H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，它確立了H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法，含有三個(gè)技術(shù)要點(diǎn)：確立了核酸檢測(cè)所需要的引物序列；確立了檢測(cè)反應(yīng)種類；確立了檢測(cè)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。該核酸檢測(cè)方法可以用于H5亞型禽流感病毒的科學(xué)研究，也可以用于動(dòng)物或人的臨床診斷檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】
H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域;具體說(shuō)來(lái)，本發(fā)明確立了H5亞型高致病性禽流感病毒的快速檢測(cè)方法，用于H5亞型禽流感病毒的快速檢測(cè)，在體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全等領(lǐng)域有較大的使用價(jià)值。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]禽流感根據(jù)致病性的不同，可以分為高致病性禽流感、低致病性禽流感和無(wú)致病性禽流感。其中，高致病性禽流感是由H5和H7亞型的某些毒株引起的疾病。
[0004]病毒核酸檢測(cè)是病毒檢測(cè)重要方法之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)H5亞型高致病性禽流感病毒的各種核酸檢測(cè)方法，包括農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，耗費(fèi)時(shí)間都比較長(zhǎng)，如農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法，NY/T 772-2013)至少需要2 h，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(H5亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法，GB/T 19438.2-2004)至少需要1.2 h，目前沒(méi)有比這些方法效率更高的檢測(cè)方法。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有H5亞型高致病性禽流感病毒檢測(cè)技術(shù)的不足，開(kāi)展了深入研究和測(cè)試，建立了基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法，僅需20 min即可完成檢測(cè)。該方法包括以下三個(gè)方面內(nèi)容:
(一)確立了核酸檢測(cè)所需要的引物序列，針對(duì)H5亞型禽流感病毒HA基因中保守區(qū)域，設(shè)計(jì)引物序列，其中上游引物序列含有3 O個(gè)堿基，序列為agggaggatggcaaggaatggtagatggtt(即序列表中SEQ ID N0.1)，下游上游引物序列含有30個(gè)堿基，序列為gctgtagtcggactttgtcataaaggttct(即序列表中SEQ ID N0.2)；
(二)確立了基于重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的快速檢測(cè)方法；
(三)確立了檢測(cè)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中依次加入純水9.2 μ?、反應(yīng)緩沖液29.5 41(含有(^了？、(《^\(1111\(10^等四種核苷酸)、第一步所合成的上游引物
2.4μ?(濃度為10 μπιοΙ/L)、第一步所合成的下游引物2.4 μ?(濃度為10 μπιοΙ/L)、酶混合物[逆轉(zhuǎn)錄酶、能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶]1.0 口1、1?嫩酶抑制劑1.0 μ?、需要檢測(cè)的流感病毒核酸2.0 μ1(從臨床樣品或其他樣品中用核酸提取試劑盒提取的)、醋酸鎂(280 mmol/L)2.5 μ?;然后將反應(yīng)體系密閉，置于恒溫儀(或水浴鍋)上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40°C 20 min;反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)產(chǎn)物中加入含有顏色的核酸電泳緩沖液，進(jìn)行瓊脂糖核酸凝膠電泳，如果出現(xiàn)大小約為345 bp
的核酸電泳條帶，則判斷為陽(yáng)性，否則判斷為陰性。
[0007]
【具體實(shí)施方式】
[0008]下面通過(guò)實(shí)施例，說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于這個(gè)實(shí)施例。
[0009]本實(shí)施例用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)H5亞型高致病性禽流感病毒進(jìn)行核酸快速檢測(cè)，包括如下步驟:
第一步(合成引物):按照本發(fā)明指定的核酸序列(即序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2)，人工合成重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)所需要的上游引物和下游引物；
第二步(配置反應(yīng)體系):在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)管中依次加入純水9.2 μ?、反應(yīng)緩沖液29.5 41(含有(^了？、(16了？、(11'了？、(1013等四種核苷酸)、第一步所合成的上游引物2.4 μ?(濃度為10 ymol/L)、第一步所合成的下游引物2.4 μ1(濃度為10 ymol/L)、酶混合物[逆轉(zhuǎn)錄酶、能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶]1.0 41、1?^酶抑制劑1.0 μ?、需要檢測(cè)的流感病毒核酸2.0 μ?(從臨床樣品或其他樣品中用核酸提取試劑盒提取的)、醋酸鎂(280 mmol/L)2.5 μ?;
第三步(反應(yīng)):將第二步配置好的反應(yīng)體系密閉后，置于恒溫儀(或水浴鍋)上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為40°C 20 min；
第四步(結(jié)果檢測(cè)):在第三步的反應(yīng)產(chǎn)物中加入含有顏色的核酸電泳緩沖液，進(jìn)行瓊脂糖核酸凝膠電泳，如果出現(xiàn)大小約為345 bp的核酸電泳條帶，則判斷為陽(yáng)性，否則判斷為陰性。
[0010]實(shí)際應(yīng)用結(jié)果:對(duì)96份H5亞型高致病性禽流感病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，以及300份標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品，用上述H5亞型高致病性禽流感病毒快速核酸檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該技術(shù)的靈敏度為100.0%，特異性為100.0%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法，采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)，其特征是可以檢出所有H5亞型禽流感病毒。2.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法，其特征有兩個(gè):一是可以檢出所有H5亞型禽流感病毒;二是采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)。3.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法，其特征有三個(gè):一是可以檢出所有H5亞型禽流感病毒；二是采用針對(duì)H5亞型禽流感病毒HA基因保守的區(qū)域而設(shè)計(jì)的一對(duì)引物;三是采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)。4.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法，可采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)，其特征有兩個(gè):一是可以檢出所有H5亞型禽流感病毒;二是檢測(cè)反應(yīng)采用的一條引物的序列^agggaggatggcaaggaatggtagatggtt,或與 gctgtagtcggactttgtcataaaggttct 序列有 10 個(gè)或10個(gè)以上的堿基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均為5撇端至3撇端，a、t、g、c表示相應(yīng)的堿基)。5.H5亞型高致病性禽流感病毒核酸快速檢測(cè)方法，其特征有兩個(gè):一是采用重組酶聚合酶擴(kuò)增反應(yīng)；二是檢測(cè)反應(yīng)采用的兩條引物，其序列分別為agggaggatggcaaggaatggtagatggtt和gctgtagtcggactttgtcataaaggttct,或與這兩個(gè)序列有10個(gè)或10個(gè)以上的堿基序列相同的序列(本段文字中，引物序列均為5撇端至3撇端，a、1:^、(3表示相應(yīng)的堿基)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK105986043SQ201610063695
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2016年1月29日
【發(fā)明人】蔣文明, 陳繼明
【申請(qǐng)人】中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心