檢測葉酸代謝相關(guān)基因的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測葉酸代謝能力相關(guān)基因的方法，包括：獲取受檢者核酸，核酸包含DNA片段；檢測以下至少兩個SNP位點的基因型，MTRR基因c.66A>G、MTHFR基因c.677C>T和MTHFR基因c.1298A>C，其中包括，利用第一引物擴增包含SNP位點的DNA片段，獲得擴增產(chǎn)物，將第二引物與擴增產(chǎn)物結(jié)合，延伸一個堿基，獲得延伸產(chǎn)物，依據(jù)延伸產(chǎn)物與第二引物的分子量差異，確定SNP位點的堿基類型。本發(fā)明還公開一種檢測葉酸代謝能力基因的試劑盒。利用本發(fā)明的方法和/或試劑盒，能夠高通量、低成本、高準(zhǔn)確度、耗時短的對葉酸代謝相關(guān)基因進行分型，分型結(jié)果能夠用以輔助指導(dǎo)受檢者補充葉酸。
【專利說明】
檢測葉酸代謝相關(guān)基因的方法和試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種檢測葉酸代謝相關(guān)基因的方 法和一種試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉酸（蝶酰單谷氨酸）是指具有相關(guān)生物活性的一類同效維生素，由蝶啶、對氨 基苯甲酸和1個或多個谷氨酸結(jié)合而成，即由a-氨基-4-羥基蝶啶與對氨基苯甲酸相連 接，再以-NH-C0-鍵與谷氨酸連接組成，其不同的輔酶形式可以作為一碳單位的供體或載 體而發(fā)揮作用，主要參與以下幾類反應(yīng)：①蛋氨酸合成；②嘌呤和嘧啶的合成；③絲氨酸和 甘氨酸的相互轉(zhuǎn)化；④組氨酸的降解。大量的科學(xué)研究表明，葉酸攝入絕對或相對的缺乏， 是引起高同型半胱氨酸血癥的直接原因。高同型半胱氨酸血癥可能導(dǎo)致新生兒神經(jīng)管缺陷 (NTDs)、唐氏綜合癥（DS)、先天性心臟?。–HD)、唇腭裂；孕婦妊娠期高血壓、早產(chǎn)、自發(fā)性 流產(chǎn)。
[0003] 目前了解到涉及葉酸代謝能力的關(guān)鍵基因包括亞甲基四氫葉酸還原酶 (methylenete-trahydmfolate reductase, MTHFR)和甲硫氨酸合成酶還原酶（methionine synthase reductase, MTRR)。這兩種酶的基因出現(xiàn)位點變異導(dǎo)致酶活性降低，會顯著影響 機體的葉酸代謝能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 依據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一種檢測葉酸代謝能力基因的方法，包括如下 步驟：獲取受檢者核酸，所述核酸包含DNA片段，所述DNA片段來自斷裂的基因組DNA和 /或游離DNA;檢測以下葉酸代謝能力基因的SNP位點中的至少兩個的基因型，MTRR基因 c. 66A>G、MTHFR基因 c. 677C>T和MTHFR基因 c. 1298A>C，其中包括，利用第一引物擴增包 含所述SNP位點的DNA片段，獲得擴增產(chǎn)物，將第二引物與所述擴增產(chǎn)物結(jié)合，延伸一個堿 基，獲得延伸產(chǎn)物，依據(jù)所述延伸產(chǎn)物與所述第二引物的分子量差異，確定所述SNP位點的 堿基類型。受檢者可以是人或者其它哺乳動物。上述3個SNP位點是發(fā)明人經(jīng)過收集、 篩選組合獲得的與個體葉酸代謝能力遺傳強相關(guān)的多態(tài)性位點。亞甲基四氫葉酸還原酶 (methylenete-trahydmfolate reductase, MTHFR)的 C677T 位點和 A1298C 位點催化產(chǎn)生 5-甲基四氫葉酸，參與甲基傳遞及核苷酸合成通路，MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸在體 內(nèi)積累。甲硫氨酸合成酶還原酶（methionine synthase reductase, MTRR)的A66G位點將 失活的甲硫氨酸合成酶還原為活性狀態(tài)，維持甲基傳遞通路繼續(xù)進行，MTRR酶的活性降低， 易致同型半胱氨酸血癥、神經(jīng)管缺陷等疾病。上述SNP位點是根據(jù)HGVS命名法標(biāo)注該位點 在參考cDNA上的位置來表示的，是為簡便指代某個特定SNP位點，一個SNP位點還可以有 其它表示方式，如以下會出現(xiàn)的的以"rs"開頭的SNP位點表示方式，rsl801394與MTRR基 因 c. 66A>G(A66G)表示同一個位點，該方式是GenBank SNP數(shù)據(jù)庫的命名方法，以rs加7 位阿拉伯?dāng)?shù)字來表示一個SNP，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，采用其它命名方式比如以該SNP 在參考gDNA上的位置來標(biāo)注指代與本發(fā)明一樣的SNP或SNP組合也屬于本發(fā)明范圍。根 據(jù)數(shù)據(jù)庫如SNP數(shù)據(jù)庫中確定并獲得特定SNP位點在基因序列上的位置信息的同時，也能 獲得其前后序列、分布頻率等。本發(fā)明利用上述3個SNP位點中的至少兩個，確定各SNP位 點的前后序列，依據(jù)其前后序列設(shè)計第一引物和第二引物，利用第一引物擴增待檢核酸，能 夠?qū)⒋龣z核酸中的包含相應(yīng)SNP位點的DNA片段擴增出來，接著基于擴增出來的包含上述 位點的DNA片段，利用第二引物利用單堿基延伸方法檢測那些位點的堿基類型，獲得那些 位點的基因型。該方法是一種高通量、低成本、高準(zhǔn)確度、檢測周期短的葉酸代謝相關(guān)基因 分型方法，能夠用以輔助指導(dǎo)受檢者補充葉酸。當(dāng)受檢者為孕婦時，在正確的時間補充合適 劑量的葉酸，能夠避免孕婦發(fā)病風(fēng)險和嬰兒出生缺陷。
[0005] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述第一引物包括多條第一序列，用于分別擴增包含 不同目標(biāo)SNP位點的DNA片段，所述第一序列的5'端包含相同的標(biāo)簽，利于擴增產(chǎn)物的識 另IJ，在本發(fā)明的一個實施例中，所帶的標(biāo)簽都為acgttggatg(SEQ ID N0:10)。在本發(fā)明的 一個實施例中，擴增產(chǎn)物為約l〇〇bp的DNA片段。
[0006] 在本發(fā)明的一個實施例中，在延伸反應(yīng)之前，還包括利用堿性磷酸酶（AP)，例如利 用重組蝦堿性磷酸酶（rSAP)去除擴增反應(yīng)體系中的的dNTP，防止dNTP參與下一步的單堿 基延伸PCR反應(yīng)。
[0007] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述第二引物包括多條第二序列，用于分別對包含不 同目標(biāo)SNP位點的擴增片段進行單堿基延伸，任兩條所述第二序列的分子量差異不小于 30Da，以使能夠一起使用同時檢測出各自延伸的堿基。在本發(fā)明的一個實施例中，所述第二 序列的長度為17~28nt，有利于多條第二序列在同一反應(yīng)體系各自進行單堿基延伸，使獲 得的延伸產(chǎn)物的3'端堿基為相應(yīng)SNP位點，以使能夠準(zhǔn)確檢測出位點的堿基類型。
[0008] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述第二序列的5'端包含不多于5個不能結(jié)合上所述 擴增產(chǎn)物的核苷酸。這里，所說的5'端包括從一條序列的5'末端的首個堿基到該序列的 中心堿基的部分，剩下部分可相應(yīng)的稱為3'端。所說的不能結(jié)合上指不能互補配對。
[0009] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述延伸產(chǎn)物包括多條延伸序列，任兩條所述延伸序 列的分子量差異不小于30Da，利于檢測出各延伸序列上所帶的延伸得的單堿基的類型。 [0010] 較佳的，本發(fā)明中的第一引物的多條第一序列之間或者第二引物的多條第二序列 之間無明顯的二聚物（dimer)、錯配（mismatch)或發(fā)卡結(jié)構(gòu)（hairpin)。在本發(fā)明的一個 實施例中，提供一組包含至少4條能夠能夠在同一反應(yīng)體系中一起使用的具體序列，例如， 當(dāng)所述SNP位點包含MTRR基因 c. 66A>G，所述第一引物包含SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2， 所述第二引物包含SEQ ID N0:3;當(dāng)所述SNP位點包含MTHFR基因 c. 677C>T，所述第一引 物包含SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5,所述第二引物包含SEQ ID N0:6;當(dāng)所述SNP位點包 含MTHFR基因 c. 1298A>C，所述第一引物包含SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8,所述第二引物 包含SEQ ID NO :9。上述各第一引物或第二引物包含的序列分別能夠擴增或延伸包含各自 所包含的SNP位點的DNA片段，而且上述任兩組或者全部三組第一引物都能夠在同一反應(yīng) 體系中擴增各自的目標(biāo)DNA片段，上述任兩個或者全部三個第二引物都能夠在同一反應(yīng)體 系中單堿基延伸各自的目標(biāo)擴增產(chǎn)物。SEQ ID N0 :1~9及其與位點的對應(yīng)關(guān)系如表1所 不。
[0011]表 1
[0013] 在本發(fā)明的一個實施例中，利用質(zhì)譜確定所述SNP位點的堿基類型，例如，通過 MALDI-T0F質(zhì)譜檢測純化后延伸產(chǎn)物的分子量。較佳的，在單堿基延伸之后，對所述延伸 產(chǎn)物進行純化，例如利用陽離子交換樹脂純化以減少陽離子對質(zhì)譜檢測準(zhǔn)確度的影響。延 伸產(chǎn)物分子量的檢測過程包括：通過點樣設(shè)備將純化后的延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到芯片的基質(zhì)上， 延伸產(chǎn)物分子和基質(zhì)形成共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)在激光激發(fā)下電離，產(chǎn)物分子帶上等量電荷，通 過高壓電場通道到達信號接收器。產(chǎn)物分子通過高壓電場通道的時間和產(chǎn)物分子量成正 比。通過比較延伸產(chǎn)物和延伸引物分子量的差值，根據(jù)A\T\C\G堿基之間道爾頓分子量的 差異，進行目標(biāo)位點的基因分型。表2顯示一組延伸引物及對應(yīng)的延伸產(chǎn)物的信息。
[0014] 表 2
[0017] 在本發(fā)明的一個實施例中，該方法還包括：當(dāng)SNP位點的基因型包含（i)，判定受 檢者葉酸代謝高度障礙，當(dāng)SNP位點的基因型包含（ii)，判定受檢者葉酸代謝中度障礙， 當(dāng)SNP位點的基因型包含（iii)，判定受檢者葉酸代謝能力低度障礙，當(dāng)SNP位點的基因型 不包含任一（丨)-(^丨），判定受檢者葉酸代謝正常；所稱（丨)1了1^基因(3.664>6的基因型 為GG，或者MTHFR基因 c. 677C>T的基因型為TT，或者MTHFR基因 c. 1298A>C的基因型為 CC，（ii)MTRR基因 c. 66A>G的基因型為AG，（iii)MTHFR基因 c. 677C>T的基因型為CT，并 且MTHFR基因 c. 1298A>C的基因型為AC。依此，可以輔助進一步對受檢者給出判斷建議。 表3顯示3個位點的基因型對葉酸代謝能力的影響程度以及可劃分出的風(fēng)險等級。進一步 的，由于一般認(rèn)為葉酸代謝能力是由2個基因共同決定的，受檢者的葉酸代謝能力可以根 據(jù)2個基因的風(fēng)險等級進行綜合評估，在本發(fā)明的一個實施例中，在受檢者是準(zhǔn)備懷孕或 是懷孕中的人時，表4示意根據(jù)一個具體評估方法劃分的風(fēng)險等級后可采用的葉酸補充量 建議。
[0022] 利用本發(fā)明這一方面的方法檢測葉酸代謝能力基因，具有以下效果：1)低成本， 能夠?qū)崿F(xiàn)將多個SNP位點在同一個反應(yīng)體系中進行檢測，檢測成本大大降低；2)高通量，本 方法在微量反應(yīng)體系中進行，檢測通量高，檢測過程自動化程度高，每日通量可達2000例； 3)實驗操作簡單，檢測結(jié)果自動判讀、準(zhǔn)確性高；4)與測序相比，具有低成本、高通量、快 速、操作簡單等優(yōu)勢；5)檢測結(jié)果全面，能夠?qū)θ~酸代謝主要通路中的2個主要相關(guān)基因的 多個位點進行檢測、綜合評估。
[0023] 依據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括引物對，所述引物對包含 第一引物和第二引物，所述引物對能夠用以確定以下3個SNP位點中的至少2個的堿基類 型：MTRR基因 c. 66A>G、MTHFR基因 c. 677C>T和MTHFR基因 c. 1298A>C。在本發(fā)明的一個實 施例中，該試劑盒包含的引物對能夠用以確定全部3個SNP位點的堿基類型。上述對本發(fā) 明一方面的或者任一【具體實施方式】中的方法的技術(shù)特征和優(yōu)點的描述，同樣適用本發(fā)明這 一方面的試劑盒，在此不再贅述。
[0024] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述第一引物包括多條第一序列，用于分別擴增包含 不同目標(biāo)SNP位點的DNA片段，所有第一序列的5'端都包含相同的標(biāo)簽，利于識別擴增產(chǎn) 物，在本發(fā)明的一個實施例中，所帶的標(biāo)簽為acgttggatg。
[0025] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述第二引物包括多條第二序列，用于分別對包含不 同目標(biāo)SNP位點的擴增片段進行單堿基延伸，任兩條所述第二序列的分子量差異不小于 30Da，以使能夠一起使用同時檢測出各自延伸的堿基。在本發(fā)明的一個實施例中，所述第二 序列的長度為17~28nt，有利于多條第二序列在同一反應(yīng)體系各自進行單堿基延伸，使獲 得的延伸產(chǎn)物的3'端堿基為相應(yīng)SNP位點，以使該試劑盒能夠準(zhǔn)確檢測出位點的堿基類 型。
[0026] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述第二序列的5'端包含不多于5個不能結(jié)合上所述 擴增產(chǎn)物的核苷酸。這里，所說的5'端包括從一條序列的5'末端的首個堿基到該序列的 中心堿基的部分，剩下部分可相應(yīng)的稱為3'端。所說的不能結(jié)合上指不能互補配對。
[0027] 在本發(fā)明的一個實施例中，所述延伸產(chǎn)物包括多條延伸序列，任兩條所述延伸序 列的分子量差異不小于30Da，利于該試劑盒檢測出各延伸序列上所帶的延伸單堿基的類 型。
[0028] 在本發(fā)明的一個實施例中，提供一組包含至少4條能夠能夠在同一反應(yīng)體系中 一起使用的具體序列，例如，當(dāng)所述SNP位點包含MTRR基因 c. 66A>G，第一引物包含SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2,第二引物包含SEQ ID N0:3;當(dāng)所述SNP位點包含MTHFR基因 c. 677C>T，第一引物包含 SEQ ID N0:4 和 SEQ ID N0:5,第二引物包含 SEQ ID N0:6;當(dāng)所 述SNP位點包含MTHFR基因 c. 1298A>C，第一引物包含SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8,第二 引物包含SEQ ID NO :9。上述各第一引物或第二引物包含的序列能夠用以擴增或延伸包含 各SNP位點的DNA片段，而且上述任兩組或者全部三組第一引物都能夠在同一反應(yīng)體系中 擴增各自的目標(biāo)DNA片段，上述任兩個或者全部三個第二引物都能夠在同一反應(yīng)體系中單 堿基延伸各自的目標(biāo)擴增產(chǎn)物。
【附圖說明】
[0029] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施方式的描述中將 變得明顯和容易理解，其中：
[0030] 圖1是本發(fā)明的一個實施例中的對待測樣本中的MTRR, c. 66A>G位點的檢測結(jié)果， 其中，圖1A是位點的檢測結(jié)果為AA基因型的示意圖，圖1B是位點的檢測結(jié)果為AG基因型 的不意圖；
[0031] 圖2是本發(fā)明的一個實施例中的對待測樣本中的MTHFR, c. 677C>T位點的檢測結(jié) 果，其中，圖2A是位點的檢測結(jié)果為CC基因型的示意圖，圖2B是位點的檢測結(jié)果為CT基 因型的示意圖，圖2C是位點的檢測結(jié)果為TT基因型的示意圖；
[0032] 圖3是本發(fā)明的一個實施例中的對待測樣本中的MTHFR, c. 1298A>C位點的檢測結(jié) 果，其中，圖3A是位點的檢測結(jié)果為AA基因型的示意圖，圖3B是位點的檢測結(jié)果為AC基 因型的示意圖。
【具體實施方式】
[0033] 以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明檢測方法和/或試劑盒進行詳細(xì)的描述。下面示 例，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明， "多個"的含義是兩個或兩個以上。
[0034] 除另有交待，以下實施例中涉及的未特別交待的試劑、序列（接頭、標(biāo)簽和引物）、 軟件及儀器，都是常規(guī)市售產(chǎn)品或者開源的，比如購自Sequenom公司的飛行時間質(zhì)譜試劑 盒來進行質(zhì)譜檢測等。
[0035] 實施例一
[0036] 收集選擇MTRR基因的66A>G位點以及MTHFR基因的6770T位點和1298A>C位點 共3個與葉酸代謝能力相關(guān)的位點。以下第一引物也稱為擴增引物，第二引物也稱為延伸 引物，未強調(diào)第一或第二引物的引物可以為包含第一引物和/或第二引物。
[0037] 針對所述7個位點進行擴增引物和延伸引物設(shè)計和優(yōu)化，可在確定目標(biāo)位點的 上下游序列后進行引物設(shè)計，使擴增引物或者延伸引物之間無嚴(yán)重的dimer、mismatch和 hairpin，使擴增引物長度在30個堿基左右，擴增引物在5'端具有10個堿基acgttggatg 的標(biāo)簽序列，延伸引物的長度在17-28個堿基左右，允許延伸引物5'端1-5個堿基與模板 (擴增產(chǎn)物）不完全匹配，延伸引物的3'末端堿基與目的檢測位點緊相鄰的堿基匹配。7 個位點的所有延伸引物和/或所延伸產(chǎn)物的分子量差異不小于30道爾頓。
[0038] 所述每個基因位點各自對應(yīng)1條F向擴增引物、1條R向擴增和1條延伸引物。所 述3個位點、引物、產(chǎn)物之間的對應(yīng)關(guān)系詳見表1和表2。
[0039] 實施例二
[0040] 1)DNA 提取
[0041] 收集了 18份人全血樣本，使用chelex-100(樹脂法）提取DNA。
[0042] 2) PCR 擴增
[0043] 通過本步PCR擴增，獲得包含目的位點的DNA片段。PCR擴增反應(yīng)體系參見表 5。其中，所有試劑購買自美國Sequenom公司，PCR儀為GeneAmp?: PCR System 9700Dual 384-Well Sample Block Module。
[0044] 表 5
[0045]
[0046] PCR反應(yīng)條件為94°C，2分鐘；94°C變性20秒，56退火30秒，72延伸1分鐘，共擴 增45個循環(huán)；最后72 °C延伸5分鐘。
[0047] 在PCR時，使用的陽性對照為已知序列的正常的人類基因組DNA，陰性對照為無菌 雙蒸水。
[0048] 3) SAP 處理
[0049] 上步擴增產(chǎn)物使用SAP酶（蝦堿性磷酸酶）處理，去除產(chǎn)物中的dNTP，防止殘余 的dNTP參與下一步的單堿基延伸PCR反應(yīng)。SAP酶反應(yīng)體系見表6。所有試劑購買自美 國 Sequenom 公司，PCR 儀為 GeneAmpK:PCR System 9700Dual 394-Well Sample Block Module。
[0050] 表 6
[0051]

[0052] SAP酶反應(yīng)條件為37°C溫育40分鐘，以去除PCR擴增反應(yīng)中剩余的dNTP ;85°C溫 育5分鐘，使SAP酶失活。
[0053] 4)單堿基延伸PCR反應(yīng)
[0054] 在蝦堿性磷酸酶處理后的擴增產(chǎn)物中加入延伸引物、ddNTP以及PCR其他反應(yīng)成 分，進行單堿基延伸PCR反應(yīng)。PCR擴增反應(yīng)體系參見表7。所有試劑購買自美國Sequenom 公司，PCR 儀為GcncAmp? PCR System 9700Dual 394-Well Sample Block Module。
[0055] 表 7
[0056]
[0057] 延伸反應(yīng)條件為94°C，30秒；94°C變性5秒，52 °C退火5秒，80 °C延伸5秒，共擴增 40個循環(huán)，且在每個循環(huán)中退火和延伸進行5個小循環(huán)；最終72°C延伸3分鐘。
[0058] 5)樹脂純化
[0059] 在延伸產(chǎn)物中加入6mg樹脂，18. 00 μ 1水，垂直搖勻40min。經(jīng)過本步純化后，反 應(yīng)體系中的陽離子與樹脂充分結(jié)合，離心后樹脂沉降在反應(yīng)孔底部，從而實現(xiàn)產(chǎn)物脫鹽。上 清可用于質(zhì)譜檢測。樹脂型號08040,購買自美國Sequenom公司。
[0060] 6)質(zhì)譜檢測
[0061] 通過點樣儀（型號 MassARRAY Nanodispenser RS 1000,購買自美國 Sequenom 公 司），將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到芯片基質(zhì)上，基質(zhì)和產(chǎn)物形成共結(jié)晶薄膜，芯片轉(zhuǎn)移 至 Sequenom MALDI-T0F 質(zhì)譜儀（型號 MassARRAYAnalyzer Compact，購買自美國 Sequenom 公司）上進行檢測，確定檢測位點基因型。
[0062] 7)質(zhì)譜檢測結(jié)果
[0063] 質(zhì)譜檢測結(jié)果如圖1-3所示。以下所稱的"結(jié)果與實際一致"是指質(zhì)譜檢測結(jié)果 與sanger驗證結(jié)果一致。
[0064] 圖1顯示了使用MTRR，c. 66A > G位點的延伸引物對待測樣本MTRR，c. 66A > G位 點的檢測結(jié)果。從圖1A可知，MALDI-T0F質(zhì)譜檢測在分子量5426. 4檢測到峰，所述峰經(jīng)分析 確認(rèn)為A，結(jié)果與實際一致。從圖1B可知，MALDI-T0F質(zhì)譜檢測在分子量5346. 5和5426. 4 檢測到峰，所述峰經(jīng)分析確認(rèn)為雜合AG，結(jié)果與實際一致。
[0065] 圖2顯示了使用MTHFR，c. 677C > T位點的延伸引物對待測樣本MTHFR，c. 677C > T位點的檢測結(jié)果。從圖2A可知，MALDI-T0F質(zhì)譜檢測在分子量5891. 9檢測到峰，所述峰 經(jīng)分析確認(rèn)為C，結(jié)果與實際一致。從圖2B可知，MALDI-T0F質(zhì)譜檢測在分子量5891. 9和 5971. 8檢測到峰，所述峰經(jīng)分析確認(rèn)為雜合CT，結(jié)果與實際一致。從圖2C可知，MALDI-T0F 質(zhì)譜檢測在分子量5971. 8檢測到峰，所述峰經(jīng)分析確認(rèn)為T，結(jié)果與實際一致。
[0066] 圖3顯示了使用MTHFR, c. 1298A>C位點的延伸引物對待測樣本MTHFR, c. 1298A>C 位點的檢測結(jié)果。從圖3A可知，MALDI-T0F質(zhì)譜檢測在分子量6091. 9檢測到峰，所述峰經(jīng)分 析確認(rèn)為A，結(jié)果與實際一致。從圖3B可知，MALDI-T0F質(zhì)譜檢測在分子量6052和6091. 9 檢測到峰，所述峰經(jīng)分析確認(rèn)為雜合AC，結(jié)果與實際一致。
[0067] 8)所測樣本來源個體的葉酸代謝能力綜合評估結(jié)果見表8。
[0068] 9)以上所有檢測結(jié)果都經(jīng)sanger驗證，結(jié)果和質(zhì)譜檢測結(jié)果完全一致。
[0069] 表 8
[0070]

【主權(quán)項】
1. 一種檢測葉酸代謝能力基因的方法，其特征在于，包括， 獲取受檢者核酸，所述核酸包含DNA片段，所述DNA片段來自斷裂的基因組DNA和/或 游離DNA ; 檢測以下葉酸代謝能力基因的SNP位點中的至少兩個的基因型， MTRR 基因 c. 66A>G、MTHFR 基因 c. 6770T 和 MTHFR 基因 c. 1298A>C， 其中包括， 利用第一引物擴增包含所述SNP位點的DNA片段，獲得擴增產(chǎn)物， 將第二引物與所述擴增產(chǎn)物結(jié)合，延伸一個堿基，獲得延伸產(chǎn)物， 依據(jù)所述延伸產(chǎn)物與所述第二引物的分子量差異，確定所述SNP位點的堿基類型。2. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述第一引物包括多條第一序列，所述第一序列的 5'端包含相同的標(biāo)簽； 任選的，所述標(biāo)簽為acgttggatg。3. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述第二引物包括多條第二序列，任兩條所述第二 序列的分子量差異不小于30Da。4. 權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述第二序列的長度為17~28nt。5. 權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述第二序列的5'端包含不多于5個不能結(jié)合上 所述擴增產(chǎn)物的核苷酸。6. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述延伸產(chǎn)物的3'端堿基為所述SNP位點。7. 權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述延伸產(chǎn)物包括多條延伸序列，任兩條所述延伸 序列的分子量差異不小于30Da。8. 權(quán)利要求1-7任一方法，其特征在于，當(dāng)所述SNP位點包含MTRR基因 c. 66A>G，所述 第一引物包含SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2,所述第二引物包含SEQ ID NO :3 ; 當(dāng)所述SNP位點包含MTHFR基因 c. 677C>T，所述第一引物包含SEQ ID N0:4和SEQ ID NO :5,所述第二引物包含SEQ ID NO :6 ; 當(dāng)所述SNP位點包含MTHFR基因 c. 1298A>C，所述第一引物包含SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8,所述第二引物包含SEQ ID NO :9。9. 權(quán)利要求1-8任一方法，其特征在于，利用質(zhì)譜確定所述SNP位點的堿基類型。10. 權(quán)利要求1-9任一方法，其特征在于，還包括， 當(dāng)所述SNP位點的基因型包含（i)，判定所述受檢者為葉酸代謝能力高度障礙， 當(dāng)所述SNP位點的基因型包含（ii)，判定所述受檢者為葉酸代謝能力中度障礙， 當(dāng)所述SNP位點的基因型包含（iii)，判定所述受檢者為葉酸代謝能力低度障礙， 當(dāng)所述SNP位點的基因型不包含任一（i)-(iii)中的任一基因型，判定所述受檢者為 葉酸代謝能力正常， (i) MTRR基因 c. 66A>G的基因型為GG，或者MTHFR基因 c. 677C>T的基因型為TT，或者 MTHFR基因 c. 1298A>C的基因型為CC， (ii) MTRR基因 c. 66A>G的基因型為AG， (iii) MTHFR基因 c. 677C>T的基因型為CT，并且MTHFR基因 c. 1298A>C的基因型為AC。11. 一種試劑盒，其包括引物對，所述引物對包含第一引物和第二引物，所述引物對能 夠用以確定以下3個SNP位點中的至少2個的堿基類型：MTRR基因 c. 66A>G、MTHFR基因 c. 677C>T 和 MTHFR 基因 c. 1298A>C ; 任選的，所述引物對能夠用以確定所述3個SNP位點的堿基類型； 任選的，所述第一引物包括多條第一序列，所有所述第一序列的5'端都包含相同的標(biāo) 簽； 任選的，所述標(biāo)簽為acgttggatg ; 任選的，所述第二引物包括多條第二序列，任兩條所述第二序列的分子量差異不小于 30Da ; 任選的，所述第二序列的長度為17~28nt ; 任選的，所述第二序列的5'端包含不多于5個不能結(jié)合上所述擴增產(chǎn)物的核苷酸； 任選的，所述延伸產(chǎn)物的3'端堿基為所述SNP位點； 任選的，所述延伸產(chǎn)物包括多條延伸序列，任兩條所述延伸序列的分子量差異不小于 30Da ; 任選的，當(dāng)所述SNP位點包含MTRR基因 c. 66A>G，所述第一引物包含SEQ ID N0:1和 SEQ ID N0:2,所述第二引物包含SEQ ID N0:3， 當(dāng)所述SNP位點包含MTHFR基因 c.677C>T，所述第一引物包含SEQIDN0:4和SEQID NO :5,所述第二引物包含SEQ ID NO :6 ; 當(dāng)所述SNP位點包含MTHFR基因 c. 1298A>C，所述第一引物包含SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :8,所述第二引物包含SEQ ID NO :9。
【文檔編號】C12Q1/68GK105986010SQ201510047570
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年1月30日
【發(fā)明人】王曉楠, 張俊青, 李智麗, 楊玲
【申請人】天津華大基因科技有限公司, 深圳華大基因科技有限公司