核酸分析方法和設(shè)備的制造方法
【專利摘要】描述檢測樣品中靶核酸的方法。第一探針附著于第一珠，并將第一珠置于樣品中，從而任何靶核酸附著于所述第一探針。第二探針也附著于靶核酸，從而任何靶核酸連接(link)或“連接(tether)”第一和第二探針。電容傳感器檢測所述珠的電容并處理電容數(shù)據(jù)以定量樣品中存在的靶核酸。第二探針可固定于傳感器表面?；蛘?，向樣品引入第二珠，所述第二珠具有附著的第二探針，第一珠連接第二珠的程度指示靶NA存在的程度。
【專利說明】核酸分析方法和設(shè)備
[0001]引言
[0002]本發(fā)明涉及用于分析微生物學(xué)實體如樣品中核酸的方法和設(shè)備。
[0003]用于核酸(NA)如DNA和RNA的實時診斷學(xué)已討論多年，但實際的應(yīng)用的和功能性系統(tǒng)匱乏。大部分現(xiàn)有系統(tǒng)是基于實驗室的且涉及用酶和化學(xué)或熒光標(biāo)記物的NA修飾。這需要熟練的實驗室技術(shù)員和笨重昂貴的基本單元如激光光學(xué)探測器。盡管這類系統(tǒng)聲稱高敏感性(如檢測〈100靶DNA)，但實踐中其需要擴增反應(yīng)(如qPCR)，其中靶在可靠檢測前復(fù)制多至十億倍。每次測試一個以上分析物需要多個平行測試或在一個反應(yīng)中的組合(多重)，進一步增加化學(xué)過程的復(fù)雜性。不同靶之間的擴增偏倚就多重分析而言是嚴重問題，因為各基因的PCR效率可變化多至?30%。擴增步驟需要純模板，因為任何共提取的抑制劑如腐殖酸可導(dǎo)致假陰性，而相反，交叉污染能導(dǎo)致假陽性。擴增步驟涉及復(fù)雜的化學(xué)，長的酶孵育時間或熱循環(huán)。樣品純化和擴增都要求將栗、閥門、濾器、加熱器、冷卻器或Peltier裝置整合到微流體裝置和/或基本單元中。微流體裝置中無氣泡形成的熱循環(huán)是具體問題。擴增所用酶通常導(dǎo)致表面吸附相關(guān)問題，引起控制反應(yīng)中有效酶濃度的問題;限制能用于微流體的材料類型;和一些情況下使表面處理成為必需。復(fù)雜的化學(xué)需要復(fù)雜的技術(shù)，使這類系統(tǒng)難以用于遠場位置。
[0004]US2006/0205093(Philips)描述使用帶微生物學(xué)實體的顆粒和向結(jié)合施加機械壓力，從而一些結(jié)合被破壞而另一些沒有。
[0005]本發(fā)明提供直接、穩(wěn)健、具有序列特異性和快速而沒有復(fù)雜化學(xué)和擴增步驟的DNA或RNA檢測。多重檢測和定量也高度可取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]根據(jù)本發(fā)明，提供檢測樣品中靶微生物學(xué)實體的方法，所述方法包括步驟:
[0007]提供附著第一珠的第一探針；
[0008]將所述第一珠置于樣品中，從而任何靶微生物學(xué)實體附著所述第一探針；
[0009]提供第二探針，其也附著所述靶微生物學(xué)實體，從而任何所述靶微生物學(xué)實體連接所述第一和第二探針;和
[0010]檢測所述珠的電容并處理電容數(shù)據(jù)以定量樣品中存在的靶微生物學(xué)實體。
[0011]在一個實施方式中，所述第二探針固定化于傳感器表面上。在一個實施方式中，所述第二探針是固定的表面上的自組裝單層。
[0012]在一個實施方式中，所述第二探針是珠上的自組裝單層。
[0013]在一個實施方式中，所述單層是有中性電荷的PNA單層。
[0014]在一個實施方式中，所述傳感器包含有平板式傳感器表面的TSV芯片，且所述樣品沉積于所述頂面上。
[0015]在一個實施方式中，將第二珠引入樣品，所述第二珠具有附著的第二探針，第一珠連接第二珠的程度指示靶微生物學(xué)實體存在的程度。在一個實施方式中，所述樣品集中在傳感器上。
[0016]在一個實施方式中，至少一些珠是有磁性的或順磁性的。在一個實施方式中，第一珠是有磁性的或順磁性的，施加磁場引起所述第一珠擔(dān)當(dāng)傳送第二珠的轉(zhuǎn)運珠，所述第二珠通過靶微生物學(xué)實體連接第一珠。
[0017]在一個實施方式中，第一與第二珠連接的程度由傳感器定量，其中校準(zhǔn)所述傳感器以根據(jù)珠的介電性能來定量珠的量。在一個實施方式中，處理僅存在第一珠的樣品相較于同時存在第一和第二珠的樣品的電容差異以提供靶微生物學(xué)實體存在的量度。
[0018]在一個實施方式中，所述傳感器具有分析物通道和陰性通道，校準(zhǔn)傳感器，從而如果分析物中不存在靶微生物學(xué)實體，則兩個通道中都檢測到相同電容。在一個實施方式中，所述微生物學(xué)實體是核酸且校準(zhǔn)用于單堿基差異。
[0019]在一個實施方式中，所述傳感器表面支持固定化的第二探針且其中向樣品引入第二珠，所述第二珠具有附著的第二探針。在一個實施方式中，所述第二珠的尺寸范圍是0.5μm-5ym，優(yōu)選 1.0μηι-3.Ομπι。
[0020]在一個實施方式中，所述珠是有磁性的且對分析物進行磁力攪拌。在一個實施方式中，引入珠，從而連接發(fā)生的程度與靶微生物學(xué)實體的量成比例，從一個位置拉到另一位置的第二珠數(shù)目與靶微生物學(xué)實體的量成比例，且傳感器檢測第二珠數(shù)目以指示靶微生物學(xué)實體的程度。
[0021]在一個實施方式中，所述方法包括磁性移出連接的第一和第二珠的步驟，從而分離未連接的第二珠，且傳感器檢測第二珠數(shù)目，指示靶微生物學(xué)實體的量。
[0022]在一個實施方式中，至少一些珠是有磁性的，施加磁場以進行珠的磁分離。在一個實施方式中，所述磁場移動。
[0023]在一個實施方式中，所述微生物學(xué)實體是核酸且多種靶核酸或基因座被靶向，其中:
[0024]a.對于基因或基因座Α、Β和C:1a+1b+1c=X3信號
[0025]b.對于基因或基因座A和B:2a+2b = X2信號。
[0026]在一個實施方式中，所述方法不區(qū)分多種基因如A、B和C并假定各自賦予關(guān)于感興趣問題的等同信息。在一個實施方式中，A、B和C是SNP，其都視作在為相關(guān)性狀如奶生產(chǎn)而育種的動物中是同樣可取的，校準(zhǔn)傳感器響應(yīng)以指示動物是否可能具有特定特性，如可能產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)奶量。
[0027]在一個實施方式中，基因組合代表易導(dǎo)致特定遺傳病的已知突變。
[0028]在一個實施方式中，所述微生物學(xué)實體是核酸并且反義鏈也被靶向，從而非互補性正向探針(Fl和F2)在同一基因的有義和反義鏈上，而非不同基因，靶向略有不同的基因座。有義和反義鏈都從裂解物中捕獲并運往下游。
[0029]在一個實施方式中，所述有義和反義鏈彼此不相互作用且無法改造(reform)，與R基因座互補的固定化的針對有義鏈的探針(Rfc)和針對反義鏈的探針(Rrc)都存在但物理上隔離，從而探針彼此不結(jié)合。在一個實施方式中，每個探針處于不同位置，攜帶有義鏈的第一珠在一個位置結(jié)合而攜帶反義鏈的那些在另一位置結(jié)合。在一個實施方式中，非互補反向探針(Rl和R2)中覆蓋的兩類珠與更大的珠和NA—起孵育，捕獲并轉(zhuǎn)運到傳感器芯片上，釋放，攪拌并結(jié)合多個電容傳感器(21、22)中每一個上面的正確SAM。在一個實施方式中，通過比較結(jié)合的有義鏈珠(有義鏈DNA和mRNA)數(shù)目與結(jié)合的反義鏈珠(僅反義鏈DNA)數(shù)目確定基因表達水平。
[0030]在一個實施方式中，序列特異性F基因座用于第一珠連接裂解物中NA，并且使用多個第二珠R基因座(R1、R2、R3)。
[0031]在一個實施方式中，靶向多種靶核酸或基因座(F1、F2、F3)且第二珠R基因座(R^fc、R3)結(jié)合各NA中的每一個。
[0032]在一個實施方式中，選擇R基因座以提供除第一珠所賦予的特異性外的額外的序列特異性，但主要擴增第一珠所捕獲各核酸的信號。
[0033]在一個實施方式中，所述RlR^R3基因座通過磁分離不同尺寸的第二珠而在下游彼此區(qū)分。
[0034]在一個實施方式中，所述RlR^R3基因座用不同傳感器(10、11)上的不同固定化的第二探針在下游彼此區(qū)分。
[0035]在一個實施方式中，進行所述方法以檢測截短的DNA或特別是RNA產(chǎn)物，該情況下產(chǎn)生(cause)終止密碼子的細胞中的突變或引起移碼的插入/缺失事件導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄物截短和蛋白質(zhì)的正確翻譯失敗。
[0036]在一個實施方式中，至少一些珠適合于在傳感器上退行，所述退行通過加熱到所述珠的至少一些變成整體的程度進行。
[0037]在一個實施方式中:
[0038]第二珠在水性溶液中穩(wěn)定，但當(dāng)移入傳感器上的溶液中時分解，和/或
[0039]第二珠含有改變?nèi)芤弘娙莸某煞?如鹽)，和/或
[0040]第二珠分解釋放顆粒的細碎片(如鐵氧體)，其立即增加電容傳感器表面上的電容變化。
[0041]在一個實施方式中，所述微生物學(xué)實體包括NA，且其中通過薄蠟層包被第二珠實現(xiàn)將第二珠與第一珠和NA復(fù)合體分離，所述薄蠟層上包被鏈霉親和素，加熱以熔化蠟從而破壞R珠上的鏈霉親和素結(jié)合下面的順磁性珠，使得第二珠的核心分離。
[0042]在一個實施方式中，所述微生物學(xué)實體包括NA，且其中與第二珠上的那些互補的PNA探針用于分離第二珠與第一珠。
[0043]在一個實施方式中，所述分離在大致室溫進行。
[0044]在一個實施方式中，當(dāng)?shù)诙樵趥鞲衅魃蠒r，所述分析物含有互補PNA探針且這些探針由于優(yōu)先的PNA-PNA結(jié)合而取代靶核酸，并釋放所述核酸。
[0045]在一個實施方式中，具有結(jié)合的不同NA的第一珠帶有(pickup)多個第二珠，第二珠熔化以與第一珠分離且其自由地與具有多個固定化的探針的傳感器陣列混合。
[0046]在一個實施方式中，第二珠覆蓋有PNA探針，并粘附于固定化的探針。
[0047]在一個實施方式中，所述固定化的探針是交替的如逐行交替，以確保各第二珠結(jié)合固定化的探針的機會均等。
[0048]在一個實施方式中，有多個不同靶待同時檢測。
[0049]在一個實施方式中，PNA探針允許珠在細胞裂解期間通過核酸連接較大珠。
[0050]另一方面，本發(fā)明提供檢測裝置，包括:
[0051 ]用于提供附著第一珠的第一探針的工具(means);
[0052]用于將所述第一珠置于樣品中的工具，從而任何靶微生物學(xué)實體附著所述第一探針；
[0053]用于提供第二探針的工具，所述第二探針也附著所述靶微生物學(xué)實體的，從而任何所述靶微生物學(xué)實體連接所述第一和第二探針;和
[0054]電容傳感器，用于檢測所述分析物電容和處理電容數(shù)據(jù)以定量分析物中的靶微生物學(xué)實體存在。
[0055]發(fā)明詳述
[0056]圖1顯示允許R珠(“報告珠”)用靶DNA附著T珠(“轉(zhuǎn)運珠”)的序列；
[0057]圖2a顯示有R珠的T珠上的單一 NA;
[0058]圖2b顯示連接的單一 T和R珠；
[0059]圖2c顯示有R珠的T珠上的多重NA;
[0060]圖2d顯示連接的多重T和R珠；
[0061 ] 圖3a、3b、4a、4b和5-10是顯示分析方法的系列圖；
[0062]圖11顯示連接不同SAM的R珠的定量多重試驗，所述SAM位于CMOS電容芯片上的傳感器上;和
[0063]圖12和13顯示傳感器和靶向有義及反義鏈的機制。
[0064]本發(fā)明提供加工樣品的方法和設(shè)備，從而使靶核酸(通常是DNA)以簡單快速方式可鑒定和量化，而不需擴增。通過同一 NA上兩個不同位置處兩種探針結(jié)合的夾心法來提供特異性。這開拓了現(xiàn)有的用于PCR和實時PCR的測定，其具有序列特異性正向和反向引物。一個示例是EURL “馬-DNA”(家馬(Equus cabal Ius))測試方案(2013年2月)。這鑒定用于檢測87堿基對靶線粒體DNA序列(圖1)的特異探針序列以及正向和反向引物。這些探針序列精心設(shè)計成物種特異性。這些相同位點由我們的2種探針靶向。
[0065]生物素化的第一探針附著鏈霉親和素包被的2.8μηι轉(zhuǎn)運或“T珠”，例如根據(jù)Homes(US5512439)(描述從裂解物中取出靶單鏈DNA或RNA，這是通過使其與連接磁珠的互補寡核苷酸DNA探針雜交進行的)。然而，在本發(fā)明中，使用PNA探針取代DNA探針。第二探針結(jié)合第二、更小的(1.Ομπι)順磁性報告珠(“R珠”)。將附有NA的T珠引入含去離子水和R珠的容器。由于R珠在溶液中，這提高與任何靶NA的會遇率。R珠是順磁性的，因而混合進一步通過外磁鐵用攪拌來改善，例如同軸電機電磁鐵的圓周運動，如Apex 18x 14x 20mm。這些R珠附著對應(yīng)NA。2種探針跨同一NA結(jié)合可導(dǎo)致T珠和R珠連接(圖1、2a、2b)。多個更小的R珠可通過對應(yīng)數(shù)目的靶NA連接同一 T珠(圖2b)。為提高檢測靈敏度，此試驗還能就陰性(無DNA)和陽性(家馬(E.cabalIus)mtDNA)樣品平行完成(圖3-10)。
[0066]孵育5分鐘后，所有T和R珠通過強磁鐵拉到容器底部。這花費約I分鐘。隨后在容器(圖5中的2)頂部引入塑料包被的倒漏斗尖頭I，其內(nèi)部有小磁鐵，如圖5所示，持續(xù)2分鐘。這吸引較大的T珠，而不是未結(jié)合的R珠ο繞管移動的同軸磁體攪拌并建立磁梯度。完成此磁分離，因為同一液體介質(zhì)中分別為2.8μηι和1.Ομπι的順磁性的T和R珠暴露于相同磁場和相同磁化率，經(jīng)受的磁矩與其半徑立方成比例，但經(jīng)受的拖曳力與其半徑成正比。T珠和R珠向其拖曳增加的終端速度加速到達零加速的點。T珠將會持續(xù)具有快許多的終端速度。給予相同磁場給定時間，R珠從一個點到另一個需要長許多的時間。
[0067]T珠和連接其的任何結(jié)合的R珠在尖端I聚集并取出。實驗證據(jù)表明破壞DNA-DNA堿基對鍵需要大于500pN的力。就PNA-DNA而言，所述數(shù)字更高。因此，較小的R珠易由較大T珠拖曳。此連接僅當(dāng)靶NA存在時可發(fā)生，因而連接的R珠數(shù)目指示存在的靶NA數(shù)目。
[0068]所述珠數(shù)目能以多種方式測定，例如通過Girvin等在US5684585公開的使珠通過毛細管光學(xué)粒子計數(shù)器，或通過W Q YanguHardware design of electrical capacitancetomography systems” ,Measurement Science Technology Vol 7 1996所述的電容層析成像。
[0069]在此實施方式中，將T珠和R珠置于DI水的大液滴3上，其在CMOS電容傳感器IC 4頂部(圖6和7)。
[0070]IC 4用直通硅晶穿孔技術(shù)(TSV)形成，如US8513061所述。這些蝕刻自硅片背面，隨后用銅回填。這帶來IC 4后面的所有輸入-輸出連接，排除鍵合線和表面形貌學(xué)，極大促進液滴和珠應(yīng)用和移動到傳感器的表面。如圖6-10所示，有用于接受樣品的光滑的平面上表面。
[0071]還顯示試驗的陽性和陰性形式。液滴通過芯片上或芯片下的加熱器加熱到R珠探針和NA復(fù)合體的熔化溫度(如60°C)。這釋放R珠。即刻在傳感器周圍引入圓形磁體，其將T珠推離到傳感器外周并隨著液滴開始蒸發(fā)而將其固定(圖7-8)，但使得未結(jié)合的R珠陷入傳感器上的液滴。液滴現(xiàn)在僅包含R珠。小磁體目前在傳感器下面應(yīng)用，其使R珠集中在傳感器上液滴底部。大部分R珠具有相對于DI水3的較低的介電常數(shù)，提供與初始樣品中靶NA量成正比的極清晰信號。如果分析物中有馬DNA，這能通過分析物、陽性和陰性傳感器的電容對比變化來檢測。
[0072]此過程需要約1-2分鐘。3-4分鐘后，液滴完全蒸發(fā)(圖10)。所述珠具有比空氣更高的介電常數(shù)，對于各分析物、陽性和陰性傳感器產(chǎn)生不同電容讀數(shù)。這些“濕”和“干”電容讀數(shù)產(chǎn)生用于更佳特異性和靈敏度的交叉檢查相關(guān)性。另一變化形式中，所述珠能由在約55°(:熔化的蜂蠟形成，當(dāng)加熱IC時釋放溶質(zhì)如鹽。這改變液滴的介電常數(shù)，進一步提高靈敏度。
[0073]或者，R珠可為非磁性的，如硅石顆粒、大蛋白質(zhì)分子或復(fù)合材料。后者的示例是蜂蠟退行性珠，其變形和/或熔化(如在55°C)以產(chǎn)生沿著傳感器表面具有低介電常數(shù)的有機區(qū)域，或釋放溶質(zhì)如鹽。這改變液體的介電常數(shù)，進一步幫助電容檢測報告珠。
[0074]以下描述本發(fā)明的多重實施方式。這遵循與單一試驗極類似的原則，但區(qū)別在于多種NA通過多個探針結(jié)合同一 T珠(圖2c、2d并與圖2a、2b對比)。根據(jù)T珠上捕獲的NA類型和數(shù)目，從R珠混合物捕獲數(shù)量成正比的互補R珠。如圖11所示，有帶十六個感應(yīng)區(qū)域11的TSVCMOS傳感器10。然后，R珠混合物在傳感器10上轉(zhuǎn)運，在該處其與T珠分開并在傳感器表面自由混合。這采用多個傳感器11表面上形成的自組裝單層(SAM)，其中各SAM具有包埋于或連接傳感器表面的序列特異性探針，所述探針與各游離R珠上的探針互補。R珠若存在，則結(jié)合于正確的傳感器表面(圖11)。因此，各傳感器的電容變化與捕獲的各R珠類型數(shù)量以及初始樣品中的NA數(shù)量成比例(圖2c、2d、ll)。
[0075]通過對樣品裂解物進行靶富集來制備樣品，HomeS(US5512439)。此裂解步驟在分開的介觀流控或微流控容器中發(fā)生。根據(jù)在裂解物中的相對比例，四個獨特的生物素化PNA探針捕獲四種不同嫩(1^、1^、1^、1^)。？嫩探針之一靶向3(^21基因上游的高保守非編碼區(qū)。這用作試驗的陽性對照。另外三個PNA探針靶向在群體中已知變化的基因座。所述NA由PNA探針通過沃森-克里克結(jié)合捕獲，其進而結(jié)合鏈霉親和素包被的順磁性T珠。順磁性T珠在合適的接受器(根據(jù)容器可手動移動并嚙合各容器)中磁性濃縮。T珠由磁力拉入孵育容器。孵育容器包含順磁性珠-較小的1.Ομ?? ‘報告’珠-“R珠”(圖2c)。R珠分成四個等同部分(Ra、Rb、Re、Rd)，各包被于第二PNA探針，所述探針與NA LA、LB、Lc和LD上的各下游位點互補。T珠上的NA會捕獲互補R珠。各T珠能捕獲超過一種R珠。
[0076]順磁性珠用磁體拉到容器基底?，F(xiàn)在移出該磁體并使用另一磁體。
[0077]順磁性T珠和結(jié)合的R珠進行磁性濃縮并取出。所述接受器手動移動并嚙合另一容器。此容器產(chǎn)生CMOS傳感器表面。順磁性珠用磁體向下拉到容器基底。加熱容器以破壞一個或多個能連接T和R珠的探針。各類R珠現(xiàn)在未結(jié)合。現(xiàn)在移出該磁體并使用另一磁體。T珠與R珠分開，在接受器中捕獲并從容器中取出。剩余的R珠進行磁力攪拌以提供CMOS傳感器表面上的混合。如上所示，CMOS傳感器10包含四個單獨傳感器區(qū)11，各用與四種珠類型各自互補的探針覆蓋于四個獨特SAM中。所述珠在正確SAM表面上結(jié)合。各SAM上結(jié)合的珠數(shù)目與裂解物中的初始NA量成比例。相應(yīng)傳感器登記的電容變化與珠數(shù)目成正比。對應(yīng)S0X21基因陽性對照的傳感器應(yīng)該總是包含結(jié)合的R珠。結(jié)合另三個對應(yīng)傳感器的R珠相對比例提供關(guān)于樣品遺傳變異的定性和定量信息。
[0078]注:所有探針可包含合適間隔子(如PEG)和配體(如生物素)以提供與核酸、SAM、底物(如氮化硅或順磁性珠或蠟)的良好相互作用。
[0079]R珠去耦合
[0080]完整試驗也可以等溫完成。這如下完成:容器中的PNA探針溶液與四個基因座(La、Lb、Lc、Ld )相關(guān)位置處的T珠PNA探針互補。PNA-PNA結(jié)合優(yōu)于PNA-NA結(jié)合。溶液中的PNA探針侵入使NA固定于T珠的PNA-NA雙鏈體，并允許NA和結(jié)合的R珠游離。拉開PNA-NA雙鏈體如下促進:在初始PNA探針上具有與NA不互補的突出。這隨后松散。新PNA探針與此突出和剩余探針序列互補，結(jié)合并更有效地侵入PNA-NA雙鏈體。
[0081 ]定量遺傳標(biāo)記指數(shù)
[0082]在另一試驗中，有單一傳感器而無3艦。基因座靶向(1^;上、1^):
[0083]a.對于存在基因或基因座A、B和C:1a+1b+1c=X3信號
[0084]b.對于基因或基因座A和D:1a+1d = X2信號。
[0085]此技術(shù)無法區(qū)分A、B、C和D并假定各自賦予關(guān)于感興趣問題的等同信息。例如，A、B、C和D可以是入侵昆蟲物種的四個遺傳標(biāo)記，所述物種無法通過眼睛與天然物種區(qū)分。存在任何一種這些物種表明有問題。類似地，所述四個基因座可代表易導(dǎo)致遺傳病的已知突變。動物中存在一個或多個這些突變可使該動物剔除另一動物(就所有這些突變而言測試為陰性)變得可取。相反，所述四個基因座可以是SNP，其都視作就相關(guān)性狀如奶生產(chǎn)飼養(yǎng)的在動物中是同樣可取的。本申請中產(chǎn)生的上述來自基于電容試驗的信號量與可能產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)產(chǎn)奶量的動物相關(guān)。
[0086]采用現(xiàn)有基于擴增的方法如終點PCR或LAMP，不太可能分辨存在一種SNP與兩種SNP之間的差異。用不同標(biāo)記探針的qPCR法至少半定量，但具有之前概括的所有劣勢。由于本發(fā)明方法直接且定量，處理各SNP或靶序列作為附加物的試驗?zāi)芊祷仃P(guān)于農(nóng)場動物品質(zhì)的指數(shù)。此類信息會幫助畜牧業(yè)的協(xié)調(diào)決策。由于所述技術(shù)使用直接定量且僅用采樣的組織量(如來自動物耳朵的標(biāo)準(zhǔn)化Imm3組織)產(chǎn)生樣品中DNA的基線，可能“計數(shù)”多種SNP。存在的兩種SNP應(yīng)產(chǎn)生兩倍的信號，等等。
[0087]截短的轉(zhuǎn)錄物檢測
[0088]在此實施方式中，根據(jù)上面的多重試驗，四個R珠基因座中的三個都位于一種感興趣mRNA上。產(chǎn)生終止密碼子的細胞中的突變或引起移碼的插入/缺失事件引起mRNA轉(zhuǎn)錄物截短和蛋白質(zhì)的正確翻譯失敗。此類突變在許多形式的癌癥中是重要的。關(guān)鍵地，重要癌基因能用此系統(tǒng)靶向并檢測導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物縮短的新生突變。截短的轉(zhuǎn)錄物是遺傳性BRCA乳腺癌風(fēng)險的主要誘發(fā)因素。所述三個傳感器各自捕獲等同數(shù)量的R珠時，觀察到全轉(zhuǎn)錄物。轉(zhuǎn)錄物截短時，觀察到大部分下游R珠的結(jié)合減少。在管家基因如S0X21的表達中提供對照。
[0089]反義鏈靶向和基因表達
[0090]多重試驗的變化性允許靶向有義和反義鏈。有義鏈NA包括DNA和更多的mRNA，而反義NA僅包括DNA。非互補正向探針(Fl和F2，圖12)在同一基因有義和反義鏈上，而非不同基因，靶向略有不同的基因座。有義和反義鏈都在T珠上捕獲，非互補反向探針(Rl和R2，圖12)覆蓋的兩類R珠與T珠和NA—起孵育，捕獲并轉(zhuǎn)運到傳感器芯片20上，釋放，攪拌并結(jié)合各電容傳感器21、22 (圖13)上的正確SAM。檢測到的反義鏈特異性R珠可提供樣品中DNA量的基線。有義鏈特異性R珠的數(shù)目應(yīng)更多且反映有義鏈DNA和mRNA的數(shù)量。通過比較有義和反義鏈的信號，能用此技術(shù)獲得感興趣基因的基因表達水平的準(zhǔn)確和直接量度。在單一試驗中，根據(jù)馬示例，相同策略會使捕獲的R珠數(shù)目加倍并提高靈敏度。
[0091 ]裂解容器中的T珠和R珠連接
[0092]在此實施方式中，T和R珠連接在裂解容器中更上游發(fā)生，縮短總分析時間。共價結(jié)合的PNA探針中包被的R珠在細胞裂解步驟期間加入Che I ex溶液(5-20 % w/v)并用靶NA立即連接到T珠。在后續(xù)磁性移出步驟中，僅連接T珠的R珠從裂解容器中移出，從而提供靶核酸的特異性和定量，如上面多個實施方式所述。
[0093]本發(fā)明不限于所述實施方式，但可在構(gòu)建和細節(jié)方面變化。所述靶不必定是NA。例如，其可另外是蛋白質(zhì)、抗原、細菌、病毒或任何其它微生物學(xué)實體。
【主權(quán)項】
1.一種檢測樣品中靶微生物學(xué)實體的方法，所述方法包括步驟: 提供附著第一珠的第一探針； 將所述第一珠置于樣品中，從而任何靶微生物學(xué)實體附著所述第一探針； 提供第二探針，其也附著所述靶微生物學(xué)實體，從而任何所述靶微生物學(xué)實體連接所述第一和第二探針;和 檢測所述珠的電容并處理電容數(shù)據(jù)以定量樣品中存在的靶微生物學(xué)實體。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二探針固定化于傳感器表面上。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述第二探針是固定的表面上的自組裝單層。4.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述第二探針是珠上的自組裝單層。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述單層是有中性電荷的PNA單層。6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述傳感器包含有平板式傳感器表面的TSV芯片，且所述樣品沉積于所述頂面上。7.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中將第二珠引入樣品，所述第二珠具有附著的所述第二探針，且所述第一珠連接所述第二珠的程度指示靶微生物學(xué)實體存在的程度。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述樣品集中在傳感器上。9.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中至少一些珠是有磁性的或順磁性的。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述第一珠是有磁性的或順磁性的，施加磁場引起所述第一珠擔(dān)當(dāng)傳送第二珠的轉(zhuǎn)運珠，所述第二珠通過靶微生物學(xué)實體連接所述第一珠。11.如權(quán)利要求7-10中任一項所述的方法，其中所述第一與第二珠連接的程度由傳感器定量，其中校準(zhǔn)所述傳感器以根據(jù)珠的介電性能來定量珠的量。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中處理僅存在第一珠的樣品相較于同時存在第一和第二珠的樣品的電容差異以提供靶微生物學(xué)實體存在的量度。13.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述傳感器具有分析物通道和陰性通道，且校準(zhǔn)傳感器，從而如果分析物中不存在靶微生物學(xué)實體，則兩個通道中都檢測到相同電容。14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述微生物學(xué)實體是核酸且所述校準(zhǔn)用于單堿基差異。15.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述傳感器表面支持固定化的第二探針且其中向樣品引入第二珠，所述第二珠具有附著的第二探針。16.如權(quán)利要求7-15中任一項所述的方法，其中所述第二珠的尺寸范圍是0.5μπι-5μπι,優(yōu)選 1.0wi1-3.0ym。17.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述珠是有磁性的且對分析物進行磁力攪拌。18.如權(quán)利要求7-16中任一項所述的方法，其中所述珠被引入，從而連接發(fā)生的程度與靶微生物學(xué)實體的量成比例，從一個位置拉到另一位置的第二珠數(shù)目與靶微生物學(xué)實體的量成比例，且傳感器檢測第二珠數(shù)目以指示靶微生物學(xué)實體的程度。19.如權(quán)利要求7-18中任一項所述的方法，包括磁性移出連接的第一和第二珠的步驟，從而分離未連接的第二珠，且傳感器檢測第二珠數(shù)目，指示靶微生物學(xué)實體的量。20.如權(quán)利要求7-19中任一項所述的方法，其中所述至少一些珠是有磁性的，施加磁場以進行珠的磁分離。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述磁場移動。22.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述微生物學(xué)實體是核酸且多種靶核酸或基因座被靶向，其中: c.對于基因或基因座A、B和C:1a+1b+1c= X3信號 d.對于基因或基因座A和B:2a+2b = X2信號。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述方法不區(qū)分多種基因如A、B和C并假定各自賦予關(guān)于感興趣問題的等同信息。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述A、B和C是SNP，其都視作在為相關(guān)性狀如奶生產(chǎn)而育種的動物中是同樣可取的，校準(zhǔn)傳感器響應(yīng)以指示動物是否可能具有特定特性，如可能產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)奶量。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中基因組合代表易導(dǎo)致特定遺傳病的已知突變。26.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述微生物學(xué)實體是核酸并且反義鏈也被靶向，從而非互補性正向探針(Fl和F2)在同一基因有義和反義鏈上，而非不同基因，靶向略有不同的基因座，有義和反義鏈都從裂解物中捕獲并運往下游。27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述有義和反義鏈彼此不相互作用且無法改造，與R基因座互補的固定化的針對有義鏈的探針(Rf。)和針對反義鏈的探針(Rrc)都存在但物理上隔離，從而探針彼此不結(jié)合。28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中每個探針處于不同位置，攜帶有義鏈的第一珠在一個位置結(jié)合而攜帶反義鏈的那些在另一位置結(jié)合。29.如權(quán)利要求26-28中任一項所述的方法，其中所述非互補反向探針(Rl和R2)中覆蓋的兩類珠與更大的珠和NA—起孵育，捕獲并轉(zhuǎn)運到傳感器芯片上，釋放，攪拌并結(jié)合多個電容傳感器(21、22)中每一個上面的正確SAM。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中通過比較結(jié)合的有義鏈珠(有義鏈DNA和mRNA)數(shù)目與結(jié)合的反義鏈珠(僅反義鏈DNA)數(shù)目確定基因表達水平。31.如權(quán)利要求7-30中任一項所述的方法，其中序列特異性F基因座用于第一珠連接裂解物中的嫩，并且使用多個第二珠1?基因座(1?1、1?2、1?3)。32.如權(quán)利要求7-31中任一項所述的方法，其中靶向所述多種靶核酸或基因座(F1、F2、F3)且第二珠R基因座(R1、R2、R3)結(jié)合各NA的每一個。33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中選擇所述R基因座以提供除第一珠所賦予的特異性外的額外的序列特異性，但主要擴增第一珠所捕獲各核酸的信號。34.如權(quán)利要求32和33所述的方法，其中所述R1、R2和R3基因座通過磁分離不同尺寸的第二珠在下游彼此區(qū)分。35.如權(quán)利要求32和33所述的方法，其中所述R^RdPR3基因座用不同傳感器(10、11)上的不同固定化的第二探針在下游彼此區(qū)分。36.如權(quán)利要求32-35中任一項所述的方法，其中實施所述方法以檢測截短的DNA或特別是RNA產(chǎn)物，該情況下產(chǎn)生終止密碼子的細胞中的突變或引起移碼的插入/缺失事件導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄物截短和蛋白質(zhì)的正確翻譯失敗。37.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中至少一些珠適合于在傳感器上退行，所述退行通過加熱到所述珠的至少一些變成整體的程度進行。38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中 所述第二珠在水性溶液中穩(wěn)定，但當(dāng)移入傳感器上的溶液中時分解，和/或 所述第二珠含有改變?nèi)芤弘娙莸某煞?如鹽)，和/或 所述第二珠分解釋放顆粒的細碎片(如鐵氧體)，其立即增加電容傳感器表面上的電容變化。39.如權(quán)利要求7-38中任一項所述的方法，其中所述微生物學(xué)實體包括NA，且其中通過薄蠟層包被第二珠實現(xiàn)將第二珠與第一珠和NA復(fù)合體分離，所述薄蠟層上包被鏈霉親和素，加熱以熔化蠟從而破壞R珠上的鏈霉親和素結(jié)合下面的順磁性珠，使得第二珠的核心分離。40.如權(quán)利要求7-39中任一項所述的方法，其中所述微生物學(xué)實體包括NA，且其中與第二珠上的那些互補的PNA探針用于分離第二珠與第一珠。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所述分離在大致室溫進行。42.如權(quán)利要求40或41所述的方法，其中所述第二珠在傳感器上時，所述分析物含有互補PNA探針，且這些探針由于優(yōu)先的PNA-PNA結(jié)合而取代靶核酸，并釋放所述核酸。43.如權(quán)利要求7-42中任一項所述的方法，其中具有結(jié)合的不同NA的第一珠帶有多個第二珠，第二珠熔化以與第一珠分離且其自由地與具有多個固定化的探針的傳感器陣列混入口 ο44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述第二珠覆蓋有PNA探針并粘附于所述固定化的探針。45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述固定化的探針是交替的如逐行交替，以確保各第二珠結(jié)合固定化的探針的機會均等。46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中有多個不同靶待同時檢測。47.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中PNA探針允許珠在細胞裂解期間通過核酸連接較大珠。48.一種檢測設(shè)備，包含: 用于提供附著第一珠的第一探針的工具； 用于將所述第一珠置于樣品中的工具，從而任何靶微生物學(xué)實體附著所述第一探針；用于提供第二探針的工具，所述第二探針也附著所述靶微生物學(xué)實體，從而任何所述靶微生物學(xué)實體連接所述第一和第二探針;和 電容傳感器，用于檢測所述分析物電容和處理電容數(shù)據(jù)以定量分析物中的靶微生物學(xué)實體的存在。
【文檔編號】C12Q1/68GK105992826SQ201480075478
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2014年12月10日
【發(fā)明人】T·卡明斯, B·歐法雷爾
【申請人】阿爾查技術(shù)有限公司