一種放射性c-met靶向親和小分子化合物及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)診斷治療領(lǐng)域，特別涉及一種放射性C? MET靶向親和小分子化合物及其應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)放射性標(biāo)記c?MET受體抑制劑，實(shí)現(xiàn)了腫瘤等病癥的活體示蹤成像?？捎糜诒O(jiān)測(cè)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體的生物化學(xué)變化特征，直觀的顯示c? MET的分布和數(shù)量，用于特異性的檢測(cè)包括腦膠質(zhì)瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌、直腸癌和宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥。也具有一定的抗癌活性，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一種放射性C-MET靶向親和小分子化合物及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)診斷治療領(lǐng)域，特別涉及一種放射性C-MET靶向親和小分子化合 物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原癌基因肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-MET)的編碼產(chǎn)物是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)的細(xì) 胞膜受體，屬酪氨酸激酶受體，當(dāng)HGF與C-MET結(jié)合后，會(huì)引起受體二聚化并導(dǎo)致一系列信號(hào) 途徑的激活，從而引起腫瘤血管生成、增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)和侵襲，最終發(fā)生轉(zhuǎn)移，因而C-MET及其配體HGF相互作用與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，C-MET受體在 多種腫瘤中高表達(dá)，包括腦膠質(zhì)瘤、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、卵 巢癌、直腸癌和宮頸癌等。HGF/C-MET信號(hào)通路參與了腫瘤與基質(zhì)的相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì) 胞增殖、腫瘤血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此HGF/C-MET已 成為腫瘤診斷中的分子標(biāo)志物，更是腫瘤治療中有效的分子靶點(diǎn)。由于C-MET在腫瘤中的重 要作用，因此以c-MET為靶點(diǎn)的腫瘤治療及成像研究是熱點(diǎn)方向。
[0003]目前已經(jīng)開(kāi)發(fā)多種治療策略，包括單克隆抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑等。目 前，超過(guò)20個(gè)不同的治療藥物，包括HGF單克隆抗體、C-MET單克隆抗體以及C-MET激酶小分 子抑制劑，已進(jìn)入臨床研究階段。因此，目前迫切需要C-MET檢測(cè)方法，對(duì)病變的C-MET表達(dá) 水平進(jìn)行檢測(cè)，用于指導(dǎo)腫瘤治療方案的設(shè)計(jì)和實(shí)施。
[0004] 由于在腫瘤患者中可存在C-MET基因的突變、擴(kuò)增和過(guò)表達(dá);故其相應(yīng)的檢測(cè)方法 有直接測(cè)序法、絕對(duì)熒光定量PCR、免疫熒光原位雜交(FISH)和免疫組織化學(xué)染色法(IHC)， 通過(guò)分析C-MET基因和C-MET蛋白篩選出適合C-MET抑制劑應(yīng)用的獲益人群。但是，這些體外 檢測(cè)方法主要依靠對(duì)大量的、細(xì)胞水平或離體組織的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。體外檢測(cè)方法雖可 判斷、分析細(xì)胞或組織的C-MET表達(dá)水平，但從技術(shù)層面上分析，都存在著一定的局限性:① 需要通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、活檢或尸檢取得標(biāo)本，不能直接應(yīng)用于人體;②體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能與活 體狀態(tài)下的真實(shí)情況不符:體外實(shí)驗(yàn)受實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)方法的影響較大，在樣品 的處理過(guò)程中，可能會(huì)遺失某些重要的成分，誤差較大，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與活體狀態(tài)下的真實(shí) 情況不符;③體外實(shí)驗(yàn)不利于動(dòng)態(tài)研究:體外實(shí)驗(yàn)需要在不同的時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)獲 取組織或反復(fù)活檢取材，只能觀察疾病的某一階段，無(wú)法實(shí)現(xiàn)在同一動(dòng)物體內(nèi)真正的動(dòng)態(tài) 研究，不易在如此復(fù)雜的、進(jìn)展的疾病全過(guò)程得到準(zhǔn)確的結(jié)論;④操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)耗財(cái)，隨機(jī) 性很大。因此，C-MET的活體可視化研究可能為解決這些問(wèn)題，提供了一種新的思路，而分子 影像學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)使之成為可能。
[0005] 分子影像學(xué)是指在活體狀態(tài)下，應(yīng)用影像學(xué)方法對(duì)人或動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞和分子水 平生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行成像、定性和定量研究的一門學(xué)科。它以應(yīng)用分子探針為顯著特點(diǎn)，采用 多種成像手段，對(duì)體內(nèi)特定靶點(diǎn)進(jìn)行成像。成像手段包括:放射性核素成像(radionuclide imaging)、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI )、磁共振波譜成像（MR spectroscopy，MRS)、光學(xué)成像（optical imaging，01)、超聲成像（ultrasound imaging， US)及多模式融合成像（integration of multi-mode imaging)等。借助這些成像技術(shù)，生 命系統(tǒng)內(nèi)部某些特定的生理或者病理過(guò)程，如基因表達(dá)，蛋白質(zhì)之間相互作用，信號(hào)傳導(dǎo)， 細(xì)胞的代謝以及細(xì)胞示蹤等等可變?yōu)橹庇^的圖像顯現(xiàn)出來(lái)。其中PET成像以其敏感性高，空 間分辨率高，定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，目前成為臨床應(yīng)用范圍廣的分子成像技術(shù)。
[0006] 迄今為止，C-MET靶向性核醫(yī)學(xué)成像探針主要是應(yīng)用大分子進(jìn)行放射性核素標(biāo)記。 例如，通過(guò)長(zhǎng)半衰期放射性核素89Zr或者 76Br(tl/2 = 16.2h)標(biāo)記Onartuzumab，MAb DN30， anti cal in PRS-110和nanobodies等抗體分子。盡管這些方法表明通過(guò)PET活體評(píng)估腫瘤C_ MET表達(dá)的可行性，但是，基于生物大分子的探針需要等較長(zhǎng)的時(shí)間（至少是注射后1天)才 能獲得較好的圖像對(duì)比度。有學(xué)者報(bào)道通過(guò)放射性 1251標(biāo)記多肽，利用單光子發(fā)射斷層成像 (SPECT)檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤的C-MET表達(dá)。但是，所獲得圖像對(duì)比度很差。目前為止，基于多肽和 小分子化合物的分子成像探針的報(bào)道很少，亟需研發(fā)基于小分子物質(zhì)的活體檢測(cè)和定量C-MET的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種放射性C-MET靶向親和小分子化合物。
[0008] 使用本發(fā)明提供的放射性C-MET靶向親和小分子化合物，通過(guò)活體分子成像技術(shù) 對(duì)C-MET進(jìn)行過(guò)活體檢測(cè)和定量，可在活體確定C-MET的表達(dá)數(shù)量、分布和疾病發(fā)展過(guò)程中 C-MET的動(dòng)態(tài)變化情況，明確c-MET靶向治療干預(yù)的最佳時(shí)間、劑量，并對(duì)C-MET靶向治療的 療效進(jìn)行準(zhǔn)確客觀的評(píng)價(jià)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物具有抗癌活性，其抗腦膠質(zhì) 瘤細(xì)胞U87MG的IC50在30nM至0.5μΜ之間。
[0009] 本發(fā)明提供的放射性c-MET靶向親和小分子化合物的結(jié)構(gòu)為：
[0010]
[0013]
[0014] R為連接cMET母體的部位。
[0015] 如上所述，Rhfc的放射性同位素1中，11(：， 758廣7(^、1241、0(^、^^、^^6厶烷基取 代化合物為：
[0016] 7
[0017] 其中R8為連接Radio-cMET部位，其可以為0,3，(：，順。1? 8也可以為1當(dāng)1?8為圓寸，其可 以連接另一個(gè)烷基取代基。n = 0~5J為1中，11(：，758匕7(^、 1241、0(/^、^^^勵(lì)0厶6厶中的一 種。
[0018] 如上所述，當(dāng)R8為N時(shí)可連接另一個(gè)烷基取代基，其結(jié)構(gòu)為：
[0019]
[0020]其中 cMET 為連接 Radio-CMET 部分。m，n2 = 0~5。乂1山可為 18F，nC，75Br、76Br、124I、 D0TA、N0TA、N0DAGA。
[0021 ]如上所述，當(dāng)R2為芐基及其取代物時(shí)，其結(jié)構(gòu)如下：
[0022]
[0023]其中 R9到R13 為Η，18F，nC，75Br、76Br、 124I、N〇2、OH、C00H、CF3、SO4H、PO3H2、D0TA、ΝΟΤΑ、 NODAGA。Ri，R3-7到 R9-13 不同時(shí)為Η。
[0024] 這些小分子化合物可作為腫瘤示蹤物應(yīng)用于臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)和臨床。 其藥學(xué)特性為ΑΤΡ競(jìng)爭(zhēng)性C-MET小分子抑制劑，可用于腫瘤成像及治療。本發(fā)明提供的 Radio-CMET靶向性分子探針主要用于在活體內(nèi)對(duì)生物過(guò)程進(jìn)行成像、定量和測(cè)量研究?；?本結(jié)構(gòu)一般分為兩個(gè)部分：信號(hào)組件（signaling component)和親和組件（affinity component)。信號(hào)組件是指能產(chǎn)生影像學(xué)信號(hào)且能被高精度的成像技術(shù)探測(cè)的造影劑或標(biāo) 記物部分（如放射性核素、熒光素、順磁性原子及超聲微泡等），本發(fā)明中為放射性同位素 18F，nC，75Br、76Br、1241及可被D0TA、ΝΟΤΑ，、NODAGA螯合的放射性同位素 64Cu，68Ga等；親和組 件即靶向分子，是與成像靶點(diǎn)特異性結(jié)合的部分(如配體或抗體等），本發(fā)明中為喹啉類C 一 MET抑制劑母體結(jié)構(gòu)。
[0025] 本發(fā)明提供的分子探針由信號(hào)組分和靶向親和組分兩部分組成，所述信號(hào)組分為 可供正電子發(fā)射斷層顯像設(shè)備檢測(cè)的部分，具體為放射性核素 D0TA、ΝΟΤΑ，、NODAGA螯合的放射性同位素64Cu，68Ga等;所述靶向親和組分為本專利涉及的、 對(duì)c-MET靶向親和小分子化合物。引入該類探針，應(yīng)用正電子發(fā)射斷層顯像(PET)，可在活體 內(nèi)檢測(cè)到正常生理及病理情況下，感興趣區(qū)域的C-ΜΕΤ的數(shù)量、分布，及其在疾病發(fā)展的不 同階段的變化特征。對(duì)于腫瘤的成像即基于此原理，放射性C-MET抑制劑向C-MET受體過(guò)表 達(dá)的腫瘤部位聚集，通過(guò)PET及其相關(guān)設(shè)備即可檢測(cè)到。
[0026] 本發(fā)明開(kāi)發(fā)的C-MET靶向性影像學(xué)診斷類藥物(分子探針），具有良好的藥代動(dòng)力 學(xué)特征和生物學(xué)分布特征，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，應(yīng)用更加方便，以圖像的形式直觀反映多種 腫瘤的生物化學(xué)特征。
[0027] 本發(fā)明的靶向特異性探針具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0028] 1)、具有C-MET受體靶向特異性，確保C-MET分子成像靶向檢測(cè)的準(zhǔn)確性。一般影像 學(xué)和核醫(yī)學(xué)檢查所用的非特異性探針不能特異性識(shí)別并結(jié)合體內(nèi)的生物分子，因此只能提 供疾病分子改變下游的信息(解剖、病理和生理學(xué)改變），或者疾病的整體形態(tài)和功能信息， 例如血流量的改變、血流灌注的改變。若想準(zhǔn)確檢測(cè)疾病發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵標(biāo)志物分子，則 要求探針可特異性識(shí)別并結(jié)合體內(nèi)分子標(biāo)志物，提供疾病分子水平的信息，加深對(duì)疾病生 物過(guò)程的理解。另外，利用靶向特異性探針，可有效地減少探針與其他非成像靶點(diǎn)的非特異 性結(jié)合，更加有助于對(duì)成像靶點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確的定量。自身阻斷實(shí)驗(yàn)和商品化C-MET靶向性小分 子抑制劑Crizonitib和Cabozantinib阻斷實(shí)驗(yàn)均證實(shí)探針對(duì)C-MET受體具有革E向特異性。
[0029] 2)、C-MET的活體可視化，確保c-MET分子成像檢測(cè)的安全、無(wú)創(chuàng)和直觀性。實(shí)現(xiàn)疾 病發(fā)展過(guò)程中關(guān)鍵分子標(biāo)志物的活體可視化，要求探針具有發(fā)射影像學(xué)信號(hào)，可供無(wú)創(chuàng)的 影像學(xué)設(shè)備在體外檢測(cè)的性能，通過(guò)圖像直觀的顯示出分子標(biāo)志物的分布情況。因?yàn)橛跋?學(xué)檢查具有安全、無(wú)創(chuàng)、直觀的特點(diǎn)。
[0030] 3)、分子探針與靶點(diǎn)c-MET的高親和力。實(shí)現(xiàn)C-MET活體檢測(cè)，獲得理想的分子成像 圖像的前提是分子探針在成像靶點(diǎn)的高濃度聚集，即要求探針到達(dá)靶區(qū)后就與靶點(diǎn)結(jié)合， 解離的時(shí)間相對(duì)較晚，確保在幾個(gè)血液循環(huán)周期后，探針在靶點(diǎn)達(dá)到理想的聚集狀態(tài)。經(jīng)實(shí) 驗(yàn)證實(shí)，分子探針的 IC5Q為98.75 ± 7.6 InM，Bmax為6842，Kd為0.9523mo 1/L。
[0031] 4)、分子探針檢測(cè)C-MET的高敏感性。在疾病早期，或者治療干預(yù)的早期檢測(cè)到分 子標(biāo)志物的變化情況，通常要求探針可檢測(cè)到非常少量的生物標(biāo)志物，即具有高度敏感性。 另外，與治療藥物不同，理想的分子探針必須確保其產(chǎn)生的生物學(xué)影響或藥理學(xué)作用盡量 低，因此需要探針的敏感性足夠高，只需要少量的探針就可獲得理想的圖像，盡量減少引入 體內(nèi)探針的數(shù)量，降低探針引發(fā)的藥理學(xué)作用。
[0032] 5)、C_MET活體分子成像的高對(duì)比度。高對(duì)比度的圖像要求病變區(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度足 夠高，即靶/背景比值(實(shí)驗(yàn)證實(shí)：探針的腫瘤/肌肉比值達(dá)到3.4:1;腫瘤/腦組織比值約為 4.67:1)和信號(hào)/噪聲比值很高(實(shí)驗(yàn)證實(shí):探針的腫瘤/噪聲比值達(dá)到3.7:1)。這就要求探 針具有理想的生物學(xué)分布特征，即探針在靶區(qū)濃聚的量大，停留的時(shí)間長(zhǎng)，而在正常組織器 官內(nèi)攝取率低，清除速度快。
[0033] 6)、分子探針在活體內(nèi)高度穩(wěn)定。盡管分子探針的引入量可能很少，但是維持分子 探針在活體內(nèi)的穩(wěn)定性和完整性依然是一個(gè)難題，因?yàn)檠獫{內(nèi)或者靶組織內(nèi)存在許多酶， 可將探針降解。圖像質(zhì)量和定量研究的準(zhǔn)確性依賴于探針在活體內(nèi)的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，探 針在離體血漿中的穩(wěn)定性很高，共孵育4小時(shí)后，有95%以上的探針結(jié)構(gòu)保持完整。活體穩(wěn) 定性結(jié)果表明：經(jīng)靜脈注射后1小時(shí)后，在血液、肝臟、腫瘤和腎臟中，有60%以上的探針結(jié) 構(gòu)保持完整。
[0034] 7)、分子探針的免疫源性和毒性低。應(yīng)用于人體的分子探針必須安全、沒(méi)有免疫源 性和毒性。產(chǎn)生的藥理學(xué)作用盡量低。
[0035] 8)、分子探針的生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)便易行，成本低。分子探針的制備過(guò)程方便易行，成本 低廉，有助于在臨床廣泛的應(yīng)用。如果生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜，成本高則勢(shì)必會(huì)影響分子探針的臨床 轉(zhuǎn)化。經(jīng)研究已經(jīng)證實(shí)該探針在活體內(nèi)穩(wěn)定性良好，C-MET靶向分子成像特異性高，準(zhǔn)確性 高，圖像的對(duì)比度佳，適用于腦膠質(zhì)瘤、肺癌的腫瘤的診斷、明確C-MET靶向治療的受益人 群，明確治療干預(yù)的最佳時(shí)間、劑量，并對(duì)治療的療效進(jìn)行準(zhǔn)確客觀的評(píng)價(jià)。同時(shí)，也為腫瘤 的基礎(chǔ)研究提供了有效的方法，為研究C-MET與疾病的發(fā)生、發(fā)展特征之間的相關(guān)性提供了 新的手段。
[0036] 9)、本發(fā)明的c-MET分子探針具有良好的抗癌活性，其抗癌IC50在30nM至0.5μΜ之 間。
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1，18F-cMET-l與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞存在明顯的特異性結(jié)合。
[0038]圖2,腦膠質(zhì)瘤18F-cMET - 1PET活體分子成像。
[0039] 圖 3，18F-cMET - 1 對(duì)U87MG細(xì)胞的 IC50 值。
[0040] 圖4，腦膠質(zhì)瘤686&-勵(lì)0六6六-〇1^1'-1活體分子成像。
[0041 ]圖5,686&-勵(lì)0厶6厶-。]\^1'一1對(duì)1]87]\^細(xì)胞的1〇50值。
[0042] 圖6，18F-cMET - 2在正常小鼠中的生物分布圖。
[0043]圖7，腦膠質(zhì)瘤18F-cMET - 2PET活體分子成像。
[0044]圖8，原位腦膠質(zhì)瘤18F-cMET - 2PET活體分子成像。
[0045] 圖9，肺癌的18F-cMET - 2PET活體分子成像。
[0046]圖 l〇，18F-cMET -2 對(duì) U87MG 細(xì)胞的 IC50 值。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 本發(fā)明公開(kāi)了一類放射性標(biāo)記的ATP競(jìng)爭(zhēng)性C-MET小分子抑制劑，作為分子成像探 針用于活體PET分子成像方法。為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下 面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0048] 由于放射性核素18F是當(dāng)前臨床應(yīng)用最為廣泛的核醫(yī)學(xué)成像放射性核素，具有：1) 釋放正電子的效率高（97%)，沒(méi)有散射線；（2)易于生產(chǎn)，各大醫(yī)院可以通過(guò)自有的加速器 自行生產(chǎn)；（3)具有合適的物理半衰期（110min)，（4)具有較低的正電子能量(0.635MeV)，安 全性高；（5)標(biāo)記方法簡(jiǎn)單，對(duì)于小分子化合物可通過(guò)親核取代等化學(xué)合成方法簡(jiǎn)單標(biāo)記 上。本發(fā)明列舉兩例 18F標(biāo)記的CMET放射性抑制劑對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體案例闡釋。但本發(fā)明不 只局限于以下表述。
[0049] 實(shí)施例1:
[0050] 1)18F-cMET-1探針的合成與表征；
[0051]
[0052]反應(yīng)試劑:4mg cMET-Ι，K18F，K222/K2C03溶液( 18F標(biāo)記用，含 15mgK222和3 · 5mgK2C03每 _升），干燥DMS0。
[0053]操作過(guò)程：
[0054]使用標(biāo)準(zhǔn)18F放射性標(biāo)記反應(yīng)儀進(jìn)行標(biāo)記。具體為粒子加速器現(xiàn)制備的K18F(K 2C03 中和H18F產(chǎn)生），加入lmLK222/K2C〇3溶液，加入lmL乙腈并攪拌，通N 2，加熱至85°C吹干溶劑，再 重復(fù)加入lmL乙腈并吹干兩次(共3次），除去所用K18F中的水。取4mgCMET-l反應(yīng)物，溶于lmL 無(wú)水DMS0中，混合均勻后N2保護(hù)下加入反應(yīng)儀，加熱至110°C反應(yīng)30min。制備HPLC分離純化 得 18F -cMET-1</H NMR(300MHz，CDC13)S8.85((1, J = 2.6Hz, 1H) ,8.31(s，lH) ,8.24-8.10 (m,lH),7.84-7.67(m,2H),7.57(t,J=7.9Hz,lH),7.35(s,lH),6.66(s,lH),5.45-5.17(m, lH),4.96(d ,J = 6.1Hz,lH),4.66(d ,J = 5.1Hz,2H),3.98-3.75(m,4H),3.47-3.28(m,4H), 1.65(d，J = 5.8Hz，3H).ESI-MS(m/z)505.2(M+H+).制備過(guò)程中用乙醇及水反復(fù)沖洗C-18柱 子洗脫產(chǎn)物，最終產(chǎn)物加熱至60 °C并用氮?dú)獯蹈伞Ｗ詈螅?8F標(biāo)記的cMET - 1溶于roS中并通 過(guò)0.22μπι超微過(guò)濾到消毒劑量瓶中，用于體外和活體實(shí)驗(yàn)。同樣，用分析型HPLC測(cè)定標(biāo)記 率，放射化學(xué)純，比活度等。
[0055] 2)離體實(shí)驗(yàn)證明
[0056] a.細(xì)胞系：C-MEΤ陽(yáng)性不同級(jí)別人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤U87MG [ WHO IV級(jí)]，U251 MG [ WHO III-1V級(jí)]和Hs683[WHO I-II級(jí)]。C-MET陰性人前列腺癌LnCap細(xì)胞用做陰性對(duì)照。
[0057] b.細(xì)胞結(jié)合和阻斷實(shí)驗(yàn):C-MET陽(yáng)性不同級(jí)別人膠質(zhì)細(xì)胞瘤和對(duì)照組LnCap細(xì)胞， 0.5X106/孔，實(shí)驗(yàn)前一天鋪于12孔板，共四組:A組:U87MG細(xì)胞組;B組：U251MG細(xì)胞組；C組： Hs683細(xì)胞組，D組:LnCap細(xì)胞組。每組分阻斷和非阻斷兩個(gè)亞組，各3孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。每孔 加入18F-cMET-l，濃度為luCi/wel 1，200ul。阻斷組加入沒(méi)標(biāo)記的c-META，濃度為lyg/200ul。
[0058]結(jié)果顯示：18F-cMET-l與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞存在明顯的特異性結(jié)合，與對(duì)照組 LnCap細(xì)胞則無(wú)結(jié)合。引入過(guò)量未經(jīng)標(biāo)記的CMET-1阻斷后，18F-cMET-l與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的結(jié) 合明顯的大大減低。引入商品化C-MET的革E1向特異性小分子抑制劑Cr i ζ οn i t i b和 Cabozantinib阻斷后，18F-cMET-l與腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的結(jié)合明顯的大大減低（圖1)。
[0059] 3)腦膠質(zhì)瘤18F-cMET - 1PET活體分子成像
[0060]建立裸鼠腦膠質(zhì)瘤(U87MG)皮下移植瘤模型，探針18F-cMET-l注射后一小時(shí)，行5 分鐘靜態(tài)PET成像掃描，并結(jié)合CT掃描。結(jié)果如圖2。18?-cMET - 1在靜脈注射后1小時(shí)后在腫 瘤部位現(xiàn)明顯聚集，而探針在對(duì)照組LnCap腫瘤(C-MET表達(dá)陰性）中未見(jiàn)聚集。經(jīng)大量未標(biāo) 記的 19F-cMET - 1阻斷后，探針在腫瘤中的聚集量明顯減少，說(shuō)明探針在腫瘤中聚集的靶向 特異性。
[0061] 4)18F-cMET-1 對(duì) U87MG 細(xì)胞的 IC50
[0062] 使用10 %FBS，加雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，在96孔板中孵育U87MG細(xì)胞5000個(gè)/孔。 孵育24h后，在96孔板的第一豎排加入500μΜ的18F -cMET-1，剩下各排分別等倍稀釋后加 入。藥品加入完畢后孵育48h，接著進(jìn)行MTT試驗(yàn)得到該化合物對(duì)U87MG細(xì)胞的半數(shù)有效濃度 IC50。經(jīng)檢測(cè)18F-cMET- 1的IC50約為250nM，如圖3所示。
[0063] 實(shí)施例2:
[0064] 1 )68Ga-NODAGA-cMET- 1 探針的合成與表征；
[0065]
[0066] 把NODAGA-cMET - 1加入至含有68Ga放射性同位素的乙醇溶液中，調(diào)節(jié)pH至合適的 值，反應(yīng)30min，然后用C18淋洗柱淋洗出產(chǎn)品，放射性檢測(cè)器檢測(cè)標(biāo)記成功。
[0067] 2)腦膠質(zhì)瘤68Ga-NODAGA-cMET - 1活體分子成像
[0068] 建立裸鼠腦膠質(zhì)瘤(U87MG)皮下移植瘤模型，探針68Ga-NODAGA-cMET - 1注射后一 小時(shí)，行5分鐘靜態(tài)PET成像掃描，并結(jié)合CT掃描。結(jié)果如圖4。686&-NODAGA-cMET-1在靜脈 注射后2小時(shí)后在腫瘤部位現(xiàn)明顯聚集，而探針在對(duì)照組0VCAR3腫瘤(C-MET表達(dá)陰性）中未 見(jiàn)聚集。經(jīng)大量未標(biāo)記的NODAGA-cMET - 1阻斷后，探針在腫瘤中的聚集量明顯減少，說(shuō)明探 針在腫瘤中聚集的靶向特異性。
[0069] 3) 68Ga-NODAGA-cMET - 1 對(duì)U8 7MG細(xì)胞的 IC50
[0070] 使用10 %FBS，加雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，在96孔板中孵育U87MG細(xì)胞5000個(gè)/孔。 孵育24h后，在96孔板的第一豎排加入500μΜ的68Ga-NODAGA-cMET- 1，剩下各排分別等倍 稀釋后加入。藥品加入完畢后孵育48h，接著進(jìn)行MTT試驗(yàn)得到該化合物對(duì)U87MG細(xì)胞的半數(shù) 有效濃度IC50。經(jīng)檢測(cè)68Ga-NODAGA-cMET - 1的IC50約為30nM，如圖5所示。
[0071] 實(shí)施例3
[0072] 1)18F-cMET -2探針的合成與表征；
[0073]
[0074] 反應(yīng)試劑:4mg cMET-2，K18F，K222/K2C03溶液( 18F標(biāo)記用，含 15mgK222和3 · 5mgK2C03每 _升），干燥DMS0。
[0075]操作過(guò)程：
[0076]使用標(biāo)準(zhǔn)18F放射性標(biāo)記反應(yīng)儀進(jìn)行標(biāo)記。具體為粒子加速器現(xiàn)制備的K18F(K 2C03 中和H18F產(chǎn)生），加入lmLK222/K2C〇3溶液，加入lmL乙腈并攪拌，通N 2，加熱至85°C吹干溶劑，再 重復(fù)加入lmL乙腈并吹干兩次(共3次），除去所用K18F中的水。取4mgCMET-2反應(yīng)物，溶于lmL 無(wú)水DMS0中，混合均勻后N2保護(hù)下加入反應(yīng)儀，加熱至110°C反應(yīng)30min。制備HPLC分離純化 得Μρ - ΟΙΕΤ - 〗。1!! Mffi(300MHz,Chloroform-d)S8.78((1, J = 2.7Hz，1H) ,7.71 (s，lH)， 7.24-7.21(m，1H)，6.87(s，1H),5.35-5.19(m，lH)，4.19(s，2H)，3.83(d，J=28.6Hz，4H)， 3.30(d，J = 9.1Hz，4H)，1.63-1.52(m，3H) .ESI-MS(m/z)370.1(M+H+).制備過(guò)程中用乙醇及 水反復(fù)沖洗C-18柱子洗脫產(chǎn)物，最終產(chǎn)物加熱至60°C并用氮?dú)獯蹈?。最后?18F標(biāo)記的cMET - 2溶于PBS中并通過(guò)0.22μπι超微過(guò)濾到消毒劑量瓶中，用于體外和活體實(shí)驗(yàn)。同樣，用分析型 HPLC測(cè)定標(biāo)記率，放射化學(xué)純，比活度等。
[0077] 2)探針活體生物學(xué)分布特征：18F - cMET - 2在正常小鼠中的生物分布尾靜脈注 射18F-cMET - 1二小時(shí)后，處死小鼠，取出器官，進(jìn)行離體主要器官伽瑪計(jì)數(shù)器測(cè)量，結(jié)果顯 示:探針18F - cMET - 1主要分布于腦膠質(zhì)瘤、肝臟，胃腸道，主要經(jīng)肝腸道排泄，部分經(jīng)腎臟， 泌尿系統(tǒng)排泄。尤其是其較高的腦膠質(zhì)瘤攝取，這是和腦膠質(zhì)瘤表達(dá)較高C-MET受體是非常 一致的（圖6)。
[0078] 3)腦膠質(zhì)瘤18F-cMET - 2PET活體分子成像
[0079]建立裸鼠腦膠質(zhì)瘤(U87MG)皮下移植瘤模型，探針18F-cMET - 2注射后一小時(shí)，行5 分鐘靜態(tài)PET成像掃描，并結(jié)合CT掃描。結(jié)果如圖了。1# 一 cMET - 2在靜脈注射后1小時(shí)后在腫 瘤部位現(xiàn)明顯聚集，而探針在對(duì)照組LnCap腫瘤(C-MET表達(dá)陰性）中未見(jiàn)聚集。經(jīng)大量商品 化(3_]\^1'的祀向特異性小分子抑制劑〇12011；[1：；[13和0313023111：；[11；[13阻斷后阻斷后，探針在腫 瘤中的聚集量明顯減少，說(shuō)明探針在腫瘤中聚集的靶向特異性。
[0080] 4)原位腦膠質(zhì)瘤18F-cMET - 2PET活體分子成像
[0081 ] 建立裸鼠原位不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤模型：U87MG，WH0 IV;U251MG，WH0 III-IV和 Hs683，WH0 I-II。探針18F - cMET - 2注射后一小時(shí)，行5分鐘靜態(tài)PET成像掃描，并結(jié)合CT掃 描。結(jié)果如圖8。邴一cMET -2在靜脈注射后1小時(shí)后在腫瘤部位現(xiàn)明顯聚集，且腫瘤對(duì)探針 的攝取量與腫瘤級(jí)別呈正相關(guān)。Western bLot結(jié)果表明：C-MET的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的級(jí)別 呈正相關(guān)，即膠質(zhì)瘤級(jí)別越高，C-MET的表達(dá)水平越高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 18F-cMET - 2PET可 用于檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤，并對(duì)腦膠質(zhì)瘤的C-MET表達(dá)水平進(jìn)行定量，同時(shí)判斷腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后。 (實(shí)驗(yàn)證實(shí):探針的腫瘤/肌肉比值達(dá)到3.4:1;腫瘤/腦組織比值約為4.67:1)和信號(hào)/噪聲 比值很高(實(shí)驗(yàn)證實(shí):探針的腫瘤/噪聲比值達(dá)到3.7:1)。活體PET/CT定量結(jié)果與動(dòng)物處死 后的探針全身分布結(jié)果一致。
[0082] 5)肺癌的18F-cMET - 2PET活體分子成像
[0083] 建立裸鼠皮下肺癌A549模型。探針18F-cMET - 2注射后一小時(shí)，行5分鐘靜態(tài)PET成 像掃描，并結(jié)合CT掃描。結(jié)果如圖9。18?-cMET - 1在靜脈注射后1小時(shí)后在腫瘤部位現(xiàn)明顯 聚集，經(jīng)大量未標(biāo)記的19F - cMET - 2阻斷后，探針在腫瘤中的聚集量明顯減少，說(shuō)明探針在 腫瘤中聚集的靶向特異性。
[0084] 6)18F-cMET -2 對(duì) U87MG 細(xì)胞的 IC50
[0085] 使用10 %FBS，加雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM，在96孔板中孵育U87MG細(xì)胞5000個(gè)/孔。 孵育24h后，在96孔板的第一豎排加入500μΜ的18F -cMET - 2,剩下各排分別等倍稀釋后加 入。藥品加入完畢后孵育48h，接著進(jìn)行MTT試驗(yàn)得到該化合物對(duì)U87MG細(xì)胞的半數(shù)有效濃度 IC50。經(jīng)檢測(cè)18F-cMET - 2的IC50約為ΙΟΟηΜ，如圖10所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種放射性C-MET靶向親和小分子化合物，結(jié)構(gòu)為：其中Ri~7為11、1中、11(：、758匕768匕 1241、0(^^、1^^或吣0厶6厶，1?1至1?7不同時(shí)為氫，或1?1、1?3 為18F，11C，75Br J6Br、124I、DOTA、NOTA、NODAGA烷基取代物，R2為芐基及其取代物； 所述的D0TA、N0TA、N0DAGA的結(jié)構(gòu)式為：R為與cMET母體化合物相連接的部位。2. 如權(quán)利要求1所述小分子化合物，其特征在于，所述Ri、R3的放射性同位素18F、nC、 75Br、76Br、124I、DOTA、ΝΟΤΑ、NODAGA烷基取代化合物為：FvH^ jc其中R8為連接部位，為〇， S，C，NH或Ν，當(dāng)R8為N時(shí)，其可以連接另一個(gè)烷基取代基;η = 0~5，Χ為18F、nC、75Br、76Br、 124I、 DOTA、ΝΟΤΑ、NODAGA 中的一種。3. 如權(quán)利要求1所述小分子化合物，其特征在于，當(dāng)R2為芐基及其取代物時(shí)，其結(jié)構(gòu)如 下：其中 R9到Ri3為H，18F，11C，75Br、 76Br、124I、NO2、OH、COOH、CF3、SO4H、PO 3H2、DOTA、ΝΟΤΑ或 NODAGA，Ri，R3-7，R9-13不同時(shí)為H。4. 權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的化合物用作腫瘤成像的探針。5. 權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的化合物在制備抗癌藥物上的用途。
【文檔編號(hào)】C07D215/38GK106008339SQ201610402431
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】程震, 張翱, 申寶忠, 卜麗紅, 陳浩
【申請(qǐng)人】武漢綠海棕生物科技有限公司