了更 高的移動性，這可能是由于化合物3的分子量相對較低的緣故。而化合物4修飾后tRNA IlE2 呈現(xiàn)出了兩條主帶，表明tRNAIlE2僅僅被部分修飾，這也許是因為較大的氨基甲酸酯和炔官 能團影響了 Tias對RNA的識別效率而導(dǎo)致了不完全修飾。因此，本發(fā)明人將選擇化合物2 和化合物3來進行后續(xù)的研究。
[0088] 接下來，本發(fā)明人構(gòu)建了 tRNAIle2C34U(SEQ ID NO :4)突變體，用以驗證Tias催化 的是否是Af tRNAIle2第34位胞嘧啶的特異性修飾。結(jié)果如圖8B所示，Tias能夠成功催化 化合物1和2共價結(jié)合到tRNA Ile2上，卻不能催化化合物1/2與tRNA Ile2C34U突變體的結(jié)合。 這一結(jié)果充分證明了 Tias不僅可以催化天然底物化合物1，也可以催化非天然的底物類似 物特異性結(jié)合到Af tRNAIle2的第34位胞嘧啶上。
[0089] 為了進一步驗證化合物2和3確實能夠精確結(jié)合Af tRNAIle2的C34，本發(fā)明人使 用RNase T1對Af tRNA1162進行消化，然后通過質(zhì)譜分析含有反密碼子環(huán)的核酸片段。結(jié)果 如圖8C所示，非修飾的tRNA Ile2片段分子量為3184. 08Da，與理論計算分子量3184. 4Da非 常接近。化合物1和化合物3修飾的tRNAIle2片段分子量分別為3295. 29和3220. 26Da (圖 8D和F)，也都非常接近理論計算分子量3295. 5和3220. 3Da。但化合物2修飾的tRNAIle2 片段分子量為3311. lOTa (圖8E)，與理論計算分子量3337. 5Da相差26. 3Da，本發(fā)明人分 析，其原因可能是因為質(zhì)譜的激光照射期間，核酸片段丟失了兩個氮原子，增加了兩個氫原 子，這種情況在以前的質(zhì)譜檢測中也曾經(jīng)出現(xiàn)過。總之，我們的結(jié)果還是能夠說明Tias可 以催化含有疊氮化物/炔官能團的AGM (化合物1)類似物--化合物2和3特異性結(jié)合Af tRNAIle2的34位胞嘧啶。
[0090] 實施例6 :Tias晶體結(jié)構(gòu)解析
[0091] 為了解開Tias (SEQ ID N0 :2)識別AGN(化合物2)的分子基礎(chǔ)，本發(fā)明人解析了 Tias結(jié)合AGN的晶體結(jié)構(gòu)（圖9)。Aspl93的主鏈羰基和Asnl94的側(cè)鏈分別與AGN的疊氮 基形成了兩個氫鍵，Arg217的胍基也與AGN的羰基形成了一個氫鍵，同時，Val203的側(cè)鏈可 以通過疏水作用穩(wěn)定胍丁胺的碳鏈。根據(jù)該晶體結(jié)構(gòu)，本發(fā)明人可以推斷，類似的疏水作用 也能夠促進Tias對炔丙胺（2-Propynylamine，化合物3)的識別。
[0092] 實施例7 :RNA體外特異性標記及成像
[0093] 本發(fā)明人接著測試Tias是否可以通過生物正交化學(xué)方法來實現(xiàn)RNA熒光標記？ 本發(fā)明人往緩沖液（20mM Tris，pH 7. 4、150mM NaCl)中混合加入100μΜ BCN-FITC和 5pmol經(jīng)化合物2修飾的tRNAIle2,同時以加入未被修飾的tRNAIle2作為對照，室溫孵育30 分鐘，經(jīng)6.5%聚丙烯酰胺凝膠（含40禮1^8，？!18.0、11111^0了4,81尿素）電泳分析后，進 行熒光成像（488nm激發(fā)，520nm發(fā)射）。由圖10A可知，經(jīng)化合物2修飾的tRNA Ile2可以與 BCN-FITC進行反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，而未經(jīng)修飾的tRNAIle2與BCN-FITC沒有產(chǎn)生任何反應(yīng)。該 結(jié)果證明了 BCN-FITC可以特異性地與修飾后tRNAIle2的疊氮基團反應(yīng)。
[0094] 本發(fā)明人在ImM亞銅離子作催化劑的條件下，又用同樣的試驗方法測試了經(jīng)化合 物3修飾的tRNA Ile2和Sulf〇-Cy5-azide的熒光成像反應(yīng)（633nm激發(fā)，670nm發(fā)射），也得 到了相同的反應(yīng)結(jié)果（圖10B)，即Sulf〇-Cy5-azide只能與修飾后的tRNA Ile2反應(yīng)并產(chǎn)生 熒光。
[0095] 盡管本發(fā)明人已經(jīng)證明了 Tias可以催化疊氮化物或炔基官能團位點特異性結(jié)合 tRNAIle2,但本發(fā)明人還想知道，該方法能否用來標記其他目標RNA ?為了實現(xiàn)這一目標，本 發(fā)明人通過體外轉(zhuǎn)錄，合成了含有3'和5'延伸端的tRNAIl62(簡稱為tRNAIl62-3-5,結(jié)構(gòu)見圖 11，核苷酸序列如 SEQ ID N0:5所示）。本發(fā)明人將5pmol tRNAIle2-3-5,8yg Tias，5mMDTT， ImM ATP和ImM AGN混合，同時以不加入AGN的混合液作為對照，37°C孵育2小時。然后去 除過量的AGN，再加入100 μ M BCN-FITC，室溫孵育30分鐘。反應(yīng)液通過聚丙烯酰胺凝膠電 泳進行分析。如圖12所示，只有加入AGN，BCN-FITC才能選擇性地標記tRNA Ile2-3-5,這也 同時說明了在tRNAIle2兩端分別加上3'和5'延伸端后，Tias仍可以催化其和AGN的特異 結(jié)合。
[0096] 實施例8 :細胞內(nèi)靶標RNA特異性標記及成像
[0097] 由于以上方法均為RNA體外標記，于是本發(fā)明人繼續(xù)開發(fā)在哺乳動物細胞內(nèi)特異 標記RNA的方法。我們選用293T細胞（購自ATCC公司），將同時帶有tRNAIle2-5S融合基 因和Tias基因的pCMV Myc 5S Tias質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，得到一株可以共同表達Tias(SEQ ID N0:1)和tRNAIle2-5S融合RNA(SEQ ID N0:6)的細胞株，同時將僅帶有Tias基因的pCMV MycTias質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，得到另一株只能表達Tias而無法表達融合RNA的細胞株。我 們將這兩種細胞培養(yǎng)于含有ImM化合物2的DMEM培養(yǎng)基中，隨后通過TRIZ0L洗滌劑來裂 解細胞，提取細胞總RNA。取50pmol細胞總RNA與100 μM BCN-Cy5混合孵育30分鐘后， 通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合熒光成像進行分析。結(jié)果如圖13所示，當細胞中沒有tRNAIl62-5S 融合RNA表達時，BCN-Cy5無法標記293T細胞轉(zhuǎn)錄組中的任何RNA，而細胞中正常表達 tRNAIle2-5S融合RNA時，BCN-Cy5可以成功標記該目標融合RNA。
[0098] 為了進一步驗證本發(fā)明的新方法在哺乳動物細胞中進行RNA成像的效果，本發(fā)明 人換用U20S細胞（購自ATCC公司，登記號：HTB-96)和化合物3重復(fù)上述實驗。兩株U20S 細胞中，一種可以同時表達Tias和tRNAIle2-5S融合RNA(SEQ ID N0:6)，另一種只能表達 Tias而無法表達融合RNA，用含有ImM化合物3的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，然后將細胞與 Sulf〇-Cy5-aZide孵育，同時加入亞銅離子作為催化劑。利用激光共聚焦顯微鏡對細胞進行 觀察。本發(fā)明人得到了相同的實驗結(jié)果：只有在正常表達融合RNA的細胞中，RNA能夠被成 功標記并成像（圖14)。
[0099] 我們用293T細胞提取RNA進行標記是因為293T細胞的轉(zhuǎn)染效率高，導(dǎo)致我們提 取的總RNA中tRNAIle2-5S融合RNA的比例高，這便于我們后續(xù)的熒光染料標記，因為我們的 檢測方法是瓊脂糖電泳后用熒光掃描儀成像，它的靈敏度相對較低，所以需要相對高豐度 的蛋白。同時這種方法可以觀察到被標記RNA的相對分子量位置，便于我們驗證tRNA Ile2-5S 融合RNA的標記。
[0100] 而我們用U20S細胞進行細胞成像是因為相對于293T細胞，U20S細胞貼壁比較牢 固，伸展性較大，便于用來進行激光共聚焦成像。但是U20S細胞的轉(zhuǎn)染效率比較低，不過對 于激光共聚焦成像來說，只需要少數(shù)的陽性細胞就可以觀察了，靈敏度較高。
[0101] 上述兩個細胞內(nèi)實驗的操作上的區(qū)別在于研究目的的不同：在293T細胞中觀察 被標記RNA的大小，在U20S細胞中觀察被標記RNA在細胞內(nèi)位置的分布，實驗?zāi)康牟煌?br>[0102] 應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進行具體地顯示和描述， 但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神 和范圍的條件下，可以在其中進行各種形式和細節(jié)的變化，可以進行各種實施方案的任意 組合。
【主權(quán)項】
1. 一種能夠在細胞內(nèi)位點特異性共價標記祀標RNA的試劑盒，所述試劑盒包括： (iHRNAiieZ-agmatidine合成酶，其氨基酸序列為沈Q ID N0:2， (2) tRNAii62或其衍生的核巧酸序列，其中所述tRNA 1162的核巧酸序列為SEQ ID NO :3， (3) 底物，所述底物為脈下胺或脈下胺類似物， (4) 反應(yīng)緩沖液； 巧)ATP儲液； 化)DTT儲液； (7)巧光染料，其選自BCN-門TC、BCN-切5或Sulfo-切5-azide。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述tRNAii62衍生的核巧酸序列為tRNAii62-3-5， 其核巧酸序列為SEQ ID NO :5,其具有下述結(jié)構(gòu)：3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述脈下胺類似物選自N- (4-氨基下基）-2-疊 氮基乙酷胺、烘丙胺或下-3-烘-1-基（4-氨基下基）氨基甲酸叔下醋。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述反應(yīng)緩沖液為IOOmM化is-肥1，抑8. 0、 IOmM KCl，5mM MgClz。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，所述試劑盒還包括使tRNA Ik2或其衍生的核巧酸序 列與祀標RNA融合的試劑。6. -種在細胞內(nèi)位點特異性共價標記祀標RNA的方法，所述方法包括下述步驟： (1) 將tRNAii62或其衍生的核巧酸序列與所述祀標RNA偶聯(lián)形成融合RNA，其中所述 tRNAiie2的核巧酸序列為SEQ ID NO :3 ; (2) 在所述細胞中共同表達氨基酸序列為SEQ ID NO :2的tRNAiieZ-agmatidine合成酶 和步驟（1)得到的融合RNA，細胞培養(yǎng)基中含有選自脈下胺或脈下胺類似物的化合物； (3) 裂解細胞，提取細胞總RNA，加入巧光染料混合解育，通過瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合巧 光成像進行分析，其中所述巧光染料選自BCN-門TC、BCN-切5或Sulfo-切5-azide。7. -種在細胞內(nèi)位點特異性共價標記祀標RNA的方法，所述方法包括下述步驟： (1) 將tRNAii62或其衍生的核巧酸序列與所述祀標RNA偶聯(lián)形成融合RNA，其中所述 tRNAiie2的核巧酸序列為SEQ ID NO :3 ; (2) 在所述細胞中共同表達氨基酸序列為SEQ ID NO :2的tRNAiieZ-agmatidine合成酶 和步驟（1)得到的融合RNA，細胞培養(yǎng)基中含有選自脈下胺或脈下胺類似物的化合物； (3) 向細胞培養(yǎng)物中加入巧光染料和催化巧光反應(yīng)的催化劑，進行解育，通過激光共聚 焦顯微鏡分析，其中所述巧光染料選自BCN-門TC、BCN-切5或Sulfo-切5-azide。8. -種在體外位點特異性共價標記祀標RNA的方法，所述方法包括在體外體系中共同 解育下列物質(zhì)：Tias，tRNAii62或其衍生的核巧酸序列與祀標RNA的融合核巧酸序列，小分子 探針，巧光染料和其他輔助材料，其中所述tRNAiie2的核巧酸序列為SEQ ID NO :3,所述小分 子探針為選自脈下胺或脈下胺類似物的化合物。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法，其中所述tRNA Iie2衍生的核巧酸序列為 tRNAii62-3-5,其核巧酸序列為SEQ ID N0:5,其具有下述結(jié)構(gòu)：10. 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一項所述的方法，其中所述脈下胺類似物選自N-(4-氨基下 基）-2-疊氮基乙酷胺、烘丙胺或下-3-烘-1-基（4-氨基下基）氨基甲酸叔下醋。
【文檔編號】C12N15/10GK105985944SQ201510046658
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月29日
【發(fā)明人】王江云, 李發(fā)慧
【申請人】中國科學(xué)院生物物理研究所