一種谷胱甘肽的高效分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種谷胱甘肽的高效分離純化方法，主要包括以下步驟：制備GSCu沉淀并稀釋，加入硫化物生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，離心，壓濾或微濾，樹脂純化，減壓濃縮，結(jié)晶，真空干燥。該谷胱甘肽的高效分離純化方法將銅鹽沉淀法與樹脂純化法有效地結(jié)合，最大限度地降低谷胱甘肽在提取過程的損失和變性，盡可能地排除雜質(zhì)的干擾；操作簡單，易于控制，處理周期短，能耗低，特別適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本發(fā)明所提供的谷胱甘肽的高效分離純化方法具有良好的應(yīng)用前景與市場潛力。
【專利說明】
一種谷胱甘肽的高效分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種谷胱甘肽的高效分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘肽(Glutath1ne，GSH)，全稱γ_L_谷氨酸_L_半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的含巰基的生物活性三肽化合物，是生物體內(nèi)重要的非蛋白巰基化合物之一。
[0003]谷胱甘肽普遍存在于動(dòng)植物細(xì)胞和微生物中，尤其在酵母、小麥胚芽以及人和動(dòng)物肝臟、腎、紅細(xì)胞和眼睛晶狀體中含量較為豐富。它主要以還原型(GSH)和氧化型(GSSH)兩種形態(tài)存在，其中在機(jī)體中大量存在并起主要作用的是還原型谷胱甘肽，本發(fā)明中提及的谷胱甘肽均是指還原型的谷胱甘肽。谷胱甘肽具有多種生理功能，尤以抗氧化和整合解毒作用最為突出，同時(shí)谷胱甘肽在細(xì)胞增殖、凋亡、成纖維過程中也扮演著重要角色。隨著研究的不斷深入，谷胱甘肽在臨床醫(yī)學(xué)、保健品、食品添加劑以及動(dòng)物飼料等方面的應(yīng)用正引起廣泛的關(guān)注，市場前景需求量正日益加大。
[0004]然而，國內(nèi)生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝還不夠成熟，其發(fā)展瓶頸主要在于發(fā)酵水平低下，后續(xù)提純工藝收率低，因而所得產(chǎn)品純度低、質(zhì)量差、成本高。解決上述問題對(duì)實(shí)現(xiàn)我國GSH大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，改變GSH原料依賴進(jìn)口的尷尬局面并推動(dòng)我國醫(yī)學(xué)工業(yè)、保健行業(yè)和食品工業(yè)的發(fā)展有著十分重要的意義，同時(shí)具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
[0005]隨著發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化及其菌種選育的多種方法的發(fā)展，發(fā)酵法已經(jīng)成為國內(nèi)外生產(chǎn)谷胱甘肽最普遍的方法，然而未能有效實(shí)現(xiàn)低成本、高收率、高純度地從發(fā)酵液獲得谷胱甘肽一直是谷胱甘肽產(chǎn)業(yè)化的障礙，也日益成為研究的熱點(diǎn)之一。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中，已報(bào)道的關(guān)于從發(fā)酵液中提純分離出GSH的方法主要有:銅鹽法、離子交換法、親和層析法、雙水相萃取、反膠束萃取等。其中，銅鹽法作為一種傳統(tǒng)的提取方法，選擇性強(qiáng)，收率高且易于操作，有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值;然而，在操作過程中，容易引入雜質(zhì)而造成產(chǎn)品純度不高。離子交換法也是一種提純GSH的常用手段，但是，所用填料成本偏高且使用壽命偏短，生產(chǎn)周期長且廢水處理量大，因而在工業(yè)生產(chǎn)中常被限制。其中，親和層析法是一種有效分離GSH的方法，但含汞樹脂穩(wěn)定性差且易泄露，因此不宜在食品藥品領(lǐng)域應(yīng)用。應(yīng)用雙水相萃取法分離GSH，雖然效率較高，但由于雙水相組成系統(tǒng)一般比較昂貴，生產(chǎn)成本高，這使得它在技術(shù)上的優(yōu)勢被削弱。其中，反膠束萃取谷胱甘肽是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ姆椒?，但其工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用還不成熟，目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。
[0007]由此可見，現(xiàn)有技術(shù)尚未能提供一種適于工業(yè)化生產(chǎn)的分離純化谷胱甘肽的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷與不足，為了獲得一種適于工業(yè)化生產(chǎn)的分離純化谷胱甘肽的方法，發(fā)明人研發(fā)出一種從大腸桿菌發(fā)酵液中分離純化谷胱甘肽的方法，其將銅鹽沉淀法與樹脂純化法巧妙地有效結(jié)合，通過銅鹽沉淀法提取谷胱甘肽液，利用離子交換樹脂除去色素等雜志以提高純度，再濃縮、結(jié)晶，得到純的谷胱甘肽晶體。
[0009]因此，本發(fā)明所提供的技術(shù)方案為:
一種谷胱甘肽的高效分離純化方法，包括以下步驟:
(1)將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入純水，充分?jǐn)嚢?，使GSCu沉淀懸浮液的勻漿濕重為300-500g/L;
(2)向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化物，攪拌反應(yīng)，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；
(3)將所述谷胱甘肽母液離心，得到含谷胱甘肽的上清液；
(4)對(duì)所述上清液進(jìn)行壓濾或微濾，用于除去顆粒雜質(zhì)；
(5)將步驟(4)所得的濾液上樣于陽離子交換樹脂或大孔吸附樹脂，洗滌平衡后，以解吸附溶液進(jìn)行洗脫，得到谷胱甘肽溶液；
(6)將所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa壓力下且在55?65°C下減壓濃縮，制得谷胱甘肽濃縮液；
(7)采用乙醇溶液對(duì)谷胱甘肽濃縮液進(jìn)行結(jié)晶操作，得到谷胱甘肽晶體粗品；
(8)真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純的谷胱甘肽晶體。
[0010]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(2)中，以150?250rpm的攪拌速度進(jìn)行攪拌反應(yīng)45?60 min。
[0011 ]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法中，所述硫化物選自以下任一種:硫化氫，硫化鈉，硫化鉀和硫化銨。
[0012]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(4)中，所述壓濾或微濾采用的濾布或?yàn)V膜的孔徑為0.45μπι。
[0013]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法中，所述陽離子交換樹脂選自以下任一種:DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，HD-8大孔強(qiáng)酸型樹脂，D-61大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂;所述大孔吸附樹脂選自以下任一種:SP207大孔吸附樹脂，XDA-1大孔吸附樹脂，DA201-C大孔吸附樹脂。
[0014]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(3)中，還包括:使用鹽酸或磷酸或硝酸調(diào)節(jié)所述上清液的pH至2?4。
[0015]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(5)中，采用陽離子交換樹脂時(shí)相應(yīng)使用的解吸附溶液為氫氧化銨水溶液、氯化鈉水溶液或鹽酸;采用大孔吸附樹脂時(shí)相應(yīng)使用的解吸附溶液為乙醇水溶液。
[0016]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(6)中所述的谷胱甘肽濃縮液的濃度為380?420 g/Lo
[0017]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(7)為:向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接著使用鹽酸或磷酸或硝酸調(diào)節(jié)谷胱甘肽乙醇溶液的PH至2?4，以150?250 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65?75%的乙醇溶液洗滌2~4次，得到谷胱甘肽晶體粗品。
[0018]優(yōu)選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(8)為:在-0.07Mpa?OMpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純度多98%的谷胱甘肽晶體。
[0019]由于本發(fā)明所提供的谷胱甘肽的高效分離純化方法將銅鹽沉淀法與樹脂純化法有效地結(jié)合;在銅鹽沉淀階段，利用GSH與氧化亞銅絡(luò)合生成沉淀的特性完成固液分離，從而除去大部分的蛋白質(zhì)和鹽分，初步濃縮提純了 GSH，利于下一步的樹脂純化;在樹脂純化階段，由于蛋白質(zhì)和鹽分等干擾成分的減少，提高了樹脂對(duì)GSH的吸附量，從而進(jìn)一步提高了生產(chǎn)效率。因此，本發(fā)明所提供的谷胱甘肽的高效分離純化方法充分利用兩者的優(yōu)點(diǎn)，解決了谷胱甘肽不易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)問題;此外，所述分離純化方法操作簡單，易于控制，處理周期短，能耗低，因而生產(chǎn)成本低，特別適合用于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，本發(fā)明所提供的谷胱甘肽的高效分離純化方法具有良好的應(yīng)用前景與市場潛力。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施方式。
[0021]第一方面，本發(fā)明提供了一種谷胱甘肽的高效分離純化方法，包括以下步驟:
(1)將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入純水，充分?jǐn)嚢?，使GSCu沉淀懸浮液的勻漿濕重為300-500g/L;
(2)向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化物，攪拌反應(yīng)，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；
(3)將所述谷胱甘肽母液離心，得到含谷胱甘肽的上清液；
(4)對(duì)所述上清液進(jìn)行壓濾或微濾，用于除去顆粒雜質(zhì)；
(5)將步驟(4)所得的濾液上樣于陽離子交換樹脂或大孔吸附樹脂，洗滌平衡后，以解吸附溶液進(jìn)行洗脫，得到谷胱甘肽溶液；
(6)將所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa壓力下且在55?65°C下減壓濃縮，制得谷胱甘肽濃縮液；
(7)采用乙醇溶液對(duì)谷胱甘肽濃縮液進(jìn)行結(jié)晶操作，得到谷胱甘肽晶體粗品；
(8)真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純的谷胱甘肽晶體。
[0022]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(2)中，以150?250 rpm的攪拌速度進(jìn)行攪拌反應(yīng)45?60
mino
[0023]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述硫化物選自以下任一種:硫化氫，硫化鈉，硫化鉀和硫化銨。
[0024]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(4)中，所述壓濾或微濾采用的濾布或?yàn)V膜的孔徑為0.45ym0
[0025]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述陽離子交換樹脂選自以下任一種:DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，HD-8大孔強(qiáng)酸型樹脂，D-61大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂；所述大孔吸附樹脂選自以下任一種:SP207大孔吸附樹脂，XDA-1大孔吸附樹脂，DA201-C大孔吸附樹脂。
[0026]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(3)中，還包括:使用鹽酸或磷酸或硝酸調(diào)節(jié)所述上清液的pH至2?4。
[0027]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(5)中，采用陽離子交換樹脂時(shí)相應(yīng)使用的解吸附溶液為氫氧化銨水溶液、氯化鈉水溶液或鹽酸;采用大孔吸附樹脂時(shí)相應(yīng)使用的解吸附溶液為乙醇水溶液。
[0028]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(6)中所述的谷胱甘肽濃縮液的濃度為380?420g/L。
[0029]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(7)為:向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接著使用鹽酸或磷酸或硝酸調(diào)節(jié)谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2?4，以150-250 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65?75%的乙醇溶液洗滌2~4次，得到谷胱甘肽晶體粗品。
[0030]在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，步驟(8)為:在-0.07 Mpa~0 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純度多98%的谷胱甘肽晶體。
[0031]下述谷胱甘肽的分離純化實(shí)施例均按照本發(fā)明所提供的技術(shù)方案實(shí)施，其中所使用的試劑或原料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得，所述步驟如無特別說明則均為常規(guī)處理操作。
[0032]實(shí)施例1
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以250 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)I小時(shí)，生成仏^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液;用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強(qiáng)酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.07 Mpa壓力下且在65°C下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至55°C的50 %的乙醇溶液，接著使用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，以200 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.07 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到174g谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.6%,總收率為72.5%。
[0033]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.11%、Η 5.54%、0 31.25%。
[0034]實(shí)施例2
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以200 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)50分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入磷酸調(diào)節(jié)pH至3，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于DOOl大孔強(qiáng)酸性苯乙稀系陽離子交換樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以2.0%鹽酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.05Mpa壓力下且在60 °C下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至60°C的55%的乙醇溶液，接著使用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，以200 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度70%的乙醇溶液洗滌3次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.07 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到17 0.6 g谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(H P L C)檢測純度為9 8.4 %，總收率為71.1%。
[0035]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.07%、Η 5.57%,O 31.26%。
[0036]實(shí)施例3
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以150 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)45分鐘，生成仏^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸調(diào)節(jié)pH至2，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于SP207大孔吸附樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以20 %乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.03Mpa壓力下且在65 °C下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至65°C的60 %的乙醇溶液，接著使用磷酸調(diào)節(jié)pH至2，以250 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度75%的乙醇溶液洗滌4次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.01 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到178.6g谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.9%，總收率為74.4%。
[0037]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.23%。
[0038]實(shí)施例4
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以200 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)60分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入磷酸調(diào)節(jié)PH至2，用0.45μπι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于SP207大孔吸附樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以20 %乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.07Mpa壓力下且在65 V下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至55 0C的60 %的乙醇溶液，接著使用磷酸調(diào)節(jié)pH至3，以200 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌4次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.05 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到164.4 g谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.6%,總收率為68.5%。
[0039]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.07%、Η 5.59%、0 31.25%。
[0040]實(shí)施例5
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化鈉，并以200 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)60分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸調(diào)節(jié)pH至2，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強(qiáng)酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.06Mpa壓力下且在55 °C下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至55°C的55 %的乙醇溶液，接著使用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，以150 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度70%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.04Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到153.8g谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.2%，總收率為64.1%。
[0041 ] 所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.10%、Η 5.56%、0 31.26%。
[0042]實(shí)施例6
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化鉀，并以250 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)45分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強(qiáng)酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以2.5%鹽酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在OMpa壓力下且在65°C下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至600C的55 %的乙醇溶液，接著使用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，以200 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌3次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.04Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到150.5 g谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.4%,總收率為62.7%。
[0043]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.09%^H 5.57%,O 31.25%。
[0044]實(shí)施例7
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化: 取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢瑁ㄈ葜?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化銨，并以150 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)50分鐘，生成仏^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸調(diào)節(jié)pH至2，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于SP207大孔吸附樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以20 %乙醇水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.02Mpa壓力下且在60°C下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至55°C的50%的乙醇溶液，接著使用稀硝酸調(diào)節(jié)pH至3，以150 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度75%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.06Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到153.1 g谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.4%，總收率為63.8%。
[0045]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.22%。
[0046]實(shí)施例8
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以150 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)60分鐘，生成仏^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸調(diào)節(jié)pH至3，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強(qiáng)酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸+0.3mo 1/L氯化鈉水溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為lOOmL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.07Mpa壓力下且在65 °C下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至60°C的60%的乙醇溶液，接著使用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，以150 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.05Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到178.8 g谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.7%,總收率為74.5%。
[0047]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.06%^H 5.56%、0 31.27%。
[0048]實(shí)施例9
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化銨，并以250 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)60分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強(qiáng)酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在OMpa壓力下且在65°C下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至600C的50 %的乙醇溶液，接著使用鹽酸調(diào)節(jié)pH至3，以200 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度75%的乙醇溶液洗滌3次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.02Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到134.Sg谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.5%,總收率為56.2%。
[0049]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.23%。
[0050]實(shí)施例10
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進(jìn)行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分?jǐn)嚢?，定容?L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉(zhuǎn)移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化銨，并以200 rpm的轉(zhuǎn)速攪拌反應(yīng)60分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉(zhuǎn)速為6000 rpm離心機(jī)離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質(zhì)，收集濾液3.5L，上樣于SP207大孔吸附樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速為lOOmL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.07 Mpa壓力下且在65 V下減壓濃縮，使GSH濃度達(dá)到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至55 0C的50 %的乙醇溶液，接著使用磷酸調(diào)節(jié)pH至3，以200 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.07Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到134.Sg谷胱甘肽晶體，經(jīng)高效液相(HPLC)檢測純度為98.6%,總收率為56.2%。
[0051 ] 所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.07%、Η 5.57%,O 31.26%。
[0052]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入純水，充分?jǐn)嚢?，使GSCu沉淀懸浮液的勻漿濕重為300-500g/L; (2)向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化物，攪拌反應(yīng)，生成⑶^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液； (3)將所述谷胱甘肽母液離心，得到含谷胱甘肽的上清液； (4)對(duì)所述上清液進(jìn)行壓濾或微濾； (5)將步驟(4)所得的濾液上樣于陽離子交換樹脂或大孔吸附樹脂，洗滌平衡后，以解吸附溶液進(jìn)行洗脫，得到谷胱甘肽溶液； (6)將所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa壓力下且在55?65°C下減壓濃縮，制得谷胱甘肽濃縮液； (7)采用乙醇溶液對(duì)谷胱甘肽濃縮液進(jìn)行結(jié)晶操作，得到谷胱甘肽晶體粗品； (8)真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純的谷胱甘肽晶體。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(2)中，以150?250 rpm的攪拌速度進(jìn)行攪拌反應(yīng)45?60 min。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，所述硫化物選自以下任一種:硫化氫，硫化鈉，硫化鉀和硫化銨。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(4)中，所述壓濾或微濾采用的濾布或?yàn)V膜的孔徑為0.45μπι。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，所述陽離子交換樹脂選自以下任一種:D001大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，HD-8大孔強(qiáng)酸型樹脂，D-61大孔強(qiáng)酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂;所述大孔吸附樹脂選自以下任一種:SP207大孔吸附樹脂，XDA-1大孔吸附樹脂，DA201-C大孔吸附樹脂。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(3)中，還包括:使用鹽酸或磷酸或硝酸調(diào)節(jié)所述上清液的PH至2?4。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(5)中，采用陽離子交換樹脂時(shí)相應(yīng)使用的解吸附溶液為氫氧化銨水溶液、氯化鈉水溶液或鹽酸;采用大孔吸附樹脂時(shí)相應(yīng)使用的解吸附溶液為乙醇水溶液。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(6)中所述的谷胱甘肽濃縮液的濃度為380?420 g/Lo9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(7)為:向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預(yù)熱至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接著使用鹽酸或磷酸或硝酸調(diào)節(jié)谷胱甘肽乙醇溶液的PH至2?4，以150?250 rpm的轉(zhuǎn)速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65?75%的乙醇溶液洗滌2~4次，得到谷胱甘肽晶體粗品。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(8)為:在-.0.07 Mpa-O Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純度多98%的谷胱甘肽晶體。
【文檔編號(hào)】C07K5/037GK106008664SQ201610593413
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月26日
【發(fā)明人】劉世領(lǐng), 王德正
【申請(qǐng)人】上海青平藥業(yè)有限公司