白蛋白的變體及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的親和力有所提高的白蛋白的變體以及其用途，且具體地說，涉及此類白蛋白的變體作為免疫原載劑的用途。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含白蛋白/免疫原融合蛋白的疫苗(例如用于粘膜遞送的疫苗)。
【專利說明】白蛋白的變體及其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的親和力有所提高的白蛋白的變體以及其用 途，且具體地說，涉及此類白蛋白的變體作為免疫原載劑的用途。在一些實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及包含白蛋白/免疫原融合蛋白的疫苗(例如用于粘膜遞送的疫苗）。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 白蛋白是一種在哺乳動(dòng)物的血漿中天然發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，在血漿中它是最豐富的蛋 白質(zhì)。其在維持血液的所需滲透壓以及血流中各種物質(zhì)的輸送中起著重要的作用。已經(jīng)從 包括人類、豬、小鼠、大鼠、兔以及山羊在內(nèi)的許多物種表征白蛋白，且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)來自不同的 來源的白蛋白共享高度的結(jié)構(gòu)關(guān)系。
[0004] 白蛋白體內(nèi)結(jié)合于新生兒Fc受體(FcRn)，且已知此相互作用對(duì)于白蛋白的血漿半 衰期來說是重要的（Chaudhury等人2003;Montoyo等人，2009) jcRn是一種膜結(jié)合蛋白，且 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其使白蛋白以及IgG免于細(xì)胞內(nèi)降解（Roopenian D.C.和Akilesh，S. (2007)， Nat.Rev. Immunol 7，715-725)。因此，F(xiàn)cRn是一種有助于維持例如人類等哺乳動(dòng)物的血清 中高水平的IgG和白蛋白的雙功能分子。
[0005] 雖然已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中表征了FcRn-IgG相互作用，但未充分表征FcRn-白蛋白。數(shù) 據(jù)表明I gG和白蛋白非協(xié)同地結(jié)合于FcRn上不同的位點(diǎn)（An de r s eη等人（2 0 0 6 )， Eur. J. Immunol 36,3044_3051 ;Chaudhury等人（2006)，Biochemistry 45,4983_4990)。眾 所周知，小鼠 FcRn結(jié)合來自小鼠和人類的IgG，而人類FcRn似乎更加區(qū)別對(duì)待（Ober等人 (2001)Int Immunol 13,1551-1559)且不結(jié)合小鼠 IfG(0ber等人（2001)Int Immunol 13， 1551-1559)。此外，人類FcRn結(jié)合來自小鼠與人類的白蛋白，而小鼠 FcRn不結(jié)合人類白蛋白 (Andersen等人（2010)JBC)。
[0006] 人類血清白蛋白（HSA)已被充分表征為585個(gè)氨基酸的多肽，其序列可見于 Peters，T·，Jr·(1996)A11 about Albumin：Biochemistry,Genetics and Medical， Applications，Academic Press，Inc.，Orlando中。其特征性結(jié)合于其受體FcRn，其中其在 pH 6.0下結(jié)合，而在pH 7.4下不結(jié)合。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HSA的血清半衰期是大致19天。已經(jīng)鑒別具 有較短的血漿半衰期的天然變體(Biochim Biophys Acta. 1991，1097:49-54)，其具有取代 D494N。此取代在此變體中產(chǎn)生N-糖基化位點(diǎn)，此N-糖基化位點(diǎn)在野生型HSA中不存在。不知 道糖基化或氨基酸變化是否引起血漿半衰期的變化。
[0007] 白蛋白具有長(zhǎng)血清半衰期，且因?yàn)榇颂匦?，其已?jīng)用于藥物遞送。白蛋白已經(jīng)偶聯(lián) 于藥學(xué)上有益的化合物(W00069902A)，并發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物維持白蛋白的長(zhǎng)血漿半衰期，因此，一 般發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)物所得到的血漿半衰期比單獨(dú)有益的治療化合物的血漿半衰期顯著更長(zhǎng)。
[0008] 此外，白蛋白已經(jīng)與治療有益肽融合(W0 01/79271A和W003/59934A)，典型的結(jié)果 是融合物具有治療有益的肽的活性和長(zhǎng)血漿半衰期，比單獨(dú)治療有益的肽的血漿半衰期顯 著更長(zhǎng)。
[0009] 白蛋白能夠結(jié)合大量配體，且此特性已經(jīng)用于延長(zhǎng)能夠結(jié)合于白蛋白的藥物的血 漿半衰期。此已經(jīng)通過藥學(xué)上有益的化合物結(jié)合于具有白蛋白結(jié)合特性的部分來實(shí)現(xiàn)。不 清楚什么決定了所形成的偶聯(lián)物或融合多肽的血漿半衰期，但似乎由構(gòu)成其的白蛋白和所 選的藥學(xué)上有益的化合物/肽給予。需要能夠控制既定白蛋白偶聯(lián)物或白蛋白融合多肽的 血漿半衰期，使得血漿半衰期可以比偶聯(lián)物/融合物的組分所給予的血漿半衰期長(zhǎng)或短，從 而能夠根據(jù)意圖治療的適應(yīng)癥的具體情況設(shè)計(jì)一種特定的藥物或疫苗。 發(fā)明概要
[0010] 本發(fā)明涉及對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的親和力有所提高的白蛋白的變體以及其用 途，且具體地說，涉及此類白蛋白的變體作為免疫原載劑和作為治療劑的用途。在一些實(shí)施 方案中，本發(fā)明涉及包含白蛋白/免疫原融合蛋白的疫苗(例如用于粘膜遞送的疫苗）。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種變體人類血清白蛋白（HSA)或小鼠血清白蛋 白（MSA)，其以相對(duì)于野生型HSA或MSA增加的親和力結(jié)合于FcRn，其中多肽包含至少一個(gè)變 體氨基酸。在一些實(shí)施方案中，多肽以10或更小、5或更小或1或更?。ɡ缭谒嵝詶l件下測(cè) 量)的Kd結(jié)合于FcRn。在一些實(shí)施方案中，多肽以比野生型白蛋白高的水平跨越極化人類細(xì) 胞輸送(例如如在極化人類細(xì)胞分析中4小時(shí)后以ng/ml測(cè)量）。在一些實(shí)施方案中，高水平 為比野生型白蛋白高至少2、3、4、5或10倍。在一些實(shí)施方案中，功效超過10ng/ml(例如超過 15ng/ml，或超過30ng/ml)。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，變體多肽與SEQ ID N0:1或野生型MSA至少80%、90%或95% 一致。在一些實(shí)施方案中，變體氨基酸為例如SEQ ID N0:1的K573Y、I523G、I253A、T527M、 E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、K573Y/T527M、 K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、V547A、V547A/ K573P、V547A/E505Q/K573P/T527M 或 K500A/H510Q 中的一個(gè)或多個(gè)、HSA 的結(jié)構(gòu)域 III 的缺失 或野生型MSA的K500A/H510Q。
[0013]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含突變(例如對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1或MSA的 變體的位置573、523、527、505或結(jié)構(gòu)域111中一個(gè)或多個(gè)的位置的取代突變)的白蛋白的變 體、其片段或其融合物，其中與野生型白蛋白比較，白蛋白與hFcRn或mFcRn的結(jié)合增加或減 少。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供白蛋白的變體與偶聯(lián)于白蛋白的氨基酸的免疫原(例如 抗原）的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，與野生型白蛋白相比改變的與FcRn的結(jié)合為結(jié)合親 和力增加。在一些實(shí)施方案中，白蛋白的變體為SEQ ID N0:1的K573Y、I523G、I253A、T527M、 E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、K573Y/T527M、 K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、K500A/H510Q、 V547A、V547A/K573P、V547A/E505Q/K573P/T527M或結(jié)構(gòu)域III缺失。在一些實(shí)施方案中，白 蛋白的變體為MSA的K500A/H510Q。在一些實(shí)施方案中，免疫原共價(jià)附接于包含硫醇基的氨 基酸。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種編碼白蛋白的變體、其片段或其融合物(如上 所述的免疫原融合蛋白）的核酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含核酸的宿主細(xì)胞。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種組合物（例如疫苗組合物），其包含上述白蛋 白的變體或融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載劑。在一些實(shí)施方案中，組合物調(diào)配成用于粘膜 施用的疫苗。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種在受試者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)(例如粘膜免疫反 應(yīng))的方法，其包括向受試者施用包含白蛋白的變體、其片段或其融合物和如上所述的免疫 原的融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含白蛋白的變體、其片段、其融合物或其 偶聯(lián)物和如上所述的免疫原的融合蛋白治療受試者的用途。
[0017] 其它實(shí)施方案提供一種疫苗組合物，其包含:a)包含野生型白蛋白多肽和偶聯(lián)物 (例如免疫原）的融合蛋白；和b)藥學(xué)上可接受的載劑。其它實(shí)施方案提供在受試者中誘導(dǎo) 免疫反應(yīng)的方法和用途，其包括在使得受試者對(duì)免疫原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的條件下向受試者施 用上述疫苗組合物。在一些實(shí)施方案中，疫苗組合物進(jìn)行氣霧化。在一些實(shí)施方案中，疫苗 組合物被遞送至受試者的粘膜表面(例如鼻內(nèi)）。
[0018] 本文中描述其它實(shí)施方案。
[0019] 附圖簡(jiǎn)述
[0020] 圖 1 提供SEQ ID N0:1，野生型HSA。
[0021] 圖2(A)和(B)展示通過突變誘發(fā)靶向的HSA位置的結(jié)晶學(xué)圖解。
[0022] 圖3展示用于產(chǎn)生白蛋白融合物的卡匣載體系統(tǒng)。
[0023] 圖4展示純化的白蛋白-GST變體的SDS-PAGE分析。（A)HSA-GST變體和B(MSA-GST變 體)的代表性非還原SDS-PAGE凝膠分析。
[0024] 圖5展示HSA-GST變體與hFcRn的結(jié)合。（A-D)ELISA測(cè)量，展示在pH 6.0下WT HSA-GST和突變變體與hFcRn的結(jié)合。（E)在pH 6.0下HSA-GST變體與hFcRn的相對(duì)結(jié)合。相對(duì)結(jié)合 基于ELISA結(jié)果(A-D)計(jì)算，其中WT FcRn結(jié)合設(shè)定成1。結(jié)果代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0025] 圖6展示MSA和HSA-GST變體與hFcRn和mFcRn的結(jié)合。ELISA測(cè)量展示在pH 6.0下WT HSA和MSA-GST融合物以及突變變體與(A)hFcRn和(B-D)mFcRn的結(jié)合。在pH 6.0下WT HSA和 MSA-GST融合物以及突變變體與hFcRn的相對(duì)結(jié)合。在pH 6.0下WT HSA和MSA-GST融合物以 及突變變體與mFcRn的相對(duì)結(jié)合。相對(duì)結(jié)合基于ELISA結(jié)果計(jì)算，其中WT設(shè)定成1。結(jié)果代表 至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0026] 圖7展示MSA和HSA-GST變體與hFcRn和mFcRn的相對(duì)結(jié)合。（A)在pH 6.0下MSA和 HSA-GST變體與(A)hFcRn和(B-D)mFcRn的相對(duì)結(jié)合。相對(duì)結(jié)合基于圖6中的ELISA結(jié)果計(jì)算， 其中WT FcRn結(jié)合設(shè)定成1。結(jié)果代表至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0027]圖8展示單體hFcRn與固定HSA變體的SPR結(jié)合。固定的（A)未融合的WT HSA、（B)WT HSA-GST、（C)HSA-EQ-GST、（D)HSA-IG-GST、（E)HSA-IA-GST、（F)HSA-KP-GST和(G)HSA-EQ/ TM/KP上注射滴定量的單體hFcRn的結(jié)合。結(jié)合數(shù)據(jù)與BIA評(píng)估軟件供應(yīng)的1:1朗繆爾結(jié)合模 型擬合。估計(jì)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)概述于表2中。
[0028]圖9展示跨越極化人類上皮細(xì)胞層的工程化HSA融合物變體的FcRn介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞 作用。從在Transwell系統(tǒng)中生長(zhǎng)的極化T84細(xì)胞的頂側(cè)至基底外側(cè)輸送的WT HSA、KA/HQ HSA和KP HSA融合物的量的ELISA定量。在時(shí)間點(diǎn)0小時(shí)和4小時(shí)從基底外側(cè)儲(chǔ)集器收集樣 品，且轉(zhuǎn)胞吞的量表示為ng/ml轉(zhuǎn)胞吞的HSA融合物。結(jié)果表示四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。
[0029] 圖10展示單體hFcRn與固定HSA變體的SPR結(jié)合。固定的（Α)ν547Α(1μΜ-0.031μΜ) (Β)ν547Α/Κ573Ρ(1μΜ-0·031μΜ)和（C)E505Q/T527M/V547A/K573P(0.25yM-3.9yM)上注射滴 定量的單體hFcRn的結(jié)合。
[0030] 圖ll(A-F)展示在pH 7.4下HSA-GST變體與hFcRn的ELISA結(jié)合。
[0031] 圖12(A)和(B)展示HSA-GST變體與hFcRn的ELISA結(jié)合。ELISA測(cè)量展示在pH 6.0下 WT HSA-GST和突變變體與hFcRn的結(jié)合。（B)ELISA測(cè)量展示在pH 7.4下WT HSA-GST和突變 變體與hFcRn的結(jié)合。
[0032]圖13展示跨越極化人類細(xì)胞的未融合HSA變體的轉(zhuǎn)胞吞作用。從在Transwell系統(tǒng) 中生長(zhǎng)的極化T84細(xì)胞的頂側(cè)(A)至基底外側(cè)(B)以及從B側(cè)至A側(cè)輸送的未融合的WT HSA和 KP的量的ELISA定量。
[0033]圖14展示跨越極化人類細(xì)胞的HSA-GST變體的轉(zhuǎn)胞吞作用。從在Transwell系統(tǒng)中 生長(zhǎng)的極化T84細(xì)胞的頂側(cè)至基底外側(cè)輸送的HSAWT、EQ、TM和KP/EQ/TM GST融合物的量的 ELISA定量。
[0034]圖15展示跨越極化人類細(xì)胞的HSA-GST變體的轉(zhuǎn)胞吞作用。從在Transwell系統(tǒng)中 生長(zhǎng)的極化T84細(xì)胞的頂側(cè)至基底外側(cè)輸送的HSA VA、KP/VA和KP/EQ/TM/VA GST融合物的 量的ELISA定量。
[0035]圖16(A)和(B)展示跨越極化人類細(xì)胞的HSA耦接NP的轉(zhuǎn)胞吞作用。（A)展示與WT HSA耦接的NP或KA/HQ在pH 6·0和7·4下的結(jié)合的ELISA。
[0036] 定義
[0037]如本文所用，術(shù)語"白蛋白"意指三維結(jié)構(gòu)與HSA基本上相同的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明 的白蛋白蛋白質(zhì)的實(shí)例包括(但不限于）人類血清白蛋白、靈長(zhǎng)類動(dòng)物血清白蛋白（例如黑 猩猩血清白蛋白、大猩猩血清白蛋白）、嚙齒動(dòng)物血清白蛋白（例如兔血清白蛋白、小鼠白蛋 白和大鼠血清白蛋白）、牛血清白蛋白、馬血清白蛋白、驢血清白蛋白、倉鼠血清白蛋白、山 羊血清白蛋白、綿羊血清白蛋白、犬血清白蛋白、天竺鼠血清白蛋白、雞血清白蛋白和豬血 清白蛋白。如SEQ ID NO: 1中公開的HSA或其任何天然存在的等位基因是根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選 白蛋白且具有67kDa的分子量。技術(shù)人員將了解可存在性質(zhì)基本上與HSA相同，但與SEQ ID NO: 1比較具有一個(gè)或幾個(gè)變化的天然等位基因，本發(fā)明人還涵蓋此類天然等位基因的使 用。
[0038] 如本文中所用，術(shù)語"白蛋白的片段"意指保留結(jié)合于FcRn的能力的白蛋白部分。 片段可由一個(gè)來源于HSA的不中斷序列組成或可包含兩個(gè)或超過兩個(gè)來源于HSA的序列。根 據(jù)本發(fā)明的片段的尺寸超過大致20個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選超過30個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選超過 40個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選超過50個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選超過75個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選超過 100個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選超過200個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選超過300個(gè)氨基酸殘基，甚至更優(yōu) 選超過400個(gè)氨基酸殘基，且最優(yōu)選超過500個(gè)氨基酸殘基。
[0039] 術(shù)語"野生型"在提及蛋白質(zhì)而使用時(shí)是指由細(xì)胞、組織或生物體的基因組編碼的 蛋白質(zhì)，不同于經(jīng)操縱以產(chǎn)生合成蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。
[0040] 術(shù)語"變體"和"突變體"在提及多肽而使用時(shí)是指與另一通常相關(guān)多肽相差一個(gè) 或多個(gè)氨基酸的氨基酸序列。變體可具有"保守"變化，其中經(jīng)取代的氨基酸具有類似的結(jié) 構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)。一種類型保守氨基酸取代是指具有類似側(cè)鏈的殘基的可互換性。舉例來說， 一組具有脂族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸;一組具有脂族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸;一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰 胺;一組具有芳族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酷氨酸和色氨酸;非天然氨基酸如對(duì)氨基苯并 氨酸，一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸;并且一組具有含硫側(cè)鏈的氨 基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙 氨酸-酷氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。更罕見地，變體可具 有"非保守"變化(例如甘氨酸經(jīng)色氨酸替換）。類似的微小變化還可包括氨基酸缺失或插入 (即添加)或兩者。可使用本領(lǐng)域眾所周知的計(jì)算機(jī)程序，例如DNAStar軟件，發(fā)現(xiàn)決定哪些 和多少氨基酸殘基在不消除生物活性下可經(jīng)取代、插入或缺失的規(guī)則?？梢栽诠δ芊治鲋?測(cè)試變體。優(yōu)選變體具有小于10%且優(yōu)選小于5%且更優(yōu)選小于2%變化(是否取代、缺失等 等）。對(duì)于氨基酸取代，使用以下名稱:原始氨基酸、位置、經(jīng)取代的氨基酸。因此，位置573賴 氨酸經(jīng)丙氨酸取代稱為"K573A"且位置573賴氨酸經(jīng)脯胺酸取代稱為K573P。多個(gè)突變通過 添加標(biāo)記（"+"）或7"分隔，例如"Gly205Arg+Ser41 lPhe"或"G205R/S411F"，分別表示甘氨 酸(G)經(jīng)精氨酸(R)和絲氨酸(S)經(jīng)苯丙氨酸(F)的位置205和411的突變。
[0041] 兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"一致性"描述。對(duì)本 發(fā)明來說，兩個(gè)氨基酸序列之間的一致性程度使用Needleman-Wunsch演算法(Needleman和 Wunsch，1970，J.Mol ·Biol · 48:443-453)，如EMBOSS套裝的Needle程序中所執(zhí)行（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice等人，2000，Trends in Genetics 16:276-277)，優(yōu)選3.0.0或更新版本中所執(zhí)行來確定。所用的任選參數(shù) 11644.000-EP7是間隙開口罰分10、間隙延伸罰分0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版） 取代矩陣。標(biāo)記為"最長(zhǎng)一致性"的Needle的輸出（使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作一致性％且 如下計(jì)算：（一致殘基X 100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)的間隙總數(shù)）。
[0042] 表述"對(duì)應(yīng)于參考序列中位置的氨基酸位置"和類似表述意圖鑒別主要或空間結(jié) 構(gòu)中對(duì)應(yīng)于參考序列中特定位置的氨基酸殘基。技術(shù)人員將了解此可通過將既定序列與參 考序列比對(duì)且鑒別與參考序列中特定位置比對(duì)的氨基酸殘基來進(jìn)行。舉例來說，為發(fā)現(xiàn)既 定白蛋白序列中對(duì)應(yīng)于HSA中位置573的氨基酸殘基，既定白蛋白序列與HSA比對(duì)且鑒別與 HSA中位置573比對(duì)的氨基酸為既定白蛋白序列中對(duì)應(yīng)于HSA中位置573的氨基酸。
[0043] 表述Xnnn意圖指位于對(duì)應(yīng)于HSA中位置nnn的位置的氨基酸殘基X，且表述XnnnY意 圖指位于對(duì)應(yīng)于HSA中位置ηηη的位置的任何氨基酸X經(jīng)氨基酸殘基Υ取代。
[0044] 如本文所用，術(shù)語"親和力"是指例如白蛋白與FcRn等結(jié)合對(duì)的兩個(gè)成員之間的結(jié) 合強(qiáng)度的量度。Kd是解離常數(shù)且具有摩爾濃度的單位。親合常數(shù)是解離常數(shù)的倒數(shù)。親合常 數(shù)有時(shí)用作描述此化學(xué)實(shí)體的通用術(shù)語。其為結(jié)合能量的直接量度。通過方程式A Go = -RT LN(K)，K的自然對(duì)數(shù)與結(jié)合的吉布斯自由能線性相關(guān)，其中R =氣體常數(shù)且溫度為開氏度 數(shù)。親和力可實(shí)驗(yàn)測(cè)定，例如通過表面等離子體共振(SPR)，使用市售Biacore SPR裝置(GE Healthcare)〇
[0045] 如本文所用，如"包含白蛋白和偶聯(lián)物的融合蛋白"中的術(shù)語"偶聯(lián)物"是指任何附 接(例如如融合蛋白中共價(jià)或非共價(jià)(例如經(jīng)由疏水性相互作用））至白蛋白的分子。實(shí)例包 括(但不限于)肽、多肽、免疫原、藥物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、小分子、核苷酸、放射性示蹤劑等。
[0046] 如本文所用，術(shù)語"在使所述受試者產(chǎn)生免疫反應(yīng)的條件下"是指免疫反應(yīng)(例如 先天性或獲得性)的任何定性或定量誘導(dǎo)、產(chǎn)生和/或刺激。
[0047] 如本文中使用，術(shù)語"免疫反應(yīng)"是指受試者的免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。舉例來說，免疫反 應(yīng)包括(但不限于)Toll受體活化、淋巴因子(例如細(xì)胞因子(例如Thl或Th2型細(xì)胞因子)或 趨化因子)表達(dá)和/或分泌、巨噬細(xì)胞活化、樹突狀細(xì)胞活化、T細(xì)胞活化(例如⑶4+或⑶8+T 細(xì)胞）、NK細(xì)胞活化和/或B細(xì)胞活化（例如抗體產(chǎn)生和/或分泌）的可檢測(cè)的改變（例如增 加）。免疫反應(yīng)的其它實(shí)例包括免疫原(例如抗原(例如免疫原性多肽））與MHC分子結(jié)合和誘 導(dǎo)針對(duì)免疫原性多肽所來源于的抗原的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（"CTL"）反應(yīng)，誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng) (例如抗體產(chǎn)生)和/或T輔助淋巴細(xì)胞反應(yīng)和/或緩發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)、免疫系統(tǒng)的細(xì)胞 (例如T細(xì)胞、B細(xì)胞(例如任何發(fā)育階段(例如漿細(xì)胞）））的擴(kuò)展(例如細(xì)胞群體發(fā)育)和抗原 呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的加工和呈現(xiàn)增加。免疫反應(yīng)可為針對(duì)受試者的免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來(例 如來自微生物的非自體抗原（例如病原體)或識(shí)別為外來的自抗原）的免疫原。因此，應(yīng)了 解，如本文所用，"免疫反應(yīng)"是指任何類型免疫反應(yīng)，包括(但不限于)先天免疫反應(yīng)(例如 活化Toll受體信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)）、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(例如免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞(例如抗原特異 性T細(xì)胞)和非特異性細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng))和體液免疫反應(yīng)(例如B細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)(例如經(jīng)由 產(chǎn)生和分泌抗體至血漿、淋巴和/或組織液中）。術(shù)語"免疫反應(yīng)"意指涵蓋受試者的免疫系 統(tǒng)對(duì)抗原和/或免疫原(例如對(duì)免疫原（例如病原體)的先天性反應(yīng)以及作為適應(yīng)性免疫反 應(yīng)結(jié)果的獲得性(例如記憶)反應(yīng))起反應(yīng)的能力的所有方面。
[0048] 如本文所用，術(shù)語"免疫性"是指在暴露于能夠引起疾病的微生物(例如病原體)后 避免患上該疾?。ǎɡ珙A(yù)防減弱(例如抑制)疾病的征象、癥狀或病狀）。免疫性可以是先天 性(例如先前未暴露于抗原下存在的非適應(yīng)性(例如非獲得性)免疫反應(yīng))和/或獲得性(例 如在先前暴露于抗原后由B和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(例如其展現(xiàn)對(duì)抗原的特異性和反應(yīng)性 增加)）。
[0049] 如本文所用，術(shù)語"免疫原"是指能夠引起受試者中免疫反應(yīng)的因子(例如微生物 (例如細(xì)菌、病毒或真菌)和/或其部分或組分(例如蛋白質(zhì)抗原））。在一些實(shí)施方案中，免疫 原引起針對(duì)免疫原(例如微生物(例如病原體或病原體產(chǎn)物））的免疫性。
[0050] 術(shù)語"測(cè)試化合物"是指可用于治療或預(yù)防身體功能的疾?。╠isease)、病、疾病 (sickness)或病癥或以其它方式改變樣品的生理或細(xì)胞狀態(tài)的任何化學(xué)實(shí)體、藥劑、藥物 等等。測(cè)試化合物包含已知與潛在的治療化合物兩者。測(cè)試化合物可以通過使用本發(fā)明的 篩選法篩選來確定為治療劑。"已知的治療化合物"是指已展示(例如通過動(dòng)物試驗(yàn)或在施 用于人類的經(jīng)驗(yàn)前)有效于此類治療或預(yù)防的治療化合物。
[0051] 如本文所用，術(shù)語"樣品"以其最廣泛意義使用。如本文所用，術(shù)語"樣品"以其最廣 泛意義使用。在某種意義上，其可以指組織樣品。在另一種意義上，意味著包括從任何來源 獲得的樣本或培養(yǎng)物以及生物制劑。生物樣品可從動(dòng)物(包括人類)獲得且涵蓋流體、固體、 組織和氣體。生物樣品包括(但不限于)血液制品，例如血漿、血清等等。這些實(shí)例不應(yīng)理解 為限制可應(yīng)用于本發(fā)明的樣品類型。懷疑含有人類染色體或與人類染色體相關(guān)的序列的樣 品可包含細(xì)胞、從細(xì)胞分離的染色體(例如一系列中期染色體）、基因組DNA (在溶解狀態(tài)中 或結(jié)合于固體支撐物，例如用于DNA印跡分析）、RNA (在溶解狀態(tài)中或結(jié)合于固體支撐物，例 如用于RNA印跡分析）、cDNA(在溶解狀態(tài)中或結(jié)合于固體支撐物)等等。懷疑含有蛋白質(zhì)的 樣品可包含細(xì)胞、組織一部分、含有一種或多種蛋白質(zhì)的提取物等等。
[0052]發(fā)明詳述
[0053]本發(fā)明涉及對(duì)新生兒Fc受體(FcRn)的親和力有所提高的白蛋白的變體以及其用 途，且具體地說，涉及此類白蛋白的變體作為免疫原載劑的用途。在一些實(shí)施方案中，本發(fā) 明涉及包含白蛋白/免疫原融合蛋白的疫苗(例如用于粘膜遞送的疫苗）。
[0054] 首先展示白蛋白上對(duì)FcRn的主要結(jié)合位點(diǎn)位于C端Dili內(nèi)（Andersen等人，Nat (]〇1]11111111.2012年1月3日；3:610;〇1&11(11111^等人13;[0(3116111181:^.2006年4月18日；45(15): 4983-90)。接著通過定點(diǎn)突變誘發(fā)，靶向人類白蛋白的Dili內(nèi)的三個(gè)完全保守組氨酸殘基 (His464、His510和His535)揭露了所有殘基對(duì)于結(jié)合都是關(guān)鍵的（Andersen等人，2012,上 述）。建立人類FcRn-人類白蛋白復(fù)合物的對(duì)接模型，其中除Dili之外，展示N端DI內(nèi)兩個(gè)暴 露的環(huán)接近受體(Andersen等人，2012,上述）。按照這些預(yù)測(cè)，人類FcRn與人類白蛋白的復(fù) 合物的兩個(gè)近來公布的共晶體結(jié)構(gòu)證實(shí)DI與DIII的影響（Oganesyan等人，J Biol Chem. 2014年3月 14 日；289( 11) :7812-24. ; Schmidt等人，Structure .2013年11 月5 日；21 (11): 1966-78)。一種共晶體結(jié)構(gòu)含有野生型白蛋白且另一種含有具有四個(gè)氨基酸取代 (￥4181^42(^45056和￥547厶）的工程化人類白蛋白的變體(批厶13)。后者在?!16與？!17.4 下對(duì)FcRn的親和力提高。兩個(gè)共晶體結(jié)構(gòu)展示高度類似的結(jié)合模式，但具有一些差異，可能 是因?yàn)镠SA13DIII中引入的突變。此外，兩個(gè)共晶體結(jié)構(gòu)都展示DI中與FcRn接觸的兩個(gè)暴露 的環(huán)。
[0055]若干研究已經(jīng)展示了人類FcRn可以在兩個(gè)方向上跨越粘膜上皮屏障輸送單體IgG 與含 IgG 的免疫復(fù)合物(Zhu等人，J 11111111111〇1.2005年7月15日；175(2):967-76;￥〇811丨(1&等 人，Immunity · 2004年6月；20(6):769-83; Spiekermann等人，J Exp Med· 2002年8月5 日；196 (3):303-10.Erratum in:J Exp Med.2003年6月2 日；197(ll):1601;Dickinson等人，J Clin Invest. 1999年10月；104(7) :903-11 ;Zhu等人，J Immunol .2001 年3月1 日；166(5): 3266-76))〇
[0056] 使用過度表達(dá)FcRn的極化Madin-Darby犬腎(MDCK)細(xì)胞，證實(shí)受體通過自頂側(cè)或 者基底外側(cè)轉(zhuǎn)胞吞作用輸送IgG(Zhu等人，J Immunol. 2001年3月1日；166(5): 3266-76 ; Jerdeva等人，Traffic· 2010年9月；11 (9): 1205-20) 〇
[0057]這些發(fā)現(xiàn)提出了FcRn是否能夠介導(dǎo)白蛋白的轉(zhuǎn)胞吞作用以及與FcRn的相互作用 的化學(xué)計(jì)量是否起作用的問題，因?yàn)榘椎鞍滓?:1方式結(jié)合FcRn，而IgG是同二聚體且具有 兩個(gè)FcRn的結(jié)合位點(diǎn)。迄今，一種使用MDCK細(xì)胞的研究表明白蛋白未轉(zhuǎn)胞吞(Tesar等人， Traffic.2006年9 月；7(9):1127-42)。
[0058]酵母顯示已經(jīng)用于研發(fā)具有一系列對(duì)人類FcRn的親和力的人類白蛋白的變體。一 種此類變體(E505G/V547A)在pH 6.0下親和力提高超過10倍，在中性pH值下微小增加，此將 人類FcRn轉(zhuǎn)殖基因小鼠和食蟹獼猴猴中半衰期分別延長(zhǎng)1.5倍和1.3倍（Schmidt等人， Structure · 2013年11 月 5 日；21 (11): 1966-78)。
[0059] 此外，使用基于結(jié)構(gòu)分析和交叉物種結(jié)合分析的方法，鑒別在酸性pH值下對(duì)人類 FcRn的親和力提高12倍，而在中性pH值下結(jié)合無法檢測(cè)的的經(jīng)單取代的人類白蛋白的變體 (K573P) (Andersen等人，J Biol Chem. 2014年5月9 日；289( 19): 13492-502)。當(dāng)在針對(duì)人類 FcRn進(jìn)行轉(zhuǎn)殖基因的小鼠和食蟹獼猴中評(píng)估時(shí)，工程化變體展示半衰期分別延長(zhǎng)1.4和1.6 倍。
[0060] 如上所述，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了包含相對(duì)于野生型白蛋白，對(duì)FcRn的親和力 增強(qiáng)或減少的免疫原和白蛋白的變體的融合蛋白。具有改變的FcRn結(jié)合特性的工程化白蛋 白的變體和衍生片段由于以下而具有提高的免疫原性：l)FcRn轉(zhuǎn)胞吞作用提高;2)隨分子 量而變的生物分布/血清半衰期超過腎清除率閾值;3)FcRn介導(dǎo)的免于降解增加;4)因 FcRn 介導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞胞內(nèi)運(yùn)輸和加工增強(qiáng)而增加 MHC I和II級(jí)上呈現(xiàn);5)適用于粘膜遞送；以 及6)因?yàn)榘椎鞍资且环N很穩(wěn)定的分子，熱穩(wěn)定性增加。
[0061 ]與此類白蛋白的變體融合的疫苗亞單位不干擾FcRn結(jié)合。因?yàn)镕cRn能夠避免降 解，驅(qū)使抗原呈現(xiàn)在MHC I和II級(jí)上且允許粘膜遞送，所以相對(duì)于未結(jié)合于變體白蛋白多肽 的免疫原，本發(fā)明的實(shí)施方案的疫苗的藥物動(dòng)力學(xué)和免疫原性提高。因此，本發(fā)明的實(shí)施方 案提供改善的疫苗組合物和其用途，克服了現(xiàn)有疫苗的限制。
[0062]在研發(fā)本發(fā)明的實(shí)施方案的過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了具有改變的FcRn結(jié)合特性 的全長(zhǎng)白蛋白以及其衍生片段。此類變體展示當(dāng)遺傳學(xué)上與大量肽和折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域融 合時(shí)保留FcRn結(jié)合。
[0063]本發(fā)明的實(shí)施方案提供了用于粘膜遞送的疫苗。已經(jīng)在關(guān)于Fc融合物的文獻(xiàn)中證 明和描述FcRn在免疫接種和粘膜遞送中的作用。例如病毒和細(xì)菌等傳染物在粘膜表面進(jìn)入 身體。肌肉內(nèi)或皮下免疫接種通常由于次最佳遞送和粘膜免疫系統(tǒng)活化而僅僅在感染部位 提供最低限度的保護(hù)。粘膜上皮細(xì)胞與固有膜內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞之間緊密相關(guān)，因此通過 粘膜表面遞送疫苗可能是一種理想的方法。粘膜是預(yù)防有效進(jìn)入的選擇性屏障。本發(fā)明的 實(shí)施方案提供了繞過此問題的組合物和方法，其通過使粘膜疫苗靶向在粘膜上皮上表達(dá)的 FcRn。此提供了完整的亞單位疫苗跨越上皮屏障安全特定地輸送至粘膜免疫系統(tǒng)，以隨后 誘發(fā)免疫細(xì)胞活化和記憶。
[0064]設(shè)計(jì)用于粘膜遞送的本發(fā)明的實(shí)施方案的疫苗利用FcRn介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞路徑來經(jīng) 粘膜遞送基于與全長(zhǎng)白蛋白或具有改變的FcRn結(jié)合特性的白蛋白突變體或片段的融合(化 學(xué)或遺傳學(xué)）的治療劑或亞單位疫苗(抗原/免疫原）。此類疫苗用于預(yù)防和治療感染(例如 通過微生物）以及預(yù)防病毒誘發(fā)的癌癥。在其它實(shí)施方案中，融合物用于遞送治療劑至特定 的身體粘膜部位。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案提供了用于局部遞送至感染/發(fā)炎部位或癌癥部 位的方法和組合物。
[0065] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在HSA的位置573、253、523、527和505中的一個(gè) 或多個(gè)或MSA的位置500或510具有取代的人類和小鼠白蛋白的變體。在一些實(shí)施方案中，變 體是缺失。舉例來說，在一些實(shí)施方案中，變體是SEQ ID N0:1的K573Y、I523G、I253A、 T527M、E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、K573Y/ T527M、K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、K500A/ !15100、￥5474、￥5474/1(573?、￥5474/^5050/1(573?/^527]\1或結(jié)構(gòu)域111缺失。在一些實(shí)施方案 中，白蛋白的變體為MSA的K500A/H510Q。
[0066] 本發(fā)明涵蓋在不同于該位置的位置包含突變(例如取代、缺失或添加）的變體，只 要該位置的取代維持即可。因此，在一些實(shí)施方案中，白蛋白的變體與野生型血清白蛋白 (例如野生型HSA、SEQ ID N0:1或野生型MSA)至少80%、90%、95%、97%或99%-致，其限 制條件為白蛋白的變體包含本文中描述的突變或缺失之一。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提 供變體白蛋白的片段。如上，片段優(yōu)選與SEQ ID N0:1的一部分（即片段的親本白蛋白）至少 80%、90%、95%、97%或99%-致。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含與變體白蛋白或 其片段融合的異源多肽序列的融合蛋白。如上，形成融合蛋白一部分的變體白蛋白和片段 優(yōu)選與SEQ ID N0:1或其一部分（即片段的親本白蛋白）至少80%、90%、95%、97%或99% 一致，且包含如本文中描述的取代突變。
[0067] 在一些實(shí)施方案中，變體白蛋白、其片段和融合物與對(duì)應(yīng)野生型序列相比，對(duì)人類 或小鼠 FcRn的親和力增加。技術(shù)人員將了解任何適合的方法可用于確定變體白蛋白對(duì)FcRn 的親和力是否高于或低于親本白蛋白對(duì)FcRn的親和力，例如確定和比較結(jié)合常數(shù)Kd。因此， 根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為Kd低于天然HSA的Kd的變體白蛋白具有比HSA更高的血漿半衰期，且認(rèn)為 Kd高于天然HSA的Kd的變體白蛋白具有比HSA更低的血漿半衰期。
[0068]在一些實(shí)施方案中，HSA變體包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。在一些實(shí)施方案中，氨 基酸取代在HSA的位置547、573、253、523、527和505或MSA的位置500或510。在一些實(shí)施方案 中，取代引起對(duì)FcRn的親和力更高(例如Kd更低）。舉例來說，在一些實(shí)施方案中，變體具有 10或更低、5或更低或1或更低的Kd。在一些實(shí)施方案中，取代是保守或非保守變化。在一些 實(shí)施方案中，特別涵蓋具有與本文中描述的變體類似的側(cè)鏈的既定位置的一種或多種變體 (例如相對(duì)于本文中描述的變體的保守變化）。
[0069]保守氨基酸取代是指具有類似側(cè)鏈的殘基的可互換性。舉例來說，一組具有脂族 側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸;一組具有脂族-羥基側(cè)鏈的氨 基酸是絲氨酸和蘇氨酸;一組具有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺;一組具有 芳族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酷氨酸和色氨酸;一組具有堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴氨酸、精 氨酸和組氨酸;并且一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。示例性的保守氨 基酸取代組是:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酷氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨 酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0070] 基因編碼的氨基酸可以被分成四個(gè)家族：（1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸）；（2)堿性 (賴氨酸、精氨酸、組氨酸）；（3)非極性(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨 酸、甲硫氨酸、色氨酸）；和(4)不帶電極性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、 蘇氨酸、酷氨酸）。苯丙氨酸、色氨酸和酷氨酸有時(shí)共同分類為芳香族氨基酸。以類似方式， 氨基酸譜系可以分組為（1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸）；（2)堿性(賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、 (3)脂族(甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸），其中絲氨酸和蘇氨 酸視情況分開分組為脂族羥基；（4)芳香族(苯丙氨酸、酷氨酸、色氨酸）；（5)酰胺(天冬酰 胺、谷氨酰胺）；和(6)含硫(半胱氨酸和甲硫氨酸）（例如Stryer等人，Biochemistry，第17-21 頁，第2版，WH Freeman and Co.，1981)〇
[0071] 在一些實(shí)施方案中，變體包括"非保守"變化(例如甘氨酸經(jīng)色氨酸替換）?？梢允?用計(jì)算機(jī)程序，發(fā)現(xiàn)決定哪些氨基酸殘基在不消除生物活性下可以經(jīng)取代、插入或缺失的 規(guī)則。
[0072] 根據(jù)本發(fā)明的白蛋白或其片段可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的技術(shù)偶聯(lián)于免疫原(例如抗 原）。本發(fā)明不限于特定的免疫原?？梢岳萌魏蚊庖咴蚩乖?。實(shí)例包括但不限于來 源于微生物(例如致病微生物）、腫瘤(例如用于癌癥疫苗)的免疫原等等。
[0073]本發(fā)明的變體白蛋白、其片段和融合物可以使用技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)制備。 一種合宜的方式是通過克隆編碼包含本文中描述的取代突變的親本白蛋白、其片段或融合 多肽的核酸。
[0074]包含本發(fā)明的變體白蛋白、其片段和融合物的融合蛋白也可以連接至信號(hào)序列以 使得在轉(zhuǎn)型的宿主生物體培養(yǎng)期間多肽分泌至生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。一般宜將變體多肽分泌至生 長(zhǎng)培養(yǎng)基中以使得回收和純化容易。
[0075]用于制備變體多肽的技術(shù)也在WO 2009019314(以引用的方式包括）中公開且這些 技術(shù)也可以應(yīng)用于本發(fā)明。白蛋白已經(jīng)在一系列宿主中成功地表達(dá)為重組蛋白質(zhì)，這些宿 主包括真菌（包括（但不限于）曲菌屬（Aspergillus) (W006066595)、克氏酵母 (Klyveromyces) (Fleer 1991，Bio/technology 9,968-975)、畢赤氏酵母屬（Pichia Pichia)(Kobayashi 1998Therapeutic Apheresis 2,257_262)和酵母菌屬 (Saccharomyces) (Sleepl990, Bio/techno logy 8，42-46))、細(xì)菌（Pandjaitab 2000， J.Allergy Clin. Immunol 105,279_285))、動(dòng)物(Barash 1993，Transgenic Research 2， 266-276)和植物(包括(但不限于）馬鈴薯和煙草(Sijmons 1990，Bio/technology 8,217和 Farran 2002，Transgenic Research 11，337_346))。本發(fā)明的HSA結(jié)構(gòu)域III衍生物、其片 段或變體優(yōu)選在適合的宿主細(xì)胞中重組產(chǎn)生。原則上，可以使用任何能夠產(chǎn)生適合量的多 肽的宿主細(xì)胞且普通從業(yè)人員能夠根據(jù)本發(fā)明選擇適合的宿主細(xì)胞。一種優(yōu)選的宿主生物 體是酵母，優(yōu)選在酵母菌屬(Saccharomycacae)中選擇，更優(yōu)選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)〇
[0076] 可以使用例如過濾、離心、色譜法、親和力分離技術(shù)等已知的分離技術(shù)的組合，從 生長(zhǎng)培養(yǎng)基回收和純化包含本發(fā)明的變體白蛋白、其片段和融合物的融合蛋白。普通從業(yè) 者能夠使用此類已知的分離步驟的特定組合純化本發(fā)明的變體白蛋白、其片段和融合物。 作為可以應(yīng)用于本發(fā)明的變體的純化技術(shù)的實(shí)例，可以提及W00044772的教導(dǎo)內(nèi)容。
[0077] 在一些實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域中已知的分子生物學(xué)技術(shù)，從融合核酸表達(dá)融合 蛋白。一種或多種免疫原多肽可以與白蛋白的變體或其片段的N端、C端融合，插入白蛋白的 變體或其片段結(jié)構(gòu)中的環(huán)中，或其任何組合。其可能或其可能不包含將融合多肽的各種組 分分開的連接序列，與白蛋白或其片段的融合物有關(guān)的教導(dǎo)內(nèi)容為本領(lǐng)域中已知且技術(shù)人 員將了解此類教導(dǎo)內(nèi)容也可以應(yīng)用于本發(fā)明。W0 01/79271A和W0 03/59934A還含有可以與 本發(fā)明的白蛋白的變體和其片段融合的多肽的實(shí)例且這些實(shí)例也適用于本發(fā)明。
[0078] 根據(jù)本發(fā)明的白蛋白的變體或其片段或包含白蛋白的變體或其片段的融合多肽 具有其血漿半衰期與親本白蛋白的變體或其片段或包含白蛋白的變體或其片段的融合多 肽相比改變的益處。其益處為:根據(jù)本發(fā)明的包含白蛋白的變體或其片段的偶聯(lián)物或包含 白蛋白的變體或其片段的融合多肽的血漿半衰期可以根據(jù)特定的治療目的來選擇。
[0079] 在其它實(shí)施方案中，白蛋白的變體偶聯(lián)于免疫原。用于免疫原偶聯(lián)白蛋白衍生物、 其片段或變體的技術(shù)為本領(lǐng)域中已知。W02009019314公開了適于治療化合物偶聯(lián)多肽的技 術(shù)的實(shí)例，此項(xiàng)技術(shù)也可以應(yīng)用于本發(fā)明。此外，W02009019314公開了可以偶聯(lián)于經(jīng)取代的 轉(zhuǎn)鐵蛋白的化合物和部分的實(shí)例，且這些實(shí)例也可以應(yīng)用于本發(fā)明。W02009019314的教導(dǎo) 內(nèi)容以引用的方式包括在本文中。
[0080] HSA在其天然形式中含有可方便用于結(jié)合的一個(gè)游離硫醇基。作為此方面內(nèi)特定 的實(shí)施方案，本發(fā)明的變體白蛋白、其片段和融合物可以包含進(jìn)一步的修改，用以在表面上 產(chǎn)生額外的游離硫醇基。其益處為:增加白蛋白衍生物、其片段或變體的有效負(fù)荷，使得超 過一個(gè)分子的免疫原可以偶聯(lián)于每個(gè)白蛋白衍生物、其片段或變體，或兩個(gè)或超過兩個(gè)不 同的免疫原可以偶聯(lián)于每個(gè)分子的變體白蛋白、其片段和融合物?？梢赃M(jìn)行修飾以提供表 面上其它游離硫醇基的特定殘基的教導(dǎo)內(nèi)容可見于以引用的方式并入的共同待決的專利 申請(qǐng)(EP 2009 152 625.1)。
[0081] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含本文中描述的白蛋白的變體或野生型白蛋 白和免疫原的疫苗組合物。本發(fā)明不受包含白蛋白/免疫原融合物的組合物的特定調(diào)配限 制。實(shí)際上，本發(fā)明的疫苗組合物可以包含除融合蛋白外的一種或多種不同試劑。這些試劑 或輔因子包括(但不限于)佐劑、表面活性劑、添加劑、緩沖劑、增溶劑、螯合劑、油類、鹽、治 療劑、藥物、生物活性劑、抗菌劑和抗微生物劑(例如抗生素、抗病毒劑等等）。在一些實(shí)施方 案中，包含融合蛋白的疫苗組合物包含增強(qiáng)免疫原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力的試劑和/或輔因 子(例如佐劑）。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，一種或多種輔因子或試劑的存在減少了誘導(dǎo)免疫 反應(yīng)(例如保護(hù)性免疫反應(yīng)(例如保護(hù)性免疫接種））所需要的免疫原的量。在一些實(shí)施方案 中，一種或多種輔因子或試劑的存在可以用于免疫反應(yīng)向細(xì)胞(例如T細(xì)胞介導(dǎo))或體液(例 如抗體介導(dǎo))免疫反應(yīng)偏移。本發(fā)明不受用于本發(fā)明治療劑的輔因子或試劑類型。
[0082] 佐劑一般描述于Vaccine Design-the Subunit and Adjuvant Approach, Powell和Newman編輯，Plenum Press，New York，1995中。本發(fā)明不受利用的佐劑類型（例如 用于組合物(例如藥學(xué)組合物）中）限制。舉例來說，在一些實(shí)施方案中，適合的佐劑包括鋁 鹽，例如氫氧化鋁凝膠（明礬)或磷酸鋁。在一些實(shí)施方案中，佐劑可以是鈣、鐵或鋅的鹽，或 可以是酰化酷氨酸或?；?、陽離子或陰離子衍生化的多糖或聚磷腈的不溶懸浮液。
[0083] -般說來，通過抗原與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的相互作用，對(duì)抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。免疫反 應(yīng)可以廣泛分類成兩個(gè)類別:體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(例如傳統(tǒng)上特征分別為抗體和 細(xì)胞效應(yīng)保護(hù)機(jī)制）。反應(yīng)的這些類別已經(jīng)稱為Thl類型反應(yīng)(細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng))和Th2類型 免疫反應(yīng)(體液反應(yīng)）。
[0084] 免疫反應(yīng)的刺激可以由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞或組分對(duì)介入(例如暴露于免疫原）的直 接或間接反應(yīng)引起。免疫反應(yīng)可以用許多方式測(cè)量，包括免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(例如B細(xì)胞、T細(xì) 胞、樹突狀細(xì)胞、APC、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞等）的活化、增殖或分化;標(biāo)記物和細(xì)胞因 子的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)；IgA、IgM或IgG效價(jià)的刺激;脾腫大(包括脾細(xì)胞結(jié)構(gòu)增加）；各種器官 中增生和混合細(xì)胞浸潤(rùn)。本領(lǐng)域中已知可以根據(jù)免疫刺激評(píng)估的免疫系統(tǒng)的其它的反應(yīng)、 細(xì)胞和組分。
[0085] 雖然實(shí)踐本發(fā)明無需理解機(jī)制且本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī)制，但在一些實(shí) 施方案中，本發(fā)明的組合物和方法誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌(例如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞 和CD4+T細(xì)胞）。特定細(xì)胞因子的表達(dá)的調(diào)節(jié)可以局部或全身發(fā)生。已知細(xì)胞因子型態(tài)可以 決定免疫反應(yīng)中T細(xì)胞調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能。在一些實(shí)施方案中，可以誘導(dǎo)Thl類型細(xì)胞因子，且 因此本發(fā)明的免疫刺激組合物可以促進(jìn)Thl類型抗原特異性免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞 (例如由此避免不需要的Th2類型免疫反應(yīng)(例如產(chǎn)生與疾病嚴(yán)重程度增強(qiáng)相關(guān)的Th2類型 細(xì)胞因子(例如IL-13)(例如IL-13誘發(fā)粘液形成）））。
[0086] 細(xì)胞因子在引導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)中起作用。輔助(CD4+)T細(xì)胞通過產(chǎn)生作用于其它免疫 系統(tǒng)細(xì)胞(包括B和其它T細(xì)胞）的可溶性因子來配合哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)。最成熟的CD4+T 輔助細(xì)胞表達(dá)兩種細(xì)胞因子型態(tài)之一:Thl或Th2 Jhl型CD4+T細(xì)胞分泌IL-2、IL-3、IFN-γ、 GM-CSF 和高水平的 TNF-α。!112 細(xì)胞表達(dá) IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13、GM-CSF 和低水平的TNF-cuThl型細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞免疫與特征為免疫球蛋白類別在小鼠中轉(zhuǎn)變成 IgG2a且在人類中轉(zhuǎn)變成IgGl的體液免疫。Thl反應(yīng)也可以與延遲型超敏反應(yīng)和自體免疫疾 病有關(guān)。Th2類型細(xì)胞因子主要誘導(dǎo)體液免疫并誘導(dǎo)類別轉(zhuǎn)變成IgGl和IgE。與Thl反應(yīng)相關(guān) 的抗體同型一般具有中和和調(diào)理能力，而與Th2反應(yīng)相關(guān)的抗體同型更多地與過敏性反應(yīng) 相關(guān)。
[0087] 若干因素已經(jīng)顯示影響免疫反應(yīng)向Thl或者Th2類型反應(yīng)偏移。最佳表征的調(diào)節(jié)劑 是細(xì)胞因子。IL-12和IFN-γ是陽性Thl和陰性Th2調(diào)節(jié)劑。IL-12促進(jìn)IFN-γ產(chǎn)生，且IFN-γ 為IL-12提供正反饋。IL-4和IL-10似乎對(duì)Th2細(xì)胞因子型態(tài)的建立是重要的，且下調(diào)Thl細(xì) 胞因子的產(chǎn)生。
[0088] 因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種刺激受試者中Thl型免疫反應(yīng)的方法， 其包括向受試者施用包含免疫原的組合物。然而，在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種刺激 受試者中Th2型免疫反應(yīng)(例如是否需要T細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)的平衡）的方法，其包括向受試者 施用包含免疫原的組合物。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，佐劑可用于(例如可以與本發(fā)明的組合 物共同施用)將免疫反應(yīng)向Thl或者Th2型免疫反應(yīng)偏移。舉例來說，誘導(dǎo)Th2或弱Thl反應(yīng)的 佐劑包括(但不限于）明礬、皂角苷和SB-As4。誘導(dǎo)Thl反應(yīng)的佐劑包括(但不限于)MPL、MDP、 ISC0MS、IL-12、IFN-γ 和SB-AS2。
[0089] 若干其它類型的Thl類型免疫原可以用于(例如作為佐劑)本發(fā)明的組合物和方法 中。這些包括(但不限于）以下。在一些實(shí)施方案中，使用單磷酰脂質(zhì)A(例如尤其是3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D_MPL)) jD-MPL是一種由Ribi Immunochem，Montana制造的眾所周知 的佐劑?；瘜W(xué)上其常常呈具有4、5或6酰化鏈的3-脫-0-?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A的混合物供應(yīng)。在 一些實(shí)施方案中，使用雙磷酰脂質(zhì)A和其3-0-脫?；凅w。這些免疫原每一個(gè)可以通過以引 用的方式整體并入本文中的GB 2122204B中描述的方法純化和制備。已經(jīng)描述其它的純化 和合成脂多糖（參見例如美國(guó)專利號(hào)6,005,099和EP 0 729 473;Hilgers等人，1986， Int.Arch.Allergy. Immunol ·，79(4): 392-6 ;Hilgers等人，1987，Immunology，60( 1): 141-6;和EP 0 549 074,這些中的每個(gè)以引用的方式整體并入本文中）。在一些實(shí)施方案中，3D-MPL呈微粒調(diào)配物形式使用（例如直徑上微小粒徑小于0.2μπι，描述于以引用的方式整體并 入本文中的ΕΡ 0689 454)。
[0090] 在一些實(shí)施方案中，皂角苷用作本發(fā)明組合物中的免疫原(例如Thl型佐劑）。皂角 苷是眾所周知的佐劑（參見例如Lacai 11 e-Dubois和Wagner (1996) Phytomedicine第2卷第 363-386頁）。皂角苷的實(shí)例包括Quil A(來源于美國(guó)南方樹皂樹肥皂草的樹皮）和其部分 (參見例如美國(guó)專利號(hào) 5,057,540;Kensil，CritRevTherDrugCarrierSyst，1996，12 (1-2):1-55;和EP 0 362 279,這些中的每個(gè)以引用的方式整體并入本文中）。也涵蓋溶血 皂角苷QS7、QS17和QS21 (Quil A的HPLC純化部分；參見例如Kensil等人（1991) ? J.Immunology 146,431-437,美國(guó)專利號(hào)5,057,540;W0 96/33739;W0 96/11711 和EP 0 362 279,這些中的每個(gè)以引用的方式整體并入本文中）適用于本發(fā)明。也涵蓋適用的是 QS21與聚山梨酸酯或環(huán)糊精的組合(參見例如W0 99/10008,以引用的方式整體并入本文 中）。
[0091] 在一些實(shí)施方案中，含有未甲基化的CpG二核苷酸（"CpG"）的免疫原性寡核苷酸用 作佐劑。CpG是DNA中存在的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸基元的縮寫。CpG為本領(lǐng)域中已知，當(dāng)通過 全身和粘膜途徑施用時(shí)作為佐劑（參見例如W0 96/02555，EP 468520，Davis等人， J·Immunol，1998，160(2):870-876;McCluskie和Davis，J·Immunol·，1998，161(9):4463-6; 和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0050238660，這些中的每個(gè)以引用的方式整體并入本文中）。舉例來說， 在一些實(shí)施方案中，免疫刺激序列是嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶;其中CG基元未甲基化。
[0092] 雖然實(shí)踐本發(fā)明無需理解機(jī)制且本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī)制，但在一些實(shí) 施方案中，一種或多種CpG寡核苷酸的存在活化各種免疫子集，包括天然殺傷細(xì)胞(其產(chǎn)生 IFN-γ )和巨噬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，CpG寡核苷酸調(diào)配成本發(fā)明的組合物以誘導(dǎo)免疫 反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，CpG的游離溶液與抗原（溶液內(nèi)存在)一起共同施用（參見例如TO 96/02555;以引用的方式并入本文中）。在一些實(shí)施方案中，CpG寡核苷酸共價(jià)偶聯(lián)于抗原 (參見例如W0 98/16247、以引用的方式并入本文中），或用例如氫氧化鋁等載劑調(diào)配(參見 Brazolot-Mi 1 lan等人，Proc.Natl .AcadSci ·，USA，1998，95(26)，15553-8) 〇
[0093] 在一些實(shí)施方案中，例如完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑等佐劑、細(xì)胞因子(例如 介白素(例如11-2、1?^丫、11^-4等）、巨噬細(xì)胞群落刺激因子、腫瘤壞死因子等）、細(xì)菌40卩核 糖基化毒素的解毒突變體(例如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大腸桿菌不耐熱腸毒素 (LT)，尤其LT-K63(其中賴氨酸取代位置63的野生型氨基酸）、LT-R72(其中精氨酸取代位置 72的野生型氨基酸）、CT-S109(其中絲氨酸取代位置109的野生型氨基酸)和PT-K9/G129(其 中賴氨酸取代位置9的野生型氨基酸和甘氨酸取代位置129的野生型氨基酸））（參見例如 TO93/13202和W092/19265，這些中的每個(gè)以引用的方式并入本文中）和其它免疫原性物質(zhì) (例如其增強(qiáng)本發(fā)明的組合物的有效性)與包含本發(fā)明的免疫原的組合物一起使用。
[0094] 用于本發(fā)明的佐劑的其它實(shí)例包括聚（二（羧酸根基苯氧基)膦腈(PCPP聚合物； Virus Research Institute，USA);脂多糖的衍生物，例如單磷酰脂質(zhì)A(MPL ; Ribi ImmunoChem Research，Inc ·，Hamilton，Mont ·)、胞壁酰二肽(MDP;Ribi)和蘇氨酰-胞壁酰 二肽（t-MDP;Ribi);0M-174(與脂質(zhì) A 相關(guān)的葡糖胺雙糖；0M Pharma SA，Meyrin， Switzerland);和利什曼蟲延伸因子（純化的利什曼蟲蛋白質(zhì)；Corixa Corporation， Seattle，Wash.)。
[0095] 佐劑可以添加至包含免疫原的組合物，或在與組合物組合或共同施用前，佐劑可 以與載劑，例如脂質(zhì)體或金屬鹽(例如鋁鹽(例如氫氧化鋁））一起調(diào)配。
[0096] 在一些實(shí)施方案中，包含免疫原的組合物包含單一佐劑。在其它實(shí)施方案中，組合 物包含兩種或超過兩種佐劑（參見例如W0 94/00153 ;W0 95/17210 ;W0 96/33739 ;W0 98/ 56414;W0 99/12565;W0 99/11241;和W0 94/00153,這些中的每個(gè)以引用的方式整體并入 本文中）。
[0097] 在一些實(shí)施方案中，包含免疫原的組合物包含一種或多種粘膜粘著劑(參見例如 美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0050281843,以引用的方式整體并入本文中）。本發(fā)明不受所利用的粘膜 粘著劑的類型限制。實(shí)際上，涵蓋多種粘膜粘著劑適用于本發(fā)明，包括(但不限于)聚（丙烯 酸）的交聯(lián)衍生物(例如卡波普(carbopo 1)和聚卡波菲）、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖 (例如海藻酸鹽和殼聚糖）、羥丙基甲基纖維素、凝集素、菌毛蛋白和羧甲基纖維素。雖然實(shí) 踐本發(fā)明無需理解機(jī)制且本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī)制，但在一些實(shí)施方案中，使用 粘膜粘著劑(例如包含免疫原的組合物中）增強(qiáng)受試者中免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)(例如施用本發(fā)明 的組合物），此增強(qiáng)是因?yàn)楫?dāng)使用粘膜粘著劑時(shí)與未使用粘膜粘著劑下對(duì)免疫原的暴露持 續(xù)時(shí)間和量相比，受試者經(jīng)歷的暴露于免疫原的持續(xù)時(shí)間和/或量增加。
[0098] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可以包含無菌水性制劑?？山邮艿拿絼┖腿?劑包括(但不限于)水、林格氏溶液(Ringed s solution)、磷酸鹽緩沖生理食鹽水和等張氯 化鈉溶液。此外，無菌非揮發(fā)性油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以采用任何溫和的非 揮發(fā)性油，包括合成的單酸甘油酯或二酸甘油酯。此外，例如油酸等脂肪酸用于注射劑的制 備中。適于粘膜、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)由其它途徑施用的載劑調(diào)配物可見于 Remington7s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company，Easton，Pa〇 [0099 ]包含本發(fā)明的免疫原的組合物可以治療性(例如增強(qiáng)免疫反應(yīng))或預(yù)防性(例如用 于免疫接種例如預(yù)防疾病征象或癥狀））使用。包含本發(fā)明的免疫原的組合物可以經(jīng)由大量 不同的遞送途徑和方法施用于受試者。
[0100] 舉例來說，本發(fā)明的組合物可以通過多種方法施用于受試者(例如經(jīng)粘膜(例如鼻 粘膜、粘液鞘等）），包括(但不限于）：懸浮在溶液中并涂覆于表面;懸浮在溶液中并使用噴 霧施加器噴霧至表面上；與粘膜粘著劑混合且施加(例如噴霧或擦拭)至表面上(例如粘膜 表面）；位于鼻和/或陰道涂覆器上或浸滲至鼻和/或陰道涂覆器上且涂覆;通過控制釋放機(jī) 構(gòu)施加;作為脂質(zhì)體施加;或在聚合物上施加。
[0101] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物經(jīng)粘膜施用（例如使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)；參見例如 Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Mack Publishing Company， Easton，Pa.，第19版，1995(例如關(guān)于粘膜遞送技術(shù)，包括鼻內(nèi)、肺、陰道和直腸技術(shù)）以及歐 洲公布號(hào)517,565和Ilium等人，J.Controlled Rel.，1994,29:133-141 (例如關(guān)于鼻內(nèi)施用 的技術(shù)），這些中的每個(gè)以引用的方式整體并入本文中）?；蛘?，本發(fā)明的組合物可以經(jīng)真皮 或經(jīng)皮，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見例如Remington:The Science arid Practice of Pharmacy， Mack Publishing Company，Easton，Pa.，第19版，1995)施用。本發(fā)明不受施用途徑限制。
[0102] 雖然實(shí)踐本發(fā)明無需理解機(jī)制且本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī)制，但在一些實(shí) 施方案中，粘膜免疫接種是優(yōu)選的施用途徑，因?yàn)槠湟呀?jīng)展示抗原的粘膜施用具有更大的 誘導(dǎo)粘膜表面(許多病原體的侵入途徑）上保護(hù)性免疫反應(yīng)的功效(例如粘膜免疫性）。另 外，例如鼻內(nèi)免疫接種等粘膜免疫接種不僅可以誘導(dǎo)鼻粘膜中粘膜免疫性，而且也可以誘 導(dǎo)例如生殖器粘膜等遠(yuǎn)端粘膜部位中的粘膜免疫性（參見例如Mestecky，Journal of Clinical Immunology，7:265-276，1987)。更有利地，在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，除誘導(dǎo)粘膜 免疫反應(yīng)外，粘膜免疫接種也誘導(dǎo)全身免疫性。在一些實(shí)施方案中，非腸胃外施用（例如疫 苗的粘膜施用）提供了一種有效并合宜的加強(qiáng)全身免疫性(例如通過腸胃外或粘膜免疫接 種誘導(dǎo)(例如在使用多個(gè)加強(qiáng)劑維持有力的全身免疫性的情況下））的方式。
[0103] 在一些實(shí)施方案中，借助于經(jīng)由粘膜途徑(例如口腔/食物或鼻途徑)施用本發(fā)明 的組合物，包含本發(fā)明的免疫原的組合物可以用于保護(hù)或治療易患或罹患疾病的受試者。 替代粘膜途徑包括陰道內(nèi)和直腸內(nèi)途徑。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，使用鼻施用途徑，本 文中稱為"鼻內(nèi)施用"或"鼻內(nèi)免疫接種"。鼻內(nèi)免疫接種的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，包括 施用疫苗的液滴或噴霧形式至有待免疫接種的受試者的鼻咽中。在一些實(shí)施方案中，提供 一種霧化或氣霧化組合物。例如口服的胃耐受膠囊等經(jīng)腸調(diào)配物、直腸或陰道施用的栓劑 也形成本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的組合物也可以經(jīng)由口腔途徑施用。在這些情況下，包含免 疫原的組合物可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或包括堿性緩沖液或腸溶膠囊。用于經(jīng) 鼻遞送的調(diào)配物可以包括以葡聚糖或環(huán)糊精和皂角苷作為佐劑的調(diào)配物。
[0104] 本發(fā)明的組合物也可以經(jīng)由陰道腔途徑施用。在此類情況下，包含免疫原的組合 物可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或乳化劑、聚合物(例如CARB0P0L)和陰道乳膏和栓 劑的其它已知的穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物也可以經(jīng)由直腸途徑施用。在 此類情況下，組合物可以包含本領(lǐng)域中已知用于形成直腸栓劑的賦形劑和/或蠟和聚合物。
[0105] 在一些實(shí)施方案中，選擇相同的施用途徑(例如粘膜施用）用于初始和強(qiáng)化免疫接 種。在一些實(shí)施方案中，利用多個(gè)施用途徑(例如同時(shí)或連續(xù)）以刺激免疫反應(yīng)。
[0106] 舉例來說，在一些實(shí)施方案中，包含免疫原的組合物以初始或者強(qiáng)化免疫接種方 案施用于受試者的粘膜表面?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，組合物以初始或者強(qiáng)化免疫接種方 案全身施用。在一些實(shí)施方案中，包含免疫原的組合物以初始免疫接種方案經(jīng)由粘膜施用 而施用于受試者，且以強(qiáng)化方案經(jīng)由全身性施用而施用于受試者。在一些實(shí)施方案中，包含 免疫原的組合物以初始免疫接種方案經(jīng)由全身性施用而施用于受試者，且以強(qiáng)化方案經(jīng)由 粘膜施用而施用于受試者。全身性施用途徑的實(shí)例包括(但不限于)腸胃外、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、 經(jīng)皮、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。包含免疫原的組合物可以用于達(dá)成預(yù)防和治療的目的。
[0107] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物通過肺遞送施用。舉例來說，本發(fā)明的組合物 可以經(jīng)由吸入遞送至受試者(例如人類)的肺(例如由此橫穿肺上皮內(nèi)層至血流）（參見例如 Ad jei 等人，Pharmaceutical Research 1990;7:565_569;Adjei 等人， Int.J.Pharmaceutics 1990;63:135-144;Braquet等人，J·Cardiovascular Pharmacology 1989 143_146;Hubbard等人，（1989)Annals of Internal Medicine，Vol. III，第206-212 頁；Smith等人，J.Clin. Invest · 1989;84:1145-1146;Oswein等人，〃Aerosolization of Proteins"，1990;Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado;Debs等人，J. Immunol · 1988; 140:3482-3488;和頒予Platz等人的美國(guó) 專利號(hào)5,284,656，這些中的每個(gè)以引用的方式整體并入本文中）。用于藥物肺遞送以達(dá)成 全身作用的方法和組合物描述于頒予Wong等人的美國(guó)專利號(hào)5,451,569,以引用的方式并 入本文中；又參見頒予Licalsi等人的美國(guó)專利號(hào)6,651,655,以引用的方式整體并入本文 中））。
[0108] 進(jìn)一步涵蓋用于實(shí)踐本發(fā)明的是各類設(shè)計(jì)用于藥劑經(jīng)肺和/或鼻粘膜遞送的機(jī)械 裝置，包括(但不限于）噴霧器、定劑量吸入器和粉末吸入器，都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉 的。適于實(shí)踐本發(fā)明的市售裝置的一些特定實(shí)例是Ultravent噴霧器(Mallinckrodt Inc.， St. Louis ,Μο . ) ； Acorn II噴霧器（Marquest Medical Products ,Englewood,Colo .)； Ventolin定劑量吸入器（Glaxo Inc.，Research Triangle Park，N.C·);和Spinhaler粉末 吸入器(Fisons Corp.，Bedford，Mass.)。所有此類裝置都需要使用適于分配治療劑的調(diào)配 物。典型地，每種調(diào)配物是采用的裝置類型特定的，且除常見的稀釋劑、佐劑、表面活性劑、 載劑和/或其它適用于療法的試劑外，可能涉及使用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)材料。此外，涵蓋脂質(zhì)體、微 膠囊或微球體、包合絡(luò)合物或其它類型載劑的使用。
[0109] 因此，在一些實(shí)施方案中，借助于通過粘膜、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、經(jīng)皮、肺、靜脈 內(nèi)、皮下或本文中描述的其它施用途徑施用組合物，包含本發(fā)明的免疫原的組合物可以用 于保護(hù)和/或治療易患或罹患疾病的受試者。疫苗制劑的全身性施用方法可以包括常規(guī)的 注射器和針或設(shè)計(jì)用于沿彈道遞送固體疫苗的裝置(看到例如W0 99/27961，以引用的方式 并入本文中），或無針壓力液體噴射裝置(參見例如美國(guó)專利號(hào)4,596,556;美國(guó)專利號(hào)5， 993,412，這些中的每個(gè)以引用的方式并入本文中）或經(jīng)皮貼片（參見例如冊(cè)97/48440;冊(cè) 98/28037,這些中的每個(gè)以引用的方式并入本文中）。本發(fā)明也可以用以增強(qiáng)涂覆于皮膚的 抗原的免疫原性(經(jīng)皮或經(jīng)皮膚遞送，參見例如W0 98/20734;W0 98/28037,這些中的每個(gè) 以引用的方式并入本文中）。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種全身性施用的遞 送裝置，其預(yù)先填充本發(fā)明的疫苗組合物。
[0110] 本發(fā)明不受施用本發(fā)明的組合物的受試者類型（例如為刺激免疫反應(yīng)(例如為產(chǎn) 生保護(hù)性免疫(例如粘膜和/或全身免疫性）））限制。實(shí)際上，涵蓋多種受試者以受益于本發(fā) 明組合物的施用。在優(yōu)選實(shí)施方案中，受試者是人類。在一些實(shí)施方案中，人類受試者具有 各種年齡(例如成年人、兒童、嬰兒等），已經(jīng)或很可能暴露于微生物(例如大腸桿菌）。在一 些實(shí)施方案中，人類受試者是更可能直接暴露于致病微生物或在暴露于病原體后更可能顯 示疾病征象和癥狀的受試者(例如免疫受抑制的受試者）。在一些實(shí)施方案中，公眾施用(例 如免疫接種)本發(fā)明的組合物(例如以預(yù)防疾病的出現(xiàn)或蔓延）。舉例來說，在一些實(shí)施方案 中，本發(fā)明的組合物和方法將用于免疫接種一組人(例如一個(gè)地區(qū)、城市、州和/或國(guó)家的人 口）以保護(hù)其自身健康(例如預(yù)防或治療疾?。Ｔ谝恍?shí)施方案中，受試者是非人類哺乳動(dòng) 物(例如豬、牛、山羊、馬、綿羊或其它家畜；或小鼠、大鼠、兔或其它動(dòng)物）。在一些實(shí)施方案 中，本發(fā)明的組合物和方法用于研究背景中（例如研究動(dòng)物）。
[0111] 本發(fā)明的組合物可以調(diào)配用于通過任何途徑施用，例如粘膜、口腔、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、腸 胃外或本文中描述的其它途徑。組合物可以呈任一種或多種不同形式，包括(但不限于)錠 劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、□含錠、泡沫劑、乳膏劑或液體制劑。
[0112] 本發(fā)明的局部調(diào)配物可以呈例如軟膏劑、乳膏劑或洗劑、泡沫劑和氣溶膠形式呈 現(xiàn)，且在軟膏劑和乳膏劑中可含有適當(dāng)?shù)某Ｒ?guī)添加劑，例如防腐劑、溶劑(例如幫助滲透)和 潤(rùn)滑劑。
[0113] 局部調(diào)配物也可以包括增強(qiáng)活性成分滲透穿過皮膚的試劑。示例性試劑包括N-(羥乙基)吡咯烷酮與細(xì)胞包膜紊亂化合物的二元組合、與亞砜或氧化膦組合的糖酯和蔗糖 單油酸酯、癸基甲基亞砜和醇。
[0114] 其它增加皮膚滲透的示例性材料包括表面活性劑或潤(rùn)濕劑，包括(但不限于)聚氧 乙稀脫水山梨糖醇單油酸酯(Polysorbate 80);脫水山梨糖醇單油酸酯(Span 80);對(duì)異辛 基聚氧乙稀-苯酸聚合物(Triton WR-1330);聚氧乙稀脫水山梨糖醇三油酸酯(Tween 85); 硫代丁二酸二辛鈉;和肌氨酸鈉 (Sarcosyl NL-97);和其它藥學(xué)上可接受的表面活性劑。
[0115] 在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，組合物可以進(jìn)一步包含以下一種或多種:醇、含鋅化合 物、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、增稠和/或膠凝劑、中和劑和表面活性劑。用于調(diào)配物中的水優(yōu)選是具 有中性pH值的去離子水。局部調(diào)配物中的其它添加劑包括(但不限于)硅酮油、染料、香料、 pH值調(diào)節(jié)劑和維生素。局部調(diào)配物也可以含有相容的常規(guī)載劑，例如乳膏或軟膏基質(zhì)和用 于洗劑的乙醇或油醇。此類載劑含量可以為調(diào)配物的約1%至約98%。軟膏基質(zhì)可以包含以 下一種或多種:礦脂、礦物油、地蠟、羊毛脂醇、泛醇、甘油、沒藥醇、可可脂等。
[0116] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥學(xué)組合物可以調(diào)配為泡沫且使用。藥學(xué)泡沫包括 調(diào)配物，例如(但不限于)乳液、微乳液、乳膏、膠狀物和脂質(zhì)體。雖然基本上類似，但實(shí)際上 這些調(diào)配物在最終產(chǎn)物的組分和稠度上不同。本發(fā)明的組合物可以另外含有藥學(xué)組合物中 通常發(fā)現(xiàn)的其它輔助組分。因此，舉例來說，組合物可以含有其它相容的藥學(xué)上活性物質(zhì)， 例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑，或可以含有適用于物理調(diào)配本發(fā)明組合物的各 種劑型的其它物質(zhì)，例如染料、調(diào)味劑、防腐劑、抗氧化劑、乳濁劑、增稠劑和穩(wěn)定劑。然而， 此類物質(zhì)在添加時(shí)優(yōu)選不過度干擾本發(fā)明組合物的組分的生物活性。調(diào)配物可以進(jìn)行殺菌 且必要時(shí)與不有害地與免疫原或調(diào)配物的其它組分相互作用的助劑(例如潤(rùn)滑劑、防腐劑、 穩(wěn)定劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩沖劑、著色劑、調(diào)味劑和/或芳香族物質(zhì)等)混 合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的免疫刺激組合物呈藥學(xué)上可接受的鹽形式施用。當(dāng)使用 時(shí)，鹽應(yīng)所述是藥學(xué)上可接受的，但非藥學(xué)上可接受的鹽宜用以制備其藥學(xué)上可接受的鹽。 此類鹽包括(但不限于）由以下酸制備的鹽:鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、順丁烯二酸、乙 酸、水楊酸、對(duì)甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲烷磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯 磺酸。此外，此類鹽可以制備為堿金屬或堿土金屬鹽，例如羧酸基的鈉、鉀或鈣鹽。
[0117] 適合的緩沖劑包括(但不限于）乙酸和鹽（l-2%w/v);檸檬酸和鹽（l-3%w/v);硼 酸和鹽(0.5-2.5 % w/v);以及磷酸和鹽(0.8-2 %w/v)。適合的防腐劑可以包括氯化苯甲烴 銨(0.003-0.03%w/v);氯代丁醇(0.3-0.9%w/v);對(duì)羥基苯甲酸酯(0.01-0.25%w/v)和硫 柳汞（0.004-0.02 % w/v)。
[0118] 在一些實(shí)施方案中，疫苗組合物與一種或多種抗生素共同施用。舉例來說，一種或 多種抗生素可以與組合物一起、在其施用前和/或后施用。本發(fā)明不受共同施用的抗生素的 類型限制。實(shí)際上，多種抗生素可以共同施用，包括(但不限于)內(nèi)酰胺抗生素、青霉素(例 如天然青霉素、氨基青霉素、耐青霉素酶的青霉素、羧基青霉素、脲基青霉素）、頭孢菌素(第 一代、第二代和第三代頭孢菌素)和其它內(nèi)酰胺(例如亞胺培南、單酰胺環(huán)類）、β_內(nèi)酰胺 酶抑制劑、萬古霉素、氨基糖苷類和放線壯觀素、四環(huán)素、氯胺苯醇、紅霉素、林肯霉素、氯林 肯霉素、利福平、甲硝噠唑、多粘菌素、強(qiáng)力霉素、喹諾酮(例如環(huán)丙沙星）、磺酰胺、三甲氧芐 二氨嘧啶和喹啉。
[0119] 存在大量抗微生物劑現(xiàn)用于治療細(xì)菌、真菌和病毒感染。關(guān)于此類藥物的一般類 別和其作用機(jī)制的綜論，熟練技工參考Go〇dman&Gi 1 man的〃The Pharmacological Basis of Therapeutics〃編輯Hardman等人，第9版，Pub .McGraw Hill，第43章至第50章，1996，（以 引用的方式整體并入本文中）。一般地，這些試劑包括抑制細(xì)胞壁合成的試劑(例如青霉素、 頭孢菌素、環(huán)絲氨酸、萬古霉素、桿菌肽）；和咪唑抗真菌劑(例如霉康唑、酮康唑和克霉唑）； 直接起作用以破壞微生物細(xì)胞膜的試劑(例如清潔劑，例如多粘菌素 B和甲磺酸粘菌素，和 抗真菌劑制霉菌素和兩性霉素 B);影響核蛋白體亞單位以抑制蛋白質(zhì)合成的試劑(例如氯 胺苯醇、四環(huán)素、紅霉素和氯林肯霉素）；改變蛋白質(zhì)合成并引起細(xì)胞死亡的試劑(例如氨基 糖苷類）；影響核酸代謝的試劑(例如利福霉素和喹諾酮）；抗代謝物(例如三甲氧芐二氨嘧 啶和磺酰胺）；以及用以抑制對(duì)DNA合成而言不可或缺的病毒性酶的核酸類似物，例如疊氮 胸苷、根賽洛韋(gangcyclovir)、阿糖腺苷和無環(huán)鳥苷?？梢圆捎每刮⑸锏母鞣N組合。
[0120] 本發(fā)明還包括涉及共同施用疫苗組合物的方法，疫苗組合物包含免疫原與一種或 多種其它活性和/或免疫刺激劑(例如包含不同免疫原、抗生素、抗氧化劑等的組合物）。實(shí) 際上，本發(fā)明的另一個(gè)方面提供通過共同施用本發(fā)明的組合物，用于增強(qiáng)現(xiàn)有技術(shù)免疫刺 激方法(例如免疫接種方法)和/或藥學(xué)組合物的方法。在共同施用程序中，試劑可以同時(shí)或 連續(xù)施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中描述的組合物在其它活性劑之前施用。藥學(xué)調(diào)配物和 施用模式可以是本文中描述的任一調(diào)配物和模式。另外，兩種或超過兩種共同施用藥劑可 以各使用不同的模式(例如途徑)或不同調(diào)配物施用。有待共同施用的其它藥劑(例如抗生 素、佐劑等）可以是本領(lǐng)域中眾所周知的任一藥劑，包括(但不限于）目前臨床使用中的藥 劑。
[0121] 在一些實(shí)施方案中，包含免疫原的組合物經(jīng)由超過一個(gè)途徑施用于受試者。舉例 來說，將得益于具有對(duì)病原微生物的保護(hù)性免疫反應(yīng)(例如免疫性)的受試者可以得益于接 受粘膜施用（例如鼻施用或本文中描述的其它粘膜途徑)和另外得益于接受一種或多種其 它施用途徑(例如腸胃外或肺施用（例如經(jīng)由噴霧器、吸入器或本文中描述的其它方法））。 在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，經(jīng)由粘膜途徑施用足以誘導(dǎo)對(duì)免疫原或免疫原所來源于的生物體 的粘膜免疫性以及全身免疫性。在其它實(shí)施方案中，經(jīng)由多個(gè)途徑施用用來提供粘膜免疫 性與全身免疫性。因此，雖然實(shí)踐本發(fā)明無需理解機(jī)制且本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī) 制，但在一些實(shí)施方案中，預(yù)期經(jīng)由多個(gè)施用途徑(例如免疫接種(例如粘膜以及氣道或腸 胃外施用組合物））施用本發(fā)明組合物的受試者可以比僅僅經(jīng)由一個(gè)途徑施用組合物的受 試者具有更強(qiáng)的對(duì)免疫原的免疫反應(yīng)。
[0122] 其它遞送系統(tǒng)可以包括時(shí)間釋放、延遲釋放或持續(xù)釋放的遞送系統(tǒng)。此類系統(tǒng)可 以避免重復(fù)施用組合物，增加受試者和醫(yī)師的便利。許多類型釋放遞送系統(tǒng)可為一般技術(shù) 者使用和已知。其包括基于聚合物的系統(tǒng)，例如聚（丙交酯-乙交酯）、共聚乙二酸酯、聚己酸 內(nèi)酯、聚酰胺酯、聚原酸酯、聚羥基丁酸和聚酐。含有上述聚合物的藥物的微膠囊描述于例 如以引用的方式并入本文中的美國(guó)專利號(hào)5,075,109。遞送系統(tǒng)還包括非聚合物系統(tǒng)，即： 脂質(zhì)，包括固醇，例如膽固醇、膽固醇酯和脂肪酸或中性脂肪，例如單酸甘油酯、二酸甘油酯 和三酸甘油酯;水凝膠釋放系統(tǒng);sylastic系統(tǒng);基于肽的系統(tǒng);蠟質(zhì)涂層;使用常規(guī)的粘合 劑和賦形劑的壓制片;部分融合的植入物等等。特定實(shí)例包括(但不限于）：（a)侵蝕系統(tǒng)，其 中本發(fā)明的藥劑呈基質(zhì)內(nèi)的形式，例如各以引用的方式并入本文中的美國(guó)專利號(hào)4,452， 775、4,675，189和5,736，152中描述的系統(tǒng);和(13)擴(kuò)散系統(tǒng)，其中活性組分以控制速率自聚 合物滲透，例如各以引用的方式并入本文中的美國(guó)專利號(hào)3,854,480、5，133,974和5,407， 686中描述。另外，可以使用基于栗的硬件遞送系統(tǒng)，其中一些適宜植入。
[0123] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的疫苗組合物以濃縮劑量調(diào)配，可以在施用于受試者 前稀釋。舉例來說，濃縮組合物的稀釋液可以施用于受試者，使得受試者接受本文中提供的 特定劑量的任一個(gè)或更多個(gè)。在一些實(shí)施方案中，濃縮組合物的稀釋可以使得向受試者施 用(例如單劑)包含〇. 5 % -50 %納米乳液和存在于濃縮組合物中的免疫原的組合物。涵蓋濃 縮組合物適用于大量受試者可以施用本發(fā)明組合物的背景中（例如免疫接種門診、醫(yī)院、學(xué) 校等）。在一些實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的免疫原的組合物(例如濃縮組合物)在室溫下穩(wěn)定 超過1周，在一些實(shí)施方案中，超過2周，在一些實(shí)施方案中，超過3周，在一些實(shí)施方案中，超 過4周，在一些實(shí)施方案中，超過5周，且在一些實(shí)施方案中，超過6周。
[0124] 在一些實(shí)施方案中，初始施用本發(fā)明的組合物(例如初始免疫接種）后，受試者可 以在第一次、第二次、第三次、第四次、第五次、第六次、第七次、第八次、第九次、第十次和/ 或超過第十次施用后接受一或多次加強(qiáng)施用（例如約2周、約3周、約4周、約5周、約6周、約7 周、約8周、約10周、約3個(gè)月、約4個(gè)月、約6個(gè)月、約9個(gè)月、約1年、約2年、約3年、約5年、約10 年）。雖然實(shí)踐本發(fā)明無需理解機(jī)制且本發(fā)明不限于任何特定的作用機(jī)制，但在一些實(shí)施方 案中，加強(qiáng)劑量中免疫原的再次引入使受試者中能夠具有有力的全身免疫性。強(qiáng)化可以用 針對(duì)初次免疫反應(yīng)所給的相同調(diào)配物，或可以用含有免疫原的不同調(diào)配物。給藥方案還將 至少部分地由受試者的需要確定并取決于從業(yè)者的判斷。
[0125] 劑量單位可以基于若干因素(包括(但不限于)受試者的體重、年齡和健康狀態(tài))成 比例地增加或減少。另外，隨后施用(例如加強(qiáng)施用）的劑量單位可以增加或減少。
[0126] 預(yù)期本發(fā)明的組合物和方法將用于各種背景，包括研究背景。舉例來說，本發(fā)明的 組合物和方法還用于免疫系統(tǒng)的研究（例如適應(yīng)性免疫反應(yīng)例如保護(hù)性免疫反應(yīng)(例如粘 膜或全身免疫性））的表征）。本發(fā)明提供的組合物和方法的用途涵蓋人類和非人類受試者 和來自那些受試者的樣品，以及涵蓋使用這些受試者的研究應(yīng)用。本發(fā)明的組合物和方法 還適用于研究和最佳化白蛋白的變體、免疫原和其它組分以及用于篩選新的組分。因此，不 意圖本發(fā)明限于任何特定的受試者和/或應(yīng)用背景。
[0127] 本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本文中包含的疫苗組合物的試劑盒。在一些實(shí)施方案中， 試劑盒包括施用疫苗必需、足夠或適用的所有組分。舉例來說，在一些實(shí)施方案中，試劑盒 包含用于施用疫苗的裝置(例如針或其它注射裝置）、溫度控制組件(例如冷凍或其它冷卻 組件）、衛(wèi)生組件(例如用于衛(wèi)生處理注射部位的酒精拭子）以及用于施用疫苗的說明書。
[0128] 實(shí)施例1
[0129] 白蛋白的變體的工程化
[0130] 材料與方法
[0131] 編碼白蛋白的變體的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0132] pcDNA3載體（Invitrogen)用于克隆與編碼GST的cDNA區(qū)段融合的編碼小鼠和人類 白蛋白的變體的cDNA。如先前描述，所有載體還編碼埃-巴二氏病毒復(fù)制起點(diǎn)（OriP) (Andersen等人，Clinical biochemistry 43,367_372(2010) ;Berntzen，等人Journal of immunological methods 298,93-104(2005))。編碼MSA和HSA基因（表 1)的cDNA片段均排序 且在來自GenScript Inc(NJ，USA)的pUC57載體中獲得。pUC57載體側(cè)接限制性位點(diǎn)HindllI 和Xhol。編碼氨基酸（（GGS)4GG)的甘氨酸-絲氨酸(GS)段的DNA序列在N端融合GST序列。先 前已經(jīng)描述載體 pcDNA3-HSAwt_GST-〇riP 和pcDNA3-HSAbartin_GST-〇riP( Andersen 等人， 2010,上文）。
[0133] 白蛋白的變體的產(chǎn)生
[0134] 使用聚乙稀亞胺（PEIMax ;MW 4000; Polysciences，Inc，Warrington)將附著 HEK293E細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞在T175瓶子（50ml)中生長(zhǎng)至95%匯合。將62.5yg質(zhì) 粒DNA與3 · 75ml OptiMEM培養(yǎng)基（Invitrogen)(溶液 1)和25μ1 PEI-MAX(6 · 45mg/ml)和 3.75ml dH20混合。接著混合溶液1和2,接著在室溫下培育30分鐘，接著混合物添加至接種 細(xì)胞中。每隔一天收獲上清液，多達(dá)轉(zhuǎn)染后12天。
[0135] GSTrap FF柱（GE Healthcare，UK)用以純化GST標(biāo)記的MSA和HSA變體。柱與 BioLogic工作站和記錄儀(BI0-RAD)親接，且根據(jù)制造商的方案進(jìn)行純化。簡(jiǎn)單地說，100ml lx PBS/0.05%疊氮化鈉 （pH 7.2)用以預(yù)先平衡柱，接著上清液用0.22以111真空過濾器 (Corning)無菌過濾，其中0.05%疊氮化鈉以1 -2ml/miη的流速施加。接著，200ml 1X PBS/ 0.05%疊氮化物用于沖洗非特異性結(jié)合。用在50禮1^8-!1(：1化!18.0)中稀釋的50111110111]\1 還原麩胱甘肽（3丨811^-41(11'；[011)洗脫結(jié)合的631'融合物。使用4111；[00111]11:^-10管柱 (Mi 11 ipore)，收集洗脫部分，濃縮，且緩沖液轉(zhuǎn)變?yōu)閘x roS/0.05%疊氮化物。所有洗脫份 儲(chǔ)存在-20 °C下，濃度為0.5-lmg/ml。將柱洗滌且儲(chǔ)存在20 %乙醇中4°C下。
[0136] 小鼠和人類FcRn的產(chǎn)生
[0137] 基本上如先前描述，截短的單體的His標(biāo)記的小鼠和人類FcRn (mFcRn和hFcRn)使 用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)產(chǎn)生（Kim等人，European journal of immunology 29,2819-2825( 1999) ;Popov，S.等人Molecular immunology 33,521-530(1996))。使用供有Ni2+離子 的HisTrap HP柱(GE Healthcare，UK)純化受體。在使用前，柱用含有0.05%疊氮化鈉的lx PBS預(yù)先平衡。上清液的pH值用lx PBS/0.05%疊氮化鈉 (pH 10.9)調(diào)整至pH 7.2,接著以 5ml min-1的流速施加于HisTrap HP柱。用200ml lx PBS和50ml 25mM咪唑/lx PBS先后洗滌 后，用5〇111125〇111]\1咪唑/11?85化!17.2-7.4)洗脫結(jié)合的受體。使用4111丨(^〇111]1杜3-10柱 (Mi 11 ipore)，將蛋白質(zhì)濃縮且緩沖液轉(zhuǎn)變?yōu)閘x PBS，接著遵循制造方案，施加在HiLoad 26/600Superdex 200制備級(jí)柱(GE Healthcare)上。將洗脫份匯集并使用Amicon Ultra柱 (Mi 11 ipore)濃縮且儲(chǔ)存在4 °C下。
[0138] 酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)
[0139] 兔 IgG(10μg/ml)(Southern Biotech)涂布在微量滴定孔(Nunc)中，且在 4°C 下培 育過夜。接著在室溫下將孔用PBS/4%脫脂乳阻斷1小時(shí)，且在PBS/0.005%Tween20(PBS/T) pH 6.0中洗滌4次?？扇躮FcRn或hFcRn (20μg/ml)在PBS/T/4 %脫脂乳pH 6.0中稀釋，添加至 孔且在室溫下培育1.5小時(shí)，接著如上所述洗滌。隨后，在室溫下GST標(biāo)記的白蛋白的變體(5 μg/ml)在PBS/T/4%脫脂乳pH 6.0中稀釋且添加至孔，歷時(shí)2小時(shí)。如上洗滌后，添加在ros/ T/4%脫脂乳pH 6 · 0中稀釋（1:4000)的辣根過氧化酶結(jié)合的抗-GST抗體(GE Healthcare) 且培育1小時(shí)。隨后，如上洗滌孔且使用四甲基對(duì)聯(lián)苯胺底物(Calbiochem)檢測(cè)結(jié)合的白蛋 白的變體。添加1〇〇μ1 1M HC1后使用Sunrise光譜儀(TECAN)，在450nm下測(cè)量吸光度。
[0140]表面等離子體共振(SPR)
[0141] 在 BIAcore 3000 儀器（GE Healthcare)上進(jìn)行 SPR 實(shí)驗(yàn)，且胺偶合（GE Healthcare)用于固定CM5芯片上GST融合的白蛋白的變體。基本上如制造商描述，注射10mM 乙酸鈉 pH 5.0(GE Healthcare)中2μg/ml的每一個(gè)。芯片表面上未反應(yīng)的部分用1M乙醇胺 阻斷。用磷酸鹽緩沖液(67臟磷酸鹽緩沖液、0.151恥(：1、0.005%了￥661120，在?!16.0或7.4 下)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以操作或稀釋樣品。通過在25 °C下在pH 6.0或7.4下將單體His標(biāo)記的hFcRn (1.0-0.015以1〇注射在固定的白蛋白的變體上進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，流速為5(^171^11。動(dòng)力學(xué)速 率數(shù)值使用BIAevaluation 4.1軟件提供的簡(jiǎn)單的朗繆爾1:1配體結(jié)合模型計(jì)算。在所有親 和力估計(jì)中，通過統(tǒng)計(jì)數(shù)值x2(表示平均平方)描述的擬合密集度低于2.0。為校正非特異性 結(jié)合和整體緩沖作用，每個(gè)相互作用曲線減去從對(duì)照CM5表面和空白注射中獲得的結(jié)合反 應(yīng)。
[0142] T84轉(zhuǎn)胞吞分析
[0143] 人類上皮細(xì)胞系T84(ATCC)維持于達(dá)伯克改良伊格爾培養(yǎng)基DMEM(Invitrogen)和 HAM的F-12培養(yǎng)基（1:1) (Invitrogen)中，供有10%熱失活FBS、2mM Lg和50U/ml PS(均來自 Bio-Wittaker)。細(xì)胞在37 °C下在濕潤(rùn)的5 %C02、95%空氣培育箱中培育。具有PTFE膜和0.4 譲孔徑的Transwell過濾器（1.12cm2) (Corning Costar，MA，USA)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培育過 夜，接著1. 〇 X 1〇6個(gè)細(xì)胞/孔接種。每日使用MILLICELL-ERS伏特歐姆儀(MILLIP0RE)測(cè)量跨 膜電阻(TER)。細(xì)胞培養(yǎng)4-6天，接著到達(dá)1000-1500 Ω X cm2的TER值。生長(zhǎng)培養(yǎng)基每日交換。
[0144] 在實(shí)驗(yàn)前，洗滌T84單層，且在漢氏HBSS緩沖液（Invitrogen)中培育1小時(shí)。為測(cè)量 頂部至基底外側(cè)輸送，200μ1標(biāo)準(zhǔn)化的HSA變體(20-30μg/ml)添加至頂面，接著在0和4小時(shí) 從具有500μ1 HBSS緩沖液的基底外側(cè)儲(chǔ)集器取樣400μ1培養(yǎng)基。
[0145]表1.編碼白蛋白的變體的構(gòu)建載體
[0148] 結(jié)果
[0149]制備一系列在C端DIII內(nèi)具有單點(diǎn)突變的與hFcRn的結(jié)合增加或減少的工程化HSA 變體。此類HSA變體基于對(duì)hFcRn-HSA復(fù)合物的對(duì)接模型的檢查構(gòu)建(Andersen等人，Nature communications 3,610 2012)。這里，將突變選擇引入HSA的Dili中以研究單點(diǎn)突變或者突 變組合如何影響與hFcRn的結(jié)合。另外，一些突變變體與I523G組合(W0201211218A1;以引用 的方式整體并入本文中）。
[0150] 將以下5個(gè)單一突變體以及10個(gè)這些突變(如表1中列出）引入HSA的Dili中；E505Q (EQ)、T527M(TM)、I523G(IG)、K573Y(KY)和K573P(KP)。除制備WT HSA外，基于先前顯示極大 地減少與hFcRn結(jié)合的兩點(diǎn)突變的組合，制備雙重突變體K500A/H510Q(KA/HQ)(Andersen等 人，2012，上述）。突變氨基酸在圖2中HSA的晶體結(jié)構(gòu)圖解中突出顯示。
[0151] 圖2展示HSA的晶體結(jié)構(gòu)。HSA的Dili內(nèi)突變的氨基酸位置的結(jié)構(gòu)位置。該圖展示 HSA的整個(gè)結(jié)構(gòu)構(gòu)造。DI-DII和Dili分別以灰色和淺灰色展示，而突變的位置以有色球突出 顯示，K500A(KA)、H510Q(HQ) (KA/HQ)、E505Q(EQ)、T527M(TM) I523G( IG)、K573Y(KY)和K573P (KP)。使用關(guān)于HSA5的結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)和程序PyMOL制成圖解。
[0152] 圖3展示用于構(gòu)建具有C端融合抗原的白蛋白的克隆卡匣的示意性概述。編碼全長(zhǎng) 白蛋白的cDNA亞克隆至限制性位點(diǎn)Hindlll和Xhol中，而僅僅編碼Dili區(qū)段的cDNA片段亞 克隆至限制性位點(diǎn)BamHI和Xho I上。BamHI限制性位點(diǎn)通過沉默突變引入白蛋白cDNA序列中 以允許Dili亞克隆。在cDNA編碼白蛋白與融合GST蛋白質(zhì)之間引入GS-連接子序列。編碼抗 原的cDNA亞克隆至限制性位點(diǎn)Xho I和Apal上。
[0153] 圖4展示純化的白蛋白-GST變體的SDS-PAGE分析。（A)HSA-GST變體和(MSA-GST變 體）的代表性非還原SDS-PAGE凝膠分析。3yg每種變體施加在凝膠上。HSA和MSA變體通過 HEK293E細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生。除全長(zhǎng)變體外，包括先前展示不結(jié)合hFcRnl的缺乏幾乎全部 Dili的截短HSA變體(Bartin)。在施加至GSTrap FF柱前將收獲的上清液匯集和過濾。使用 非還原SDS-PAGE，接著考馬斯染色，分析純化變體的完整性。除在約70kDa的分子量下迀移 的HSA Bartin外，所有變體都迀移為對(duì)應(yīng)于100-llOkDa的主要色帶，都與預(yù)期分子量一致。 [0154]為比較在酸性pH值下白蛋白融合物的結(jié)合能力，將滴定量的標(biāo)準(zhǔn)化HSA GST變體 添加至捕捉在兔IgG上的hFcRn，且結(jié)合的白蛋白的變體使用來自山羊的HRP結(jié)合的抗-GST 抗體檢測(cè)（圖5A至圖?)。計(jì)算與hFcRn的結(jié)合，其中WT HSA的結(jié)合被設(shè)定成1.0 (圖5C)。在單 點(diǎn)突變體中，EQ、IG和TM展示結(jié)合中度改善，比WT多2-3倍，接著為KP和KY，其比WT結(jié)合強(qiáng)烈5 倍。組合兩或三個(gè)突變引起結(jié)合進(jìn)一步增加，其中突變體KP/IG、KY/EQ/TM和KY/IG/TM展示 與KY/IG和KP/IG/TM之后KY相比，結(jié)合略微提高，而檢測(cè)到KY/TM、KP/TM和KP/EQ/TM結(jié)合最 強(qiáng)烈，展示結(jié)合強(qiáng)度提高6倍。因此，在單一突變體中，KY和KP結(jié)合最強(qiáng)烈，而這些與TM和EQ 的組合得到最佳結(jié)合劑。
[0155] 為比較在酸性pH值下白蛋白融合物的結(jié)合能力，將滴定量的標(biāo)準(zhǔn)化MSA和HSA-GST 變體添加至捕捉在兔IgG上的hFcRn(圖6A)和mFcRn(圖6B至圖6D)，且結(jié)合的白蛋白的變體 使用來自山羊的HRP結(jié)合的抗-GST抗體檢測(cè)。
[0156] 計(jì)算與hFcRn(圖6A)和mFcRn(圖6B至圖6D)的結(jié)合，其中WT MSA的結(jié)合被設(shè)定成 1.0(圖7) IP展示與hFcRn的結(jié)合比MSA強(qiáng)烈3倍，且該受體與MSA結(jié)合比與HSA結(jié)合更強(qiáng)烈。 HSA和MSA KA/HQ突變體不結(jié)合于hFcRn或mFcRn。另外，未檢測(cè)到mFcRn對(duì)HSA的結(jié)合。在單點(diǎn) 突變體中，它們中無一個(gè)與mFcRn的結(jié)合比MSA強(qiáng)，而KP與IG的組合引起結(jié)合中度提高，比WT MSA多2倍。此外，以下組合KP/TM、KP/IG/TM和KP/EQ/TM與WT MSA相比，相對(duì)結(jié)合提高4-6倍。
[0157] 感測(cè)器圖譜（圖8)展示在酸性pH值下與hFcRn的結(jié)合差異大。結(jié)合曲線與1:1結(jié)合 模型擬合且推導(dǎo)的結(jié)合動(dòng)力學(xué)在表2中列出。這里，與GST的融合展示對(duì)與hFcRn的結(jié)合的負(fù) 面影響極小，與先前結(jié)果一致(Andersen等人，J Biol Chem. 2013年8月16日；288(33): 24277-85 hEQ和IG突變體展示與hFcRn的結(jié)合超過WT對(duì)應(yīng)物6倍，而IA結(jié)合幾乎與這些突變 體一樣好。此外，KP突變體結(jié)合提供14倍，而三重突變體EQ/TM/KP展示最大提高，對(duì)應(yīng)于超 過180倍。
[0158] 完全確定FcRn跨越上皮屏障輸送IgG的能力（Dickinson等人，1999 ;McCarthy等 人，2000)。然而，尚未證明在上皮細(xì)胞中表達(dá)的FcRn是否可以輸送HSA。因此，為研究HSA是 否可以通過FcRn依賴性方式跨越表達(dá)內(nèi)源性hFcRn的上皮層輸送，使用Tanswel 1系統(tǒng)測(cè)量 FcRn介導(dǎo)的IgG輸送。首先，將WT HSA與KA/HQ比較，且將等量的這些添加至Transwe 11系統(tǒng) 的頂部?jī)?chǔ)集器，其中人類上皮細(xì)胞系T84生長(zhǎng)為極化單層。在添加至頂面后的時(shí)間點(diǎn)0和4小 時(shí)從基底外側(cè)儲(chǔ)集器處收集樣品。使用ELISA定量輸送的HSA融合物，其中融合物捕捉在抗-GST抗體上且使用HRP結(jié)合的抗-HSA抗體檢測(cè)結(jié)合的融合物。檢測(cè)到輸送功效的顯著差異， 因?yàn)閃T融合物輸送比缺乏與hFcRn的結(jié)合的雙重突變體多5倍（圖9)。因此，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支 持在人類上皮中表達(dá)的FcRn能夠跨越細(xì)胞層將HSA轉(zhuǎn)胞吞。
[0159] 接著，評(píng)估與hFcRn的結(jié)合提高的HSA變體是否比其WT對(duì)應(yīng)物轉(zhuǎn)胞吞更有效。發(fā)現(xiàn) 與WT相比，單一KP突變的引入增加輸送功效幾乎3倍(圖9)。
[0160] 表2.
[0162] 實(shí)施例2
[0163] 制備在C端Dili內(nèi)具有單點(diǎn)突變的各與hFcRn的結(jié)合增加的工程化HSA變體。HSA變 體基于對(duì)hFcRn-HSA復(fù)合物1和V547的對(duì)接模型的檢查構(gòu)建（如Eleven Biopharmaceuticals(WO 2013075066A2)描述）。這里，將突變組合引入HSA的Dili中以研究 其如何影響與hFcRn的結(jié)合。
[0164] 材料與方法
[0165] 編碼白蛋白的變體的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0166] pcDNA3載體（Invitrogen)用于克隆與編碼GST的cDNA融合的編碼人類血清白蛋白 的變體的cDNA。所有載體還編碼埃-巴二氏病毒復(fù)制起點(diǎn)（OriP)，如先前描述(Andersen等 人，2010，上文;Berntzen等人，上文）。編碼HSA基因的cDNA片段均排序且在來自GenScript Inc(NJ，USA)的pUC57載體中獲得。pUC57載體側(cè)接限制性位點(diǎn)Hindlll和Xhol。編碼氨基酸 ((GGS)4GG)的甘氨酸-絲氨酸（GS)段的DNA序列在N端融合GST序列。先前已經(jīng)描述載體 pcDNA3-HSAwt-GST-〇riP(Andersen等人，2010，上文）。
[0167] 白蛋白的變體的產(chǎn)生
[0168] 使用聚乙稀亞胺（PEIMax ;MW 4000; Polysciences，Inc，Warrington)將附著 HEK293E細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞在T175瓶子（50ml)中生長(zhǎng)至95%匯合。將62.5yg質(zhì) 粒DNA與3 · 75ml OptiMEM培養(yǎng)基（Invitrogen)(溶液 1)和25μ1 PEI-MAX(6 · 45mg/ml)和 3.75ml dH20混合。接著混合溶液1和2,接著在室溫下培育30分鐘，接著混合物添加至接種 細(xì)胞中。每隔一天收獲上清液，多達(dá)轉(zhuǎn)染后12天。
[0169] GSTrap FF柱（GE Healthcare，·)用以純化GST標(biāo)記的HSA變體。柱與BioLogic工 作站和記錄儀(BI0-RAD)耦接，且根據(jù)制造商的方案進(jìn)行純化。簡(jiǎn)單地說，100ml lx PBS/ 0.05%疊氮化鈉 (pH 7.2)用以預(yù)先平衡柱，接著上清液用0.22μηι真空過濾器(Corning)無 菌過濾，其中0.05%疊氮化鈉以l-2ml/min的流速施加。接著，200ml lx PBS/0.05%疊氮化 物用于沖洗非特異性結(jié)合。用在50mM Tris-HCl(pH 8.0)中稀釋的50ml 10mM還原麩胱甘肽 (Sigma-Aldrich)洗脫結(jié)合的HSA GST融合物。使用Amicon Ultra-10管柱(Millipore)，收 集洗脫部分，濃縮，且緩沖液轉(zhuǎn)變?yōu)?X TOS/0.05%疊氮化物。所有洗脫份儲(chǔ)存在-20°C下， 濃度為ο. 5-lmg/ml。將柱洗滌且儲(chǔ)存在20 %乙醇中4°C下。
[0170] 人類FcRn的產(chǎn)生
[0171] 基本上如先前描述，截短的單體的His標(biāo)記的人類FcRn(hFcRn)使用桿狀病毒表達(dá) 載體系統(tǒng)產(chǎn)生(Kim等人，上文;Popov等人，上文）。使用供有Ni 2+離子的HisTrap HP柱(GE HealthCare，UK)純化受體。在使用前，柱用含有0.05%疊氮化鈉的lx PBS預(yù)先平衡。上清液 的口!1值用11?83/0.05%疊氮化鈉(?!110.9)調(diào)整至?!17.2，接著以511111^11_ 1的流速施加于 HisTrap HP柱。用200ml lx PBS和50ml 25mM咪唑/lx PBS先后洗滌后，用50ml 250mM咪唑/ lx PBS(pH 7.2-7.4)洗脫結(jié)合的受體。使用Amicron Ultra-10柱(Millipore)，將蛋白質(zhì)濃 縮且緩沖液轉(zhuǎn)變?yōu)閘x PBS，接著遵循制造方案，施加在HiLoad 26/600Superdex 200制備級(jí) 柱(GE Heal thcare)上。將洗脫份匯集并使用Ami con U1 tra柱(Mi 11 ipore)濃縮且儲(chǔ)存在4 。(:下。
[0172] 表面等離子體共振(SPR)
[0173] 在 BIAcore 3000 儀器（GE Healthcare)上進(jìn)行 SPR 實(shí)驗(yàn)，且胺偶合（GE Healthcare)用于固定CM5芯片上GST融合的HSA?；旧先缰圃焐堂枋?，注射10mM乙酸鈉 pH 5.0(GE Heal thcare)中2μg/ml的每一個(gè)。芯片表面上未反應(yīng)的部分用1M乙醇胺阻斷。用磷 酸鹽緩沖液(67mm磷酸鹽緩沖液、0.15M NaCl、0.005 % Tween 20,在pH 6.0或7.4下)進(jìn)行實(shí) 驗(yàn)，以操作或稀釋樣品。通過在25°C下在pH 6.0下將單體His標(biāo)記的hFcRn(1.0-0.015μΜ)注 射在固定的HSA上進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，流速為50μ1/π?η。動(dòng)力學(xué)速率數(shù)值使用BIAevaluation 4.1軟件提供的簡(jiǎn)單的朗繆爾1:1配體結(jié)合模型計(jì)算。在所有親和力估計(jì)中，通過統(tǒng)計(jì)數(shù)值 x2(表示平均平方)描述的擬合密集度低于2.0。為校正非特異性結(jié)合和整體緩沖作用，每個(gè) 相互作用曲線減去從對(duì)照CM5表面和空白注射中獲得的結(jié)合反應(yīng)。
[0174] 結(jié)果
[0175] 表3. HSA DII突變體對(duì)于hFcRn的結(jié)合動(dòng)力學(xué)
[0177] HSA變體固定(約500RU)在芯片上并注射hFcRn的連續(xù)稀釋液。使用簡(jiǎn)單的一階（1: 1)雙分子相互作用模型，獲得動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)。動(dòng)力學(xué)值表示三個(gè)值的平均值。結(jié)果展示于 表3和圖10中。
[0178] 在pH 6.0下，與K573P組合的V547A與WT HSA相比，KD提高超過200倍，且其結(jié)合很 依賴于pH值。
[0179] 與E505Q、T527M和K573P組合的V547A與WT HSA相比，KD提高超過1400倍，但其結(jié)合 不太依賴于pH值。
[0180] 靶向的氨基酸殘基在圖2中HSA的晶體結(jié)構(gòu)圖解中突出顯示。
[0181] 實(shí)施例3
[0182] 具有改變的與hFcRn的結(jié)合的HSA變體的設(shè)計(jì)
[0183]已經(jīng)制備一系列在C端Dili內(nèi)具有單點(diǎn)突變的與hFcRn的結(jié)合增加或減少的工程 化HSA變體。此類HSA變體基于對(duì)hFcRn-HSA復(fù)合物的對(duì)接模型的檢查構(gòu)建(Andersen等人， Nature communications 3,610 2012)。這里，將突變選擇引入HSA的Dili中以研究單點(diǎn)突 變或者突變組合如何影響與hFcRn的結(jié)合。另外，一些突變變體與I523G或V547A組合 (W0201211218A1和WO 2013075066A2;以引用的方式整體并入本文中）。
[0184] 將以下六個(gè)單一突變體以及這些突變的10個(gè)組合（如表4中列出）引入HSA的組合 Dili 中：E505Q(EQ)、T527M(TM)、I523G(IG)、V547A(VA)、K573Y(KY)和 K573P(KP)。除制備 WT HSA外，基于先前顯示極大地減少與hFcRn結(jié)合的兩點(diǎn)突變的組合，制備雙重突變體Κ500Α/ H510Q(KA/HQ)(AnderSen等人，2012,上文）。突變氨基酸在圖2中HSA的晶體結(jié)構(gòu)圖解中突出 顯不〇
[0185] 表4.編碼白蛋白GST變體的構(gòu)建載體
[0187] 編碼HSA變體的表達(dá)載體的構(gòu)建
[0188] pcDNA3載體（Invitrogen)用于克隆與編碼GST標(biāo)簽的cDNA融合的編碼HSA變體的 cDNA。所有載體還編碼埃-巴二氏病毒復(fù)制起點(diǎn)（OriP)，如先前描述（Andersen等人， Clinical biochemistry 43,367_372;Berntzen等人，（2005)Journal of immunological methods 298,93-104)。編碼HSA基因的cDNA片段均排序且在來自GenScript Inc(NJ，USA) 的pUC57載體中獲得。pUC57載體側(cè)接限制性位點(diǎn)Hindlll和Xhol。編碼氨基酸（（GGS)4GG)的 甘氨酸-絲氨酸（GS)段的DNA序列在N端融合GST序列。先前已經(jīng)描述載體pcDNA3-HSAwt-GST-OriP和pcDNA3-HSAbartin-GST-〇riP(Anderson等人，2010，上文） 。
[0189] HSA融合物變體的產(chǎn)生
[0190] 使用聚乙稀亞胺（PEIMax ;MW 4000; Polysciences，Inc，Warrington)將附著 HEK293E細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染前，細(xì)胞在T175瓶子（50ml)中生長(zhǎng)至95%匯合。將62.5yg質(zhì) 粒DNA與3 · 75ml OptiMEM培養(yǎng)基（Invitrogen)(溶液 1)和25μ1 PEI-MAX(6 · 45mg/ml)和 3.75ml dH20混合。接著混合溶液1和2,接著在室溫下培育30分鐘，接著混合物添加至接種 細(xì)胞中。每隔一天收獲上清液，多達(dá)轉(zhuǎn)染后12天。
[0191] GSTrap FF柱（GE Healthcare，·)用以純化GST標(biāo)記的HSA變體。柱與BioLogic工 作站和記錄儀(BI0-RAD)耦接，且根據(jù)制造商的方案進(jìn)行純化。簡(jiǎn)單地說，100ml lx PBS/ 0.05%疊氮化鈉 (pH 7.2)用以預(yù)先平衡柱，接著上清液用0.22μηι真空過濾器(Corning)無 菌過濾，其中0.05%疊氮化鈉以l-2ml/min的流速施加。接著，200ml lx PBS/0.05%疊氮化 物用于沖洗非特異性結(jié)合。用在50mM Tris-HCl(pH 8.0)中稀釋的50ml 10mM還原麩胱甘肽 (Sigma-Aldrich)洗脫結(jié)合的HSA GST融合物。使用Amicon Ultra-10管柱(Millipore)，收 集洗脫部分，濃縮，且緩沖液轉(zhuǎn)變?yōu)?X TOS/0.05%疊氮化物。所有洗脫份儲(chǔ)存在-20°C下， 濃度為〇. 5-lmg/ml。將柱洗滌且儲(chǔ)存在20 %乙醇中4°C下。
[0192] 人類FcRn的產(chǎn)生
[0193] 基本上如先前描述，截短的單體的His標(biāo)記的人類FcRn使用桿狀病毒表達(dá)載體系 統(tǒng)產(chǎn)生（Kim等人，（1999)European journal of immunology 29,2819-2825;Popov等人， (1996)Molecular immunology 33,521-530)。使用供有Ni2+離子的HisTrap HP柱（GE HealthCare，UK)純化受體。在使用前，柱用含有0.05%疊氮化鈉的lx PBS預(yù)先平衡。上清液 的口!1值用11?83/0.05%疊氮化鈉(?!110.9)調(diào)整至?!17.2，接著以511111^11_ 1的流速施加于 HisTrap HP柱。用200ml lx PBS和50ml 25mM咪唑/lx PBS先后洗滌后，用50ml 250mM咪唑/ lx PBS(pH 7.2-7.4)洗脫結(jié)合的受體。使用Amicron Ultra-10柱(Millipore)，將蛋白質(zhì)濃 縮且緩沖液轉(zhuǎn)變?yōu)閘x PBS，接著遵循制造方案，施加在HiLoad 26/600Superdex 200制備級(jí) 柱(GE Heal thcare)上。將洗脫份匯集并使用Ami con U1 tra柱(Mi 11 ipore)濃縮且儲(chǔ)存在4 。(:下。
[0194] 酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)
[0195] 通過在微量滴定孔(Nunc)中用4-羥基-3-碘-5-硝基苯基乙酸（10μg/ml)特異性涂 布抗人類IgGl突變變體，進(jìn)行GST融合的HSA變體(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)的篩 選。盤在4°C下培育過夜，接著在室溫下孔用PBS/4%脫脂乳阻斷1小時(shí)，接著在PBS/T pH 6 · 0中洗滌4次。在室溫下恒定量的Hi s標(biāo)記的hFcRn(20μg/ml)在PBS/T/4 %脫脂乳pH 6 · 0中 稀釋，添加至孔，且培育2小時(shí)，接著如上洗滌孔。隨后，在室溫下5μg/ml GST標(biāo)記的WT HSA 和突變變體在PBS/T/4%脫脂乳pH 6.0中稀釋，且添加至孔，歷時(shí)2小時(shí)。如上洗滌后，接著 添加在PBS/T/4 %脫脂乳pH 6.0中稀釋（1: 3000)的辣根過氧化酶結(jié)合的抗-GST抗體(GE Healthcare)且培育1小時(shí)。洗滌后，使用四甲基對(duì)聯(lián)苯胺底物(Calbiochem)檢測(cè)結(jié)合的HSA 變體。使用Sunr i se光譜儀(TECAN)，在620nm下測(cè)量吸光度。
[0196] 表面等離子體共振(SPR)
[0197] 在 BIAcore 3000 儀器（GE Healthcare)上進(jìn)行 SPR 實(shí)驗(yàn)，且胺偶合（GE Healthcare)用于固定CM5芯片上GST融合的HSA變體。基本上如制造商描述，注射lOmM乙酸 鈉 pH 5.0(GE Healthcare)中2μg/ml的每一個(gè)。芯片表面上未反應(yīng)的部分用1M乙醇胺阻斷。 用磷酸鹽緩沖液(67臟磷酸鹽緩沖液、0.151恥(：1、0.005%了￥661120，在?!16.0或7.4下)進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)，以操作或稀釋樣品。通過在25°C下在pH 6.0下將單體His標(biāo)記的hFcRn( 1.0-0.015μ Μ)注射在固定的HSA變體上進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，流速為50μ1/π?η。動(dòng)力學(xué)速率數(shù)值使用 BIAevaluation 4.1軟件提供的簡(jiǎn)單的朗繆爾1:1配體結(jié)合模型計(jì)算。在所有親和力估計(jì) 中，通過統(tǒng)計(jì)數(shù)值x2(表示平均平方)描述的擬合密集度低于5.0。為校正非特異性結(jié)合和整 體緩沖作用，每個(gè)相互作用曲線減去從對(duì)照CM5表面和空白注射中獲得的結(jié)合反應(yīng)。
[0198] HSA變體與羧基涂布的Molday Ι0Ν的偶合。
[0199] 用 100MWC0離心柱（Millipore)，將 1.5ml CL-30Q02-CA(5mg Fe/ml)(BioPal)緩沖 液轉(zhuǎn)變?yōu)?0mMMES(pH5·5)。通過分別添加600μl和900μlEDC和NHS溶液(GEhealthcare) 來活化羧基，接著在室溫下在轉(zhuǎn)輪上培育20分鐘。為去除未反應(yīng)的試劑，遵循管柱制造商的 指導(dǎo)，活化粒子通過經(jīng)50mMMES緩沖液(pH5.5)平衡的NAP-G-25柱(GEhealthcare)。使用 每毫升CL-30Q02-CA 2mg HSA變體(溶于0.1M碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0))，且在混合后在室 溫下在轉(zhuǎn)輪上培育120分鐘。隨后，用100MW⑶離心管柱(Mi 11 ipore)，將偶合粒子緩沖液轉(zhuǎn) 變?yōu)閘x PBS/0.05%疊氮化物，且儲(chǔ)存在4°C。
[0200] T84轉(zhuǎn)胞吞分析
[0201] 人類上皮細(xì)胞系T84(ATCC)維持于達(dá)伯克改良伊格爾培養(yǎng)基DMEM(Invitrogen)和 HAM的F-12培養(yǎng)基（1:1) (Invitrogen)中，供有10%熱失活FBS、2mM Lg和50U/ml PS(均來自 Bio-Wittaker)。細(xì)胞在37 °C下在濕潤(rùn)的5 %C02、95%空氣培育箱中培育。具有PTFE膜和0.4 譲孔徑的Transwell過濾器（1.12cm 2) (Corning Costar，MA，USA)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培育過 夜，接著1. 〇 X 1〇6個(gè)細(xì)胞/孔接種。每日使用MILLICELL-ERS伏特歐姆儀(MILLIP0RE)測(cè)量跨 膜電阻(TER)。細(xì)胞培養(yǎng)4-6天，接著到達(dá)1000-1500 Ω X cm2的TER值。生長(zhǎng)培養(yǎng)基每日交換。 [0202] 在實(shí)驗(yàn)前，洗滌T84單層，且在漢氏HBSS緩沖液（Invitrogen)中培育1小時(shí)。為測(cè)量 頂部至基底外側(cè)輸送，與Molday I0N(100ml/ml，用1M MES調(diào)整，pH 6.0)偶合的200μ1標(biāo)準(zhǔn) 化的HSA變體(20-30μg/ml)或HSA變體添加至頂面，接著在0和4小時(shí)從具有500μ1 HBSS緩沖 液的基底外側(cè)儲(chǔ)集器取樣400ml培養(yǎng)基。在測(cè)量相反方向上輸送的分析中，500μ1 HSA(8yg/ ml)添加至基底外側(cè)面，接著在0和4小時(shí)從具有200μ1 HBSS緩沖液的頂部?jī)?chǔ)集器取樣150μ1 培養(yǎng)基。
[0203] 使用ELISA定量跨越Τ84細(xì)胞的HSA變體和偶聯(lián)物的輸送。濃度已知的HSA變體用作 標(biāo)準(zhǔn)。來自山羊的抗-GST抗體(1:5000稀釋）(GE healthcare)或來自山羊的抗-HSA抗體(1: 2000稀釋）（Sigma)在lx PBS中涂布于96孔NUNC盤中且在4°C下培育隔夜。接著，孔使用200μ 1 4%S/PBS阻斷1小時(shí)，接著用roS/T洗滌4次，接著添加滴定量的在S/T/roS中稀釋的收獲 培養(yǎng)基。盤在室溫下培育1小時(shí)，接著如上洗滌。隨后，添加來自小鼠的HRP結(jié)合的抗-HSA抗 體(Abeam)，在S/T/roS中稀釋1:5000，且在室溫下培育1小時(shí)。盤如上洗滌，接著添加10(^1 3,3、5,5~四甲基對(duì)聯(lián)苯胺溶液(Merck)。使用Sunrise光譜儀(TECAN)在620nm下測(cè)量吸光 度。
[0204] 結(jié)果
[0205]為比較在中性pH值下HSA融合物的結(jié)合能力，將滴定量的標(biāo)準(zhǔn)化HSA-GST變體添加 至捕捉在人類IgG突變體上的hFcRn，且結(jié)合的HSA-GST變體使用來自山羊的HRP結(jié)合的抗 GST抗體檢測(cè)（圖11F)，其展示突變變體中無一個(gè)在中性pH值下結(jié)合受體(圖11)。
[0206]為比較在酸性pH值下HSA融合物的結(jié)合能力，將滴定量的標(biāo)準(zhǔn)化HSA-GST變體添加 至捕捉在人類IgG突變體上的hFcRn，且結(jié)合的HSA-GST變體使用來自山羊的HRP結(jié)合的抗-GST抗體檢測(cè)。KP和VA同等結(jié)合且顯著比WT多，而KP/VA的組合進(jìn)一步提高，而KP/EQ/TM/VA 在所有突變體中在pH 6.0下結(jié)合最強(qiáng)。在中性pH下，除強(qiáng)烈結(jié)合的KP/EQ/TM/VA外，突變變 體中無一個(gè)展示可檢測(cè)的結(jié)合。
[0207] 為研究HSA是否可以通過FcRn依賴性方式跨越表達(dá)內(nèi)源性hFcRn的上皮層輸送，使 用Transwell系統(tǒng)測(cè)量FcRn介導(dǎo)的IgG輸送。首先，測(cè)量?jī)蓚€(gè)方向上的未融合的WT HSA和KP 的輸送。僅僅測(cè)量到從頂部至基底外側(cè)方向的有效輸送，其中展示KP輸送比WT多（圖15)。在 基底外側(cè)至頂部方向上，展示僅僅輸送微量的KP變體，而WT未檢測(cè)到（圖13)。
[0208] 此外，WT HSA-GST與KA/HQ-GST比較，且將等量的這些添加至Transwell系統(tǒng)的頂 部?jī)?chǔ)集器。在添加至頂面后的時(shí)間點(diǎn)〇和4小時(shí)從基底外側(cè)儲(chǔ)集器處收集樣品。使用ELISA定 量輸送的HSA融合物，其中融合物捕捉在抗-GST抗體上且使用HRP結(jié)合的抗-HSA抗體檢測(cè)結(jié) 合的融合物。檢測(cè)到輸送功效的顯著差異，因?yàn)閃T融合物輸送比缺乏與hFcRn的結(jié)合的雙重 突變體(KA/HQ)多5倍（圖14)。因此，這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈支持在人類上皮中表達(dá)的FcRn能夠跨越 細(xì)胞層將HSA轉(zhuǎn)胞吞。接著，評(píng)估與hFcRn的結(jié)合提高的HSA變體(KP)是否比WT對(duì)應(yīng)物轉(zhuǎn)胞吞 更有效（圖14)。發(fā)現(xiàn)與WT相比，單一KP突變的引入增加輸送功效幾乎3倍（圖16)。單一突變 體EQ和TM輸送比WT更有效，遠(yuǎn)勝KP，而與KP相比，KP/TM/EQ的組合引起輸送增強(qiáng)大致2倍（圖 14) 〇
[0209]接著，VA的從頂部至基底外側(cè)面的轉(zhuǎn)胞吞作用與KP/VA和KP/TM/EQ/VA比較，且發(fā) 現(xiàn)KP/VA輸送比VA更有效3倍（圖15)，而在兩種pH條件下強(qiáng)烈結(jié)合的KP/TM/EQ/VA不輸送(圖 15) 〇
[0210] 接著解決偶聯(lián)于HSA的NP是否可以跨越極化細(xì)胞層穿梭。WT HSA和KA/HQ經(jīng)由FcRn 結(jié)合位點(diǎn)遠(yuǎn)端的DI內(nèi)的游離半胱氨酸殘基，位點(diǎn)特異性偶聯(lián)于NP。將NP添加至頂面且將跨 越細(xì)胞輸送且在基底外側(cè)釋放的量定量并展示偶聯(lián)于WT HSA的NP比KA/HQ多2倍(圖16)。 [0211]以上說明書中所提及的所有出版物和專利以引用的方式并入本文中。在不脫離本 發(fā)明的精神和范圍下本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見本發(fā)明所描述的方法和系統(tǒng)的各種修改和 變化。雖然本發(fā)明已經(jīng)結(jié)合特定優(yōu)選的實(shí)施方案描述，應(yīng)了解如要求的本發(fā)明不應(yīng)過度局 限于此類特定實(shí)施方案。實(shí)際上，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的用于進(jìn)行本發(fā)明的所述模 式的各種修改意圖在以下權(quán)利要求書范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種變體人類血清白蛋白（HSA)或小鼠血清白蛋白多肽(MSA)，其以相對(duì)于野生型 HSA或MSA增加的親和力結(jié)合于FcRn，其中所述多肽包含至少一個(gè)變體氨基酸。2. 如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽以1 OnM或更小的Kd結(jié)合于HSA或MSA。3. 如權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述多肽以5nM或更小的Kd結(jié)合于HSA或MSA。4. 如權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述多肽以InM或更小的Kd結(jié)合于HSA或MSA。5. 如權(quán)利要求2至4中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述Kd在酸性pH值下測(cè)量。6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽以高于野生型白蛋白的水平跨 越極化人類細(xì)胞輸送。7. 如權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述輸送水平在極化人類細(xì)胞分析中4小時(shí)后以ng/ ml測(cè)量。8. 如權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述較高水平比野生型白蛋白高至少兩倍。9. 如權(quán)利要求7所述的多肽，所述較高水平為比野生型白蛋白高至少三倍。10. 如權(quán)利要求7所述的多肽，其中所述較高水平為比野生型白蛋白高至少5倍。11. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述變體多肽與SEQ ID NO: 1至少 80 %-致。12. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述變體多肽與SEQ ID NO: 1至少 90 %-致。13. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述變體多肽與SEQ ID NO: 1至少 95 %-致。14. 如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述取代在SEQ ID NO: 1的氨基酸 547、573、523、253、527、500和505或1^4的位置500或510中的一個(gè)或多個(gè)。15. 如權(quán)利要求14所述的多肽，其中所述取代選自由以下組成的組：SEQ ID N0:1的 K573Y、I523G、I523A、T527M、E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/ E505Q/T527M、K573Y/T527M、K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、 1(573卩/^527]\^547厶、￥547厶/1(573?、￥547厶/^5050/1(573?/^527]\1或1(50(^/!15100、骱5的結(jié)構(gòu) 域111的缺失或野生型]\^4的1(50(^/!15100。16. -種變體人類血清白蛋白（HSA)多肽，其中所述多肽包含在選自由以下組成的組的 SEQ ID NO: 1 的位置的一個(gè)或多個(gè)取代：547、573、523、253、527、500和505。17. 如權(quán)利要求16所述的多肽，其中所述取代選自由以下組成的組：K573Y、1523G、 I523A、T527M、E505Q、K573P、K573Y/I523G、K573Y/I523G/T527M、K573Y/E505Q/T527M、 K573Y/T527M、K573P/I523G、K573P/I523G/T527M、K573P/E505Q/T527M、K573P/T527M、 V547A、V547A/K573P、V547A/E505Q/K573P/T527M和K500A/H510Q。18. -種變體人類血清白蛋白多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1的結(jié)構(gòu)域III的缺 失。19. 一種變體小鼠血清白蛋白（MSA)多肽，其中所述多肽包含在野生型MSA的位置500 和/或510的取代。20. 如權(quán)利要求19所述的多肽，其中所述取代是野生型MSA的K500A/H510Q。21. -種融合蛋白，其包含a)白蛋白的變體、其片段或其融合物;和b)偶聯(lián)物。22. 如權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中所述白蛋白的變體以與野生型白蛋白相比，以 增加的結(jié)合親和力結(jié)合于FcRn。23. 如權(quán)利要求22所述的融合蛋白，其中所述白蛋白的變體為如權(quán)利要求1至20中任一 項(xiàng)所述的白蛋白的變體。24. 如權(quán)利要求21所述的融合蛋白，其中所述偶聯(lián)物共價(jià)附接于包含硫醇基的氨基酸。25. 如權(quán)利要求21至24中任一項(xiàng)所述的融合蛋白，其中所述偶聯(lián)物為免疫原。26. 如權(quán)利要求25所述的融合蛋白，其中所述免疫原在受試者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。27. -種核酸，其編碼如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的多肽或融合蛋白。28. -種宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求27所述的核酸。29. -種疫苗組合物，其包含如權(quán)利要求21至26中任一項(xiàng)所述的融合蛋白和藥學(xué)上可 接受的載劑。30. -種在受試者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其包括在使得所述受試者產(chǎn)生免疫反應(yīng)的 條件下向所述受試者施用如權(quán)利要求29所述的疫苗組合物。31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述疫苗被遞送至受試者的粘膜表面。32. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述疫苗鼻內(nèi)或通過吸入遞送。33. -種如權(quán)利要求29所述的疫苗組合物的用途，其用于在受試者中引起免疫反應(yīng)。34. -種如權(quán)利要求21至26中任一項(xiàng)所述的融合蛋白的用途，其用于疫苗組合物中。35. -種疫苗組合物，其包含： a) 包含野生型白蛋白多肽和偶聯(lián)物的融合蛋白；和 b) 藥學(xué)上可接受的載劑。36. 如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物，其中所述偶聯(lián)物是免疫原。37. 如權(quán)利要求35所述的疫苗組合物，其中所述疫苗進(jìn)行氣霧化。38. -種在受試者中誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法，其包括在使得所述受試者對(duì)所述免疫原產(chǎn) 生免疫反應(yīng)的條件下向所述受試者施用如權(quán)利要求34至36中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物。39. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述疫苗組合物被遞送至所述受試者的粘膜表面。40. 如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述疫苗組合物鼻內(nèi)遞送。41. 一種如權(quán)利要求35至37中任一項(xiàng)所述的疫苗組合物的用途，其用于在受試者中對(duì) 所述免疫原廣生免疫反應(yīng)。42. 如權(quán)利要求40所述的用途，其中所述疫苗組合物被遞送至所述受試者的粘膜表面。43. 如權(quán)利要求40所述的用途，其中所述疫苗組合物鼻內(nèi)遞送。
【文檔編號(hào)】C07K14/765GK105992770SQ201480065698
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2014年10月31日
【發(fā)明人】J.T.安德森, I.桑利, M.伯恩
【申請(qǐng)人】奧斯陸大學(xué)