一種無鹽無有機(jī)溶劑純化技術(shù)制備透明質(zhì)酸鈉的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及到一種無鹽無有機(jī)溶劑純化技術(shù)制備透明質(zhì)酸鈉的方法。微生物發(fā)酵制備透明質(zhì)酸鈉發(fā)酵液，通過發(fā)酵液的快速升溫處理和過濾、快速降溫后加入活性炭吸附和過濾、超濾、無鹽狀態(tài)下低濃度除菌過濾、動態(tài)冷凍干燥工藝制備無菌透明質(zhì)酸鈉原料。本發(fā)明的優(yōu)點是：通過純化和動態(tài)冷凍干燥技術(shù)制備的透明質(zhì)酸鈉原料干粉的細(xì)菌內(nèi)毒素可以達(dá)到0.05EU/mg，分子量可以達(dá)到200萬道爾頓以上；同時采用快速升降溫處理、無鹽狀態(tài)下低濃度除菌過濾和動態(tài)冷凍干燥技術(shù)可以減去傳統(tǒng)工藝中大量的無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑的使用，一方面降低生產(chǎn)成本，減少高濃度無機(jī)鹽對大規(guī)模生產(chǎn)的不銹鋼設(shè)備的腐蝕；同時減少透明質(zhì)酸鈉植入人體后因有機(jī)溶劑帶來的刺激性和過敏，提高透明質(zhì)酸的生物安全性。
【專利說明】
一種無鹽無有機(jī)溶劑純化技術(shù)制備透明質(zhì)酸鈉的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種無菌生物發(fā)酵法的透明質(zhì)酸及其鹽的制備、純化、靜態(tài)冷凍和動態(tài)真空干燥技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]透明質(zhì)酸，又名玻璃酸是由葡萄糖醛酸和N —乙酰氨基葡萄糖以糖苷鏈交替連接而成的一種雙糖重復(fù)單元組成的線性多糖。透明質(zhì)酸多以透明質(zhì)酸鹽(如透明質(zhì)酸鈉)的形式存在于細(xì)菌和高等動物中的具有生物功能的天然生物聚合物，如革蘭氏陽性的鏈球菌、動物組織包括皮膚、玻璃體、臍帶、透明軟骨和關(guān)節(jié)滑液等多種組織中，并在其中起到保濕、增強(qiáng)皮膚組織彈性、修復(fù)和預(yù)防損傷等生理作用。
[0003]透明質(zhì)酸是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組分之一，廣泛存在身體的許多組織中，因此，非常適用于靶向這些組織的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，并且已經(jīng)廣泛研究并將透明質(zhì)酸及其衍生物應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如二十世紀(jì)七八十年代已經(jīng)批準(zhǔn)用于眼科手術(shù)包括白內(nèi)障眼科手術(shù)、青光眼手術(shù)、角膜移植術(shù)等，作為粘彈劑補(bǔ)充資料關(guān)節(jié)炎，作為組織隔離劑預(yù)防組織粘連，用于填充軟組織缺陷如面部皺紋等。
[0004]目前國內(nèi)外的透明質(zhì)酸及其鹽的純化制備工藝，基本上采用過濾除去菌體等雜質(zhì)后，再以高濃度鹽條件下用大量的有機(jī)溶劑如乙醇、異丙醇、丙酮等進(jìn)行多糖沉淀來提取透明質(zhì)酸及其鹽。有機(jī)溶劑的大量使用，一方面增加了設(shè)備的投入成本和有機(jī)溶劑本身的生產(chǎn)成本，高濃度無機(jī)鹽對大規(guī)模生產(chǎn)的不銹鋼設(shè)備的腐蝕給規(guī)?；a(chǎn)帶來一定的影響；同時透明質(zhì)酸鈉殘留在有機(jī)溶劑中的無法全部回收，收率低；另一方面，有機(jī)溶劑在透明質(zhì)酸鈉中殘留也會造成透明質(zhì)酸鈉植入人體后因有機(jī)溶劑產(chǎn)生一定的刺激性和過敏。
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種采用低鹽和無有機(jī)溶劑提純制備透明質(zhì)酸及其鹽的生產(chǎn)方法，該方法具有生產(chǎn)成本低，質(zhì)量高的特點。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是，提供一種制備透明質(zhì)酸及其鹽的方法，所述的透明質(zhì)酸符合作為體內(nèi)植入材料的標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0007]同樣，本發(fā)明的目的是，提供一種商業(yè)上可行的生產(chǎn)透明質(zhì)酸及其鹽的方法。
[0008]本發(fā)明提供的方法，是在合時的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物進(jìn)行發(fā)酵，隨后將含有透明質(zhì)酸的發(fā)酵液進(jìn)行快速升溫、過濾，再加入冷的注射用水進(jìn)行快速冷卻降溫，然后再以活性炭吸附和過濾、超濾、無鹽濃度下除菌過濾、濃縮、結(jié)晶和動態(tài)冷凍干燥制備透明質(zhì)酸及其土卜
ΠΤΤ.0
[0009]本發(fā)明提供的方法具有節(jié)約鹽和有機(jī)溶劑的大量使用、提高收率的特點，同時可以減少高濃度無機(jī)鹽對大規(guī)模生產(chǎn)的不銹鋼設(shè)備的腐蝕，避免有機(jī)溶劑殘留帶來透明質(zhì)酸及其鹽植入體內(nèi)后的刺激過敏反應(yīng)等優(yōu)點，具有很大的優(yōu)越性。
[0010]本發(fā)明提供的方法中適用的微生物細(xì)菌可以是馬疫鏈球菌、18型化膿性鏈球菌、獸疫鏈球菌；通常在32°C?38°C和pH6.5?7.5進(jìn)行發(fā)酵6h?60h。在發(fā)酵過程中，對于不同的菌種的培養(yǎng)時間因不同的鏈球菌菌株而有相對較大的差異。
[0011]本發(fā)明提供了一種透明質(zhì)酸及其鹽的純化方法，將含有透明質(zhì)酸鈉發(fā)酵液快速升溫至50°C?90°C，維持5min?lOmin，使細(xì)菌莢膜和菌體分離、同時使培養(yǎng)基蛋白質(zhì)變性，用燒結(jié)鈦棒過濾器過濾；而避免傳統(tǒng)的用有機(jī)溶劑沉淀發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的方法。在濾液中加入冷的注射用水將發(fā)酵液快速冷卻至室溫，加入活性炭吸附，聚醚砜濾芯進(jìn)行精濾，有效的去除蛋白質(zhì)、多妝、核酸等雜質(zhì)以及細(xì)菌內(nèi)毒素。然后對精濾液進(jìn)彳丁超濾，以達(dá)到進(jìn)一步對濾液去除蛋白、無機(jī)鹽、內(nèi)毒素的目的，并且稀釋濾液用于后續(xù)的除菌過濾。
[0012]本發(fā)明提供了一種有效的從透明質(zhì)酸中去除蛋白質(zhì)、多肽、核酸等雜質(zhì)，本發(fā)明采用活性炭進(jìn)行處理。為了提高效果，活性炭要通過高溫干烤進(jìn)行活化，活性炭要足量達(dá)到濾液體積的2%?3%，吸附次數(shù)2?3次，吸附時間在4h?8h。
[0013]本發(fā)明提供了一種通過超濾進(jìn)一步純化而去除蛋白、無機(jī)鹽和細(xì)菌內(nèi)毒素后得到的無鹽的透明質(zhì)酸超濾稀溶液。該方法中，是在透明質(zhì)酸濾液中不斷加入無熱原的注射用水稀釋透明質(zhì)酸濾液，用截留分子量在5萬?10萬Da的超濾膜進(jìn)行超濾，加入的注射用水的體積以使超濾后透明質(zhì)酸超濾液的濃度在0.2g/L?0.5 g/L，超濾液中的電導(dǎo)率達(dá)到100M"s/cm 以下。
[0014]本發(fā)明提供了一種無鹽的透明質(zhì)酸除菌過濾的方法。在該方法中，透明質(zhì)酸或其鹽濃度在0.2g/L?0.5 g/L，濾芯材質(zhì)米用聚醚砜，除菌過濾壓力為0.12mPa?0.18mPa。
[0015]本發(fā)明提供了一種動態(tài)真空干燥技術(shù)進(jìn)行透明質(zhì)酸無菌原料的制備。
[0016]該方法中，首先將無菌過濾的透明質(zhì)酸或其鹽的稀溶液過濾到常溫減壓設(shè)備中進(jìn)行常溫、減壓至真空度為_30kPa濃縮至透明質(zhì)酸或其鹽濃度為2 g/L?5 g/L。
[0017]在該方法中，通過加壓將透明質(zhì)酸或其鹽濃縮液輸入動態(tài)低溫冷凍設(shè)備中，采用動態(tài)冷凍技術(shù)將設(shè)備夾套溫度降至_5°C?5°C，邊攪拌邊抽真空制備無菌透明質(zhì)酸或其鹽濃縮液的冰晶。
[0018]在該方法中，對冰晶進(jìn)行通過邊攪拌邊真空干燥的動態(tài)真空干燥技術(shù)制備透明質(zhì)酸鈉無菌原料干粉，攪拌速度為50rpm?200rpm、真空度為_30kPa、干燥時間36?72h、夾套升溫至25°C?45°C。
【具體實施方式】
[0019]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0020]實施例1
第一步:微生物發(fā)酵
馬疫鏈球菌(CCTCC 94034)在植物源性培養(yǎng)基中在32°C?38°C和pH6.5?7.5培養(yǎng)條件下進(jìn)行微生物發(fā)酵40?60h。
[0021]第二步:分離
將含有透明質(zhì)酸鈉發(fā)酵液快速升溫至50°C?90°C，維持5?lOmin，使細(xì)菌莢膜和菌體分離、同時使培養(yǎng)基蛋白質(zhì)變性，用燒結(jié)鈦棒過濾器過濾；
過濾完畢，立即在濾液中加入冷的注射用水將發(fā)酵液快速冷卻至室溫。
[0022]第三步:提純
在濾液中按照濾液體積的3%加入經(jīng)高溫干烤活化過的活性炭，活性炭吸附次數(shù)2次，第一次吸附時間8h，第二次吸附時間4h，每次吸附完成后用0.δμπι聚醚砜濾芯的過濾器進(jìn)行精濾。
[0023]對精濾液進(jìn)行超濾，在透明質(zhì)酸鈉精濾液中通過邊不斷加入無熱原的注射用水稀釋透明質(zhì)酸鈉濾液，同時用截留分子量在5萬Da的超濾膜進(jìn)行超濾，加入的注射用水超濾，最終加入注射用水體積為濾液體積的5倍，透明質(zhì)酸鈉超濾液的濃度在0.5g/L，超濾液中的電導(dǎo)率達(dá)到9(^s/cm。
[0024]第四步:除菌過濾
用0.22IM聚醚砜濾芯的過濾器對上述超濾液進(jìn)行除菌過濾壓入常溫減壓設(shè)備中，除菌過濾壓力為0.18mPa。
[0025]第五步:動態(tài)冷凍干燥
過濾完畢，關(guān)閉閥門，在常溫減壓設(shè)備中，將透明質(zhì)酸鈉的無菌濾液常溫減壓濃縮至透明質(zhì)鈉濃度為5g/L。
[0026]通過加壓將透明質(zhì)酸鈉濃縮液輸入動態(tài)低溫冷凍設(shè)備中，將動態(tài)低溫冷凍設(shè)備夾套溫度降至_5°C?5°C，邊攪拌邊抽真空制備無菌透明質(zhì)酸鈉濃縮液的冰晶，攪拌速度150rpmo
[0027]采用動態(tài)真空干燥技術(shù)通過邊攪拌邊真空干燥透明質(zhì)酸鈉冰晶制備透明質(zhì)酸鈉無菌原料干粉，攪拌速度為150rpm、真空度為_30kPa、干燥時間36h、夾套升溫至45°C。
[0028]該方法制備透明質(zhì)酸鈉的在重均分子量為2.323 X 16,分散系數(shù)Mw/Mn為1.155，細(xì)菌內(nèi)毒素小于0.05Eu/mg，蛋白含量0.03%。
[0029]實施例2 第一步:同實施例1。
[0030]第二步:同實施例2。
[0031]第三步:提純
在濾液中按照濾液體積的2.5%加入經(jīng)高溫干烤活化過的活性炭，活性炭吸附次數(shù)3次，第一次吸附時間8h，第二次吸附時間4和，第三次吸附時間4h，每次吸附完成后用0.δμπι聚醚砜濾芯的過濾器進(jìn)行精濾。
[0032]對精濾液進(jìn)行超濾，在透明質(zhì)酸精濾液中通過邊不斷加入無熱原的注射用水稀釋透明質(zhì)酸濾液，同時用截留分子量為5萬Da的超濾膜進(jìn)行超濾，加入的注射用水的體積為濾液體積的8倍，超濾后透明質(zhì)酸超濾液的濃度在0.35g/L左右，超濾液中的電導(dǎo)率達(dá)到70)J-s/cm 以下。
[0033]第四步:同實施例1，除菌過濾壓力為0.15mPa。
[0034]第五步:動態(tài)冷凍干燥
在常溫減壓設(shè)備中，將透明質(zhì)酸鈉無菌濾液常溫減壓濃縮至透明質(zhì)酸鈉濃度為3.5g/L左右。
[0035]通過加壓將透明質(zhì)酸鈉濃縮液壓入動態(tài)低溫冷凍設(shè)備中，將動態(tài)低溫冷凍設(shè)備夾套溫度降至_5°C?5°C，邊攪拌邊抽真空制備無菌透明質(zhì)酸鈉濃縮液的冰晶，攪拌速度100rpmD
[0036]采用動態(tài)真空干燥技術(shù)通過邊攪拌邊真空干燥透明質(zhì)酸鈉冰晶制備透明質(zhì)酸鈉無菌原料干粉，攪拌速度為lOOrpm、真空度為_30kPa、干燥時間54h、夾套升溫至35°C。
[0037]該方法制備透明質(zhì)酸鈉的在重均分子量為2.496 X 16,分散系數(shù)Mw/Mn為1.114，細(xì)菌內(nèi)毒素小于0.05Eu/mg，蛋白含量0.01%。
[0038]實施例3 第一步:同實施例1。
[0039]第二步:同實施例2。
[0040]第三步:提純
在濾液中按照濾液體積的2%加入經(jīng)高溫干烤活化過的活性炭，活性炭吸附次數(shù)3次，第一次和第二次吸附時間8h，第三次吸附時間4h，每次吸附完成后用0.δμπι聚醚砜濾芯的過濾器進(jìn)行精濾。
[0041]對精濾液進(jìn)行超濾，在透明質(zhì)酸精濾液中通過邊不斷加入無熱原的注射用水稀釋透明質(zhì)酸濾液，同時用截留分子量10萬Da的超濾膜進(jìn)行超濾，加入的注射用水的體積為濾液的10倍，透明質(zhì)酸超濾液的濃度在0.2g/L，超濾液中的電導(dǎo)率達(dá)到4(^s/cm以下。
[0042]第四步:同實施例1，除菌過濾壓力為0.12mPa。
[0043]第五步:動態(tài)冷凍干燥
過濾完畢，關(guān)閉閥門，在常溫減壓設(shè)備中，將透明質(zhì)酸鈉的無菌濾液常溫、低壓濃縮至透明質(zhì)酸或其鹽濃度為2 g/L ο
[0044]通過加壓將透明質(zhì)酸鈉的濃縮液壓入動態(tài)低溫冷凍設(shè)備中，將動態(tài)低溫冷凍設(shè)備夾套溫度降至_5°C?5°C，邊攪拌邊抽真空制備無菌透明質(zhì)酸或其鹽濃縮液的冰晶，攪拌速度50rpm。
[0045]通過邊攪拌邊真空干燥透明質(zhì)酸或其鹽冰晶的動態(tài)真空干燥技術(shù)制備透明質(zhì)酸鈉無菌原料干粉，攪拌速度為50rpm、真空度為_30kPa、干燥時間72h、夾套升溫至25°C。
[0046]以下是各個實施例生產(chǎn)的透明質(zhì)酸鈉原料干粉與傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝(有機(jī)溶劑提純和鹽濃度下除菌過濾)質(zhì)量性能比較表。
[0047]該方法制備透明質(zhì)酸鈉的在重均分子量為2.535 X 16,分散系數(shù)Mw/Mn為1.063，細(xì)菌內(nèi)毒素小于0.05Eu/mg，蛋白含量0.01%。
【主權(quán)項】
1.一種無鹽無有機(jī)溶劑純化技術(shù)制備透明質(zhì)酸鈉的方法，其特征在于:將能分泌透明質(zhì)酸的細(xì)菌在培養(yǎng)基中和適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)生透明質(zhì)酸，將得到的透明質(zhì)酸鈉發(fā)酵液經(jīng)純化處理、除菌過濾、濃縮、動態(tài)冷凍干燥制備透明質(zhì)酸鈉無菌原料粉。2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所選細(xì)菌為馬疫鏈球菌、18型化膿性鏈球菌、獸疫鏈球菌。3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將透明質(zhì)酸鈉發(fā)酵液快速升溫至50-90°C，維持5-10分鐘，使細(xì)菌莢膜和菌體分離、使培養(yǎng)基蛋白質(zhì)變性，燒結(jié)鈦棒過濾器過濾；在濾液中加入冷的注射用水將發(fā)酵液快速冷卻至室溫。4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于將濾液用活性炭吸附，0.45Mfli聚醚砜濾芯進(jìn)行精濾，去除多種雜質(zhì)。5.權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于活性炭要活化、足夠的量以及充分的吸附時間，以提高去除可溶性蛋白質(zhì)、多肽、核酸的效果。6.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于對精濾液進(jìn)行超濾，對透明質(zhì)酸濾液進(jìn)行進(jìn)一步去除蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、細(xì)菌內(nèi)毒素并且稀釋制品。7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在無鹽狀態(tài)下進(jìn)行低濃度透明質(zhì)酸溶液的除菌過濾，濃度在0.2 g/L?0.5 g/Lo8.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用常溫、減壓濃縮技術(shù)在常溫、減壓至真空度為-30kPa將透明質(zhì)酸或其鹽濃縮至濃度為2 g/L?5 g/L。9.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將無菌透明質(zhì)酸鈉濃縮液在動態(tài)低溫冷凍設(shè)備中，通過動態(tài)冷凍技術(shù)在設(shè)備夾套溫度-5 °C?5°C，邊攪拌邊抽真空制備無菌透明質(zhì)酸或其鹽濃縮液的冰晶。10.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用動態(tài)真空干燥技術(shù)對無菌透明質(zhì)酸或其鹽濃縮液的冰晶進(jìn)行通過邊攪拌邊真空干燥制備透明質(zhì)酸鈉無菌原料干粉，攪拌速度為50?200rpm、真空度為_30kPa、干燥時間36?72h、夾套升溫至25°C?45°C。
【文檔編號】C12P19/26GK105985994SQ201510105074
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月11日
【發(fā)明人】蔣麗霞, 王文斌, 陶偉棟, 魏長征
【申請人】上海其勝生物制劑有限公司