選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，采用分子量為2000-4000dalton、終濃度為2％×10-6(w/v)至1％×10-7(w/v)的小分子肝素(/肝素鈉)配合優(yōu)化設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行密閉PCR，在不影響靶特異性擴(kuò)增效率的情況下，能夠選擇性地競(jìng)爭(zhēng)抑制引物二聚體PD非特異性擴(kuò)增；從而實(shí)現(xiàn)徹底杜絕引物二聚體造成的PCR假陽(yáng)性結(jié)果使SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光PCR等核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)臨床檢測(cè)分析的不利影響。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)増的小分子肝素
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及分子檢驗(yàn)領(lǐng)域的核酸擴(kuò)增技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及選擇性抑 制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，通過(guò)小分子肝素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合短DNA來(lái)選擇性干擾引物二聚 體擴(kuò)增的技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 二十世紀(jì)末誕生的多聚酶鏈反應(yīng)PCR(美國(guó)專(zhuān)利US 4, 683, 202)技術(shù)模擬了天然 基因幾何級(jí)數(shù)復(fù)制過(guò)程，以其獨(dú)特的幾何指數(shù)擴(kuò)增模式能使數(shù)十個(gè)靶分子甚至單個(gè)分子放 大幾百萬(wàn)倍直至上億倍，加之PCR簡(jiǎn)單的操作使其成為生物世紀(jì)使用最廣的基礎(chǔ)核心技 術(shù)。并由此衍生了一系列的PCR新理論、新方法及改良操作等，尤其是從只能定性的終末檢 測(cè)PCR發(fā)展為動(dòng)態(tài)擴(kuò)增與熒光檢測(cè)同步的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Biot eChniqueS1997Jan22-l : 130)，實(shí)現(xiàn)了精確定量的飛躍，以及依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)或轉(zhuǎn)錄依賴(lài)的擴(kuò)增系統(tǒng)（Transcript-based amplification system，TAS)，環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（Loop mediated isothermal amplification，LAMP)等恒 溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)一步簡(jiǎn)化了操作。目前涉及PCR的相關(guān)研究及發(fā)明創(chuàng)造已數(shù)不勝數(shù)，多聚酶 鏈反應(yīng)PCR已成為引用最多的科研方法和最熱門(mén)的專(zhuān)利申請(qǐng)領(lǐng)域。截至目前全世界PCR專(zhuān) 利或相關(guān)的設(shè)計(jì)更是多達(dá)四至五位數(shù)以上。
[0003] 然而，PCR巨大的擴(kuò)增倍數(shù)也使其非特異性指數(shù)放大而成為長(zhǎng)期困擾并未解決的 根本性障礙。一對(duì)按常規(guī)引物設(shè)計(jì)原則優(yōu)選的引物對(duì)在沒(méi)加模板的本底PCR系統(tǒng)也會(huì)從30 個(gè)熱循環(huán)開(kāi)始出現(xiàn)引物二聚體ro非特異性擴(kuò)增，這也是普通PCR -般只反應(yīng)30個(gè)熱循環(huán) 的主要原因。但是實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要反應(yīng)40個(gè)熱循環(huán)才能使低濃度靶分子有效擴(kuò)增 檢測(cè)，且一對(duì)引物添加一些無(wú)關(guān)的基因組DNA也不明顯增加非特異性擴(kuò)增。目前PCR非特 異性研究很少，多主要集中在PCR熱啟動(dòng)（hot start)反應(yīng)方面（綜述《畜牧獸醫(yī)科技信 息》2009年03期12-13頁(yè)）；但在PCR熱變性后才加入完全成份的人工手動(dòng)熱啟動(dòng)也僅僅 能推后1-2個(gè)熱循環(huán)開(kāi)始非特異性擴(kuò)增，低溫時(shí)的優(yōu)化引物結(jié)合延伸不是ro主要因素，PCR 熱循環(huán)反應(yīng)時(shí)的引物二聚體ro擴(kuò)增仍是PCR非特異性的根本原因。
[0004] 綜合一些PCR研究中的現(xiàn)象和各種PCR增強(qiáng)劑/或增效劑的研究，一般措施對(duì) 引物二聚體ro非特異性與靶模板特異性擴(kuò)增作用均是平行的，缺乏特異的抑制ro擴(kuò) 增選擇性。采用上下游引物完全同序（或單一引物雙倍量）PCR方法（Nucleic Acids Res. 1997vol25-16，p3235)雖絕對(duì)沒(méi)有Η)擴(kuò)增但試驗(yàn)也顯示顯著抑制靶分子擴(kuò)增效率。中 國(guó)專(zhuān)利（CN102146432A)公開(kāi)揭示了部分同序引物對(duì)的本底擴(kuò)增位于30-50(或60)個(gè) 熱循環(huán)之間，一對(duì)上下游6-8個(gè)base堿基同序的引物對(duì)如同序片段離3'末端3-5base位 置，則能最有效推后7-10個(gè)熱循環(huán)才出現(xiàn)ro非特異性擴(kuò)增，同時(shí)一點(diǎn)都不影響特異性靶分 子擴(kuò)增效率。但仍需要遵守極嚴(yán)格的PCR操作規(guī)范以防ro產(chǎn)物氣霧膠再污染，于PCR反應(yīng) 45個(gè)熱循環(huán)內(nèi)尚不能完全消除PCR非特異性。
[0005] 綜上，核酸擴(kuò)增PCR技術(shù)非特異性高主要是由引物二聚體（Primer Dimer)反復(fù)擴(kuò) 增、累積造成的，而目前采用的種種抑制引物二聚體非特異性擴(kuò)增的試劑、措施對(duì)引物-引 物和靶-引物之間的作用均缺乏特異針對(duì)性，沒(méi)有根本解決ro非特異性擴(kuò)增的限制。因 此，亟需研究改進(jìn)，以徹底杜絕引物二聚體造成的PCR假陽(yáng)性結(jié)果使SYBR Green I實(shí)時(shí)熒 光PCR等核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)臨床檢測(cè)分析的不利影響。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的是提供"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"，從關(guān)鍵的引物 作用差異化來(lái)解決特異問(wèn)題。本發(fā)明根據(jù)引物與特異模板是引物全長(zhǎng)堿基正確配對(duì)互補(bǔ)， 而與非特異模板為僅引物3'末端互補(bǔ)再借助其它區(qū)堿基錯(cuò)配結(jié)合力，錯(cuò)配結(jié)合力小于堿 基正確配對(duì)力量的推論。采用縮短的分子量為2000-4000dalton的小分子肝素，在不影響 靶特異性擴(kuò)增效率的前提下，選擇性地競(jìng)爭(zhēng)抑制引物二聚體ro非特異性擴(kuò)增的技術(shù)途徑。
[0007] 本發(fā)明"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"在充分優(yōu)選的一對(duì)引物基礎(chǔ) 上，借鑒抗凝血?jiǎng)?肝素，近年來(lái)發(fā)展出了不引起出血的低分子量肝素作為臨床抗血栓治 療劑。肝素也因?yàn)槠涓呙芏然撬?硫酸負(fù)離子能強(qiáng)力結(jié)合DNA鏈而成為最毒的PCR抑制 劑，
【申請(qǐng)人】通過(guò)逐步降解、縮短肝素長(zhǎng)鏈而逐漸降低其PCR毒性，終于實(shí)驗(yàn)出在其靶擴(kuò)增毒 性剛消除的一狹窄范圍內(nèi)仍能保留抑制引物二聚體聚合、擴(kuò)增的藥性作用，在不影響靶特 異性擴(kuò)增效率前提下，選擇性地抑制ro非特異性擴(kuò)增，與中間部分同序引物對(duì)聯(lián)用則可完 全消除PCR本底非特異性。既不干擾靶分子特異性擴(kuò)增，其本底又在PCR45個(gè)循環(huán)內(nèi)基本 為一直線(xiàn)，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增值干擾。再輔助以礦物油封閉下的一端引物分層緩釋熱啟動(dòng) 及尿嘧啶糖苷酶（UNG)修飾處理使核酸應(yīng)用檢測(cè)在PCR反應(yīng)內(nèi)沒(méi)有引物二聚體累積，PCR多 重封閉沒(méi)有氣霧膠產(chǎn)生或僅沒(méi)有擴(kuò)增的氣霧膠，假如微量的產(chǎn)物泄露也可進(jìn)一步被UNG有 效酶解，多重保證不產(chǎn)生假陽(yáng)性非特異性反應(yīng)，使核酸擴(kuò)增檢測(cè)絕對(duì)可靠。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"，采用小分子 肝素選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的PCR方法，逐漸降解縮短的小分子肝素（heparin)會(huì)同 比例減低其結(jié)合核酸DNA的能力，在低于引物-靶分子完全配對(duì)的結(jié)合力而高于引物-引 物間堿基錯(cuò)配聚合力的對(duì)應(yīng)肝素作用濃度范圍內(nèi)選擇性地抑制引物二聚體ro非特異性擴(kuò) 增；其中，小分子量肝素/肝素鈉_(C 12H16013NS2Na3) 4「即分子量（MW) 2000-4000dalton，純 度達(dá)99%以上肝素，選擇性抑制PCR引物二聚體擴(kuò)增的濃度范圍為：終濃度0. 2% X10 5 至1% X 10 7(w/v)小分子肝素能夠不影響靶特異性擴(kuò)增而有效抑制本底引物二聚體非特 異性擴(kuò)增；選擇性抑制染料法實(shí)時(shí)熒光PCR方法的非特異反應(yīng)假陽(yáng)性。
[0009] 在本發(fā)明所述"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"中，純度達(dá)99%以上 小分子肝素/肝素鈉 （MW :2000-4000d)，經(jīng)其濃度梯度PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)比有模板實(shí)時(shí)熒光PCR- 本底實(shí)時(shí)熒光PCR抑制效果，優(yōu)化終濃度2% X105X1/16至2% X 10 5X 1/32(w/v)小分 子肝素完全不影響靶特異性擴(kuò)增效率而完全抑制本底引物二聚體直至49個(gè)熱循環(huán)都不擴(kuò) 增。
[0010] 在本發(fā)明所述"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"中，對(duì)本底越低的優(yōu)化 引物對(duì)，小分子肝素抑制引物二聚體作用越強(qiáng)；引物對(duì)序列對(duì)肝素作用效果和使用濃度均 有一定的影響，優(yōu)化較好的引物對(duì)使小分子肝素作用明顯更大一些；反過(guò)來(lái)說(shuō)小分子肝素 與本底低的較優(yōu)化引物對(duì)具有進(jìn)一步協(xié)同抑制非特異性效果；不同序列優(yōu)化引物對(duì)其小分 子肝素最佳作用濃度范圍亦有一定變異，具體引物要由對(duì)比抑制PCR試驗(yàn)決定。
[0011] 在本發(fā)明所述"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"中，密閉PCR反應(yīng)，管 底預(yù)置重比重引物使分層的PCR反應(yīng)液因缺少一引物成份而熱啟動(dòng)可控?cái)U(kuò)增，采用礦物油 封閉下的一端引物分層熱緩釋及UNG處理也使礦物油層面上或管壁上濺留的反應(yīng)液因缺 少完全成份僅產(chǎn)生沒(méi)有擴(kuò)增的氣霧膠泄露；加小分子肝素的優(yōu)化引物PCR使核酸檢測(cè)反應(yīng) 內(nèi)沒(méi)有引物二聚體累積，泄露的氣霧膠又是沒(méi)有擴(kuò)增的氣霧膠，假如極微量的產(chǎn)物泄露就 可進(jìn)一步被UNG有效酶解。
[0012] 在本發(fā)明所述"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"中，所述重比重的熱緩 釋引物是10% (w/v)蔗糖稀釋引物，高比重粘性引物預(yù)先加入PCR管底，再依次加 PCR各成 份、最后加礦物油于PCR管壁，室溫下不要混勻振蕩（Vortex)，以免破壞緩釋分層，短瞬離 心使所有反應(yīng)液均沉降于管底；經(jīng)PCR熱變性數(shù)分鐘后，管底的重引物被熱混勻/熱釋放進(jìn) 入反應(yīng)液而啟動(dòng)擴(kuò)增，而礦物油封閉層面上殘留液因缺少完全的PCR成份僅產(chǎn)生無(wú)效擴(kuò)增 的微量氣霧膠，假如可能的擴(kuò)增產(chǎn)物泄露也可進(jìn)一步被UNG有效酶解，多重保證不產(chǎn)生假 陽(yáng)性非特異性反應(yīng)，使核酸擴(kuò)增應(yīng)用檢測(cè)絕對(duì)可靠。
[0013] 在本發(fā)明所述"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"中，在PCR反應(yīng)中，核 酸擴(kuò)增系統(tǒng)所用的所述聚合酶Taq(5U/ μ 1)中加入10% -20%量的UDG酶，在不會(huì)過(guò)度降 解產(chǎn)物模板而不影響特異模板擴(kuò)增效率情況下，仍有效降解進(jìn)一步嚴(yán)控的微量氣霧膠而徹 底杜絕交叉污染，進(jìn)一步保證靶特異擴(kuò)增可靠性。
[0014] 在本發(fā)明所述"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"中，其技術(shù)用于基因 檢測(cè)試劑25Χ的PCR增效劑：含2. 5% X 10 5(w/v)小分子肝素 （MW :2000-4000dalton)， 20% -50% (v/v)甘油，和 0· 1% -10% (w/v)PEG_及 1% ΧΙΟ 6(v/v)次氯酸。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種選擇性抑制PCR引物二聚體擴(kuò)增的方法，在PCR反應(yīng)中， 采用小分子肝素，所述小分子肝素分子量為2000-400()dalt〇n，所述小分子肝素濃度為 2% X106(w/v)至1% X107(w/v)。優(yōu)選地，采用小分子肝素抑制本底引物二聚體非特異 性擴(kuò)增；所述小分子肝素濃度為2% X 10 5X 1/16 (w/v)至2% X 10 5X 1/32 (w/v);所述小 分子肝素與本底低的優(yōu)化引物對(duì)協(xié)同抑制非特異性擴(kuò)增；在密閉PCR反應(yīng)中，管底預(yù)置重 比重?zé)峋忈屢锸狗謱拥腜CR反應(yīng)液因缺少一引物成份而熱啟動(dòng)可控?cái)U(kuò)增，采用礦物油封 閉下的一端引物分層熱緩釋及UNG處理使礦物油層面上或管壁上濺留的反應(yīng)液因缺少完 全成份僅產(chǎn)生沒(méi)有擴(kuò)增的氣霧膠泄露；所述重比重?zé)峋忈屢餅?0% (w/v)蔗糖稀釋引 物；進(jìn)行所述密閉PCR反應(yīng)，將所述重比重?zé)峋忈屢镱A(yù)先加入到PCR管底，再依次加 PCR 各成份、最后加礦物油于PCR管壁封閉，室溫下不要混勻振蕩，以免破壞緩釋分層，短瞬離 心使所有反應(yīng)液均沉降于管底；經(jīng)PCR熱變性后，管底的重比重?zé)峋忈屢锉粺峄靹蚧蛘?熱釋放進(jìn)入反應(yīng)液而啟動(dòng)擴(kuò)增；在PCR反應(yīng)中，在核酸擴(kuò)增系統(tǒng)所用的聚合酶Taq中加入 UDG酶，所述UDG酶在聚合酶Taq中的體積含量為10 % -20 %。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種基因檢測(cè)試劑，所述基因檢測(cè)試劑為25X的PCR增效劑，所 述PCR增效劑含有如下組分：小分子肝素、甘油、PEG6。。。和次氯酸；其中，小分子肝素分子 量為 2000-4000dalton，濃度為 2% X105X1/16(w/v)至 2% X 10 5X 1/32(w/v);甘油為 20% -50% (v/v) ;PEG6_S〇. 1% -10% (w/v);次氯酸為 1% ΧΙΟ 6(v/v)次氯酸。
[0017] 首先，PCR非特異性主要源于系統(tǒng)內(nèi)引物二聚體ro幾何倍數(shù)地?cái)U(kuò)增，核酸擴(kuò)增系 統(tǒng)一般由模板、引物、底物和聚合酶及相應(yīng)的緩沖液組成，其中引物不僅決定著檢測(cè)的特異 性，而且擴(kuò)增產(chǎn)物直接從引物延伸而來(lái)，靶核酸擴(kuò)增數(shù)百萬(wàn)倍至上億倍是由于過(guò)量的千億 倍的引物作用所致，一對(duì)擴(kuò)增引物往往使用5 μ M/L或5ρΜ/ μ 1濃度（反應(yīng)終濃度0. 1 μ M/ L或0. ΙρΜ/ μ 1)，折算成分子數(shù)為5 X 6. 02 X 1017/L或5 X 6. 02 X 1011/ μ 1，其數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò) 量于模板濃度，甚至較最終擴(kuò)增產(chǎn)物分子數(shù)目也高出數(shù)千倍以上。一對(duì)引物每條濃度必須 3-5 μ M/L或3-5ρΜ/ μ 1才能有效的特異性擴(kuò)增靶模版，如此極過(guò)量的一對(duì)引物3'末端彼 此間有互補(bǔ)即相互雜交延伸產(chǎn)生二聚體，再大量被非特異性擴(kuò)增。引物二聚體形成一般是 借助其3'末端壹至多個(gè)互補(bǔ)堿基反向配對(duì)、互為引物延伸形成二聚體，引物對(duì)之間多個(gè)連 續(xù)反向互補(bǔ)堿基可通過(guò)常規(guī)引物設(shè)計(jì)方法規(guī)避。但堿基僅四種組成排列，引物3'末端與非 特異性模板有1-2個(gè)互補(bǔ)序列不可避免，同時(shí)DNA單鏈有一定柔性彎曲度，引物3'末端少 數(shù)堿基互補(bǔ)就可借助其互補(bǔ)區(qū)外的多個(gè)斷續(xù)配對(duì)堿基的合力結(jié)合、延伸一些序列，延伸了 的引物對(duì)之間易多個(gè)堿基互補(bǔ)雜交、延伸產(chǎn)生二聚體，在隨后熱循環(huán)中以二聚體為模板被 游離引物大量非特異性擴(kuò)增、并結(jié)合染料，在不加模板的基于染料SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光 PCR本底對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，引物二聚體非特異性擴(kuò)增一般在30個(gè)左右熱循環(huán)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng) 期，非特異性擴(kuò)增開(kāi)始嚴(yán)重起來(lái)，對(duì)于一般PCR而言，30個(gè)熱循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量足夠用了，大 多PCR可以結(jié)束了，如果沒(méi)有二聚體擴(kuò)增產(chǎn)物的污染以及污染被反復(fù)擴(kuò)增，引物二聚體對(duì) 于大多數(shù)30個(gè)熱循環(huán)以?xún)?nèi)的PCR影響不太大。絕大多數(shù)一對(duì)引物產(chǎn)生二聚體的本底循環(huán)閾 值（Ct值）一般在30個(gè)循環(huán)附近，實(shí)時(shí)熒光PCR第30-38個(gè)熱循環(huán)仍位于5000-5拷貝靶 分子檢測(cè)范圍或黃金檢測(cè)窗口期，因此嚴(yán)重干擾低濃度靶分子精確定量和弱陽(yáng)性標(biāo)本準(zhǔn)確 定性。引物形成二聚體理論上是低于引物間雜交Tm值溫度時(shí)耐熱聚合酶部分催化作用，但 是熱變性熱啟動(dòng)PCR的本底引物Ct值也僅推后1-3個(gè)循環(huán)數(shù)，多在Ct32個(gè)循環(huán)左右。因 此熱啟動(dòng)僅能破壞一對(duì)引物3'末端個(gè)別1-2個(gè)堿基雜交，引物二聚體大部分成因還應(yīng)該是 源于熱循環(huán)引物退火溫度54°C時(shí)末端少數(shù)互補(bǔ)堿基再借助3'末端外的引物間多個(gè)不連續(xù) 配對(duì)互補(bǔ)堿基的合力結(jié)合、而延伸產(chǎn)生二聚體。
[0018] 其次，任何一丁點(diǎn)PCR系統(tǒng)外的交叉污染也是幾何級(jí)放大PCR所不能容許的，而實(shí) 時(shí)熒光PCR"閉管分析"多數(shù)情況下并不完全密閉，也存在擴(kuò)增產(chǎn)物氣霧膠再污染的難題，除 螺旋蓋毛細(xì)管外，大多數(shù)0. 2ml PCR試管或96孔板，在熱循環(huán)95°C變性時(shí)變軟，高溫高壓下 就會(huì)有一些氣霧膠溢（擠）出管蓋，一個(gè)氣霧膠顆粒就含有1〇 5個(gè)分子拷貝，氣霧膠不僅含 高濃度已擴(kuò)增陽(yáng)性靶分子，更多的是過(guò)量一對(duì)引物間產(chǎn)生的引物二聚體擴(kuò)增或引物-探針 聚合體的擴(kuò)增，且每一個(gè)檢測(cè)反應(yīng)管/孔都會(huì)產(chǎn)生引物二聚體非特異性指數(shù)擴(kuò)增。隨著重 復(fù)同一PCR，泄漏的污染物會(huì)得到反復(fù)地指數(shù)擴(kuò)增、積聚，隨后的實(shí)時(shí)熒光PCR不是從0循環(huán) 開(kāi)始而是從上次PCR結(jié)束循環(huán)數(shù)開(kāi)始，污染物越來(lái)越多。擴(kuò)增產(chǎn)物氣霧膠防污染一般采用 dUTP代替dTTP產(chǎn)物再結(jié)合尿嘧啶-DNA-糖基酶（UDG/UNG，美國(guó)專(zhuān)利US 6, 090, 553)選擇 性降解污染產(chǎn)物，UDG/UNG隨后PCR熱變性失活，但在實(shí)際工作中微量酶對(duì)大量的引物二聚 體含dUTP擴(kuò)增產(chǎn)物降解作用有限，并不能消除或推后SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR本底引 物Ct值，過(guò)量酶又會(huì)過(guò)度降解模板從而抑制特異模板擴(kuò)增效率。防止氣霧膠溢出擴(kuò)散的關(guān) 鍵是采用螺旋蓋PCR管、加礦物油封閉等密閉措施，但即使PCR反應(yīng)液表面加一層礦物油也 因加樣/礦物油時(shí)濺出的或液面管壁上殘留的PCR混合液仍然能在熱蓋條件下有效PCR擴(kuò) 增，并有產(chǎn)物氣霧膠溢出，造成下次同一重復(fù)PCR交叉污染，且仍不能夠被微量UDG有效降 解。防止這種污染的一個(gè)措施是礦物油封閉下結(jié)合采用PCR -成份熱緩釋而使濺起礦物油 面上或管壁上殘留反應(yīng)液因缺少PCR完全成份而產(chǎn)生無(wú)效擴(kuò)增的氣霧膠，一般使用高比重 10%蔗糖溶解一端引物預(yù)先加入PCR管底，再依次小心加入反應(yīng)液層和封閉礦物油層，PCR 反應(yīng)液進(jìn)入熱循環(huán)后分層被打破而混勻開(kāi)始熱啟動(dòng)擴(kuò)增，同時(shí)仍采用dUTP代替dTTP的底 物和UDG酶降解更進(jìn)一步嚴(yán)控的微量產(chǎn)物就能徹底杜絕擴(kuò)增氣霧膠交叉污染。
[0019] 核酸擴(kuò)增系統(tǒng)的引物、底物和聚合酶及相應(yīng)的緩沖液（buffer)和Mg2+離子成份均 是長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，允許變化的范圍非常窄，簡(jiǎn)單的濃度改變對(duì)引物二聚體非特異性擴(kuò) 增和靶特異性擴(kuò)增的效果基本均是平行的作用。如使用降低一半濃度的常規(guī)引物能顯著降 低二聚體的形成量，但也同時(shí)平行急劇降低特異性靶模板擴(kuò)增數(shù)量，使正常PCR不能進(jìn)行。 改變聚合酶及相應(yīng)的緩沖液（buffer)和Mg 2+、K+離子效果基本也是同樣結(jié)果。但對(duì)于擴(kuò)增 100-300bp短模板常規(guī)實(shí)時(shí)熒光PCR尤其TaqMan探針?lè)ǘ?，使用降低一半常?guī)濃度dNTP 底物可提高部分?jǐn)U增效率。核酸擴(kuò)增技術(shù)常常采用多種PCR增強(qiáng)劑，如甜菜堿（Betaine)， 二甲基亞砜（DMS0)，甲/乙酰胺和二甲基甲酰胺（DMF)等增加擴(kuò)增效率、平行推前約1-2個(gè) Ct值，更主要還是有效增進(jìn)模板二級(jí)結(jié)構(gòu)解鏈而增加擴(kuò)增效率，但也都平行增加引物二聚 體本底Ct值；單鏈結(jié)合蛋白SSB等顯著抑制引物二聚體ro本底擴(kuò)增但也干擾靶特異性擴(kuò) 增效率，使定量線(xiàn)性紊亂；均對(duì)靶特異擴(kuò)增和引物二聚體非特異性擴(kuò)增沒(méi)有特異選擇性。最 后只得探尋最強(qiáng)的PCR抑制劑，從引物的靶特異配對(duì)擴(kuò)增和引物間堿基錯(cuò)配非特異性擴(kuò)增 的差異化抑制去探索。
[0020] 盡管各種PCR增效劑及添加物質(zhì)實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)特異靶擴(kuò)增效率與引物間非特異擴(kuò) 增的影響均是平行的，導(dǎo)致引物二聚體非特異性主要原因還是過(guò)量引物對(duì)序列自身結(jié)合延 伸的作用，設(shè)計(jì)選擇出一對(duì)本底擴(kuò)增盡量低的優(yōu)選引物一直是定量PCR成功的首選前提。 但是仔細(xì)分析引物與靶分子互補(bǔ)、對(duì)比引物-引物間的結(jié)合延伸作用，還是存在著質(zhì)的差 另IJ。弓丨物與特異的靶分子之間是堿基遵循G-C、A_T法則完全配對(duì)互補(bǔ)的結(jié)合；由于引物設(shè) 計(jì)原則已排除了引物對(duì)之間的連續(xù)堿基互補(bǔ)，引物對(duì)之間是借助堿基錯(cuò)配結(jié)合的；引物二 聚體擴(kuò)增是由于引物對(duì)極度過(guò)量經(jīng)反復(fù)熱循環(huán)反應(yīng)才達(dá)到低濃度靶分子的擴(kuò)增程度。引物 間堿基錯(cuò)配結(jié)合力應(yīng)該顯著低于引物-靶分子間配對(duì)互補(bǔ)結(jié)合力，這就為選擇性抑制引物 二聚體ro的結(jié)合、擴(kuò)增而不影響引物-靶特異性結(jié)合、擴(kuò)增而提供了差異化理論依據(jù)。
[0021] 肝素是小腸肥大細(xì)胞產(chǎn)生的一類(lèi)硫酸化粘性戊多糖，廣泛作為抗凝血?jiǎng)?。近年?lái)， 提取或降解的小分子肝素/肝素鈉，其抗凝血活性顯著降低，在不引起總凝血指標(biāo)變化情 況下，具有明顯的抗血栓治療作用而不會(huì)引起出血。肝素多聚糖鏈構(gòu)型類(lèi)似于核酸多糖鏈， 且其高密度硫酸/磺酸負(fù)離子能強(qiáng)力結(jié)合DNA鏈堿基而成為最毒的PCR抑制劑，極微量（抗 凝血量的萬(wàn)分之一）就足以徹底殺滅PCR反應(yīng)。同理借鑒，逐漸降解縮短的小分子肝素亦 會(huì)同步減低結(jié)合核酸DNA的能力，在低于引物-靶分子結(jié)合力而高于引物-引物間聚合力 的狹窄窗口范圍內(nèi)選擇性地抑制引物二聚體ro非特異性擴(kuò)增。
[0022] 肝素（h印arin)結(jié)構(gòu)是以
（其中 R1= SO 3H/H，R2= SO 3H/ C0-CH3)基本構(gòu)架的一組多樣性變異重復(fù)雙糖，分子式：-(C12H160 13NS2Na3)n-，小分子肝素/ 肝素鈉分子量一般為2000-400()dalt〇n不等，平均每個(gè)肝素雙糖單元含有2. 7個(gè)硫酸基。 大分子肝素采用肝素酶降解法（美國(guó)專(zhuān)利US 5106734)或肝素季胺化β消除降解（美國(guó) 專(zhuān)利US 5389618)法制備小分子肝素，不同濃度醇溶劑分級(jí)沉淀較大分子肝素，DEAE陰離 子交換色譜精制，最終產(chǎn)品采用凝膠色譜（GPC)進(jìn)行分子量測(cè)定。小分子量肝素/肝素 鈉 _(C12H16013NS2Na3) 4 s-即分子量 2000-4000dalton，純度達(dá) 99% 以上肝素（h印arin)，經(jīng)其 濃度梯度PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)比有模板實(shí)時(shí)熒光PCR-本底實(shí)時(shí)熒光PCR抑制效果，小分子肝素對(duì) PCR抑制濃度增加100倍量以上仍不抑制靶特異性擴(kuò)增效率，而1 % (w/v) X 10 6終濃度選 擇性地抑制ro擴(kuò)增。
[0023] 小分子肝素作用實(shí)時(shí)熒光PCR :
[0024] 實(shí)時(shí)熒光PCR是通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物量（即產(chǎn)物標(biāo)記熒光強(qiáng)度）與起始靶基 因分子數(shù)目直接相關(guān)而定量。擴(kuò)增產(chǎn)物量增加的熒光信號(hào)達(dá)到對(duì)數(shù)期的循環(huán)數(shù)定為(；值 (Cycle threshold)，其與祀模板起始分子拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在負(fù)相關(guān)線(xiàn)性關(guān)系，即起始革巴模 板稀釋一倍達(dá)到同樣擴(kuò)增產(chǎn)物強(qiáng)度所需的擴(kuò)增循環(huán)就要增加一個(gè)循環(huán)數(shù)（C t值），擴(kuò)增產(chǎn)物 增加的信號(hào)既可通過(guò)產(chǎn)物DNA結(jié)合熒光染料顯示，如基于熒光染料SYBR Green I的實(shí)時(shí)熒 光PCR(美國(guó)專(zhuān)利US6, 569, 627);又可采用帶淬滅基團(tuán)的熒光探針TaqMan和熒光標(biāo)記引物 來(lái)檢測(cè)。染料法實(shí)時(shí)熒光PCR不僅便宜簡(jiǎn)便，其靈敏度和重復(fù)線(xiàn)性均要明顯好于探針?lè)?，?受限于更嚴(yán)重的引物二聚體非特異性擴(kuò)增干擾。實(shí)時(shí)熒光PCR -般以25 μ 1-50 μ 1反應(yīng)體 積作為其標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系，本發(fā)明采用染料法實(shí)時(shí)熒光PCR25 μ 1反應(yīng)體系，依次按以下比例 吸取PCR反應(yīng)成份加入PCR反應(yīng)管為標(biāo)準(zhǔn)配方：
[0025]
[0026] 最后，每管相應(yīng)加入5 μ 1標(biāo)本模板或?qū)φ諜z測(cè)，進(jìn)行40-45個(gè)循環(huán)：變性 94°C 20-30秒，退火54°C 30秒，延伸72°C 20-30秒并讀取熒光值。
[0027] 為了試驗(yàn)找出小分子肝素在不影響靶特異擴(kuò)增效率的濃度時(shí)仍然能夠有效抑制 ro擴(kuò)增的肝素作用濃度范圍，以乙型肝炎病毒HBV的引物（序列同后面實(shí)施例）染料法實(shí) 時(shí)熒光PCR為試驗(yàn)工具，進(jìn)行不同濃度梯度小分子肝素對(duì)比靶模板組與不含靶模板的本底 PCR組對(duì)比試驗(yàn)。按上面提到的標(biāo)準(zhǔn)配方，但實(shí)驗(yàn)對(duì)象肝素梯度體積加大為5 μ 1，以便檢測(cè) 的靈敏度更準(zhǔn)確一些，配Α組10次PCR反應(yīng)混合液加1 μ 1的1 μ g/ml X 10 2靶模板質(zhì)粒， 而B(niǎo)組10次不含模板的本底反應(yīng)混合液，反應(yīng)液20 μ 1分別加入2 X 10個(gè)PCR反應(yīng)管并按 下表依次加5 μ 1不同肝素梯度，進(jìn)行49個(gè)熱循環(huán)反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖1和CT值如下表：
[0028]
[0029] 由上述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果可見(jiàn)，加 5μ1的1% ΧΙΟ 4X 1/16至1% ΧΙΟ 4X 1/32小分 子肝素完全不影響A組靶特異性擴(kuò)增效率而完全抑制B組本底引物二聚體直至49個(gè)循環(huán) 都不擴(kuò)增。
[0030] 配制25 X倍PCR增效劑的小分子肝素含量計(jì)算：換算成加 ΙμL的小分子肝素增 5Χ 倍，5X1% ΧΙΟ 4Χ1/16 至 5X1% ΧΙΟ 4Χ 1/32 = 3. 125% Χ10 5 至 1. 56% Χ10 5,取 中點(diǎn)平均數(shù)，即配25Χ倍增效劑含2. 5% X 10 5(w/v)肝素，加增效劑1 μ 1于25 μ 1反應(yīng) 液，小分子肝素于PCR反應(yīng)終濃度1% X 10 6 (w/v)不影響靶特異性擴(kuò)增效率而最有效抑制 引物二聚體擴(kuò)增。
[0031] 由于肝素鈉鹽溶解度明顯好于酸性肝素，所以，肝素生產(chǎn)一般取鈉鹽形式，稀釋成 PCR增效劑時(shí)以酸性肝素形式抑制引物二聚體擴(kuò)增較好一些，但低濃度需要添加一定的甘 油和聚乙二醇PEG保護(hù)劑以增加其穩(wěn)定性，再配合一定微量的次氯酸消解ro氣霧膠產(chǎn)物 組成配方PCR增效劑抑制PCR非特異擴(kuò)增效果更佳。同時(shí)引物對(duì)序列對(duì)肝素作用效果和 使用濃度均有一定的影響，優(yōu)化較好的引物對(duì)使小分子肝素作用明顯更大一些；反過(guò)來(lái)說(shuō) 小分子肝素與本底低的較優(yōu)化引物對(duì)具有進(jìn)一步協(xié)同抑制作用，配合使用實(shí)時(shí)熒光PCR使 40-45個(gè)熱循環(huán)內(nèi)不加模板的本底PCR系統(tǒng)反應(yīng)為一條直線(xiàn)，絕對(duì)沒(méi)有引物二聚體非特異 性擴(kuò)增。
[0032] 長(zhǎng)期以來(lái)PCR非特異性得不到控制解決主要是由于內(nèi)源性引物二聚體ro持續(xù)產(chǎn) 生、外源性氣霧膠交叉污染、和一丁點(diǎn)產(chǎn)物污染的幾何級(jí)數(shù)放大所致。在沒(méi)有找到絕對(duì)有效 的控制外源污染前，任何的抑制內(nèi)源ro探索都是徒勞的；相反沒(méi)有徹底抑制內(nèi)源ro擴(kuò)增就 找不到控制外源污染有效方法。一般法定PCR嚴(yán)格操作規(guī)程只是減少了 PCR污染程度但對(duì) 幾何級(jí)數(shù)放大而言作用極有限，本發(fā)明采用一引物重比重分層一熱緩釋配合礦物油密閉法 是保障肝素抑制內(nèi)源ro作用前提。因而一般實(shí)時(shí)熒光PCR加熱蓋并不能封閉擴(kuò)增反應(yīng)，仍 需要加礦物油封閉，但在礦物油面上的殘留反應(yīng)液PCR時(shí)會(huì)揮發(fā)至管頂而擋住熒光光路， 所以有礦物油時(shí)PCR儀仍需要設(shè)置熱蓋，而熱蓋條件下殘留反應(yīng)液留在礦物油面上仍能有 效熱循環(huán)擴(kuò)增，所以設(shè)置熱蓋但不要等熱蓋升溫就開(kāi)始PCR，首先變性95°C 2-5分鐘使礦物 油面上的殘留反應(yīng)液盡量揮發(fā)擠出管外再等熱蓋升溫至105°C，同時(shí)配合管底預(yù)置的重比 重緩釋引物使礦物油面上的殘留反應(yīng)液因缺少一引物成份而絕不會(huì)擴(kuò)增導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物氣 霧膠交叉污染；含蔗糖緩釋引物還使礦物油下面PCR反應(yīng)液熱啟動(dòng)，避免低溫時(shí)啟動(dòng)非特 異性擴(kuò)增。PCR多重封閉沒(méi)有氣霧膠產(chǎn)生或僅沒(méi)有擴(kuò)增的氣霧膠，萬(wàn)一可能的擴(kuò)增產(chǎn)物泄露 也可進(jìn)一步被UNG有效酶解，多重保證不產(chǎn)生假陽(yáng)性非特異性反應(yīng)，使核酸擴(kuò)增應(yīng)用檢測(cè) 絕對(duì)可靠。
[0033] 本發(fā)明"選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素"PCR實(shí)驗(yàn)操作，除PCR增效劑 不同，和分層熱緩釋配合礦物油密閉外與一般常規(guī)PCR基本一樣，標(biāo)本核酸提取純化，采用 常規(guī)方法制備，沒(méi)有特殊要求。樣本DNA提取制備方法包括煮沸法，PEG沉淀法，酒精沉淀 法，堿裂解法，蛋白酶K消化法，酚氯仿抽提法，離心結(jié)合柱法，及胍鹽抽提磁微珠結(jié)合法。 樣本總RNA提取制備一般采用異硫氰酸胍一步法或Trizol試劑快速抽提，一般不用純化 mRNA，必要時(shí)采用PolyA纖維素或磁微珠固相法純化。反轉(zhuǎn)錄（RT)即可分步反應(yīng)，亦可與 PCR -步反應(yīng)。快速檢測(cè)選擇一步RT-PCR單管反應(yīng)，單管加入兩種不同的酶，即用于RT的 反轉(zhuǎn)錄酶（如AMV或M-MLV突變體、Superscript ΙΙ/SuperScript反轉(zhuǎn)錄酶等），常規(guī)PCR 時(shí)DNA聚合酶沒(méi)有限制，用于實(shí)時(shí)PCR采用熱穩(wěn)定DNA聚合酶（如Taq、Taq Plus等）。熱 穩(wěn)定DNA聚合酶活性在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中被其抗體所抑制，進(jìn)入PCR過(guò)程的高溫變性使反轉(zhuǎn)錄 酶失活，同時(shí)也使熱穩(wěn)定DNA聚合酶抑制抗體失活，使擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行。還有一種策略是 使用既具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，又具有DNA聚合酶活性的Tth耐熱聚合酶。其PCR反應(yīng)體系的 底物和聚合酶及相應(yīng)的緩沖液（buffer)和Mg 2+離子濃度能夠與一般普通PCR反應(yīng)體系相 同或通用。
【附圖說(shuō)明】：
[0034] 圖1為肝素濃度梯度抑制PCR反應(yīng)曲線(xiàn)，對(duì)比有模板實(shí)時(shí)熒光PCR組A-本底實(shí)時(shí) 熒光PCR組B的Ct值，兩組擴(kuò)增曲線(xiàn)中，加5μ1的1% X104X1/16至1% Χ104Χ1/32 小分子肝素完全不影響A組靶特異性擴(kuò)增效率而完全抑制B組本底引物二聚體直至49個(gè) 循環(huán)都不擴(kuò)增；圖2為乙肝HBV添加肝素增效劑SYBR Green I法實(shí)時(shí)熒光PCR分析，結(jié)果 pUHBcore標(biāo)準(zhǔn)定量曲線(xiàn)梯度較好，本底對(duì)照Ct值在45循環(huán)內(nèi)基本為一直線(xiàn)，在PCR反應(yīng)內(nèi) 幾乎沒(méi)有擴(kuò)增Ct值。 具體實(shí)施例：
[0035] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、條件、步驟及應(yīng)用所作的修改或替換，均屬于 本發(fā)
[0036] 明的范圍。
[0037] 人乙型肝炎病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR:
[0038] 乙型病毒性肝炎（簡(jiǎn)稱(chēng)乙肝）由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV)引起 的一種世界性的傳染性疾病。在中國(guó)人群中乙肝感染率非常高，極大的危害了人們的身體 健康。目前乙肝的檢測(cè)方法主要有酶免疫法、放免法、化學(xué)發(fā)光法、免疫熒光法、核酸擴(kuò)增 (PCR)熒光定量法等。酶免疫法應(yīng)用較廣，但是實(shí)時(shí)熒光PCR分析法能夠精確測(cè)定乙型肝炎 病人的病毒基因，對(duì)感染者病毒復(fù)制水平的判斷，病情傳染性及抗病毒藥物療效監(jiān)測(cè)具有 無(wú)法替代的重要作用。
[0039] 乙型肝炎病毒（HBV)為部分雙鏈DNA病毒，主要有三段種型特異保守區(qū)，分別位于 表面抗原（HBsAg)區(qū)，X區(qū)和核心（Core)區(qū)，大部分HBV實(shí)時(shí)熒光PCR研究集中選擇核心 (Core)區(qū)和表面抗原（HBsAg)區(qū)。HBV核心（Core)區(qū)有正負(fù)雙鏈DNA，表面抗原（HBsAg) 區(qū)僅含負(fù)鏈DNA單鏈，且大量二級(jí)結(jié)構(gòu)亦集中于此區(qū)域，影響PCR擴(kuò)增效率。比較大多數(shù)發(fā) 表的核心（Core)區(qū)PCR引物序列，仍存在一些明顯的引物間形成二聚體堿基互補(bǔ)序列，甚 至不符合一般引物設(shè)計(jì)通用原則，試用PCR實(shí)際引物二聚體大都在Ct值30循環(huán)處。
[0040] 本發(fā)明精選乙型肝炎病毒（HBV)核心（Core)區(qū)（CDR :2308-2442) -段序列作為 HBV同序引物置換的核酸擴(kuò)增靶特異序列，展示兩端各20堿基Core區(qū)（nt :2308-2442)序 列如下：
[0041] AB540584 Core 區(qū)（nt :2308-2442)
[0042] AATGCCCC TATCTTATCAAC------GTCGCAGAAGA TCTCAATC
[0043] HBVcore實(shí)時(shí)熒光PCR引物設(shè)計(jì)：
[0044] 本發(fā)明根椐一般引物選取原則以盡量減少引物二聚體來(lái)綜合考慮、設(shè)計(jì)：
[0045] (1)選取含種型特異保守序列的100_300bp片段作為靶保守區(qū)；(2)引物長(zhǎng) 16-24base，解鏈溫度Tm在52-60°C，引物間差小于2-3°C; (3) -對(duì)引物GC含量50%，分布 均勻；（4) 一對(duì)引物間不要有連續(xù)3個(gè)以上堿基互補(bǔ)序列，避免4個(gè)以上重復(fù)序列和二級(jí)結(jié) 構(gòu)；（5)引物3'末端最后5個(gè)堿基避免連續(xù)3個(gè)以上G/C堿基；(6)引物3'最末端一般選 擇單個(gè)G或C堿基，如選T減少引物二聚體但也降低了特異性結(jié)合；（7)引物3'最末端絕 對(duì)不能選"GC或CG夾"結(jié)尾，產(chǎn)生嚴(yán)重引物二聚體非特異性擴(kuò)增。（8) -對(duì)引物中間部分 6-8base相同序列能減緩引物二聚體非特異性擴(kuò)增值。
[0046] HBVc引物序列如下：
[0047] HBVcF :5' -at gcc cct ate tta tea ac_3'
[0048] HBVcR :5,-g att gag ate tta tgc gac_3'
[0049] 其中，F(xiàn)代表上游特異引物序列，R代表下游特異引物序列，粗體代表同序堿基。
[0050] 另以臨床檢驗(yàn)的已知HBV陽(yáng)性標(biāo)本血清煮沸法上清為模板，選定全長(zhǎng)Core區(qū) (1900-2450)片段兩側(cè)序列合成帶酶切位點(diǎn)引物擴(kuò)增模板550bp片段，將該片段酶切并克 隆至pUC 19載體作為乙肝模擬定量對(duì)照DNA (pHBVc)，并且CPG酶甲基化后以pUC 19 (lng/ml) 液從0. 01 μ g/ml點(diǎn)開(kāi)始作10倍稀釋6-7次生成10倍梯度定量標(biāo)準(zhǔn)品，最后加2% (v/v) 甘油凍存。
[0051] 聚合酶Taq(5U/ μ 1)中加入10% -20%量的UDG酶，在不會(huì)過(guò)度降解產(chǎn)物模板而 不影響特異模板擴(kuò)增效率情況下，仍有效降解進(jìn)一步嚴(yán)控的微量氣霧膠，從而徹底杜絕交 叉污染，進(jìn)一步保證靶特異擴(kuò)增可靠性。
[0052] 25Χ 的 PCR 增效劑：含 2. 5 % X 10 5(w/v)小分子肝素 （MW :2000-4000dalton)， 50% (v/v)甘油，和添加少許PEG6。。。及1% X10 6(v/v)次氯酸。
[0053] (1)標(biāo)本處理：
[0054] 采用一步煮沸法，取50 μ 1-100 μ 1血清加等量的煮沸緩沖液（用前充分混勻微 珠，剪大口吸頭吸取），輕混，置沸水浴10分鐘，經(jīng)4°C短暫冷卻后高速離心10分鐘，取上清 加樣5 μ 1。
[0055] 弱陽(yáng)性標(biāo)本采用PEG沉淀HBV，取血清500 μ 1加500 μ 1 16 % (w/v) PEG鹽液，振蕩 (Vortex)混勻，高速離心10分鐘，棄上清950 μ 1，濃縮沉淀留50 μ 1加50 μ 1煮沸緩沖液， 余同上煮沸法，加樣5μ1。但PEG沉淀回收率平均為60%，定量檢測(cè)必須計(jì)算損失。或另 購(gòu)商業(yè)提取盒。2X 煮沸緩沖液：0· 02N Na0H，0. 02% SDS(w/v)，25mM KoAc，10mM(NH4)2S04， 0· 5% G25 (v/v)，0· 5M Betaine，0· 5% Glycerol (v/v)和 0· 05% Gelatin (w/v) 〇
[0056] (2) SYBR Green I 熒光 PCR 反應(yīng)：
[0057] 采用25 μ 1反應(yīng)體系，由于SYBR Green I對(duì)單鏈和低于0· 1 μ g/ml (101°拷貝數(shù)） DNA結(jié)合率極低，熒光本底很低，但對(duì)進(jìn)入對(duì)數(shù)期擴(kuò)增的高濃度DNA結(jié)合率增加數(shù)千倍，熒 光信號(hào)強(qiáng)烈使SYBR Green I PCR系統(tǒng)靈敏度高于探針?lè)≒CR-個(gè)數(shù)量級(jí)，（反應(yīng)體系25 μ 1 熒光信號(hào)已大大過(guò)剩，還能夠減低至納升級(jí)，更加適合高通量的微納PCR芯片反應(yīng)）。
[0058]
[0059] 首先每個(gè)PCR管先加 2 μ 1含10%蔗糖的緩釋引物HBVeF (1. 25 μ Μ)于管底，不必?fù)Q 吸頭；再加 5 μ 1樣本或標(biāo)準(zhǔn)品于PCR管的近管底處，每管換一加樣吸頭；再加反應(yīng)混合液 18 μ 1于相應(yīng)PCR管壁中部，小心就不必?fù)Q吸頭；最后，每反應(yīng)管再沿上部管壁小心加 30 μ 1 石蠟油，不要混勻，以防破壞緩釋?zhuān)趟搽x心；預(yù)加樣的緩釋引物常溫下不進(jìn)入PCR反應(yīng)液 使擴(kuò)增不能進(jìn)行，熱變性后引物完全釋放入PCR反應(yīng)液?jiǎn)?dòng)PCR運(yùn)行。
[0060] 每個(gè)檢測(cè)可平行2份X25 μ 1計(jì)平均Ct值，分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0061] 在上述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)時(shí)熒光PCR儀（西安天隆公司TL988型和MJ Inc.DNA Engine 0ption?2,儀器激發(fā)光波長(zhǎng)：480nm，檢測(cè)光波長(zhǎng)：520nm)，按使用說(shuō)明書(shū)操作。首先 預(yù)反應(yīng)50 °C 2分鐘-95 °C 2分鐘，然后45個(gè)循環(huán)：94°C 20-30秒，54°C 30秒，72 °C 20-30秒。 于72 °C讀取熒光值。
[0062] 上述實(shí)驗(yàn)中，也可不加 SYBR Green I的反應(yīng)液進(jìn)行常規(guī)終末PCR35次熱循環(huán)反 應(yīng)，擴(kuò)增條件相同，礦物油代替熱蓋，產(chǎn)物用1. 5% -2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（電泳時(shí)熒光 染料影響電泳迀移率）。
[0063] (3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：
[0064] 模擬陽(yáng)性基因質(zhì)粒pHBcore定量標(biāo)準(zhǔn)品作10倍稀釋梯度，其系列濃度與拷貝數(shù)的 換算及SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)生的Ct值線(xiàn)性關(guān)系見(jiàn)下表：
[0065]
[0066] SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)時(shí)結(jié)果見(jiàn)附圖2,作10倍稀釋模板的標(biāo)準(zhǔn)定量曲線(xiàn)， 表左邊第一條擴(kuò)增曲線(xiàn)為〇. 01 μ g/ml模板約109拷貝，隨之10倍稀釋?zhuān)詈笠粭l擴(kuò)增曲線(xiàn) 為沒(méi)有模板的本底對(duì)照，本底對(duì)照Ct值在45PCR循環(huán)內(nèi)幾乎沒(méi)有擴(kuò)增Ct值。
[0067] 血清樣本加等量煮沸緩沖液后上樣5 μ 1，較標(biāo)準(zhǔn)品5 μ 1稀釋了一倍。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)ct值所得樣本拷貝數(shù)或國(guó)際單位須乘兩倍，按下表樣本換算。Ct值〈38為陽(yáng)性，Ct>39 為陰性，一般不必作溶解曲線(xiàn)分析，陽(yáng)性Tm值87°C，Tm〈78°C為陰性。
[0068]
[0069] 通過(guò)大量培養(yǎng)乙型肝炎病毒（HBV)的檢測(cè)和1000余例所收集的臨床標(biāo)本實(shí)驗(yàn)， 40%陽(yáng)性標(biāo)本病度滴度分布于10 3_109IU/ml范圍內(nèi)，同TaqMan探針?lè)ū容^、和上海復(fù)星公 司、廣洲達(dá)安公司試劑比較，同樣拷貝數(shù)標(biāo)本DNA的檢測(cè)Ct值要早2-3個(gè)循環(huán)數(shù)，靈敏度高 出一個(gè)數(shù)量級(jí)。尤其對(duì)弱陽(yáng)性標(biāo)本和大量陰性血清的重復(fù)檢測(cè)結(jié)果非常穩(wěn)定，遠(yuǎn)好于其它 方法和試劑。
[0070]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，其特征在于，采用小分子肝素選擇性抑 制引物二聚體擴(kuò)增的PCR技術(shù)方法，逐漸降解縮短的小分子肝素會(huì)同比例減低其結(jié)合核酸 DNA的能力，在低于引物-靶分子完全配對(duì)的結(jié)合力而高于引物-引物間堿基錯(cuò)配聚合力的 對(duì)應(yīng)肝素作用濃度范圍內(nèi)選擇性地抑制引物二聚體非特異性擴(kuò)增；其中，小分子肝素分子 量為2000-4000dalton，選擇性抑制PCR引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素濃度范圍為：終濃度 2% X 10 6(w/v)至1% X 10 7(w/v)，小分子肝素能夠不影響靶特異性擴(kuò)增而有效抑制本底 引物二聚體非特異性擴(kuò)增。2. 根椐權(quán)利要求1所述的選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，其特征在于，經(jīng) 小分子肝素濃度梯度PCR實(shí)驗(yàn)，對(duì)比有模板實(shí)時(shí)熒光PCR和本底實(shí)時(shí)熒光PCR的抑制效果， 優(yōu)化終濃度為2% X 10 5X 1/16 (w/v)至2% X 10 5X 1/32 (w/v)的小分子肝素完全不影響 靶特異性擴(kuò)增效率而完全抑制本底引物二聚體直至49個(gè)熱循環(huán)都不擴(kuò)增。3. 根椐權(quán)利要求1所述的選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，其特征在于，對(duì) 本底越低的優(yōu)化引物對(duì)，小分子肝素抑制引物二聚體擴(kuò)增作用越強(qiáng)；引物對(duì)序列對(duì)肝素作 用效果和使用濃度均有一定的影響，優(yōu)化較好的引物對(duì)使小分子肝素作用明顯更大一些； 反過(guò)來(lái)說(shuō)小分子肝素與本底低的較優(yōu)化引物對(duì)具有進(jìn)一步協(xié)同抑制非特異性效果；不同序 列優(yōu)化引物對(duì)其小分子肝素最佳作用濃度范圍亦有一定變異，具體引物要由對(duì)比抑制PCR 試驗(yàn)決定。4. 根椐權(quán)利要求1所述的選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，其特征在于，在 密閉PCR反應(yīng)中，管底預(yù)置重比重引物使分層的PCR反應(yīng)液因缺少一引物成份而熱啟動(dòng)可 控?cái)U(kuò)增，采用礦物油封閉下的一端引物分層熱緩釋及UNG處理也使礦物油層面上或管壁上 濺留的反應(yīng)液因缺少完全成份僅產(chǎn)生沒(méi)有擴(kuò)增的氣霧膠泄露；加小分子肝素的優(yōu)化引物 PCR使核酸檢測(cè)反應(yīng)內(nèi)沒(méi)有引物二聚體累積，泄露的氣霧膠又是沒(méi)有擴(kuò)增的氣霧膠，萬(wàn)一極 微量的產(chǎn)物泄露就能夠進(jìn)一步被UNG有效酶解。5. 根椐權(quán)利要求4所述的選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，其特征在于，所 述重比重的熱緩釋引物是10% (w/v)蔗糖稀釋引物，高比重粘性引物預(yù)先加入PCR管底，再 依次加 PCR各成份、最后加礦物油于PCR管壁，室溫下不要混勻振蕩，以免破壞緩釋分層，短 瞬離心使所有反應(yīng)液均沉降于管底；經(jīng)PCR熱變性后，管底的重引物被熱混勻或者熱釋放 進(jìn)入反應(yīng)液而啟動(dòng)擴(kuò)增，而礦物油封閉層面上殘留液因缺少完全的PCR成份僅產(chǎn)生無(wú)效擴(kuò) 增的微量氣霧膠，萬(wàn)一可能的擴(kuò)增產(chǎn)物泄露也能夠進(jìn)一步被UNG有效酶解，多重保證不產(chǎn) 生假陽(yáng)性非特異性反應(yīng)，使核酸擴(kuò)增應(yīng)用檢測(cè)絕對(duì)可靠。6. 根椐權(quán)利要求5所述的選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，其特征在于，在 PCR反應(yīng)中，核酸擴(kuò)增系統(tǒng)所用的聚合酶Taq(5U/yl)中加入10% -20%量的UDG酶，在不 會(huì)過(guò)度降解產(chǎn)物模板而不影響特異模板擴(kuò)增效率情況下，仍有效降解進(jìn)一步嚴(yán)控的微量氣 霧膠而徹底杜絕交叉污染，進(jìn)一步保證靶特異擴(kuò)增可靠性。7. 根椐權(quán)利要求1所述的選擇性抑制引物二聚體擴(kuò)增的小分子肝素，其特征在于， 小分子肝素用于構(gòu)成基因檢測(cè)試劑25 X的PCR增效劑，所述PCR增效劑含有如下組 分：2 % ΧΙΟ 5X1/16 至 2 % X 10 5X 1/32(w/v)小分子肝素，20 % -50 % (w/v)甘油， 0· 1% -10% (w/v)PEG6。。。及 1% ΧΙΟ 6(v/v)次氯酸。8. -種選擇性抑制PCR引物二聚體擴(kuò)增的方法，其特征在于，在PCR反應(yīng)中，采用小分 子肝素，所述小分子肝素分子量為2000-4000dalton，所述小分子肝素濃度為2% X 10 6(w/ v)至 1 % X 10 7 (w/v)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的選擇性抑制PCR引物二聚體擴(kuò)增的方法，其特征在于，采用小 分子肝素抑制本底引物二聚體非特異性擴(kuò)增； 所述小分子肝素濃度為2% X105X1/16(w/v)至2% X 10 5X 1/32(w/v); 所述小分子肝素與本底低的優(yōu)化引物對(duì)協(xié)同抑制非特異性擴(kuò)增； 在密閉PCR反應(yīng)中，管底預(yù)置重比重?zé)峋忈屢锸狗謱拥腜CR反應(yīng)液因缺少一引物成 份而熱啟動(dòng)可控?cái)U(kuò)增，采用礦物油封閉下的一端引物分層熱緩釋及UNG處理使礦物油層面 上或管壁上濺留的反應(yīng)液因缺少完全成份僅產(chǎn)生沒(méi)有擴(kuò)增的氣霧膠泄露； 所述重比重?zé)峋忈屢餅?0% (w/v)蔗糖稀釋引物；進(jìn)行所述密閉PCR反應(yīng)，將所述 重比重?zé)峋忈屢镱A(yù)先加入到PCR管底，再依次加 PCR各成份、最后加礦物油于PCR管壁 封閉，室溫下不要混勻振蕩，以免破壞緩釋分層，短瞬離心使所有反應(yīng)液均沉降于管底；經(jīng) PCR熱變性后，管底的重比重?zé)峋忈屢锉粺峄靹蚧蛘邿後尫胚M(jìn)入反應(yīng)液而啟動(dòng)擴(kuò)增； 在PCR反應(yīng)中，在核酸擴(kuò)增系統(tǒng)所用的聚合酶Taq中加入U(xiǎn)DG酶，所述UDG酶在聚合酶 Taq中的體積含量為10% -20%。10. -種基因檢測(cè)試劑，其特征在于，所述基因檢測(cè)試劑為25X的PCR增效劑，所述 PCR增效劑含有如下組分：小分子肝素、甘油、PEG_。和次氯酸；其中， 小分子肝素分子量為2000-4000dalton，濃度為2 % X10 5X1/16(w/v)至 2% X 10 5X 1/32(w/v)； 甘油為 20% -50% (v/v); PEG_S〇. 1% -10% (w/v); 次氯酸為1% ΧΙΟ 6(v/V)次氯酸。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK105985947SQ201510090536
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月28日
【發(fā)明人】江洪, 岳素文, 何玉貴
【申請(qǐng)人】北京萬(wàn)達(dá)因生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限責(zé)任公司