去羥肌苷的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了去羥肌苷的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用，本發(fā)明提供的去羥肌苷的藥物組合物中含有去羥肌苷和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，去羥肌苷、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對肝郁證具有治療作用；去羥肌苷和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時，對肝郁證的治療效果顯著提高，可開發(fā)成治療肝郁證的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實質(zhì)性特點和顯著的進步。
【專利說明】
去羥肌苷的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應用
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及去羥肌苷的新用途，具體涉及去羥肌苷的藥物組 合物及其在生物醫(yī)藥中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 去羥肌苷能抑制HIV的復制。在細胞酶的作用下轉(zhuǎn)化為具有抗病毒活性的代謝物 雙去氧三磷酸腺苷(ddATP)，為人類免疫缺陷病毒(HIV)復制抑制劑。其作用機制與齊多夫 定相似。
[0003] 迄今為止，尚未見去羥肌苷及其藥物組合物與肝郁證的相關(guān)性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種去羥肌苷的藥物組合物，該藥物組合物中含有去羥肌 苷和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，去羥肌苷和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療肝郁證。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物a)，
[0007]
[0008] -種去羥肌苷的藥物組合物，包括去羥肌苷、如權(quán)利要求1所述的化合物（I)和藥 學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0010] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將小駁骨粉碎，用65~85%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物 用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫8個柱體積，收集70%洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步 驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化 合物(I)。
[0012] 進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] 上述化合物(I)在制備治療肝郁證的藥物中的應用。
[0014] 上述去羥肌苷的藥物組合物在制備治療肝郁證的藥物中的應用。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點:本發(fā)明提供的去羥肌苷的藥物組合物中含有去羥肌苷和一種結(jié)構(gòu) 新穎的天然產(chǎn)物，去羥肌苷、化合物（I)單獨作用時，對肝郁證具有治療作用;去羥肌苷和化 合物（I)聯(lián)合作用時，對肝郁證的治療效果顯著提高，可開發(fā)成治療肝郁證的藥物。
【具體實施方式】
[0016] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護范 圍。
[0017] 實施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0018]分離方法：（a)將小駁骨(3kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(20L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水飽和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫8個 柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃 縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1 (8個柱體積）、25:1 (8個柱體積）、15:1 (8個柱體 積)和5:1(10個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正 相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1(8個柱體積）、5:1(10個柱體積)和2:1(5個柱體 積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )。
[0019] 結(jié)構(gòu)確證:HR-ESI-MS顯示[Μ+Na]+為m/z 397.1987,結(jié)合核磁特征可得分子式為 C22H3qO5,不飽和度為8。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ(ρρπι，CDCl 3,500MHz ):H-la( 1.36，m)，H-lb (1.52，m)，H-2a(1.91，m)，H-2b(2.02，m)，H-5(1.98，m)，H-6a(2.05，m)，H-6b(2.47，dd，J= 14.3,4.6Hz)，H-9(2.26，m，2H)，H-12(1.83，s)，H-13(2.03，s)，H-14(0.95，s)，H-15(1.77， s)，H-4'（2.26，s)，H-5'（2.32, s)，3'-Ac0( 1.95, s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，CDCl3， 125MHz) :29.4(CH2，l-C)，23.8(CH2,2-C)，136.7(C，3-C)，126.3(C，4-C)，49.7(CH，5-C)， 29.4(CH2,6-C)，130.2(C，7-C)，201.1(C，8-C)，59.8(CH2,9-C)，36.7(C，10-C)，145.3(C，11-C)，22.3(CH3，12-C)，23.1(CH3，13-C)，18.4(CH3，14-C)，11.7(CH 3，15-C)，167.3(C，r-C)， 104.6(C，2'-C)，155.8(C，3'-C)，16.8(CH3,4'-C)，10.7(CH 3,5'-C)，169.6(C，3'-Ac0)，21.3 (CH3,3'-Ac0)。紅外波譜中的1715CHT 1與1680CHT1吸收帶表明結(jié)構(gòu)中存在羰基與雙鍵片段 。13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有22個碳信號，包括七個甲基(一個乙酰甲基），四個亞甲基， 一個次甲基，以及十個季碳(三個羰基碳和六個烯烴碳）。以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表 明該化合物為雙環(huán)結(jié)構(gòu)。 1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示六個甲基質(zhì)子信號δΗ 1.83(3H，s)、2.03 (3H，s)、0.95(3H，s)、1.77(3H，s)、2.26(3H，s)、2.32(3H，s)，以及一個乙酰基甲基質(zhì)子信號 δΗ 1.95 (3H，s);以上NMR數(shù)據(jù)可以確認該化合物為闊苞菊酮衍生物，HMBC譜中H3-12與C-11、 Η3-13與C-11、H3-14與C-IO以及Η3-15與C-4相關(guān)信號可以歸屬為闊苞菊酮上的片段。通過 HMBC譜中H3-4 '與C-3 '、H3-5 '與C-2 '和C-Γ以及3 ' -AcO與C-3 '的相關(guān)性可以確認結(jié)構(gòu)中存 在3 ' -乙?；?2 ' -甲基-2 ' -丁烯酰氧基邊鏈結(jié)構(gòu)，而質(zhì)子信號δΗ 2.26(3H，s)以及2.32(3H， s)可以歸屬為H-4'的甲基信號與H-5'的甲基信號。NOESY譜中He-I與H3-H的相關(guān)信號表明 H3-H為β構(gòu)型，此外Ηα-l與H-5的相關(guān)信號暗示H-5在H3-H的異側(cè)。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜 和NOESY譜，以及文獻關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進 一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0020]
[0021] 實施例2:藥理作用
[0022]本實施例次采用甲狀腺素片灌胃、饑飽失常法喂養(yǎng)制備肝郁證大鼠模型，觀察藥 物降低動物血衆(zhòng)五輕色胺（5-hydroxytryptamine，5_ΗΤ)、去甲腎上腺素（norepinephrine， NE)、腎上腺素(epinephrine，E)水平等方面的抗肝郁證的作用。
[0023] 1、材料與方法
[0024] 1.1動物
[0025]青春期健康雌性SD大鼠，體重(200± 10)g，動物飼料為普通固體飼料，均由西安交 通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，在西安交通大學醫(yī)學院生理實驗室飼養(yǎng)、觀察、研究。實 驗室溫度（20 ± 3) °C，濕度（55 ± 5) °C，12h照明并通風。
[0026] 1.2試劑與樣品
[0027] 去羥肌苷購自中國藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實施例1。甲 狀腺素片由山東省萊陽生物化學制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格:40g/L; 5-HT放射免疫試劑盒、NE放射免 疫試劑盒均由上海朗卡生物科技有限公司提供;〇. 〇 4mmo 1/L戊巴比妥鈉、0.15mmol/L氯化 鈉溶液均由西安交通大學醫(yī)學院生理實驗室提供。
[0028] 1.3大鼠分組及模型制備
[0029] 全部大鼠自由攝食及飲水，適應性飼養(yǎng)1周，并測出每只大鼠平均每日飲食量約為 20g，飲水量約為0.02L。一周后將大鼠隨機分為5組，每組12只，分為正常對照組、模型對照 組、去羥肌苷組【l〇〇mg/(kg · d)】、化合物（I)組(【100mg/(kg · d)】、去羥肌苷與化合物（I) 組合物組【50mg/(kg · d)去輕肌苷+ 50mg/(kg · d)化合物（I)】?？瞻讓φ战M每天給予 0.15mmol/L氯化鈉溶液0.002L灌胃及充足飲食飲水。其余組第1~4周給予甲狀腺素片 12.9mg/(kg · d)灌胃，自第5周開始，大鼠每日限定飲食飲水3次，每籠每次給以飼料50g，飲 水0.05L，持續(xù)足夠刺激時間及足夠強度，共4周；至第5周時藥物組給以上述劑量的藥物灌 胃，共4周。
[0030] 1.5體溫的測定實驗
[0031] 于給藥結(jié)束后，即第56天測定肛溫。
[0032] 1.6血漿5-HT、NE及E含量的測定實驗
[0033]用0.04mmol/L戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉動物后尾靜脈采血，分離血漿，采用夾心 ELISA法檢測各組大鼠血漿中的5-HT、NE及E的含量，具體操作按照試劑盒說明進行。
[0034] 1.7統(tǒng)計學方法
[0035]所有資料均以（X土s)表示，運用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異采用單因 素方差分析(One-WayANOVA、LSD)，組內(nèi)差異米用配對t檢驗（Paired-Samplest-Test)，以P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
[0036] 2、實驗結(jié)果
[0037] 2.1對肝郁證模型大鼠肛溫的的影響
[0038] 第1天各組大鼠肛溫均在正常范圍（36.4~37.2°C)，且無顯著性差異(P>0.05);第 28天肝郁模型組肛溫明顯升高，與空白對照組相比有顯著性差異(P<0.01);與模型對照組 比較，去羥肌苷與化合物（I)組合物組肛溫明顯降低(P<〇.01);與模型對照組比較，去羥肌 苷組、化合物（I)組肛溫降低(P<〇.05)。結(jié)果見表1。
[0039] 2.2對肝郁證模型大鼠5-HT、NE及E含量的影響
[0040] 與正常對照組比較，模型對照組大鼠的5-HT、NE及E含量均明顯升高(P<0.01)。與 模型對照組比較，去羥肌苷與化合物（I)組合物組大鼠的5-HT、NE及E含量均明顯降低(P< 0.01);與模型對照組比較，去羥肌苷組、化合物（I)組大鼠的5-HT、NE及E含量均降低（P< 0.05)。結(jié)果見表1。
[00411 表1對肝郁證模型大鼠肛溫和5-HT、NE及E含量的影響
[0043] 肝郁證作為中醫(yī)臟腑證候中常見的證候之一，在病癥中有上升趨勢。其臨床多以 患者的主觀感覺反映出來，確切的客觀指標尚在探索之中，以往建立的肝郁模型表現(xiàn)不盡 相同，目前仍無統(tǒng)一的評價標準?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為：西醫(yī)學的心理應激理論與中醫(yī)學情志 致病相一致。當體處于應激狀態(tài)時，就會出現(xiàn)以交感神經(jīng)興奮和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì) 軸激活為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應，從而引起神經(jīng)遞質(zhì)5_HT、E及NE的變化。神經(jīng)內(nèi)分泌 學已證實，中樞內(nèi)NE與5-HT是調(diào)節(jié)情緒及行為的重要活性物質(zhì)，NE增多出現(xiàn)易激惹、易發(fā) 怒；5-HT升高則呈現(xiàn)情緒低落狀態(tài)。已有的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)肝郁患者血漿中E、NE的含量發(fā)生 改變，實證時血漿NE、E含量均增高且多伴有交感偏亢；由肝氣郁結(jié)證形成肝郁脾虛證時血 漿NE、E含量減低。該實施例應用甲狀腺素片及饑飽失常法建立的肝郁證大鼠模型，克服了 因藥物造模法引起的實質(zhì)性肝損害和情志造模法某種程度上造成的大鼠機體直接損傷的 缺點，更接近于肝郁證臨床的病因和病癥，較好的再現(xiàn)了中醫(yī)情志致病的臨床癥狀變化特 點，
[0044] 上述結(jié)果表明，去羥肌苷、化合物（I)單獨作用時，對肝郁證具有治療作用；去羥肌 苷和化合物（I)聯(lián)合作用時，對肝郁證的治療效果顯著提高，可開發(fā)成治療肝郁證的藥物。
[0045]上述實施例的作用在于說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護 范圍。本領域的普通技術(shù)人員應當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種去羥肌苷的藥物組合物，其特征在于:包括去羥肌苷、如權(quán)利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的去羥肌苷的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的去羥肌苷的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將小 駁骨粉碎，用65~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫 8個柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70 %乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和 2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。7. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療肝郁證的藥物中的應用。8. 權(quán)利要求2~4任一所述的去羥肌苷的藥物組合物在制備治療肝郁證的藥物中的應 用。
【文檔編號】C07C67/48GK106008216SQ201610475585
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】劉芊芊
【申請人】劉芊芊