一種尖吻蝮蛇毒高效價(jià)抗血清的制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種尖吻蝮蛇毒高效價(jià)抗血清的制備方法及其應(yīng)用，包括以下步驟：a、按照0.1g尖吻蝮蛇原毒加50 mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性；b、將經(jīng)過Na2EDTA處理的無出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝膠中；c、將含蛇毒的凝膠磨細(xì)后免疫注射家兔，4次免疫注射，之間間隔7天，第一次注射皮下注射1.25 mL,腹腔注射2.25 mL，第二、第三、第四次注射均腹腔注射3.5 mL，第四次注射后第3天以切斷頸動(dòng)脈方式殺死家兔取血，6小時(shí)后離心獲得抗血清，冷凍保存。本發(fā)明保證被免疫動(dòng)物健康存活、降低抗血清的生產(chǎn)成本、制備出了高效價(jià)的抗血清。
【專利說明】
一種尖吻蝮蛇毒高效價(jià)抗血清的制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 一種尖吻蝮蛇毒高效價(jià)抗血清的制備方法及其應(yīng)用，屬免疫技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]尖吻蝮蛇acutus)俗稱五步蛇，屬于蝮亞科、蝮屬，分布于我國長江以南地區(qū)(包括臺(tái)灣)，是我國特有劇毒蛇。該蛇毒為血循環(huán)型毒蛇，其主要毒素為出血毒素，前人從尖吻蝮蛇毒液中分尚出4種出血毒素，被尖吻蝮蛇咬傷后傷口和內(nèi)臟大量出血，致死、致殘率極高。
[0003]目前治療尖吻蝮蛇咬傷的有效方法是注射抗血清，傳統(tǒng)方法制備全毒抗血清采用福氏佐劑乳化后免疫注射動(dòng)物的方法，由于乳化后的蛇毒出血活性仍然很強(qiáng)，因此，注射的抗原量比較小，否則被免疫的動(dòng)物就會(huì)死亡，抗原量小導(dǎo)致抗血清效價(jià)低，因此治療效果不佳。制備高效價(jià)全毒抗血清對(duì)于有效治療尖吻蝮蛇咬傷，降低致死和致殘率有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明旨在利用尖吻蝮蛇毒的出血毒素都含Ca2+，Na2EDTA可以通過螯合Ca2+使出血活性喪失、抗原性仍然保留的特點(diǎn)，全毒中加入Na2EDTA消除出血活性，然后將無出血活性的蛇毒蛋白包圍到網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中，將含蛇毒蛋白的凝膠磨細(xì)后免疫注射家兔，獲得高效價(jià)的抗尖吻蝮蛇全毒抗血清。
[0005]本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下:
一種尖吻蝮蛇毒高效價(jià)抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
a、按照0.1g尖吻蝮蛇原毒加50mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性；
b、蛇毒蛋白的包埋將經(jīng)過Na2EDTA處理的無出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝膠中；
C、將含蛇毒的凝膠磨細(xì)后免疫注射家兔，4次免疫注射，之間間隔7天，第四次注射后取血，6小時(shí)后離心獲得抗血清。
[0006]所述的尖吻蝮蛇毒高效價(jià)抗血清的制備方法制得的抗血清。
[0007]所述的抗血清在治療尖吻蝮蛇咬傷患者上的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明技術(shù)效果體現(xiàn)在幾個(gè)方面:
1、保證被免疫動(dòng)物健康存活
由于出血活性被抑制，注射部位不會(huì)發(fā)生出血和壞死，因此，被注射動(dòng)物不會(huì)因?yàn)榭乖母弊饔枚劳?，保證了制備抗血清實(shí)驗(yàn)的成功。
[0009]2、不使用昂貴的福氏佐劑，降低抗血清的生產(chǎn)成本
本發(fā)明將蛇毒蛋白包埋在網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中，蛇毒蛋白從網(wǎng)狀的聚丙烯酰胺凝膠中緩慢釋放到動(dòng)物體內(nèi)，用這種方法不但抗原在動(dòng)物體內(nèi)停留時(shí)間長，充分刺激免疫系統(tǒng)，而且用聚丙烯酰胺凝膠替代了昂貴的福氏佐劑。
[0010]3、制備的抗血清效價(jià)高
通過比較，本發(fā)明比傳統(tǒng)方法制備的抗血清效價(jià)高出2.5倍，因此注射同等量的抗血清治療效果大大提高，如果少注射抗血清，則可以降低異原血清對(duì)人體的副作用。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例一:
第一步:尖吻蝮蛇出血活性的抑制
取5mL體積的干凈塑料管，將0.1g尖吻蝮蛇原溶解于2.0 mL 0.1M Tris-HCKpH 8.8)緩沖液中，加50 mg Na2EDTA并充分溶解；
第二步:蛇毒蛋白的包埋
將上述無出血活性的溶液加入1.4mL 30%丙烯酰胺、50uL 10 %過硫酸銨、2uL四甲基乙二胺(TEMED)，充分混勻，沿試管壁緩慢加入0.5mL異丙醇，I h后凝固，去除異丙醇，取出膠體用手術(shù)刀評(píng)分成4份，每份約I g，冷凍保存；
第三步:注射免疫家兔，獲得抗血清
取I份上述膠體，加2.0 mL生理鹽水，于研缽內(nèi)充分磨細(xì)，吸入到5mL規(guī)格的一次性注射器中，總體積約3.5mL，免疫注射2.5kg左右的家兔，共注射4次，二次之間間隔7天，第一次注射皮下注射1.25mL，腹腔注射2.25mL，第二、第三、第四次注射均腹腔注射3.5mL，第四次注射后第3天以切斷頸動(dòng)脈方式殺死家兔取血，6小時(shí)后離心獲得抗血清，冷凍保存。
[0012]第四步:抗血清效價(jià)的測(cè)定抗血清效價(jià)的測(cè)定與ELISA方法相似。
[0013]將尖吻蝮蛇原毒用包被液(0.1mol/LpH 9.5的碳酸鹽緩沖液)配制成10yg/mL作為抗原樣品，將待測(cè)抗血清進(jìn)行倍比稀釋，以不含尖吻蝮蛇毒的包被液代替抗原樣品為空白，以未免疫的家兔血清替代待測(cè)抗血清作為陰性對(duì)照，用制備的抗血清作為一抗，羊抗兔IgG-堿性磷酸酶為二抗，I mg/mL的p-NPP為底物，顯色45分鐘后在酶標(biāo)儀上測(cè)定0D4Q5值，以空白對(duì)照調(diào)零，待測(cè)抗血清的吸光值2倍于陰性血清吸光值的效價(jià)定為I，通過計(jì)算抗血清的稀釋倍數(shù)計(jì)算未稀釋前抗血清的效價(jià)。ELI SA檢測(cè)的大致步驟如下:
(I)抗原包被:酶標(biāo)板每孔加200yL包被抗原，酶標(biāo)板置4°C冰箱過夜。
[0014](2)封閉:加封閉液，每孔200 yL ,37 °C孵育I h。
[0015](3)加一抗:加入倍比稀釋的抗血清(ELISA緩沖液稀釋)，陰性為未免疫的家兔血清，37 0C孵育I h0
[0016](4)加酶標(biāo)二抗:所有酶標(biāo)板孔加入1/10000的羊抗兔IgG-堿性磷酸酶(Sigma，ELISA緩沖液稀釋)，37 °C孵育I h。
[0017](5)加底物:1 mg/mL的p-NPP(Sigma，溶于底物緩沖液，pH 9.8),37 °C黑暗中孵育30 min，測(cè)0D4Q5值。
[0018]經(jīng)過計(jì)算，“實(shí)施例一”制備的抗血清效價(jià)達(dá)到510，而用常規(guī)蛇毒加福氏佐劑乳化制備的抗血清效價(jià)只有200，可見本發(fā)明制備的抗血清效價(jià)提高約2.5倍。
[0019]實(shí)施例二:
第一步:尖吻蝮蛇出血活性的抑制
取5mL體積的干凈塑料管，將0.09g尖吻蝮蛇原溶解于1.8mL 0.1M Tris-HCKpH 8.8)緩沖液中，加40mgNa2EDTA并充分溶解；
第二步:蛇毒蛋白的包埋
將第一步獲得的無出血活性的溶液加入I.3mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %過硫酸銨、2uLTEMED，充分混勻，其他步驟與“實(shí)施例一”第二步相同；
第三步:注射免疫家兔，獲得抗血清與“實(shí)施例一”第三步相同。
[0020]第四步:抗血清效價(jià)的測(cè)定檢測(cè)過程與“實(shí)施例一”第四步相同。
[0021]經(jīng)過計(jì)算，“實(shí)施例二”制備的抗血清效價(jià)達(dá)到550，而用常規(guī)蛇毒加福氏佐劑乳化制備的抗血清效價(jià)只有200，可見本發(fā)明制備的抗血清效價(jià)提高約2.6倍。
[0022]實(shí)施例三:
第一步:尖吻蝮蛇出血活性的抑制
取5mL體積的干凈塑料管，將0.1lg尖吻蝮蛇原溶解于2.2mL 0.1M Tris-HCKpH 8.8)緩沖液中，加60mgNa2EDTA并充分溶解；
第二步:蛇毒蛋白的包埋
將第一步獲得的無出血活性的溶液加入I.5mL 30%丙烯酰胺、50uL10 %過硫酸銨、2uLTEMED，充分混勻，其他步驟與“實(shí)施例一”第二步相同；
第三步:注射免疫家兔，獲得抗血清與“實(shí)施例一”第三步相同。
[0023]第四步:抗血清效價(jià)的測(cè)定
抗血清效價(jià)的測(cè)定與ELISA方法相似。檢測(cè)過程與“實(shí)施例一”第四步相同。
[0024]經(jīng)過計(jì)算，“實(shí)施例三”制備的抗血清效價(jià)達(dá)到510，而用常規(guī)蛇毒加福氏佐劑乳化制備的抗血清效價(jià)只有200，可見本發(fā)明制備的抗血清效價(jià)提高約2.5倍。
[0025]本發(fā)明用不同劑量的尖吻蝮蛇毒，采用Na2EDTA消除出血活性，聚丙烯酰胺凝膠包埋代替乳化，均獲得穩(wěn)定和滿意的結(jié)果，說明該技術(shù)實(shí)用、可靠。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種尖吻蝮蛇毒高效價(jià)抗血清的制備方法，其特征在于包括以下步驟:a、按照0.1g尖吻蝮蛇原毒加50mg Na2EDTA的比例用Na2EDTA抑制尖吻蝮蛇的出血活性； b、蛇毒蛋白的包埋將經(jīng)過Na2EDTA處理的無出血活性的尖吻蝮蛇蛇毒包埋于聚丙烯酰胺凝膠中； C、將含蛇毒的凝膠磨細(xì)后免疫注射家兔，4次免疫注射，之間間隔7天，第四次注射后第3天以切斷頸動(dòng)脈方式殺死家兔取血，6小時(shí)后離心獲得抗血清。2.權(quán)利要求1所述的尖吻蝮蛇毒高效價(jià)抗血清的制備方法制得的抗血清。3.權(quán)利要求2所述的抗血清在治療尖吻蝮蛇咬傷患者上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/395GK106008713SQ201610633985
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月5日
【發(fā)明人】韋傳寶
【申請(qǐng)人】安徽威爾試劑盒科技有限責(zé)任公司