抗人pd-1人源化單克隆抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種抗人PD?1人源化單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明通過篩選得到了具有良好特異性、較高的親和性和穩(wěn)定性的抗人PD?L1人源化單克隆抗體，該抗體能夠特異性地與人PD?1結(jié)合，并且不結(jié)合CD28家族其它成員，阻斷PD?L1與PD?1相結(jié)合，部分恢復(fù)T細(xì)胞的功能，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。
【專利說明】
抗人PD-1人源化單克隆抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種抗人ro-i人源化單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] T細(xì)胞活化需要兩個(gè)信號(hào)，第1信號(hào)來自T細(xì)胞抗原受體(TCR)與抗原肽-MHC復(fù)合物 的結(jié)合，為抗原特異性的;第2信號(hào)即協(xié)同刺激信號(hào)，由T細(xì)胞上粘附分子的受體與抗原提呈 細(xì)胞(APC)上相應(yīng)的配體結(jié)合，為抗原非特異性的。第2信號(hào)在T細(xì)胞活化中具有重要的作 用，若無協(xié)同刺激分子提供第2信號(hào)，T細(xì)胞識(shí)別抗原后將處于無應(yīng)答狀態(tài)或凋亡。CD28/ CTLA-4與其配體B7-UB7-2的結(jié)合為T細(xì)胞活化所必需的協(xié)同刺激通路，參與機(jī)體抗原特異 性體液免疫和細(xì)胞免疫。CD28-B7家族的新成員，包括：ICOS(inducible costimulator)及 其配體B7RP-1 以及PD-1 (programmed death-1)及其配體PD-L1 和PD-L2<XD28和IC0S可傳遞 協(xié)同刺激(陽性)信號(hào);而CTLA-4和ro-i則傳遞抑制性(陰性)信號(hào)。T細(xì)胞活化的陽性和陰性 信號(hào)之間的平衡，對(duì)機(jī)體抵抗外來抗原的入侵，防止自身免疫反應(yīng)的發(fā)生起著關(guān)鍵作用。
[0003] PD-1是55KD的跨膜蛋白，與CD28、IC0S和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL)相關(guān)抗原4 (CTLA-4)同屬免疫球蛋白超家族成員。其胞外區(qū)只有1個(gè)IgV樣區(qū)，與CTLA-4有23%的同源 性，但無結(jié)合B7-1/B7-2必需的MYPPPY基序；胞漿區(qū)有2個(gè)酪氨酸殘基，尾部有1個(gè)ITIM (immunoreceptor tryosine-based inhibitory motif)，而無 YXXM基序。其他CD28家族中 的成員以二硫鍵連接的同源二聚體形式而存在，而Η)-1則以單體形式存在。與CD28、CTLA-4 的局限性表達(dá)（主要在T細(xì)胞）不同，PD-1可表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和骨髓細(xì)胞，以及 CD4-CD8-胸腺細(xì)胞。
[0004] ro-i有兩個(gè)配體，ro-Ll(B7-Hl)和ro-L2(B7-DC)，均為B7家族中的新成員，胞外都 有1個(gè)IgV樣區(qū)和1個(gè)IgC樣區(qū)。PD-L1含有290個(gè)氨基酸，其胞外區(qū)與B7-UB7-2分別有20%和 15%的同源性，胞漿區(qū)變化多樣，但二級(jí)結(jié)構(gòu)同B7-UB7-2非常相似。在基因水平上TO-L2與 PD-L1有37.4%的同源性。？0-1^1和?0-1^的表達(dá)與調(diào)節(jié)不同。？0-1^11111^^在非淋巴組織(如胎 盤、心、肺和骨骼?。┲泻控S富，但除巨噬樣細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層外，PD-L1蛋白在正常組織 中幾乎檢測(cè)不到。在APC、T細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上經(jīng)誘導(dǎo)可表達(dá)ro-Ll，而且多種人類的腫瘤中 富含ro-Ll。相反，PD-L2僅在樹突狀細(xì)胞(DC)和單核細(xì)胞上表達(dá)。用IFN- γ處理DC和單核細(xì) 胞后，PD-L1和PD-L2的表達(dá)均上調(diào)。但是，實(shí)際上PD-L1和PD-L2分別受Thl和Th2型細(xì)胞的調(diào) 節(jié)。在巨噬細(xì)胞上，Th 1細(xì)胞分泌的IFN- γ可經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子STAT1上調(diào)H)-L 1的表達(dá);而IFN- γ 需經(jīng)IL-4才能誘導(dǎo)PD-L2表達(dá)，STAT6參與了 IL-4下游的信號(hào)傳導(dǎo)，提示PD-L2的表達(dá)受Th2 細(xì)胞的調(diào)節(jié)。
[0005] ro-i是免疫抑制性受體，與其配體ro-Li、ro-L2相互作用傳遞抑制性信號(hào)，在免疫 應(yīng)答中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用。PD-1與PD-L1 /PD-L2的結(jié)合，可抑制TCR介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖和 細(xì)胞因子(IL-2、IFN-y及IL-10)產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯，但不增加細(xì)胞死亡。分別阻斷DC 上H)-Ll、ro-L2的表達(dá)，可導(dǎo)致T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子（IFN-γ和IL-10)產(chǎn)生增加，且同時(shí)阻 斷二者表現(xiàn)的作用相加，表明H)-L1和PD-L2的功能是抑制T細(xì)胞活化。PD-1也可參與B細(xì)胞 應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)。PD-1信號(hào)傳導(dǎo)的作用是抑制B細(xì)胞增殖、分化、Ig類型轉(zhuǎn)換，在建立和/或維 持外周自身耐受中起重要作用。PD-1抑制BCR介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制（Molecular Mechanisms)是:PD-1通過其所含SH2區(qū)的酪氨酸磷酸酶2(SHP-2)，使BCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信 號(hào)換能器去磷酸化，從而抑制效應(yīng)分子的酪氨酸磷酸化，包括Igf3、Syk、PLC-y2&ERKl/2。 該抑制作用不需要Ι??Μ N-末端的酪氨酸，而需要C-末端的其他酪氨酸殘基。
[0006] PD-1在抑制TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的同時(shí)，可減弱IC0S、IL-4和IL-21的作用，但不 影響CD28、IL-7和IL-15的效應(yīng)。然而Η)-1信號(hào)傳導(dǎo)能夠抑制亞理想水平的CD28介導(dǎo)的協(xié)同 刺激作用。在某些情況下，PD-1 - PD-L通路可能是第2位的或后備的，只有當(dāng)⑶28-B7協(xié)同刺 激通路缺乏或處于亞理想水平時(shí)，該通路才能發(fā)揮調(diào)節(jié)T細(xì)胞應(yīng)答的作用。在其他情況下， 該通路對(duì)T細(xì)胞活化或分化起核心作用，這可能有賴于正在進(jìn)行的免疫應(yīng)答的特定階段。 APC上抑制性ro-Ll/ro-L2和協(xié)同刺激B7-1/B7-2信號(hào)的相對(duì)水平，可能影響T細(xì)胞活化的程 度，決定廣生耐受還是自身免疫。PD-Li在非淋巴組織上的表達(dá)，提不ro-i -ro-L可能是通 過抑制自身反應(yīng)性Τ、Β細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞而誘導(dǎo)免疫耐受及調(diào)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)。
[0007] 腫瘤細(xì)胞所具有的逃避免疫系統(tǒng)的能力，是通過在其表面產(chǎn)生的程序性死亡配體 (PD-L1)結(jié)合到τ細(xì)胞的ro-i蛋白上實(shí)現(xiàn)的。機(jī)體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)浸潤(rùn)的Τ細(xì)胞高表 達(dá)ro-i分子，腫瘤細(xì)胞會(huì)高表達(dá)PD-1的配體PD-L1和PD-L2，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中ro-i通路持 續(xù)激活，T細(xì)胞功能被抑制而不能發(fā)現(xiàn)腫瘤以至于不能向免疫系統(tǒng)發(fā)出需要攻擊腫瘤和殺 傷腫瘤細(xì)胞的治療。
[0008] PD-1抗體是針對(duì)PD-1的一種抗體蛋白，使得前兩種蛋白不能發(fā)生結(jié)合，阻斷這一 通路，部分恢復(fù)T細(xì)胞的功能，使這些細(xì)胞能夠繼續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞。2014年7月，PMDA批準(zhǔn)全 人源化IgG4抗Η)-1單克隆抗體Nivolumab在日本上市，用于治療晚期黑色素瘤，成為首個(gè)獲 得主要監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的PD-1抗體。20 15年，？04先后批準(zhǔn)默沙東的1^7^11(1& (pembrolizumab)和百時(shí)美施貴寶的0PDIV0( nivolumab)兩種]^-1抗體上市。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種具有良好特異性、較高的親和性 和穩(wěn)定性的抗人ro-i人源化單克隆抗體。
[0010]本發(fā)明第一方面涉及抗人ro-i人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括選自 于如下一組的⑶R區(qū)：
[0011] 重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID 勵(lì)：17-19所示，輕鏈0)1?1、001?2、0)1?3 的序列分別如SEQ ID N0:35-37所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序列。
[0012] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包括選 自于如下的重鏈可變區(qū)框架區(qū)：FRl、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 :20-23所示，或 分別與上述序列的同一性大于70%、80%、85%、90%、95%、99%的序列。
[0013] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其還包括選 自于如下的輕鏈可變區(qū)框架區(qū)：FRl、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 :38-41所示，或 分別與上述序列的同一性大于70%、80%、85%、90%、95%、99%的序列。
[0014] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括選自 于如下的重鏈可變區(qū)：其序列如SEQ ID N0:16所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序 列。
[0015] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其包括選自 于如下的輕鏈可變區(qū)：其序列如SEQ ID N0:34所示，或者分別與上述序列的同一性大于 70%、80%、85%、90%、95%、99% 的序列。
[0016] 具體的，本發(fā)明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其重鏈的序列 如SEQ ID N0:8所示。
[0017] 具體的，本發(fā)明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其輕鏈的序列 如SEQ ID N0:25所示。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的核酸分子，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸 序列，所述重鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0019] (l)SEQ ID N0：17-19；
[0020] (2)與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個(gè)的序列:a)結(jié)合相同抗原表位； b)同一性大于 70%、80%、85%、90% 或 97%。
[0021 ]進(jìn)一步的，所述重鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0022] SEQ ID N0:16,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié)合相同 抗原表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區(qū)中含有一個(gè)到 幾個(gè)核苷酸的替換。
[0023]在本發(fā)明的實(shí)施方案中所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:5所示的序列。
[0024] 進(jìn)一步的，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:7所示的序列。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項(xiàng)的核酸分子，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核酸 序列，所述輕鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0026] (l)SEQ ID NO：35-37；
[0027] (2)與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個(gè)的序列:a)結(jié)合相同抗原表位； b)同一性大于 70%、80%、85%、90% 或 97%。
[0028] 進(jìn)一步的，所述輕鏈可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0029] SEQ ID N0:34,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié)合相同 抗原表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區(qū)中含有一個(gè)到 幾個(gè)核苷酸的替換。
[0030]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:26所示的序列。 [0031] 進(jìn)一步的，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:24所示的序列。
[0032] 本發(fā)明第四方面涉及載體，其含有本發(fā)明第二或第三方面任一項(xiàng)的核酸分子。
[0033] 進(jìn)一步的，本發(fā)明中所指的載體含有本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的核酸分子和第三方 面任一項(xiàng)的核酸分子。
[0034]本發(fā)明第五方面涉及宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第二或第三方面任一項(xiàng)的核酸分子 或本發(fā)明第四方面任一項(xiàng)的載體。
[0035]本發(fā)明第六方面涉及偶聯(lián)物，其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的抗人ro-i人源化單 克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，以及其它生物活性物質(zhì)，所述抗人PD-1人源化單克隆抗體或 其抗原結(jié)合部分直接或通過連接片段與其它生物活性物質(zhì)偶聯(lián)。
[0036]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述其它生物活性物質(zhì)選自可直接或間接抑制細(xì)胞生長(zhǎng) 或殺滅細(xì)胞、或通過激活機(jī)體免疫反應(yīng)從而抑制或殺滅細(xì)胞，從而達(dá)到治療腫瘤的化學(xué)物 質(zhì)、毒素、多肽、酶、同位素、細(xì)胞因子或其他具有生物活性的單一物質(zhì)或混合物質(zhì)。
[0037] 本發(fā)明第七方面涉及組合物(例如藥物組合物），其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的 抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分、第二方面或第三方面任一項(xiàng)的核酸分子、 第四方面任一項(xiàng)的載體、第五方面任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞、或者本發(fā)明第六方面任一項(xiàng)的偶聯(lián) 物，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，以及任選的其它生物活性物質(zhì)。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明第七方面任一項(xiàng)的組合物(例如藥物組合物），所述其它生物活性物質(zhì) 包括但不限于其它抗體、融合蛋白或藥物(例如抗腫瘤藥物，如放、化療藥物）。
[0039] 本發(fā)明還涉及診斷試劑或試劑盒，其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的抗人ro-i人源 化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，所述診斷試劑或試劑盒用于在體外(例如細(xì)胞或組織)或 體內(nèi)（例如人或動(dòng)物模型)診斷與ro-ι相關(guān)的疾病(例如腫瘤或病毒感染，例如ro-Li高表達(dá) 的病毒感染或ro-Li高表達(dá)的腫瘤）。
[0040] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述腫瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、黑 色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質(zhì)瘤、胃癌、鼻咽癌、喉 癌、宮頸癌、子宮體癌、骨肉瘤、甲狀腺癌、前列腺癌;所述病毒感染包括但不限于急性、亞急 性或慢性耶￥、!1(^、!11￥感染。
[0041] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié) 合部分、第二方面或第三方面任一項(xiàng)的核酸分子、第四方面任一項(xiàng)的載體、第五方面任一項(xiàng) 的宿主細(xì)胞、第六方面任一項(xiàng)的偶聯(lián)物或第七方面任一項(xiàng)組合物用于制備預(yù)防或治療與 ro-ι相關(guān)的疾病(例如腫瘤，微生物或病毒感染，例如ro-Li高表達(dá)的腫瘤或ro-Li高表達(dá)的 病毒感染)的藥物的用途。
[0042] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述腫瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、黑 色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質(zhì)瘤、胃癌、鼻咽癌、喉 癌、宮頸癌、子宮體癌、骨肉瘤、甲狀腺癌、前列腺癌;所述微生物感染包括但不限于細(xì)菌、真 菌、原生動(dòng)物感染;所述病毒感染包括但不限于急性、亞急性或慢性HBV、HCV、HIV感染。
[0043] 以下對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述:在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學(xué) 和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的蛋白質(zhì)和核酸化 學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞和組織培養(yǎng)、微生物學(xué)、免疫學(xué)相關(guān)術(shù)語和實(shí)驗(yàn)室操作步驟均為相應(yīng) 領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的術(shù)語和常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語的定 義和解釋。
[0044] 在本發(fā)明中，術(shù)語"抗體"是指通常由兩對(duì)相同的多肽鏈(每對(duì)具有一條"輕"（L)鏈 和一條"重"（H)鏈)組成的免疫球蛋白分子?？贵w輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈可分類為μ、 I γ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可 變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個(gè)氨基酸的"J"區(qū)連接，重鏈還包含大約3個(gè)或更多個(gè)氨基 酸的"D"區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)（V H)和重鏈恒定區(qū)（CH)組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域 (CH1、Ch2和Ch3 )組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)（VL)和輕鏈恒定區(qū)（α)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè) 結(jié)構(gòu)域α組成?？贵w的恒定區(qū)可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種 細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(Clq)的結(jié)合。V H和VL區(qū)還可被細(xì)分為具 有高變性的區(qū)域(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))，其間散布有較保守的稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的區(qū)域。各 VH和VL由按下列順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從氨基末端至羧基末端排列的3 個(gè)CDR和4個(gè)FR組成。各重鏈/輕鏈對(duì)的可變區(qū)(VH和VL)分別形成抗體結(jié)合部位。氨基酸至各 區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md·(1987and 1991))，或Chothia&Lesk (1987) J.Mol .Biol .196 :901-917 ;Chothia等人（1989)Nature 342:878-883的定義。術(shù)語 "抗體"不受任何特定的產(chǎn)生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體 和多克隆抗體?？贵w可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgGl，IgG2，IgG3或IgG4亞 型），IgAl，IgA2，IgD，IgESlgi^j^·^。
[0045] 在本發(fā)明中，術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"是指全長(zhǎng)抗體的一個(gè)或多個(gè)部分，所述 部分保持結(jié)合抗體所結(jié)合的相同抗原(例如，PD-1)的能力，與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)抗原的特異 性結(jié)合。通常參見，F(xiàn)undamental Immunology，Ch· 7(Paul，W.，ed·，第2版，Raven Press， N.Y. (1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的。可通過重組DNA技術(shù)或通過 完整抗體的酶促或化學(xué)斷裂產(chǎn)生抗原結(jié)合部分。在一些情況下，抗原結(jié)合部分包括Fab、 Fab'、F(ab'）2、Fd、Fv、dAb和互補(bǔ)決定區(qū)（Q)R)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗 體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合能力的抗體的至少一部 分。
[0046] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明通過篩選得到了具有良好特異 性、較高的親和性和穩(wěn)定性的抗人PD-1人源化單克隆抗體，該抗體能夠特異性地與人PD-1 結(jié)合，并且不結(jié)合CD28家族其它成員，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用。
[0047] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。
【附圖說明】
[0048]圖1是鼠源Η)-1抗體的ELISA結(jié)合活性結(jié)果圖；
[0049] 圖2是鼠源ro-Ι抗體的ELISA抑制活性結(jié)果圖；
[0050] 圖3是鼠源ro-i抗體的細(xì)胞結(jié)合活性結(jié)果圖；
[0051 ]圖4是鼠源ro-i抗體的細(xì)胞抑制活性結(jié)果圖；
[0052] 圖5是鼠源ro-i抗體的MLR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；
[0053] 圖6是人源化ro-i抗體的ELISA直接結(jié)合活性結(jié)果圖；
[0054] 圖7是人源化ro-i抗體的ELISA抑制結(jié)合活性結(jié)果圖；
[0055] 圖8是人源化ro-i抗體細(xì)胞結(jié)合活性結(jié)果圖；
[0056] 圖9是人源化ro-i抗體人源化ro-i抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對(duì)細(xì)胞因子IFN-γ 分泌的影響圖；
[0057] 圖10是人源化PD-1抗體人源化PD-1抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對(duì)細(xì)胞因子IL-2 分泌的影響圖；
[0058] 圖11是人源化ro-i抗體在血清中的穩(wěn)定性結(jié)果圖；
[0059] 圖12是人源化ro-i抗體與人CD28、CTLA-4的結(jié)合特異性及與不同物種的ro-i蛋白 的結(jié)合結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0060] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0061] 實(shí)施例一鼠源抗體篩選
[0062] 1.1動(dòng)物免疫
[0063] 采用經(jīng)典的免疫時(shí)間表，對(duì)BALB/c小鼠免疫，免疫原為hPD-Ι (人源Η)-1)蛋白（購 自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司），以使動(dòng)物產(chǎn)生抗hPD-Ι的抗體，具體方案如表1所示： [0064]表ihro-ι蛋白動(dòng)物免疫方案
[0065]
[0066]
[0067] 1.2細(xì)胞融合及雜交瘤細(xì)胞篩選
[0068] 融合前調(diào)整小鼠骨髓瘤SP2/0的狀態(tài)，保證其生長(zhǎng)密度不超過于1.0X106個(gè)細(xì)胞， 提前3天進(jìn)行終免，終免采用尾靜脈注射的方式，提前一天準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞，鋪板數(shù)量為2.0 X 104個(gè)細(xì)胞/孔。通過PEG融合，保證脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞的數(shù)量比在10:1到5:1之間，每孔所 鋪脾細(xì)胞數(shù)量不超過1.0X10 5。融合7天以后收獲上清液并更換培養(yǎng)基。
[0069]收獲的上清液首先通過直接ELISA結(jié)合方法進(jìn)行初篩，將篩得的陽性克隆擴(kuò)增后 收上清液進(jìn)行復(fù)篩。
[0070]復(fù)篩采用細(xì)胞結(jié)合以及細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行兩輪篩選，篩選得到的陽性克隆采用有 限稀釋法進(jìn)行亞克隆，鋪96孔板，分別為5個(gè)/孔，2個(gè)/孔和1個(gè)/孔。培養(yǎng)7天后采用直接 ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，挑選陽性亞克隆進(jìn)行擴(kuò)增并保種。
[0071 ]其中，所涉及的各實(shí)驗(yàn)方法的具體步驟如下：
[0072] A、ELISA 結(jié)合方法
[0073] 包被hPD-1-Fc在板上，加入梯度稀釋的抗體，孵育洗滌后，再加入羊抗鼠 -HRP，顯 色，讀數(shù)擬合出反應(yīng)曲線，計(jì)算出EC50值。
[0074] B、細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)
[0075]提前一天將hPD-1-Fc過表達(dá)細(xì)胞鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次日封閉后加入梯 度稀釋的抗體，再加入anti-mouse-EU，讀數(shù)即可。
[0076] C、細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)
[0077]提前一天將hPD-1-Fc過表達(dá)細(xì)胞鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次日封閉后加入梯 度稀釋的抗體，再加入FOl-Fc-Biotin，再加入Europium-labeled streptavidin，讀數(shù)即 可。
[0078] 1.3鼠源抗體的制備及活性鑒定
[0079] 將挑選陽性亞克隆的雜交瘤細(xì)胞接種至SFM培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)7天左右，收集上清，離 心過濾后用Protein G純化柱純化，純化抗體分別進(jìn)行ELISA結(jié)合活性、ELISA抑制活性、細(xì) 胞結(jié)合活性、細(xì)胞抑制活性檢測(cè)和mlr實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過篩選，獲得活性最高的一株鼠源抗ro-i單 克隆抗體，命名為mouse anti-PD-1。
[0080] 其中，所涉及的各實(shí)驗(yàn)方法的具體步驟如下：
[0081] A、ELISA 結(jié)合活性
[0082] 包被PD1-His在板上，加入梯度稀釋的抗體，孵育洗滌后，再加入羊抗鼠-HRP，顯 色，讀數(shù)擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖1所示，計(jì)算出EC50值，其與hPD-Ι結(jié)合活性EC50為 2.402ng/mL〇
[0083] B、ELISA 抑制活性
[0084] 梯度稀釋的抗體和一定濃度的roi-Fc-His預(yù)先孵育，再將混合物加入到包被roi-Fc的板上，孵育洗滌后再加入anti-His-HRP，顯色，讀數(shù)擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖2所示， 計(jì)算IC50值，其抑制活性IC50為3.827nM。
[0085] C、細(xì)胞結(jié)合活性
[0086] 提前一天將H)1-27(PD1過表達(dá)CH0-K1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞)鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次 日封閉后加入梯度稀釋的抗體，洗滌再加入ant i-mouse-EU，然后洗滌加入熒光增強(qiáng)液，讀 數(shù)即可，擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖3所示，計(jì)算出其細(xì)胞結(jié)合活性EC50為87.80ng/mL。 [0087] D、細(xì)胞抑制活性
[0088] 提前一天將H)1-27(PD1過表達(dá)CH0-K1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞)鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次 日封閉后加入梯度稀釋的抗體，再加入HH-Fc，洗滌加入anti-Human-EU，然后洗滌加入熒 光增強(qiáng)液，擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖4所示，計(jì)算出其細(xì)胞抑制活性IC50為284. Ing/mL。
[0089] e、MLR 實(shí)驗(yàn)
[0090] 將磁珠分選出來的⑶4+T細(xì)胞和DC細(xì)胞以一定比例混合鋪板，再加入不同濃度的 anti-PDl鼠單抗，培養(yǎng)5天后，用試劑盒檢測(cè)IFN- γ的濃度，結(jié)果如圖5所示，anti-PDl鼠單 抗能顯著促進(jìn)IFN- γ的表達(dá)
[0091] 實(shí)施例二鼠源抗體人源化及親和力成熟
[0092] 2.1鼠源抗體基因獲取
[0093] 米用Purelink RNA Micro kit提取mouse anti-PD-1 雜交瘤總RNA，之后用 PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄總RNA制備cDNA。分別用Leader primer擴(kuò)增抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)，反應(yīng)體系及PCR條件分別如表2和表3所示。
[0094] 表2鼠源抗體基因 cDNA PCR反應(yīng)體系 Γ00951
[0096] 表3鼠源抗體基因 cDNA PCR反應(yīng)條件
[0097]
[0098] 電泳分析PCR結(jié)果，在有擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)管中加入0.5μ1 LA Taq酶，72°C反應(yīng) lOmin。之后進(jìn)行酶連，反應(yīng)體系如表4所示。
[0099] 表4酶連反應(yīng)體系
[0100]
[0101]酶連完成后轉(zhuǎn)化，挑克隆，保種，得到鼠源抗人PD-1抗體。測(cè)序后，得到其重鏈可變 區(qū)核酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:1和2所示，輕鏈可變區(qū)核酸序列和氨基酸序列 分別如SEQ ID NO:3和4所示。
[0102] 2.2人源化設(shè)計(jì)
[0103]分析鼠源抗體序列，與人胚系（germ line)基因比對(duì)，最終確定重鏈FR1模板來源 于HM855688(IGHV3-21*04)，重鏈FR2模板來源于L06614(IGHV3-30*07)，重鏈FR3模板來源 于M77327(IGHV3-30*15)，并確定輕鏈的人源化模板為X63397(IGKV2-28*01)。通過CDR-grafting，將重鏈和輕鏈的CDR并置到構(gòu)架序列，構(gòu)建人源化抗體，基因合成人源化抗體可 變區(qū)的片段。得到其重鏈可變區(qū)核酸序列如SEQ ID N0:5所示，輕鏈可變區(qū)核酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0104] 2.3抗體庫構(gòu)建
[0105] 分析鼠源抗體CDR的DNA序列，確定可變區(qū)CDR中的突變位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物序列，將突 變位點(diǎn)所在的位置設(shè)計(jì)為NNS，使之編碼任意的氨基酸。以人源化抗體scFv為模板，PCR擴(kuò)增 scFv抗體庫，將scFv的抗體庫，通過sfH酶切位點(diǎn)，構(gòu)建到噬菌體質(zhì)粒中，構(gòu)建二級(jí)抗體庫。
[0106] 2.4抗體庫篩選
[0107]然后通過噬菌體展示進(jìn)行高親和力抗體篩選，具體方法如下：
[0108] A、通過電轉(zhuǎn)化，將含scFv的抗體庫的噬菌體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，經(jīng)過37 °C，220rpm，lh的恢復(fù)后，將輔助菌體(helper phage)加入到剩余的菌液中，另加入氨節(jié) 西林，37°C，220rpm，lh。2500rpm X 5min離心去上清，用2 X YT-AK培養(yǎng)基吹懸菌泥，37 °C， 220rpm過夜培養(yǎng)；
[0109] B、包被抗原:用包被緩沖液稀釋roi-Fc-His，混勻加入到免疫管中，4°C包被過夜；
[0110] C、重組噬菌體收集:上述過夜培養(yǎng)菌液，2500rpmX5min離心，收集上清10ml，加入 2ml PEG/NaCl，混勻放置冰上30-60min，10000g X 20min離心，去上清，用2 X YT培養(yǎng)基溶解 噬菌體庫；
[0111] D、封閉：免疫管用PBS洗兩次，加入封閉液，室溫lh。另外，取等體積封閉液與噬菌 體庫混合，室溫封閉l〇-15min;
[0112] E、孵育噬菌體庫:免疫管用PBS洗2次，加入封閉好的噬菌體庫，37 °C培養(yǎng)箱2-3h;
[0113] F、洗脫：取100μΙ TG1菌液（前一天接種）到10ml 2XYT中，37°C，220rpm培養(yǎng)到 A600值0.4-0.5。用TOST洗滌免疫管8次，再用roS洗2次，加入5ml對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的菌液，37 °C， 220rpm,lh；
[0114] G、0UTPUT:稀釋上述菌液至10-\10-2,分別取100ul涂平板；
[0115] H、下一輪篩選:取200μ1 helper phage加入到5ml洗脫后的菌液中，同時(shí)加入5μ1 氨芐西林，37°(：，220鄺111，111。2500印111\5111丨11離心去上清，用1011112\￥1^1(吹懸菌泥，37°(：， 220rpm過夜培養(yǎng)。
[0116] 重復(fù)步驟B-H。
[0117] 經(jīng)過三輪篩選，挑選單克隆，制備重組噬菌體，通過Phage ELISA方法，檢測(cè)重組噬 菌體活性，具體如下：
[0118] 八、包被詘0-1+(：，4°(：過夜；
[0119] B、PBST 洗兩次，加入 phage 上清，25°C，lh;
[0120] C、PBST 洗三次，加入稀釋的 anti-M13-biotinAb，25°C，lh;
[0121] D、PBST洗三次，加入稀釋的HRP-streptavidin，25°C，lh;
[0122] E、PBST洗三次，加入預(yù)熱的TMB，25°C，10min，加入1M H2S04中止反應(yīng)，0D450檢測(cè) 吸光值。挑選陽性克隆，送測(cè)序，通過PCR，重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)拼接至其對(duì)應(yīng)的人源抗 體的恒定區(qū)序列，擴(kuò)增的抗體重鏈和輕鏈全長(zhǎng)片段(包含信號(hào)肽)分別克隆入PCDNA3.1GS。 共轉(zhuǎn)染輕鏈質(zhì)粒、重鏈質(zhì)粒至EXPI 293細(xì)胞株，培養(yǎng)7天后，用Protein A(GE)純化上清，最 終獲得親和力成熟抗體。親和力成熟抗體分別進(jìn)行Elisa結(jié)合活性、Elisa抑制活性和Cell 結(jié)合活性檢測(cè)。
[0123] A、ELISA 結(jié)合活性
[0124] 包被PD1-His在板上，加入梯度稀釋的抗體，孵育洗滌后，再加入羊抗鼠-HRP，顯 色，讀數(shù)擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖6所示，計(jì)算出EC50值，其與hPD-Ι結(jié)合活性EC50為 6.094ng/mL〇
[0125] B、ELISA 抑制活性
[0126] 梯度稀釋的抗體和一定濃度的roi-Fc-His預(yù)先孵育，再將混合物加入到包被roi-Fc的板上，孵育洗滌后再加入anti-His-HRP，顯色，讀數(shù)擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖7所示， 計(jì)算IC50值，其抑制活性IC50為406.1nM。
[0127] C、細(xì)胞結(jié)合活性
[0128] 提前一天將H)1-27(PD1過表達(dá)CH0-K1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞)鋪至用于檢測(cè)培養(yǎng)的細(xì)胞板，次 日封閉后加入梯度稀釋的抗體，洗滌再加入ant i-mouse-EU，然后洗滌加入熒光增強(qiáng)液，讀 數(shù)即可，擬合出反應(yīng)曲線，結(jié)果如圖8所示，計(jì)算出其細(xì)胞抑制活性IC50為103.2ng/mL。 [0129] 2.5抗體篩選結(jié)果
[0130] 經(jīng)過三輪篩選，挑選單克隆76個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，選擇其中40個(gè)克隆測(cè)序，結(jié)果顯示，克 隆序列與原始的人源化抗體可變區(qū)序列一致。將人源化抗體可變區(qū)序列與人源抗體的恒定 區(qū)序列拼接，形式全抗體序列，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒P3 . lGS-hup01-HC和P3 . lGS-hup01-LC，瞬轉(zhuǎn) 293細(xì)胞制備抗體并檢測(cè)抗體活性。
[0131] anti-ro-Ι重鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:7和8所示。其中，重鏈 可變區(qū)核苷酸序列為：
[0132] GAGGTGCAACTGGTGGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGAAGCCCGGAGGATCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCCTCCGG CTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCTACCATCA GCAACGGAGGCTCCTTCACCTATTACCCTGACTCCATGAAGGGCAGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGTCCAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGGACAGCGACTATTA CGGCATCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACAACCGTGACAGTGAGCTCC(SEQ ID NO：5)
[0133] 橫線部分分別為CDRl、CDR2、CDR3，其序列編號(hào)分別為SEQIDN0:9-ll;未劃?rùn)M線 部分分別為FRl、FR2、FR3、FR4，其序列編號(hào)分別為SEQIDN0:12-15。
[0134] 對(duì)應(yīng)的，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為：
[0135] EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSffVRQAPGKGLEffVATISNGGSFTYYPDSMKGRFTISRDNSKN TLYLQMSSLRAEDTAVYYCARDSDYYGIFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：16)
[0136] 橫線部分分別為CDRl、CDR2、CDR3，其序列編號(hào)分別為SEQIDN0:17-19;未劃?rùn)M線 部分分別為FRl、FR2、FR3、FR4，其序列編號(hào)分別為SEQIDN0 :20-23。
[0137] anti-ro-1輕鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:24和25所示。其中，輕 鏈可變區(qū)核苷酸序列為：
[0138] GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTCTGTCCCTGCCTGTGACACCCGGAGAGCCTGCCTCCATCAGCTGCAGGAGCTC CAAGAGCCTGCTGTACAAAGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGTATTTACAGAAGCCTGGCCAGTCCCCCCAGCTGC TGATCTACCTCATGTCCACCAGGGCCTCCGGAGTGCCTGATCGGTTCAGCGGATCCGGCAGCGGCACCGATTTCACC CTCAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTATTGCCAGCAGCTGGTGGAGGACCCCTTCACCTT CGGCCAAGGCACAAAGCTGGAGATCAAGAGGACTGTG(SEQ ID NO：26)
[0139] 橫線部分分別為CDRl、CDR2、CDR3，其序列編號(hào)分別為SEQIDN0:27-29;未劃?rùn)M線 部分分別為FRl、FR2、FR3、FR4，其序列編號(hào)分別為SEQIDN0 :30-33。
[0140] 對(duì)應(yīng)的，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為：
[0141] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNVYLQKPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCQQLVEDPFTFGQGTKLEIKRTY(SEQ ID NO：34)
[0142] 橫線部分分別為CDRl、CDR2、CDR3，其序列編號(hào)分別為SEQIDN0:35-37;未劃?rùn)M線 部分分別為FRl、FR2、FR3、FR4，其序列編號(hào)分別為SEQIDN0:38-41。
[0143] 實(shí)施例三人源化抗體表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0144] 以P3. lGS-hup01-HC和P3. lGS-hup01-LC為模板，通過PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)抗體重鏈片段 和輕鏈片段，構(gòu)建人源化抗體表達(dá)質(zhì)粒。
[0145] 輕鏈和重鏈上下游引物、反應(yīng)體系及PCR條件如表5、表6和表7所示。
[0146] 表5人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應(yīng)的上下游引物
[0147]
[0148] 表6人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應(yīng)體系
[0149]
[0150]表7人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應(yīng)條件
[0151]
[0152] 用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收輕鏈、重鏈的全長(zhǎng)序列。對(duì)抗體片段輕鏈、重鏈以及質(zhì) 粒分別進(jìn)行雙酶切，電泳后膠回收抗體酶切和質(zhì)粒酶切片段，之后對(duì)片段進(jìn)行酶連。酶連之 后的人源化抗體表達(dá)質(zhì)粒命名為P3.1GS-PD-1。反應(yīng)體系如表8-表10所示。
[0153] 表8人源化抗體輕鏈和重鏈雙酶切反應(yīng)體系
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158]
[0159] 將上述酶連產(chǎn)物加入到lOOyL XL1-10感受態(tài)中，冰上30分鐘，然后，42°C熱擊90 秒，迅速放置冰上2分鐘，接著加入500yL LB培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)1小時(shí)，將菌液于4000rpm 離心5分鐘，棄500yL上清，用槍吹懸菌泥，涂布于含50yg/mL AMP的LB固體平板上，37°C過夜 培養(yǎng)。挑單菌落到5mL LB液體培養(yǎng)基(50yg/mL AMP)，37°C250rpm培養(yǎng)6小時(shí)，PCR驗(yàn)證克隆， 用15%滅菌甘油保藏陽性菌種，每個(gè)克隆2根，取一份凍存管送測(cè)序，另一份保存-20°C。
[0160] 實(shí)施例四穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建
[0161 ]人源化抗體表達(dá)質(zhì)粒P3.1GS-PD-1，轉(zhuǎn)染前采用Pvul對(duì)其進(jìn)行線性化;采用電轉(zhuǎn)染 的方法，將含有人源化抗體輕鏈、重鏈基因的線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CH0-KSM4，轉(zhuǎn)染了四次，將 轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別命名為 20150703T，20150704T，20150708T 及 20150714T。
[0162] 轉(zhuǎn)染后撤谷氨酰氨進(jìn)行加壓篩選，其中20150708Τ及20150714Τ待轉(zhuǎn)染細(xì)胞恢復(fù)2 天后進(jìn)行加壓鋪板。培養(yǎng)約30-40天后，96孔板可觀察到克隆長(zhǎng)出，此時(shí)進(jìn)行產(chǎn)量鑒定。將高 產(chǎn)克隆轉(zhuǎn)移并擴(kuò)增培養(yǎng)。待細(xì)胞數(shù)目達(dá)到2X10 6cellS/mL左右接種進(jìn)行補(bǔ)料分批培養(yǎng)，培 養(yǎng)結(jié)束后收獲上清進(jìn)行產(chǎn)量鑒定，獲得備選母克隆。而20150703T及20150704T的母克隆由 半固體鋪板方法篩選獲得。將高產(chǎn)的克隆開展亞克隆篩選:半固體鋪板，6孔板每孔3000-5000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)基2.5mL，鋪板后置于37°C、5 %C02靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)7-12天可挑選單克隆。 將挑選的單克隆進(jìn)行產(chǎn)量鑒定，獲得備選克隆。
[0163] 通過補(bǔ)料篩選獲得高產(chǎn)細(xì)胞株，搖瓶補(bǔ)料方案為:采用CDM4CH0為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行 接種，接種密度為5 X 105cel 1 s/mL，接種后置于37 °C、5 % C02、120rpm培養(yǎng)，接種當(dāng)天記為第 〇天，培養(yǎng)至第3天開始補(bǔ)加70g/L的cell Boost 5,每天補(bǔ)加接種體積的6%直至細(xì)胞收獲。 根據(jù)補(bǔ)料篩選結(jié)果，選擇不同轉(zhuǎn)染中相對(duì)高產(chǎn)的細(xì)胞株建立PCB，凍存保種，并進(jìn)行傳代穩(wěn) 定性研究。表達(dá)的抗體名anti-PD-1。
[0164] 實(shí)施例五抗體的結(jié)合特異性和結(jié)合動(dòng)力學(xué)比較
[0165]采用Biacore分析實(shí)施例四中的細(xì)胞株表達(dá)抗體的親和力及結(jié)合動(dòng)力學(xué)。利用標(biāo) 準(zhǔn)胺偶聯(lián)化學(xué)和由Biacore提供的試劑盒，經(jīng)伯胺將羊抗人IgG共價(jià)連接至CM5芯片。將抗體 以30yL/min的流速在HBS EP緩沖液中流動(dòng)而測(cè)量結(jié)合。結(jié)合時(shí)間300秒，解離時(shí)間7200秒。 測(cè)定的ka、kd和KD值如表11所示。
[0166] 表11人源化抗體anti-PD-Ι的結(jié)合動(dòng)力學(xué)結(jié)果
[0167]
[0168] 實(shí)施例六抗體在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響
[0169] 先用roS緩沖液1:1稀釋血液，移取3mL的LSM至離心管內(nèi)，加入稀釋過的血液4mL， 注意加入的時(shí)候，確保使稀釋后的血液至于LSM的上層，不可混勾。400g，RT離心30-40min。 最后吸出分離出的上層的PBMC，100g離心lOmiruBD公司CD4+細(xì)胞分離磁珠分離CD4+T細(xì)胞， 使用BD公司DC細(xì)胞分離磁珠分離DC細(xì)胞。96孔板每孔⑶4+T細(xì)胞數(shù)量1 X 105，DC數(shù)量1 X 104，體積共計(jì)100yL共培養(yǎng)。加入梯度稀釋的抗體，培養(yǎng)5天后檢測(cè)IFN- γ，IL-2的濃度。 [0170] 結(jié)果分別如圖9和圖10所示，抗體能有效的促進(jìn)混合淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2。 [0171 ]實(shí)施例七抗體在血清中的穩(wěn)定性
[0172]用猴血清稀釋人源化抗體anti-PD-Ι，濃度為O.Smg/mLJT-C分別放置0天、1天、4 天、7天。
[0173] 重組人PD-1融合蛋白以0.5yg/mL的濃度在包被緩沖液中4°C過夜。次日棄去孔內(nèi) 溶液用TOST洗兩次。然后加入1%BSA，37°C封閉1小時(shí)然后用TOST洗兩次。穩(wěn)定性抗體樣品 以lyg/mL起始依次進(jìn)行3倍稀釋共8個(gè)濃度梯度，37°C孵育1小時(shí)，PBST洗三次。用羊抗人 FAB-HRP，1:10000稀釋，37 °C孵育1小時(shí)，PBST洗三次。加入TMB顯色15min，以0 · 5M的H2SO4中 止反應(yīng)并在450nm讀出吸光度。
[0174] 結(jié)果如圖11所示，人源化抗體anti-PD-Ι顯示出了良好的血清穩(wěn)定性，7天之內(nèi)均 未顯示明顯的活性衰減。
[0175] 實(shí)施例八ELISA測(cè)定與人CD28、CTLA-4的結(jié)合特異性及與不同物種的PD-1蛋白的 結(jié)合
[0176] 測(cè)試重組⑶28家族成員重組人⑶28、重組人CTLA-4、重組鼠 ro-Ι、重組食蟹猴H)-1、重組人ro-1蛋白與抗體結(jié)合。不同蛋白以0.5yg/mL的濃度在包被緩沖液中4 °C過夜。次日 棄去孔內(nèi)溶液用PBST洗兩次。然后加入1 % BSA，37 °C封閉1小時(shí)然后用PBST洗兩次。加入0.5 yg/mL抗體樣品，孵育1小時(shí)，PBST洗三次。用羊抗人FAB-HRP，1:10000稀釋，37°C孵育1小時(shí)， PBST洗三次。加入TMB顯色15min，以0.5M的H2S04中止反應(yīng)并在450nm讀出吸光度。
[0177] 結(jié)果如圖12所示，抗體不結(jié)合CD28家族其它成員?？贵w以類似的親和力結(jié)合人和 食蟹猴重組ro-i蛋白。
[0178] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和 變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在于:包括選自于如下 一組的CDR區(qū)： 重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID腸：17-19所示，輕鏈〇)1?1工01?2、〇)1?的序 列分別如SEQ ID N0:35-37所示，或與上述序列結(jié)合相同抗原表位的序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在 于:還包括選自于如下的重鏈可變區(qū)框架區(qū)：FR1、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 : 20-23所示，或分別與上述序列的同一性大于70 %、80 %、85 %、90 %、95 %、99 %的序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在 于:其重鏈的序列如SEQ ID NO:8所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在 于:還包括選自于如下的輕鏈可變區(qū)框架區(qū)：FR1、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 : 38-41所示，或分別與上述序列的同一性大于70 %、80 %、85 %、90 %、95 %、99 %的序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分，其特征在 于:其輕鏈的序列如SEQ ID NO:25所示。6. -種核酸分子，其特征在于:其包含能夠編碼抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列，所述重鏈 可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO：17-19； (2) 與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié)合相同抗原表位;b)同 一性大于70%、80%、85%、90%或97%。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸分子，其特征在于:所述重鏈可變區(qū)包含選自如下一組的 氨基酸序列： SEQ ID NO: 16,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié)合相同抗原 表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區(qū)中含有一個(gè)到幾個(gè) 核苷酸的替換。8. -種核酸分子，其特征在于:其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區(qū)的核酸序列，所述輕鏈 可變區(qū)包含選自如下一組的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO：35-37； (2) 與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié)合相同抗原表位;b)同 一性大于70%、80%、85%、90%或97%。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸分子，其特征在于:所述輕鏈可變區(qū)包含選自如下一組的 氨基酸序列： SEQ ID N0:34,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個(gè)的序列：a)結(jié)合相同抗原 表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區(qū)中含有一個(gè)到幾個(gè) 核苷酸的替換。10. -種載體，其特征在于:其含有權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的核酸分子。11. 一種宿主細(xì)胞，其特征在于：其含有權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)的核酸分子或權(quán)利要求10 的載體。12. -種偶聯(lián)物，其特征在于:其含有權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的抗人PD-L1人源化單克隆抗 體或其抗原結(jié)合部分，以及其它生物活性物質(zhì)，所述抗人ro-Li人源化單克隆抗體或其抗原 結(jié)合部分直接或通過連接片段與其它生物活性物質(zhì)偶聯(lián)。13. -種組合物，其特征在于:其含有權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的抗人PD-L1人源化單克隆抗 體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求6-9的核酸分子、權(quán)利要求10的載體、權(quán)利要求11的宿主細(xì) 胞、或者權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，以及任選的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，以及任選的其它 生物活性物質(zhì)。14. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結(jié)合部分、權(quán)利要求 6-9的核酸分子、權(quán)利要求10的載體、權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞、權(quán)利要求12的偶聯(lián)物、或者權(quán) 利要求13的組合物用于制備預(yù)防或治療腫瘤、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病(T細(xì)胞功能障礙）、微生物 或病毒引起的感染的用途。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106008714SQ201610345750
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月24日
【發(fā)明人】李戈, 郭樹華, 張佳春, 朱翔, 朱一翔
【申請(qǐng)人】瑞陽(蘇州)生物科技有限公司