一種抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性單克隆抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性單克隆抗體及其應(yīng)用，所述單克隆抗體屬于IgG1亞類抗體，由雜交瘤細(xì)胞株SZ?169產(chǎn)生；其中，雜交瘤細(xì)胞株SZ?169的保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2016134。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明所述單克隆抗體能夠特異性的結(jié)合人全長(zhǎng)ADAMTS13和截短型的ADAMTS13?T7蛋白，且與截短型ADAMTS13?T7蛋白結(jié)合能力明顯高于全長(zhǎng)ADAMTS13蛋白；(2)本發(fā)明的單克隆抗體在變性條件下，能夠明顯抑制ADAMTS13水解VWF，并隨著單克隆抗體濃度的增加而抑制作用增強(qiáng)；(3)本發(fā)明所述單克隆抗體能夠有效應(yīng)用于藥物制備中，增加了藥物的靶向性和特異性。CCTCC NO：C201613420160628
【專利說(shuō)明】
一種抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性單克隆抗體及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種單克隆抗體，尤其涉及一種抗人血管性血友病 因子裂解酶的抑制性單克隆抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血管性血友病因子裂解蛋白酶（a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type lmotif 13，ADAMTS13)是從血衆(zhòng)中純化出來(lái)的一個(gè)金屬蛋白 酶，隸屬于金屬蛋白酶超家族（a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motif s，ADAMTSs) QADAMTS13通過(guò)裂解VWF的Tyrl605-Metl606肽鍵，降低 其底物血管性血友病因子(von Willebrand factor，VWF)分子量，從而抑制血小板聚集和 微血管血栓形成。研究表明，ADAMTS13先天性或獲得性缺陷，導(dǎo)致彌散性微血管性血栓，與 血檢性血小板減少性紫療（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)的發(fā)病密切相 關(guān)。血檢性血小板減少性紫療（thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)是一種急性 有潛在致死性的疾病，臨床上以發(fā)熱、血小板減少、溶血性貧血、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和腎臟損害 五聯(lián)征為主要表現(xiàn)。相反，VWF對(duì)ADAMTS13敏感性增加會(huì)導(dǎo)致血管性血友病(VWD)2A型的一 個(gè)亞型的發(fā)生，這與VWF不能與血小板膜糖蛋白lb結(jié)合相關(guān)。
[0003] ADAMTS13蛋白主要由9個(gè)結(jié)構(gòu)功能域組成，從氨基端到羧基端依次為：信號(hào)肽、前 導(dǎo)肽、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、去整合素結(jié)構(gòu)域、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第1基序、富半胱氨酸 區(qū)域、間隔區(qū)、凝血酶敏感蛋白1(TSP1)第2-8重復(fù)基序、補(bǔ)體結(jié)合區(qū)域(CUB)，其中末端兩個(gè) CUB結(jié)構(gòu)域?yàn)锳DAMTS13所特有。
[0004] ADAMTS13各結(jié)構(gòu)的具體功能目前尚未完全闡明，因此，針對(duì)ADAMTS13的單克隆抗 體的研制將為ADAMTS13功能、血栓形成的機(jī)制研究以及TTP和2A型VWD新的治療方法的研究 提供有力的研究工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 解決的技術(shù)問(wèn)題:為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，獲得一種能夠特異性抑制抗人血管 性血友病因子裂解酶功能的抗體，本發(fā)明提供了一種抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制 性單克隆抗體及其應(yīng)用。
[0006] 技術(shù)方案:一種抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性單克隆抗體，所述單克隆 抗體屬于IgGl亞類抗體，由雜交瘤細(xì)胞株SZ-169產(chǎn)生;其中，雜交瘤細(xì)胞株SZ-169的保藏編 號(hào)為CCTCC N0:C2016134。
[0007] 所述雜交瘤細(xì)胞株SZ-169的制備方法如下：
[0008] (1)使用重組的截短型的人血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)蛋白作為免疫 原，以常規(guī)方法免疫Balb/C小鼠；
[0009] (2)獲取融合細(xì)胞生長(zhǎng)克隆:從免疫合格小鼠無(wú)菌取其脾細(xì)胞作為抗原致敏的B細(xì) 胞，按常規(guī)方法，將B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0株融合，然后利用常規(guī)的融合細(xì)胞HAT篩選方 法進(jìn)行篩選，進(jìn)而獲取融合細(xì)胞生長(zhǎng)克??；
[0010] (3)應(yīng)用ELISA法和Western免疫印跡法等生化和免疫學(xué)技術(shù)篩選和鑒定后，挑選 出具有高抗體分泌水平的雜交瘤細(xì)胞株SZ-169(1G11);
[0011] 上述雜交瘤細(xì)胞株SZ-169的制備方法中，使用截短型的人ADAMTS13蛋白作為免疫 原，常規(guī)三次免疫接種8周齡雌性Balb/c小鼠，每次間隔4周；用ELISA法檢測(cè)被免疫動(dòng)物血 清中單克隆抗體的存在和濃度;免疫完成后，選擇產(chǎn)生足夠高濃度抗血清的小鼠，分離動(dòng)物 脾臟并制備脾細(xì)胞懸液；按照已知的雜交瘤技術(shù)（參見(jiàn):K0hler and Milstein，Nature， 215:495-497，1975;K0hler et al，Immunology Today，4:72-76，1983)將所得到的小鼠脾 細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，制備可持續(xù)傳代并分泌抗血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13單克 隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
[0012] 所述雜交瘤細(xì)胞系的保藏信息為：保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，簡(jiǎn)稱CCTCC);地址:湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué) 保藏中心（武漢大學(xué)第一附屬小學(xué)對(duì)面）；保藏日期2016年6月28日；保藏編號(hào)CCTCC N0: C2016134;分類命名：雜交瘤細(xì)胞株SZ-169( 1G11)。
[0013]采用上述雜交瘤細(xì)胞株SZ-169生產(chǎn)單克隆抗體的方法如下：
[0014] 方法一:在雜交瘤培養(yǎng)液中接種上述雜交瘤細(xì)胞，培養(yǎng)后培養(yǎng)液中分離純化得所 需的特異性抗血管性血友病因子裂解酶的單克隆抗體；
[0015] 方法二:在動(dòng)物腹腔內(nèi)接種上述雜交瘤細(xì)胞，動(dòng)物腹水液中分離和純化得所需的 特異性抗血管性血友病因子裂解酶的單克隆抗體。
[0016] 優(yōu)選的，所述單克隆抗體能夠與全長(zhǎng)的重組人ADAMTS13和截短型的人ADAMTS13-T7特異性結(jié)合。
[0017] 本發(fā)明的單克隆抗體屬于IgGl亞類抗體。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，本發(fā)明的單克隆抗 體可與全長(zhǎng)的重組人ADAMTS13和截短型的人ADAMTS13-T7特異性結(jié)合。另外，免疫印跡分析 顯示，本發(fā)明的單克隆抗體能夠與還原性的全長(zhǎng)的重組人ADAMTS13特異性結(jié)合，且與還原 性的ADAMTS13在分子量為190KDa的蛋白結(jié)合。
[0018] 所述的單克隆抗體在抑制人血管性血友病因子裂解酶功能中的應(yīng)用。
[0019] 所述的單克隆抗體在抑制人血管性血友病因子裂解酶水解特異性底物血管性血 友病因子中的應(yīng)用。
[0020] 所述的單克隆抗體在制備血栓性血小板減少性紫癜藥物中的應(yīng)用。
[0021] 所述的單克隆抗體在制備血管性血友病藥物中的應(yīng)用。
[0022]優(yōu)選的，所述單克隆抗體的應(yīng)用濃度為0~200yg/mL時(shí)，隨著濃度的增大，單克隆 抗體對(duì)ADAMTS13的抑制作用增強(qiáng)。
[0023]有益效果：（1)本發(fā)明所述單克隆抗體能夠特異性的結(jié)合人全長(zhǎng)ADAMTS13和截短 型的ADAMTS13-T7蛋白，且與截短型ADAMTS13-T7蛋白結(jié)合能力明顯高于全長(zhǎng)ADAMTS13蛋 白；（2)本發(fā)明的單克隆抗體在變性條件下，能夠明顯抑制ADAMTS13水解VWF，并隨著單克隆 抗體濃度的增加而抑制作用增強(qiáng)；（3)本發(fā)明所述單克隆抗體能夠有效應(yīng)用于藥物制備中， 增加了藥物的靶向性和特異性。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是Western Blot鑒定分析純化的重組的全長(zhǎng)ADAMTS13和截短型ADAMTS13-T7 蛋白；
[0025] 圖2是10%SDS-PAGE鑒定分析純化的重組截短型ADAMTS13-T7蛋白的電泳圖；
[0026] 圖3是ELISA法檢測(cè)單克隆抗體SZ-169與重組的全長(zhǎng)ADAMTS13和截短型ADAMTS13- T7蛋白特異性結(jié)合反應(yīng)圖；
[0027] 圖4是Western Blot免疫印跡法測(cè)定單克隆抗體SZ-169與重組的全長(zhǎng)ADAMTS13特 異性結(jié)合圖；
[0028]圖5是靜止條件(變性)單克隆抗體SZ-169對(duì)ADAMTS13水解VWF的影響的多聚體分 析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0030] 實(shí)施例1制備免疫原一重組人血管性血友病因子裂解酶截短型蛋白ADAMTS13-T7
[0031 ] (1.1)真核表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化擴(kuò)增和定量
[0032] 將pSecTag-ADAMTS13-T7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Escherchia coli DH5a感受態(tài)中， 涂板后37°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取陽(yáng)性克隆，37°C細(xì)菌搖床過(guò)夜擴(kuò)增培養(yǎng)，4°C離心收集細(xì)菌后，用 質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提(按試劑盒說(shuō)明書操作）。質(zhì)粒經(jīng)Hind III和Xho I雙酶切進(jìn) 行鑒定。
[0033] (1.2)pSecTag-ADAMTS13-T7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HeLa 細(xì)胞
[0034] HeLa細(xì)胞培養(yǎng)：HeLa細(xì)胞用含 10%小牛血清的DMEM(Dulbecco's Modified Eagles Medium)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將細(xì)胞接種于24細(xì)胞培養(yǎng)孔板中（1.0 X 105/mL)，至 60~80%融合。
[0035] 轉(zhuǎn)染液制備:將pSecTag-ADAMTS13-T7質(zhì)粒lyg稀釋至100yL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中， 加入3yL X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫放置20分鐘。
[0036] 轉(zhuǎn)染前準(zhǔn)備:無(wú)血清DMEM漂洗細(xì)胞1次，每孔加入900yL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基。
[0037]轉(zhuǎn)染:將待轉(zhuǎn)染混合物緩緩加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，混勻后37°C、5^^02溫箱培養(yǎng)6h， 棄去無(wú)血清上清，換入含血清細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0038]穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選:轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48h后消化分離，重新接種至35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿 中（2X 103/mL)，換入細(xì)胞篩選液（含10%小牛血清01^1細(xì)胞培養(yǎng)基，加入40(^8/11^ Hygromycine B)進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞克隆的篩選;待細(xì)胞大部分死亡脫落后（約7至10日后），重新 換入細(xì)胞篩選維持液(含10 %小牛血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，加入200yg/mL Hygromycine B)進(jìn) 行維持篩選；篩選后待陽(yáng)性細(xì)胞克隆長(zhǎng)出，挑選單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，即獲得穩(wěn)定表達(dá)重組 rADAMTSl3-T7蛋白的細(xì)胞株，并通過(guò)Western Blot方法篩選高表達(dá)細(xì)胞株保種凍存。
[0039] (1.3)HeLa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株上清的收集、濃縮
[0040] 穩(wěn)定表達(dá)重組截短型ADAMTS13-T7蛋白的細(xì)胞株用無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基馴化 后，再行大量擴(kuò)增培養(yǎng)，收集無(wú)血清培養(yǎng)上清。所收集的上清立即經(jīng)Amicon Ultra-15離心 超濾管100倍離心濃縮，分裝后凍存于_80°C冰箱備用。
[0041 ] (1.4)重組 ADAMTS13-T7 蛋白 WesternBlot 鑒定
[0042]將濃縮后的培養(yǎng)上清進(jìn)行5%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，并行Western Blot鑒定。以 兔抗人ADAMTS13多抗及鼠抗His單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠 IgG為二抗，ECL 顯影劑化學(xué)發(fā)光法顯影，膠片經(jīng)清洗風(fēng)干后，于凝膠成像儀下拍照，以Image J軟件分析，結(jié) 果如圖1所示。
[0043] (1.5)重組截短型ADAMTS13-T7蛋白純化
[0044] 蛋白純化緩沖液配制:按照說(shuō)明書配制如下蛋白純化緩沖液，
[0045]
[0046]
[0047]
[0048] 平衡Ni-NTA Agarose:將保存液中的Ni-NTA Agarose與保存液混勾，吸取4mL Ni_ NTA Agarose至15mL離心管中。500 Xg離心5min，小心棄上清。加入10倍體積NPI-10緩沖液 平衡Ni-NTA AgarosejOC) X g離心5min，小心棄上清。
[0049] 蛋白與Ni-NTA Agarose結(jié)合:將濃縮后培養(yǎng)上清與Ni-NTA Agarose混勻，4°C搖床 結(jié)合過(guò)夜。500 X g離心5min，小心收集上清待電泳。
[0050] Ni-NTA Agarose洗滌：加入10倍體積NPI-20緩沖液洗滌Ni-NTA Agarose，充分混 勻。500 X g離心5min，小心收集上清待電泳。重復(fù)洗滌一次。
[0051 ] 重組ADAMTS13-T7蛋白洗脫：加入1倍體積NPI-250緩沖液重懸洗滌后Ni-NTA Agarose，室溫下充分混勾2min，使重組蛋白與Ni-NTA Agarose分離。500 X g離心5min，將上 清收集至編號(hào)的離心管中，置于冰上。重復(fù)洗脫6次。
[0052]純化后蛋白定量:使用分光光度計(jì)對(duì)純化后蛋白定量，用NPI-250緩沖液調(diào)零，測(cè) 定蛋白樣品在280nm處的吸光度，推算純化后蛋白濃度。
[0053] (1.6)透析去除咪唑：高濃度咪唑可能造成蛋白沉淀，因此，使用消毒后的PBS緩沖 液去除純化蛋白中高濃度的咪唑，_80°C凍存蛋白備用。
[0054] (1.7)純化后蛋白鑒定
[0055] 將結(jié)合后培養(yǎng)上清、洗滌后上清及洗脫液進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，電泳后進(jìn)行考 馬斯亮藍(lán)染色及Western Blot鑒定。以兔抗人ADAMTS13多抗及鼠抗His單抗作為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠 IgG為二抗，ECL顯影劑化學(xué)發(fā)光法顯影，膠片經(jīng)清洗風(fēng)干后，于凝膠 成像儀下拍照，以ImageJ軟件分析，結(jié)果如圖2所示。
[0056]實(shí)施例2特異性抗血管性血友病因子裂解酶的單克隆抗體的制備
[0057] 應(yīng)用常規(guī)免疫學(xué)方法和雜交瘤技術(shù)(K0hler and Milstein，Nature，215:495- 497,1975)制備本發(fā)明的單克隆抗體。
[0058]首先，以純化的ADAMTS13-T7蛋白質(zhì)免疫8周齡雌性Balb/c小鼠（上?？茖W(xué)院實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物中心），共免疫三次，每次間隔四周。前兩次為背部皮下多點(diǎn)注射加腹腔注射，第三次為 經(jīng)小鼠尾靜脈注射加腹腔注射。
[0059] 待被免疫小鼠的血清抗體滴度達(dá)到足夠高后，處死動(dòng)物并分離脾臟細(xì)胞。應(yīng)用標(biāo) 準(zhǔn)的單克隆抗體細(xì)胞融合技術(shù)，將被免疫Balb/c小鼠的脾臟細(xì)胞與小鼠的SP2/0骨髓瘤細(xì) 胞(法國(guó)巴黎輸血中心雜交瘤實(shí)驗(yàn)室引進(jìn))進(jìn)行細(xì)胞融合。在HAT培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)融合細(xì) 胞，培養(yǎng)后取上清以ELISA法篩選出高水平分泌抗體的細(xì)胞株。用于進(jìn)一步的擴(kuò)大培養(yǎng)或凍 存。
[0060] 應(yīng)用ELISA法和Western印跡法等生化和免疫學(xué)技術(shù)篩選和鑒定后，獲得特異性抗 血管性血友病因子裂解酶的單克隆抗體，命名為SZ-169。
[0061] 為了大量制備單克隆抗體，選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷行小鼠腹 腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中（5X10 5/小鼠）。大約在接種一周后即有明 顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5~10mL腹水。
[0062] 實(shí)施例3檢測(cè)單克隆抗體的化學(xué)性質(zhì)
[0063] (1)應(yīng)用免疫雙擴(kuò)散方法測(cè)定證實(shí)，本發(fā)明的單抗SZ-169屬于IgGl亞類。
[0064] (2)將單克隆抗體SZ-169接種于Balb/c小鼠腹腔產(chǎn)生腹水，經(jīng)過(guò)BeaverBeadsTM Protein A/G Matrix抗體純化磁珠純化，經(jīng)PBS透析，用紫外分光光度儀測(cè)定IgG含量，測(cè)知 每lmL腹水可純化得到IgG 3-6mg。
[0065] (3)ELISA實(shí)驗(yàn)測(cè)定SZ-169的特異性:純化后抗體利用ELISA方法檢測(cè)效價(jià)。純化的 ADAMTS13-T7蛋白和ADAMTS13全長(zhǎng)蛋白用碳酸鹽緩沖液配置成lyg/mL，100yl/孔包板，4°C 過(guò)夜；0.05 % Tween-roS洗滌2次后，2 % BSA-roST封閉過(guò)夜，同上洗滌后，每孔加100μ1純化 的抗體（1:100，1:1000，1:5000，1:10000)，PBS為空白對(duì)照，以同期未免疫小鼠血清為陰性 對(duì)照，以免疫小鼠血清為陽(yáng)性對(duì)照，37 °C孵育2h。同上洗滌4次，加 HRP-GAM-IgG(1: 5000稀 釋）100μ1/孔，37°C孵育lh。同上洗滌6次，TMB顯色100μ1/孔，室溫8-10π?η，50μ1/孔3M硫酸 終止反應(yīng)。酶標(biāo)檢測(cè)儀上讀取0D450值（圖3)。結(jié)果顯示，純化后的單克隆抗體SZ-169與截?cái)?型ADAMTS13-T7蛋白結(jié)合能力明顯高于全長(zhǎng)ADAMTS13蛋白。
[0066] (4)Western blot免疫印跡法檢測(cè)單克隆抗體識(shí)別的抗原蛋白：純化的重組 ADAMTS13蛋白行8% SDS-PAGE電泳，在Bio-Rad系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維酸上，用2 %BSA-roS封 閉過(guò)夜，次日用含0.05%Tween-roS洗滌后，加入純化后的抗體（1:300稀釋），室溫孵育2h， 洗滌半小時(shí)后，加入二抗HRP-GAM-IgG(l:5000)，室溫孵育lh，再次洗滌后ECL顯色，壓片觀 察。陽(yáng)性對(duì)照中加入免疫小鼠血清（1: 2000 )，陰性對(duì)照加入未免疫小鼠血清（1: 2000)(圖 4)。結(jié)果表明，單克隆抗體SZ-169能與ADAMTS13結(jié)合，在190kDa處顯帶，同時(shí)陽(yáng)性對(duì)照免疫 小鼠的血清也在該處顯帶，而陰性對(duì)照未免疫小鼠血清跟蛋白無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明抗體與 ADAMTS13是特異性結(jié)合的。
[0067] 實(shí)施例4單克隆抗體對(duì)ADAMTS13水解VWF的影響：
[0068] rADAMTS13的預(yù)處理：5mM CaCl2,20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl和5mg/mL (w/v)BSA條件同時(shí)加入純化的抗體(0，12 · 5，25，50，100，200yg/mL)37°C孵育lh，小鼠 IgG (mlg)作為陰性對(duì)照。
[0069] pVWF(血漿來(lái)源的純化的VWF)的預(yù)變性：pVWF(終濃度為37.5U/mL)在1.5M尿素， 20mM Tris-HCl(pH 8.0)條件下37°C孵育2h。
[0070] 變性條件下ADAMTS13水解pVWF:將預(yù)變性的rVWF以1 : 10稀釋與預(yù)處理的 rADAMTS13(終濃度為25nM)在20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl和5mg/mL(w/v)BSA條件 下37°C孵育1.5h，用EDTA(終濃度為20mM)終止反應(yīng)。
[0071] 以SDS-瓊脂糖電泳分析。取適量的反應(yīng)混合物分別加入2 X多聚體電泳上樣緩沖 液（10mM Tris，lmM EDTA，8M尿素，5%SDS，0.02%溴酚藍(lán)，pH 8.0)，60°C加熱30min，上樣后 于4°C經(jīng)1.3%SDS-瓊脂糖凝膠垂直電泳3h(恒壓90V)，電泳結(jié)束后直接將凝膠貼附于瓊脂 糖凝膠支撐介質(zhì)一GelBond Film上，風(fēng)干后用5%脫脂奶粉室溫封閉lh，然后加入HRP-VWF 兔抗人多抗(1:1000)孵育2h，經(jīng)TBS-0.05 % Tween洗膜5次后，用ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光法顯影。 [0072] 結(jié)果顯示，單克隆抗體SZ-169,與ADAMTS13作用之后，與pVWF混合后37°C孵育2h 后，混合物處理后經(jīng)瓊脂糖多聚體分析顯示，能隨著抗體濃度的增加抑制ADAMTS13對(duì)VWF的 水解，同時(shí)小鼠 IgG(mlgG)對(duì)水解也無(wú)影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆 抗體屬于IgGl亞類抗體，由雜交瘤細(xì)胞株SZ-169產(chǎn)生;其中，雜交瘤細(xì)胞株SZ-169的保藏編 號(hào)為CCTCC N0:C2016134。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性單克隆抗體，其 特征在于，所述單克隆抗體能夠與全長(zhǎng)的重組人ADAMTS13和截短型的人ADAMTS13-T7特異 性結(jié)合。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗人血管性血友病因子裂解酶的抑制性單克隆抗體，其 特征在于，所述單克隆抗體能夠與還原性的全長(zhǎng)的重組人ADAMTS13特異性結(jié)合。4. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在抑制人血管性血友病因子裂解酶功能中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在抑制人血管性血友病因子裂解酶水解特異性底物血 管性血友病因子中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備血栓性血小板減少性紫癜藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備血管性血友病藥物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求4~7任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單克隆抗體的應(yīng)用濃度為0~ 200yg/mL時(shí)，隨著濃度的增大，單克隆抗體對(duì)ADAMTS13的抑制作用增強(qiáng)。
【文檔編號(hào)】C07K16/40GK106008715SQ201610564881
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月18日
【發(fā)明人】馬珍妮, 凌婧, 沈飛, 馮宇鋒, 蘇健, 阮長(zhǎng)耿
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)附屬第醫(yī)院, 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院