一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物、其制備方法及應(yīng)用，該氨基酸嵌段共聚物具有式I或式II結(jié)構(gòu)；R1為氫、烷基或取代烷基；R2為?NH?或?R5(CH2)rNH?；R3為氫、疏水基團和活性藥物基團中的一種或多種；R4為苯甲基、膽固醇甲?；?、乙酰基、膽酸基、脫氧膽酸基或C4～C20的烷基。該氨基酸嵌段共聚物為具有優(yōu)良水溶性的多肽共聚物，可用于生物材料如藥物遞送領(lǐng)域。該材料凍干后復(fù)溶效果良好，能克服當(dāng)前高分子材料或高分子納米藥物水溶性差的缺陷。當(dāng)該材料通過修飾而含有疏水基團或者化學(xué)鍵合有生物活性的藥物，即使修飾后的高分子材料或鍵合藥仍能保持優(yōu)異的水溶性和復(fù)溶能力，在生物材料領(lǐng)域有潛在應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及聚氨基酸技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物及其制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近十幾年中，納米藥物發(fā)展迅速，對傳統(tǒng)小分子藥物在體內(nèi)的傳輸產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的 影響。納米藥物是指利用納米技術(shù)，將藥物活性成分裝載于納米材料內(nèi)部，制備出的尺度為 納米級的藥物，這些納米藥物可以輸送藥物活性成分至體內(nèi)靶點位置，進而釋放藥物發(fā)揮 活性。其中，藥物活性成分包括抗癌藥、抗炎藥或抗病毒藥。納米載體可以提高負(fù)載藥物的 水溶性和體內(nèi)穩(wěn)定性，并可在病灶部位緩釋或控釋藥物從而達到更持久和高效的治療效 果，目前有多種納米藥物已經(jīng)上市或正處于臨床階段。
[0003]在目前臨床使用的納米藥物中，使用的載體材料很大一部分是高分子材料。其中， 人工合成的聚氨基酸在各種高分子材料中脫穎而出，成為構(gòu)建納米藥物的常用材料。聚氨 基酸在納米藥物中被廣泛應(yīng)用，這得益于其具有良好的生物相容性、生物可降解性和可修 飾性;而且聚氨基酸材料具有成熟的合成化學(xué)理論指導(dǎo)，便于進行大批量的制備。國外正在 臨床階段的NK105、NC6004、CT-2103等，都是利用聚氨基酸通過物理包埋或者共價鍵合的方 式制備的納米藥物。國內(nèi)也有很多相關(guān)專利報道了基于聚氨基酸的納米藥物，例如，申請?zhí)?為201210034414.7的中國專利文獻公開了一種阿霉素納米粒子及其制備方法。該方法通過 靜電復(fù)合將帶正電的阿霉素?fù)?dān)載到帶負(fù)電的聚氨基酸上，所述聚氨基酸含有聚（γ-丙炔 基-L-谷氨酸酯-g-巰基丁二酸)段和聚乙二醇段，在水性介質(zhì)中，其能將阿霉素包裹于納米 粒內(nèi)核，從而賦予阿霉素復(fù)合物粒子較好的穩(wěn)定性。
[0004] 由于高分子納米藥物通常在透析凍干后以凍干粉末的形式來長期存放，這對材料 的水溶性和凍干后復(fù)溶能力都有很高的要求。但是，很多高分子材料本身的溶解能力不足， 且高分子納米藥物在凍干制備過程中水分的喪失會造成高分子之間進一步的堆疊和纏繞， 使得其凍干后水溶性進一步降低。特別是聚氨基酸類材料會在凍干過程發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的改 變，使其溶解性進一步下降。為了改善這種情況，通常采用在凍干過程中加入大量凍干保護 劑的辦法。然而，加入凍干保護劑會提高制備工藝的復(fù)雜程度，同時也可能改變納米藥物的 組裝和形貌。因此，開發(fā)具有優(yōu)良水溶性的高分子材料，對克服納米藥物水溶性和凍干復(fù)溶 能力的不足具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本申請?zhí)峁┮环N水溶性的氨基酸嵌段共聚物及其制備方法和應(yīng)用，本 發(fā)明提供的氨基酸嵌段共聚物材料具有優(yōu)異的水溶性、凍干后復(fù)溶能力和生物相容性，可 以用于多種生物活性成分的體內(nèi)輸送。
[0006] 本發(fā)明提供一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：
[0007]
[TOOS」式I中，選目氫、烷基或取代烷基；
[0009] 式 I 和式 II 中，R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5 S-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NHC00-或-NHC0-，1?10;
[0010] R3選自氫、疏水基團和活性藥物基團中的一種或多種；
[0011 ] R4選自苯甲基、膽固醇甲?；?、乙酰基、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基；
[0012] 20^n^500；5^m^200〇
[0013] 優(yōu)選地，40彡η彡300; 10彡m彡100。
[0014] 優(yōu)選地選自C1~C40的烷基；
[0015] 或者，心選自由巰基、糖殘基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亞胺、馬來酰亞胺、 生物素、RGD類短肽、LHRH類短肽和葉酸中的一種或多種基團取代的烷基。
[0016] 優(yōu)選地，Ri為甲基，R2為-NH-，R3為氫，R4為乙?；?。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的氨基酸嵌段共聚物具有式I或式II結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明 中，所述氨基酸嵌段共聚物是一種具有優(yōu)良水溶性的多肽共聚物，可用于生物材料尤其是 藥物遞送等領(lǐng)域。并且，該聚多肽材料凍干后的復(fù)溶效果良好，可以克服當(dāng)前高分子材料或 高分子納米藥物水溶性差的缺陷。當(dāng)該材料通過修飾而含有疏水基團或者化學(xué)鍵合有生物 活性的藥物，即修飾后的高分子材料或鍵合藥仍能保持優(yōu)異的水溶性和復(fù)溶能力。因此，本 發(fā)明提供的水溶性聚多肽在生物材料尤其是納米藥物等領(lǐng)域中有潛在的應(yīng)用前景。
[0018] 本發(fā)明提供一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物的制備方法，包括以下步驟：
[0019] 將第一嵌段共聚物和乙醇胺反應(yīng)，得到水溶性的氨基酸嵌段共聚物；
[0020] 所述第一嵌段共聚物具有式III結(jié)構(gòu)：
[0021；
Ills
[0022] 所述水溶性的氨基酸嵌段共聚物具有式I結(jié)構(gòu)：
[0023]
[0024] 式III和式I中，選自氫、烷基或取代烷基；
[0025] R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5 為-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NHC00-或-NHC0-，1 彡 r^lO；
[0026] R4選自苯甲基、膽固醇甲?；?、乙酰基、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基；
[0027] 20^n^500；5^m^200；
[0028] 式I中，R3為氫。
[0029] 本發(fā)明提供一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物的制備方法，包括以下步驟：
[0030] 將第二嵌段共聚物和乙醇胺反應(yīng)，得到水溶性的氨基酸嵌段共聚物；
[0031] 所述第二嵌段共聚物具有式IV結(jié)構(gòu)：
[0032]
[0033] 所述水溶性的氨基酸嵌段共聚物具有式II結(jié)構(gòu)：
[0034]
[0035] 式IV和式II 中，R2選自-NH-或-R5(CH2)rNH-，其中，R5為-0-、_0⑶ΝΗ-、-0⑶-、-NHC00-或-NHC0-，1?10;
[0036] R4選自苯甲基、膽固醇甲?；?、乙?；?、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基；
[0037] 20^n^500；5^m^200；
[0038] 式II中，R3為氫。
[0039]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明實施例以聚（乙二醇)-b-聚(L-天冬氨酸芐酯)為基礎(chǔ)，通 過和乙醇胺反應(yīng)得到目標(biāo)高分子。本發(fā)明制得的氨基酸嵌段共聚物具有式I或式II所示的 結(jié)構(gòu)，其具有優(yōu)異的水溶性，而且材料凍干后的復(fù)溶效果良好，可以克服當(dāng)前高分子材料或 高分子納米藥物水溶性差的缺陷。并且，本發(fā)明制得的氨基酸嵌段共聚物易于進行各種化 學(xué)修飾，可以用于生物材料尤其是藥物遞送等領(lǐng)域。此外，該高分子材料的制備方法便捷， 易于大量生產(chǎn)。由此可見，本發(fā)明提供的制備方法能拓展聚氨基酸在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用，解 決當(dāng)前高分子材料在制備納米藥物過程中存在的問題。
[0040] 本發(fā)明提供一種氨基酸高分子材料，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：
[0041]
[0042] 式I中，辦選自氫、烷基或取代烷基；
[0043] 式 I 和式 II 中，R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5 為-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NHC00- 或-NHC0-，1?10;
[0044] R3選自芐氧羰基、膽酸基、脫氧膽酸基、反式維甲酸基、膽固醇甲酰基和C4~C20的 烷基中的一種或多種；
[0045] R4選自苯甲基、膽固醇甲?；⒁阴；⒛懰峄?、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基；
[0046] 20^n^500；5^m^200〇
[0047] 優(yōu)選地，所述高分子材料室溫下水溶性大于lg/mL。
[0048] 本發(fā)明提供一種高分子鍵合藥，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：
[0049] luu&u」 式1中，選目a、烷.現(xiàn)取代烷
[0051 ]式 I 和式 II 中，R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5 S-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NHC00-或-NHC0-，1?10;
[0052] R3選自甲氨蝶呤基團、DMXAA基團、紫杉醇基團、多西他賽基團、喜樹堿基團或修飾 后的活性藥物基團；
[0053] R4選自苯甲基、膽固醇甲?；⒁阴；?、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基；
[0054] 20^n^500；5^m^200〇
[0055] 優(yōu)選地，所述高分子鍵合藥的存在狀態(tài)為膠束、納米粒子、溶液、粉末或薄膜。
[0056] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的氨基酸高分子材料和高分子鍵合藥能保持優(yōu)異的 水溶性和復(fù)溶能力，在納米藥物等領(lǐng)域中有潛在的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0057] 圖1為實施例1制備的帶有保護基的嵌段共聚物以氘代三氟乙酸作為溶劑時的核 磁共振氫譜圖；
[0058] 圖2為實施例1制備的氨基酸嵌段共聚物以三氟乙酸作為溶劑時的核磁共振氫譜 圖；
[0059] 圖3為實施例2制備的芐氧羰基修飾的高分子材料以氘代二甲基亞砜作為溶劑時 的核磁共振氫譜圖；
[0060]圖4為實施例3制備的高分子鍵合藥以氘代三氟乙酸作為溶劑時的核磁共振氫譜 圖；
[0061 ]圖5為實施例3制備的高分子鍵合藥的流體力學(xué)半徑分布圖；
[0062]圖6為實施例3制備的高分子鍵合藥膠束的透射電子顯微鏡照片；
[0063]圖7為實施例3制備的高分子鍵合藥在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中釋放示意 圖。
[0064]圖8為實施例1制備的氨基酸嵌段共聚物對A549細(xì)胞的毒性結(jié)果圖。
[0065] 圖9為實施例1制備的氨基酸嵌段共聚物對MCF-7細(xì)胞的毒性結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0066] 下面對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例 僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范 圍。
[0067] 本發(fā)明提供了一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：
[0068]
[0069] 式I中，Ri選自氫、烷基或取代烷基；
[0070] 式 I 和式 II 中，R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5 S-0-、_0C0NH-、-0C0-、-NHC00-或-NHC0-，1 <r< 10; R3選自氫、疏水基團和活性藥物中的一種或多種;R4選自苯甲基、膽固 醇甲酰基、乙酰基、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基;20<n<500; 5<m<200。
[0071] 本發(fā)明提供的氨基酸嵌段共聚物材料具有優(yōu)異的水溶性、凍干后復(fù)溶能力和生物 相容性，可以用于多種生物活性成分的體內(nèi)輸送。
[0072] 本發(fā)明提供的水溶性的氨基酸嵌段共聚物具有式I結(jié)構(gòu)，包括聚乙二醇嵌段和天 冬氨酸嵌段，該高分子主體是具有良好生物相容性和可降解性的聚氨基酸。其中，η為聚乙 二醇鏈段的聚合度，20<η<500,優(yōu)選40<η<300,更優(yōu)選80<η<250。!!!為天冬氨酸嵌段的 聚合度，5<m<200,優(yōu)選10<m<100,更優(yōu)選10<m<60。在本發(fā)明的一些實施例中，n = 227，m=10;Sn = 113，m = 20;Sn = 113，m=12。
[0073]式I中，選自氫、烷基或取代烷基。在本發(fā)明的一些實施例中，辦可以選自Cl~C40 的烷基，優(yōu)選自C1~C20的烷基，更優(yōu)選為甲基。在本發(fā)明的另一些實施例中，可以選自由 巰基、糖殘基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亞胺、馬來酰亞胺、生物素、R⑶類短肽、LHRH 類短肽和葉酸中的一種或多種基團取代的烷基。式I中，R2選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-。在本發(fā) 明的優(yōu)選實施例中，R2為-NH-。在本發(fā)明的一些實施例中，RA-R 5(CH2)rNH-。其中兒為-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NHC00-或-NHC0-，優(yōu)選為-0-;1 彡r 彡 10,優(yōu)選 2彡r 彡6。
[0074] 式I中，R4選自苯甲基、膽固醇甲酰基、乙?；?、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷 基，優(yōu)選為乙?；?。R3選自氫、疏水基團和活性藥物基團中的一種或多種。在本發(fā)明的一些 實施例中，r 3包括氫，使該材料富含有羥基的側(cè)鏈，不但能提高水溶性和復(fù)溶能力等，而且 易于進行各種修飾。
[0075] 在本發(fā)明的另一些實施例中，R3包括疏水基團，其通過酯鍵連接到高分子主體上。 其中，所述疏水基團包括但不限于C4~C20的烷基、芐氧羰基、膽酸基、脫氧膽酸基、反式維 甲酸基、膽固醇甲?；然鶊F。在本發(fā)明的另一些實施例中，R 3包括活性藥物基團，可以是 未修飾的活性藥物基團通過酯鍵直接連到高分子主體上，也可以是修飾后通過酯鍵直接連 到高分子上。所述活性藥物基團優(yōu)選為小分子活性藥物基團，其中活性藥物可以為甲氨蝶 呤、DMXAA、紫杉醇、多西他賽、喜樹堿等。
[0076] 在本發(fā)明中，R3可以為氫，也可以包括氫和疏水基團如芐氧羰基，還可以包括氫和 活性藥物基團如DMXAA;本發(fā)明對兩種不同基團的比例沒有特殊限制。在本發(fā)明中，天冬氨 酸嵌段中的斜杠7"表明其中的天冬氨酸結(jié)構(gòu)單元以不同形式形成無規(guī)共聚物。
[0077]或者，本發(fā)明提供的水溶性的氨基酸嵌段共聚物具有式II結(jié)構(gòu)，包括聚乙二醇嵌 段和天冬氨酸嵌段。其中，η為聚乙二醇鏈段的聚合度，20<n<500,優(yōu)選40<n<300,更優(yōu) 選80<n<250。!!!為天冬氨酸嵌段的聚合度，5<m<200,優(yōu)選10<m<100,更優(yōu)選10<m< 60。在本發(fā)明的一些實施例中，n = 227，m=10;或n = 113，m = 20;Sn = 113，m=12。
[0078]式II中，R2、R3和R4的各自獨立的選擇范圍與式I中的范圍是一致的，在此不再贅 述。具體的，在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例中，所述氨基酸嵌段共聚物具有式I結(jié)構(gòu)；其中，Rl 為甲基，R2為-NH-，R3為氫，R4為乙酰基，如式ι-a所示。在本發(fā)明的另一些優(yōu)選實施例中，所 述氨基酸嵌段共聚物具有式Π 結(jié)構(gòu):其中，R2S-NH-，R3為氫，R4為乙?；?，如式ΙΙ-a所示。
[0079]
[0080] 在本發(fā)明的實施例中，所述氨基酸嵌段共聚物室溫下水溶性大于lg/mL;凍干后的 材料室溫下水溶性可大于2g/mL。所述氨基酸嵌段共聚物是一種具有優(yōu)良水溶性的多肽共 聚物，可以用于生物材料尤其是藥物遞送等領(lǐng)域。并且，該聚多肽材料凍干后的復(fù)溶效果良 好，可以克服當(dāng)前高分子材料或高分子納米藥物水溶性差的缺陷。同時，本發(fā)明提供的嵌段 共聚物具有良好的生物相容性、安全性。
[0081] 本發(fā)明提供了一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物的制備方法，包括:將具有式III結(jié) 構(gòu)的第一嵌段共聚物和乙醇胺反應(yīng)，得到具有式I結(jié)構(gòu)的氨基酸嵌段共聚物；
[0082]
[0083] 式III和式I中，Ri選自氫、烷基或取代烷基;R2選自-NH-或-R5(CH2)rNH-，其中，R 5 為-0-、-0⑶NH-、-oco-、-NH⑶0-或-NHC0-，1彡r彡10; R4選自苯甲基、膽固醇甲?；⒁阴?基、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基;20彡η彡500; 5彡m彡200;式I中，R3為氫。
[0084] 本發(fā)明以具有式III結(jié)構(gòu)的第一嵌段共聚物為原料，其包括帶有保護基的聚天冬 氨酸片段。本發(fā)明實施例提供第一嵌段共聚物，其制備方法優(yōu)選如下：具有式V或式VI結(jié)構(gòu) 的單氨基聚乙二醇類化合物與γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內(nèi)羧酸酐在有機溶劑中反應(yīng)， 得到具有式III結(jié)構(gòu)的第一嵌段共聚物;式V和式VI中，心選自氫、烷基或取代烷基;20<m< 500;式VI 中，R5 為-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NHC00-或-NHC0-; 1 彡 r 彡 10;
[0085]
[0086] 在本發(fā)明中，所述具有式V或式VI結(jié)構(gòu)的單氨基聚乙二醇類化合物的R^Rs、!!!和r與 上文相應(yīng)的內(nèi)容是一致的，在此不再一一贅述;所述單氨基聚乙二醇類化合物可通過本領(lǐng) 域技術(shù)人員熟知的方法獲得。在本發(fā)明的一些優(yōu)選方案中，所述單氨基聚乙二醇類化合物 具有式V結(jié)構(gòu)，Ri為甲基。在本發(fā)明的另一些優(yōu)選方案中，所述單氨基聚乙二醇類化合物具 有式VI結(jié)構(gòu)，辦為甲基，抱為-〇-，r = 2。在本發(fā)明的實施例中，所述單氨基聚乙二醇類化合物 的數(shù)均分子量可為1000~10000。
[0087]在制備上述帶有保護基的嵌段共聚物的過程中，所述具有式V或式VI結(jié)構(gòu)的單氨 基聚乙二醇化合物中伯氨基與γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內(nèi)羧酸酐的摩爾比優(yōu)選為1:5 ~200,更優(yōu)選為1:10~100。所述的有機溶劑優(yōu)選為Ν，Ν-二甲基甲酰胺和二氧六環(huán)中的一 種或兩種，更優(yōu)選為Ν，Ν-二甲基甲酰胺;所述反應(yīng)優(yōu)選在無水和/或攪拌條件下進行。
[0088]在本發(fā)明實施例中，攪拌反應(yīng)的溫度優(yōu)選為20°C~30°C。所述攪拌反應(yīng)的時間優(yōu) 選為48h~96h，更優(yōu)選為54h~72h。在本發(fā)明的一些實施例中，在無水的Ν，N-二甲基甲酰胺 和無水條件下，利用具有式V或式VI結(jié)構(gòu)的單氨基聚乙二醇類化合物中的伯胺基引發(fā)γ-苯 甲基-L-天冬氨酸酯-Ν-內(nèi)羧酸酐，反應(yīng)完畢后可加入過量的乙酸酐封端。
[0089] 本發(fā)明實施例反應(yīng)結(jié)束后，可減壓抽去大部分有機溶劑和未反應(yīng)的乙酸酐，再用 乙醚沉降，抽濾，干燥后，得到具有式III結(jié)構(gòu)的第一嵌段共聚物。本發(fā)明實施例可取一定量 帶有保護基的第一嵌段共聚物，溶解于有機溶劑中，加入乙醇胺反應(yīng)，得到具有式I結(jié)構(gòu)(R 3 為氫)的氨基酸嵌段共聚物。
[0090] 上述具有保護基的嵌段共聚物與乙醇胺反應(yīng)過程中，帶有保護基的聚天冬氨酸片 段在有機溶劑中將會把保護基脫除，生成如式1所示的中間體，進而在乙醇胺的作用下進一 步開環(huán)，得到式I所示的嵌段共聚物。其中，所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為30°c~40°C。所述反應(yīng)優(yōu) 選在攪拌的條件下進行;攪拌反應(yīng)的時間優(yōu)選為12h~24h，更優(yōu)選為15h~20h。所述反應(yīng)的 有機溶劑優(yōu)選為N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和二氧六環(huán)中的一種或多種，更優(yōu)選為N， N-二甲基甲酰胺。本發(fā)明對反應(yīng)加料的順序沒有特殊限制;所述反應(yīng)優(yōu)選在無水條件下進 行。
[0091]
[0092] 反應(yīng)結(jié)束后，本發(fā)明實施例將反應(yīng)產(chǎn)物用過量乙醚沉降，經(jīng)過濾、洗滌、干燥后得 到具有式I結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物。為了得到式I所示的嵌段共聚物的凍干粉末，本發(fā)明實施例 可將上述沉降產(chǎn)物用N，N_二甲基甲酰胺溶解，在純水中透析，冷凍干燥。其中，所述透析的 時間優(yōu)選為24h~72h，透析過程中換水6~15次。按照本領(lǐng)域常用的冷凍干燥方法，得到具 有式I結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物的凍干粉。
[0093] 本發(fā)明還提供了一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物的制備方法，包括:將具有式IV 結(jié)構(gòu)的第二嵌段共聚物和乙醇胺反應(yīng)，得到具有式II結(jié)構(gòu)的氨基酸嵌段共聚物;式IV和式 11 中，R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5 為-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NHC00-或-NHC0-，1 彡 r 彡 10; R4選自苯甲基、膽固醇甲?；?、乙?；?、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基；20 <η< 500;5彡m彡200;式II中，R3為氫；
[0094]
[0095] 在這種方法中，本發(fā)明以具有式IV結(jié)構(gòu)的第二嵌段共聚物為原料，其包括帶有保 護基的聚天冬氨酸片段。本發(fā)明實施例提供第二嵌段共聚物，其制備方法優(yōu)選如下:具有式 VII或式VIII結(jié)構(gòu)的雙氨基聚乙二醇類化合物與γ -苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內(nèi)羧酸酐在 有機溶劑中反應(yīng)，得到具有式IV結(jié)構(gòu)的第二嵌段共聚物;式VII和式VIII中，20<m<500;式 VIII 中，R5 為-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NHC00-或-NHC0-; 1 彡 r 彡 10;
[0096]
[0097]在本發(fā)明中，所述具有式VII或式VIII結(jié)構(gòu)的雙氨基聚乙二醇類化合物的R5、m和r 與上文相應(yīng)的內(nèi)容是一致的，在此不再一一贅述;所述雙氨基聚乙二醇類化合物可通過本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法獲得。在本發(fā)明的一些優(yōu)選方案中，所述雙氨基聚乙二醇類化合 物具有式VII結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的另一些優(yōu)選方案中，所述雙氨基聚乙二醇類化合物具有式 VIII結(jié)構(gòu)，抱為-〇-，r = 2。在本發(fā)明的實施例中，所述雙氨基聚乙二醇類化合物的數(shù)均分子 量可為1000~10000。
[0098] 在本發(fā)明中，以γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內(nèi)羧酸酐為原料可制備式III、式IV 所示的帶有保護基的嵌段共聚物。本發(fā)明對這種氨基酸-Ν-內(nèi)羧酸酐的來源沒有特殊限制， 可以采用市售產(chǎn)品，也可以參照本領(lǐng)域熟知的以下方法制備:L-天冬氨酸和苯甲醇在濃硫 酸的作用下發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)后處理得到γ -苯甲基-L-天冬氨酸酯，所述γ -苯甲基-L-天冬氨 酸酯與雙(三氯甲基)碳酸酯(三光氣)反應(yīng)，得到γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯-Ν-內(nèi)羧酸酐。
[0099] 本發(fā)明制備帶有保護基的第二嵌段共聚物的過程與制備第一嵌段共聚物的過程 等內(nèi)容是一致的，在此不再贅述。
[0100] 本發(fā)明實施例反應(yīng)結(jié)束后，可減壓抽去大部分有機溶劑和未反應(yīng)的乙酸酐，再用 乙醚沉降，抽濾，干燥后，得到具有式IV結(jié)構(gòu)的第二嵌段共聚物。本發(fā)明實施例可取一定量 帶有保護基的第二嵌段共聚物，溶解于有機溶劑中，加入乙醇胺反應(yīng)，得到具有式II結(jié)構(gòu) (R3為氫)的氨基酸嵌段共聚物。
[0101] 本發(fā)明具有保護基的第二嵌段共聚物與乙醇胺反應(yīng)的過程與第一嵌段共聚物反 應(yīng)的過程等內(nèi)容是一致的;本發(fā)明制備式II所示的嵌段共聚物的凍干粉末的過程與制備式 I所示的嵌段共聚物的凍干粉末的過程也是一致的，在此均不再贅述。
[0102] 上文所述的式I和式II所示的材料(R3為氫)可以被各種帶有羧基的疏水小分子通 過酯化反應(yīng)修飾，也可以被帶有羥基的疏水基團修飾。本發(fā)明以芐醇為例，將芐醇和羰基二 咪唑反應(yīng)制備出活化的中間體羰基咪唑修飾的芐基(Bn-CD I，式2 )，該材料可以和式I -a、式 Π-a所示的高分子在有機溶劑和有機堿的作用下反應(yīng)，從而分別得到具有I和II結(jié)構(gòu)的疏 水修飾的高分子材料，即R3包括芐氧羰基等類型的疏水基團。
[0103]
[0104] 在本發(fā)明中，所述的高分子材料中疏水基團通過酯鍵連接到高分子上，需要的反 應(yīng)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。所述反應(yīng)的溶劑優(yōu)選為N，N_二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和 二氧六環(huán)中的一種或多種，更優(yōu)選為N，N_二甲基甲酰胺。在本發(fā)明實施例中，所述反應(yīng)的有 機堿優(yōu)選為N，N-二甲基對氨基吡啶(DMAP)。所述反應(yīng)的溫度優(yōu)選為40°C~50°C ;反應(yīng)時間 優(yōu)選為12h~24h。
[0105] 相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種氨基酸高分子材料，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：
[0106]
[0107] 式I中，R!選自氫、烷基或取代烷基；式I和式II中，R2選自-NH-或-R5 (CH2 )rNH-，其 中，R5為-ο-、-0C0NH-、-oco-、-NHC00-或-NHC0-，1彡r彡10; R3選自芐氧羰基、膽酸基、脫氧膽 酸基、反式維甲酸基、膽固醇甲?；虲4~C20的烷基中的一種或多種;R4選自苯甲基、膽固 醇甲?；⒁阴；?、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基;20<n<500; 5<m<200。
[0108] 本發(fā)明提供的氨基酸高分子材料包括疏水基團，其通過酯鍵連接到高分子上。其 中，R3選自芐氧羰基、膽酸基、脫氧膽酸基、反式維甲酸基、膽固醇甲?；虲4~C20的烷基 中的一種或多種，優(yōu)選為芐氧羰基。其余基團的相應(yīng)內(nèi)容如前文所述，在此不再贅述。
[0109] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述氨基酸高分子材料室溫下水溶性大于lg/mL。所述 高分子材料的存在狀態(tài)可以為膠束、納米粒子、溶液、粉末或薄膜，本發(fā)明對此沒有特殊限 制。在本發(fā)明中，所述氨基酸高分子材料可以按照前文所述的方法制備得到。本發(fā)明修飾后 的高分子材料仍能保持優(yōu)異的水溶性和復(fù)溶能力，應(yīng)用前景良好。
[0110]此外，上文所述的式I和式II所示的材料(R3為氫)還可以被活性藥物有效鍵合。本 發(fā)明以一個帶有羧基的藥物DMXAA為例，來考察基于式I和式II所示的材料(R3為氫)在構(gòu)建 高分子鍵合藥中的應(yīng)用。DMXAA學(xué)名為5，6-二甲基磺醌-4-乙酸，又稱ASA404，是一個強效的 血管阻斷劑。DMXAA可以選擇性的對腫瘤部位新生血管造成破壞，切斷腫瘤內(nèi)部供血，使腫 瘤內(nèi)部營養(yǎng)不足，造成腫瘤內(nèi)部細(xì)胞大面積的壞死，且不影響正常組織的血管。如式3所示， DMXAA是一個分子量比較小的一元酸，正常情況下水溶性較低。而且DMXAA在血液中代謝較 快，不利于長期在腫瘤部位發(fā)揮效果。利用納米載體的腫瘤部位被動靶向和長駐留，可有效 提高DMXAA的效果。
[0111]
[0112] 在本發(fā)明實施例中，上述高分子鍵合藥制備方法如下:具有式I-a或式ΙΙ-a結(jié)構(gòu)的 氨基酸嵌段共聚物與DMXAA在有機溶劑中，在有機堿和縮合劑的作用下通過酯縮合反應(yīng)，得 到所述具有式I或式Π 結(jié)構(gòu)的高分子鍵合藥，即R3包括DMXAA等類型的活性藥物基團。
[0113] 在本發(fā)明中，所述的高分子鍵合藥中活性藥物基團通過酯鍵連接到高分子上，需 要的反應(yīng)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。在上文所述的制備方法中，所述有機堿優(yōu)選為N，N_ 二甲基對氨基吡啶、三乙胺或吡啶。所述縮合劑優(yōu)選為二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基 碳二亞胺(DIC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC · HC1)或其他類似的縮 合試劑。所述的有機溶劑優(yōu)選為N，N-二甲基甲酰胺和二甲基亞砜中的一種或多種;所述反 應(yīng)優(yōu)選在無水條件下進行。
[0114] 反應(yīng)結(jié)束后，本發(fā)明實施例可將反應(yīng)產(chǎn)物用過量乙醚沉降，過濾、洗滌、干燥后即 得目標(biāo)分子。本發(fā)明實施例可用N，N-二甲基甲酰胺溶解，在純水中透析，冷凍干燥，得到高 分子鍵合藥的凍干粉。其中，所述透析的時間優(yōu)選為24h~72h，透析過程中換水6~15次。本 發(fā)明實施例可通過超速離心除去未反應(yīng)DMXAA固體，并進一步通過220nm濾膜純化，所得到 的透析液按常規(guī)的方式冷凍干燥，得到具有式I或式II結(jié)構(gòu)的高分子鍵合藥的凍干粉。
[0115] 相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種高分子鍵合藥，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：
[0116]
[0117] 式I中，Ri選自氫、烷基或取代烷基；式I和式II中，R2選自-NH-或-R 5 (CH2 )rNH-，其 中，Rs為-0-、-0C0NH-、-0C0-、-NH ⑶ 0-或-NHC0-，1 彡 r 彡 10; R3選自甲氨蝶呤基團、DMXAA 基 團、紫杉醇基團、多西他賽基團、喜樹堿基團或修飾后的活性藥物基團;R4選自苯甲基、膽固 醇甲?；?、乙酰基、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基;20<n<500; 5<m<200。
[0118] 本發(fā)明提供的高分子鍵合藥包括活性藥物基團，其通過酯鍵直接連接到高分子上 或者修飾后通過酯鍵連接到高分子上。其中，R3選自甲氨蝶呤基團、DMXAA基團、紫杉醇基 團、多西他賽基團、喜樹堿基團或修飾后的活性藥物基團，優(yōu)選為DMXAA基團。其余基團的相 應(yīng)內(nèi)容如前文所述，在此不再贅述。
[0119] 在本發(fā)明中，所述高分子鍵合藥的存在狀態(tài)可以為膠束、納米粒子、溶液、粉末或 薄膜。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述高分子鍵合藥膠束均為球形的自組裝結(jié)構(gòu)，粒徑分布 均勻；膠束流體力學(xué)半徑可在l〇nm~70nm之間。所述高分子鍵合藥中的藥物擔(dān)載量可為 10%~50%質(zhì)量比，如實施例中擔(dān)載量為12%、15%、16%等。
[0120] 在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述高分子鍵合藥室溫下水溶性大于lg/mL。在本發(fā)明 中，所述高分子鍵合藥可以按照前文所述的方法制備得到，其仍能保持優(yōu)異的水溶性和復(fù) 溶能力，同時具有良好的藥物活性，利于應(yīng)用。
[0121] 為了進一步理解本申請，下面結(jié)合實施例對本申請?zhí)峁┑乃苄缘陌被崆抖喂?聚物及其制備方法和應(yīng)用進行具體地描述。
[0122] 實施例1
[0123] 向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入5.00g數(shù)均分子量為5000的具有式V結(jié)構(gòu)的聚乙二醇類化 合物，與80mL無水甲苯在130°C下，共沸除水3h后，減壓抽干剩余的甲苯;將得到的固體溶解 于50mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液;將3.50g γ -苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內(nèi)羧酸酐溶解于40mL干燥的Ν，Ν-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液。在氮氣氛圍中，將所述第 一溶液與第二溶液混合，在室溫、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)48h;然后提高溫度到35°C，加入 10mL乙酸酐繼續(xù)反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓抽去大部分N，N-二甲基甲酰胺和未反應(yīng)的乙酸 酐，再用乙醚進行沉降，抽濾，干燥后，得到帶有保護基的嵌段共聚物。
[0124] 對得到的帶保護基的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果參見圖1，圖1為實施例1 制備的帶有保護基的嵌段共聚物以氘代三氟乙酸作為溶劑時的核磁共振氫譜圖。結(jié)果表 明，γ -苯甲基-L-天冬氨酸酯鏈段的聚合度為12，將該嵌段共聚物記為mPEG113-b-PBLA12，其 結(jié)構(gòu)如式ΠΙ-a:
[0125]
[0126] 取5.00g得到的mPEG113-b-PBLA12在35 °C下溶解于45mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺 中，加入2mL乙醇胺，攪拌反應(yīng)24h，將所得產(chǎn)物用乙醚沉降，過濾、洗滌，干燥后用N，N-二甲 基甲酰胺溶解，在純水中透析72h，透析過程中換水10次，然后冷凍干燥，得到具有式I結(jié)構(gòu) 的氨基酸嵌段共聚物的凍干粉。經(jīng)溶解性分析顯示，凍干后的材料室溫下在水中溶解性大 于2g/mL。
[0127] 對得到的氨基酸嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果參見圖2,圖2為實施例1制備 的氨基酸嵌段共聚物以三氟乙酸作為溶劑時的核磁共振氫譜圖。結(jié)果表明，實施例1得到的 嵌段共聚物具有式Ι-a的結(jié)構(gòu)，其中，心是甲基;R 2S-NH-;R3為氫;R4是乙?；?所述嵌段共 聚物的產(chǎn)率為 70%，其中，n = 113，m=12,記為 mPEG113-b-P(ASP-EI)12。
[0128] 實施例2
[0129] 在一干燥的圓底燒瓶中，加入15.0g芐醇和33.0g羰基二咪唑，加入100mL無水二氯 甲烷溶解，室溫反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入500mL乙酸乙酯稀釋，依次用蒸餾水和飽 和食鹽水洗滌有機層，隨后將有機層用無水MgS0 4干燥，過夜。減壓除去有機溶劑，最后得到 10.0g Bn-CDI〇
[0130] 為了得到芐氧羰基修飾的高分子材料，向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入1.00g實施例1中制 備的具有式Ι-a結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物、Bn-CDI(145mg)和DMAP(105mg)，抽真空12h。然后加入 10mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解，在50°C、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，用 過量的乙醚進行沉降，洗滌，抽濾，干燥后，得到目標(biāo)高分子。
[0131] 對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果參見圖3,圖3為實施例2制備的芐氧 羰基修飾的高分子材料以氘代二甲基亞砜作為溶劑時的核磁共振氫譜圖。結(jié)果表明，芐氧 羰基成功接枝到高分子上。實施例2得到的高分子材料具有式I結(jié)構(gòu)，其中，Ri是甲基;辦為-NH-; R3包括氫和芐氧羰基，芐氧羰基所占的比例為34% ;R4是乙?；?。并且，疏水修飾后材料 室溫下的水溶性大于lg/mL。
[0132] 實施例3
[0133] 向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入0.69g實施例1中制備的具有式I-a結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物、 DMXAA(0.37g)和DMAP(120mg)，抽真空12h。然后加入10mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解；用 注射器加入DIC(1.3g)，在室溫、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用過量的乙醚 進行沉降，洗滌，抽濾，干燥后，得到高分子鍵合藥粗品。將該粗品用N，N-二甲基甲酰胺溶 解，然后在純水中透析72h，透析過程中換水10次，所得透析液通過高速離心，然后通過 220nm濾膜純化，最后通過冷凍干燥，得到具有式I結(jié)構(gòu)的高分子鍵合藥的凍干粉末。
[0134] 對得到的氨基酸嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果參見圖4,圖4為實施例3制備 的高分子鍵合藥以氘代三氟乙酸作為溶劑時的核磁共振氫譜圖。結(jié)果表明，DMXAA成功鍵合 到高分子上。實施例3得到的鍵合藥具有式I結(jié)構(gòu)，其中，心是甲基；r 2S-nh-;r3包括氫和 DMXAA;R4是乙?；?；產(chǎn)率為65%，該鍵合藥記為PAED-1。利用紫外-可見光譜在343nm的吸 收，測定實施例2得到的鍵合藥中DMXAA的含量，通過以下公式計算鍵合藥中的DMXAA的擔(dān)載 量(DLC)。測定表明，DMXAA的DLC=12%。
[0135] DLC=(鍵合藥中藥物的質(zhì)量/鍵合藥的總質(zhì)量）X 100%。
[0136] 復(fù)溶后，將PAED-1溶解于磷酸緩沖鹽溶液PBS(pH=7 · 4)，濃度至IjO · lmg/mL，利用動 態(tài)光散射分析，測定膠束的流體力學(xué)半徑，結(jié)果參見圖5,圖5為實施例3制備的高分子鍵合 藥的流體力學(xué)半徑分布圖。結(jié)果表明，PAED-1膠束流體力學(xué)半徑在12nm~30nm之間，粒徑分 布非常均勻。利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察該PAED-1膠束組裝形貌，結(jié)果參見圖6,圖6為 實施例3制備的高分子鍵合藥膠束的透射電子顯微鏡照片。結(jié)果顯示，實施例3得到的鍵合 藥PAED-1膠束均為球形的自組裝結(jié)構(gòu)，粒徑分布均勻。
[0137] 實施例4
[0138] 向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入5.00g數(shù)均分子量為5000的具有式V結(jié)構(gòu)的聚乙二醇類化 合物，與80mL無水甲苯在130°C下，共沸除水3h后，減壓抽干剩余的甲苯;將得到的固體溶解 于50mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液;將5.48g γ -苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內(nèi)羧酸酐溶解于60mL干燥的Ν，Ν-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液。在氮氣氛圍中，將所述第 一溶液與第二溶液混合，在室溫、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)48h;然后提高溫度到35°C，加入 10mL乙酸酐繼續(xù)反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓抽去大部分N，N-二甲基甲酰胺和未反應(yīng)的乙酸 酐，再用乙醚進行沉降，抽濾，干燥后，得到帶有保護基的嵌段共聚物。
[0139] 對得到的帶有保護基的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，γ-苯甲基-L-天冬氨酸酯鏈段的聚合度為20,將該嵌段共聚物記為mPEG 113-b-PBLA20。
[0140] 取5.00g所述的帶有保護基的化合物mPEG113-b-PBLA2Q在35°C下溶解于45mL干燥的 N，N-二甲基甲酰胺中，加入2mL乙醇胺，攪拌反應(yīng)24h，將所得產(chǎn)物用乙醚沉降，過濾、洗滌， 干燥后用N，N-二甲基甲酰胺溶解，在純水中透析72h，透析過程中換水10次，然后冷凍干燥， 得到具有式I結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物的凍干粉。
[0141] 對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，實施例4得到的嵌段共聚物具 有式I-a結(jié)構(gòu)，其中，心是甲基;R：*-NH-;R 3為氫;R4是乙?；?n=113，m=20。所述嵌段共聚 物的產(chǎn)率為70%，記為mPEGii3-b-P(ASP-EI)2〇。
[0142] 實施例5
[0143] 為了得到芐氧羰基修飾的高分子材料，向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入1.00g實施例4中制 備的具有式Ι-a結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物、Bn-CDI(243mg)和DMAP(176mg)，抽真空12h。然后加入 10mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解，在50°C、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，用 過量的乙醚進行沉降，洗滌，抽濾，干燥后，得到目標(biāo)高分子。
[0144] 對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，芐氧羰基成功接枝到高分子 上。實施例5得到的高分子材料具有式I結(jié)構(gòu)，其中，心是甲基;1? 2為-順_; R3包括氫和芐氧羰 基，節(jié)氧幾基所占的比例為40% ;R4是乙醜基。并且，疏水修飾后材料的水洛性大于lg/mL。
[0145] 實施例6
[0146] 向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入0.83g實施例4中制備的具有式I-a結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物、 DMXAA(0.55g)和DMAP(180mg)，抽真空12h。然后加入15mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解；用 注射器加入DIC(2.0g)，在室溫、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用過量的乙醚 進行沉降，洗滌，抽濾，干燥后，得到高分子鍵合藥粗品。將該粗品用N，N-二甲基甲酰胺溶 解，然后在純水中透析72h，透析過程中換水10次，所得透析液通過高速離心，然后通過 220nm濾膜純化，最后通過冷凍干燥，得到具有式I結(jié)構(gòu)的高分子鍵合藥的凍干粉末。
[0147] 對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，DMXAA成功鍵合到高分子上。 實施例6得到的鍵合藥具有式I結(jié)構(gòu)，該鍵合藥記為PAED-2。并且，該鍵合藥室溫下的水溶性 大于lg/mL。利用紫外-可見光譜在343nm的吸收，測定實施例6得到的鍵合藥中DMXAA的含 量，通過實施例3中公式計算鍵合藥中的DMXAA的擔(dān)載量(DLC)。測定表明，DMXAA的DLC = 15%〇
[0148] 復(fù)溶后，將PAED-2溶解于roS(pH = 7.4)，濃度到0.1mg/mL，利用動態(tài)光散射分析， 測定膠束的流體力學(xué)半徑。結(jié)果表明，PAED-2膠束流體力學(xué)半徑在18nm~60nm之間，粒徑分 布均勻。利用透射電子顯微鏡(TEM)分析，結(jié)果顯示，實施例6得到的鍵合藥PAED-2膠束均為 球形的自組裝結(jié)構(gòu)，粒徑分布均勻。
[0149] 實施例7
[0150] 向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入10.00g數(shù)均分子量為10000的具有式VII結(jié)構(gòu)的聚乙二醇 類化合物，與80mL無水甲苯在130°C下，共沸除水3h后，減壓抽干剩余的甲苯;將得到的固體 溶解于80mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液;將6.0g γ -苯甲基-L-天冬氨酸酯-Ν-內(nèi)羧酸酐溶解于50mL干燥的Ν，Ν-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液。在氮氣氛圍中，將所述 第一溶液與第二溶液混合，在室溫、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)48h;然后提高溫度到35°C，加 入20mL乙酸酐繼續(xù)反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓抽去大部分N，N-二甲基甲酰胺和未反應(yīng)的乙 酸酐，再用乙醚進行沉降，抽濾，干燥后，得到帶有保護基的嵌段共聚物。
[0151] 對得到的帶保護基的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，γ-苯甲基-L-天 冬氨酸酯鏈段的總聚合度為20,此時，該嵌段共聚物記為roLAio-b-PEGm-b-PBLAnj。其結(jié)構(gòu) 如式IV-a:
[0152]
[01 53] 可 μ J 1 Ubi L_LU U 1 l^VJZZ / U 1 l ?νπνψ J ?ΟΙΙΙΙ^ I /'TfCUjNjN---?甲 甲酰胺中，加入2mL乙醇胺，攪拌反應(yīng)24h，將所得產(chǎn)物用乙醚沉降，過濾、洗滌，干燥后用N， N-二甲基甲酰胺溶解，在純水中透析72h，透析過程中換水10次，然后冷凍干燥，得到具有式 II結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物。經(jīng)溶解性測定顯示，凍干后的材料室溫下在水中溶溶解性大于2g/ mL〇
[0154] 對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，實施例7得到的嵌段共聚物具 有式ΙΙ-a結(jié)構(gòu)，其中，R2S-NH-;R 3為氫;R4是乙酰基;n = 227，m=10。所述嵌段共聚物的產(chǎn)率 為 60%，記為 P(ASP-EI)i〇-b-PEG227-b-P(ASP-EI)i〇〇
[0155] 實施例8
[0156] 為了得到芐氧羰基修飾的高分子材料，向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入1.00g實施例7中制 備的具有式Π -a結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物、Bn-CDI(145mg)和DMAP(105mg)，抽真空12h。然后加入 10mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解，在50°C、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后，用 過量的乙醚進行沉降，洗滌，抽濾，干燥后，得到目標(biāo)高分子。
[0157] 對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，芐氧羰基成功接枝到高分子 上。實施例8得到的高分子材料具有式II結(jié)構(gòu)，其中，R 2*-NH-; R3包括氫和芐氧羰基，芐氧羰 基所占的比例為34% ;R4是乙酰基。并且，疏水修飾后材料室溫下的水溶性大于lg/mL。
[0158] 實施例9
[0159] 向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入0.80g實施例7中制備的具有式ΙΙ-a結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物、 DMXAA(0.40g)和DMAP(130mg)，抽真空12h。然后加入12mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解；用 注射器加入DIC(1.5g)，在室溫、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用過量的乙醚 進行沉降，抽濾，干燥后，得到高分子鍵合藥粗品。將該粗品用N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后 在純水中透析72h，透析過程中換水10次，所得透析液通過高速離心，然后通過220nm濾膜純 化，最后通過冷凍干燥，得到具有式II結(jié)構(gòu)的高分子鍵合藥。并且，該高分子鍵合藥的水溶 性大于lg/mL。
[0160] 對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，DMXAA成功鍵合到高分子上。 實施例9得到的鍵合藥具有式II結(jié)構(gòu)，其中，R 2S-NH-，R3包括氫和DMXAA，R4為乙?；?產(chǎn)率 為65%，該鍵合藥記為PAED-3。利用紫外-可見光譜在343nm的吸收，測定實施例9得到的鍵 合藥中DMXAA的含量，通過實施例3中公式計算鍵合藥中的DMXAA的擔(dān)載量(DLC)。測定表明， DMXAA 的 DLC=13%〇
[0161] 復(fù)溶后，將PAED-3溶解于roS(pH = 7 · 4)，濃度到0 · lmg/mL，利用動態(tài)光散射分析， 測定膠束的流體力學(xué)半徑。結(jié)果表明，PAED-3膠束流體力學(xué)半徑在12nm~55nm之間，粒徑分 布均勻。利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察，實施例9制備的鍵合藥PAED-3膠束均為球形的自 組裝結(jié)構(gòu)，粒徑分布均勻。
[0162] 實施例10
[0163] 向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入10.00g數(shù)均分子量為10000的具有式VII結(jié)構(gòu)的聚乙二醇 類化合物，與80mL無水甲苯在130°C下，共沸除水3h后，減壓抽干剩余的甲苯;將得到的固體 溶解于80mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第一溶液;將llgy-苯甲基-L-天冬氨酸酯-N-內(nèi)羧酸酐溶解于100mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺中，得到第二溶液。在氮氣氛圍中，將所 述第一溶液與第二溶液混合，在室溫、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)48h;然后提高溫度到35°C， 加入20mL乙酸酐繼續(xù)反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，減壓抽去大部分N，N-二甲基甲酰胺和未反應(yīng)的 乙酸酐，再用乙醚進行沉降，抽濾，干燥后，得到帶有保護基的嵌段共聚物。
[0164] 對得到的帶保護基的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，γ-苯甲基-L-天 冬氨酸酯鏈段的總聚合度為40,此時，該嵌段共聚物記為roLA 2Q-b-PEG227-b-PBLA2Q，其結(jié)構(gòu) 如式IV-a所示。
[0165] 取5 · OOg 所述的 PBLA2Q-b-PEG227-b-PBLA2Q 在35 °C 下溶解于45mL 干燥的N，N-二甲基 甲酰胺中，加入2mL乙醇胺，攪拌反應(yīng)24h，將所得產(chǎn)物用乙醚沉降，過濾、洗滌，干燥后用N， N-二甲基甲酰胺溶解，在純水中透析72h，透析過程中換水10次，然后冷凍干燥，得到具有式 II結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物。并且，該材料凍干后水溶性大于2g/mL。
[0166] 對該嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，實施例10得到的嵌段共聚物具有 式ΙΙ-a結(jié)構(gòu)，其中，R2S-NH-，R 3為氫，R4為乙?；?n = 227，m=20。所述嵌段共聚物的產(chǎn)率為 61 %，記為P (ASP-EI) 2〇-b-PEG227-b-P (ASP-EI) 2〇 〇
[0167] 實施例11
[0168] 為了得到芐氧羰基修飾的高分子材料，向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入1.00g實施例10中 制備的具有式ΙΙ-a結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物、Bn-CDI(243mg)和DMAP(176mg)，抽真空12h。然后加 入10mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解，在50°C、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束后， 用過量的乙醚進行沉降，洗滌，抽濾，干燥后，得到目標(biāo)高分子。
[0169] 對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，芐氧羰基成功接枝到高分子 上。實施例11得到的高分子材料具有式II結(jié)構(gòu)，其中，R 2為-NH-; R3包括氫和芐氧羰基，芐氧 羰基所占的比例為41% ;R4是乙酰基。并且，疏水修飾后材料的水溶性大于lg/mL。
[0170] 實施例12
[0171] 向干燥的反應(yīng)瓶內(nèi)加入0.82g實施例10中制備的具有式ΙΙ-a結(jié)構(gòu)的嵌段共聚物、 DMXAA(0.54g)和DMAP(180mg)，抽真空12h。然后加入18mL干燥的N，N-二甲基甲酰胺溶解；用 注射器加入DIC(2.0g)，在室溫、氮氣保護條件下攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，用過量的乙醚 進行沉降，抽濾，干燥后，得到高分子鍵合藥粗品。將該粗品用N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后 在純水中透析72h，透析過程中換水10次，所得透析液通過高速離心，然后通過220nm濾膜純 化，最后通過冷凍干燥，得到具有式II結(jié)構(gòu)的高分子鍵合藥的凍干粉。
[0172]對得到的嵌段共聚物進行核磁共振分析，結(jié)果表明，DMXAA成功鍵合到高分子上。 實施例12得到的鍵合藥具有式11結(jié)構(gòu)，其中，，R3包括氫和DMXAA，R4為乙酰基;產(chǎn)率 為67%，該鍵合藥記為PAED-4。利用紫外-可見光譜在343nm的吸收，測定實施例12得到的鍵 合藥中DMXAA的含量，通過實施例3中公式計算鍵合藥中的DMXAA的擔(dān)載量(DLC)。測定表明， DMXAA 的 DLC=16%。
[0173] 將PAED-4溶解于roS(pH = 7.4)，濃度到0.1mg/mL，利用動態(tài)光散射分析，測定膠束 的流體力學(xué)半徑。結(jié)果表明，PAED-4膠束流體力學(xué)半徑在15nm~65nm之間，粒徑分布均勻。 利用透射電子顯微鏡(TEM)觀察，實施例12制備的鍵合藥PAED-4膠束均為球形的自組裝結(jié) 構(gòu)，粒徑分布均勻。
[0174] 實施例13
[0175] 取5mg的實施例3制備的PAED-l鍵合藥溶解在5mL0.01M的pH值為7.4的磷酸鹽緩 沖溶液中，然后轉(zhuǎn)移至截留分子量為3500的透析袋，用45mL相應(yīng)pH值的緩沖液進行透析，透 析在溫度為37°C、轉(zhuǎn)速為100的恒溫振蕩箱中進行，每隔特定時間取樣4mL，并補充相應(yīng)量的 緩沖液。
[0176] 利用紫外-可見光譜在343nm的吸收測定釋放液的濃度，得到累計釋放百分比隨著 時間增加的變化關(guān)系，釋放結(jié)果如圖7所示，圖7為實施例3制備的高分子鍵合藥在pH值為 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中釋放示意圖。釋放測定表明，該鍵合藥在正常的生理條件下可以持 續(xù)緩慢的釋放藥物，可以保護藥物在血壓循環(huán)中穩(wěn)定性，等到達腫瘤組織和細(xì)胞，在其中酶 的參與下，快速釋放活性藥物成分，發(fā)揮抑瘤效果。
[0177]實施例14采用MTT細(xì)胞毒性試驗考察氨基酸嵌段共聚物材料的毒性
[0178] 1、收集對數(shù)期A549非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，接種入96孔板內(nèi)，每孔中含有100yL(~ 7000個)細(xì)胞;在37 °C，飽和濕度，5 % C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;
[0179] 2、24h后棄去培養(yǎng)液，用培養(yǎng)基將實施例1制備的mPEG113-b-P(ASP-EI) 12#釋到不 同濃度，加入96孔板內(nèi)，每孔加入200yL，每種濃度3個復(fù)孔;在37°C，飽和濕度，5 % C02細(xì)胞 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;
[0180] 3、48h后，每孔加入20μΙ^度為5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮 唑溴鹽溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h;終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200yL二甲基亞砜，低速振 蕩lOmin，用酶標(biāo)儀檢測各孔在492nm處的吸收值，計算得到各個濃度的嵌段共聚物的細(xì)胞 存活率。
[0181] 結(jié)果參見圖8,圖8為實施例1制備的氨基酸嵌段共聚物對A549細(xì)胞的毒性結(jié)果圖。 結(jié)果表明，在各濃度的嵌段共聚物下細(xì)胞存活率均在80%以上，由此證明本發(fā)明制備的氨 基酸嵌段共聚物具有良好的安全性。
[0182] 實施例15
[0183] 1、收集對數(shù)期MCF-7人乳腺癌細(xì)胞，接種入96孔板內(nèi)，每孔中含有100yL(~7000 個)細(xì)胞;在37 °C，飽和濕度，5 % C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;
[0184] 2、24h后棄去培養(yǎng)液，用培養(yǎng)基將實施例1制備的mPEG113-b-P(ASP-EI) 12#釋到不 同濃度，加入96孔板內(nèi)，每孔加入200yL，每種濃度3個復(fù)孔;在37 °C，飽和濕度，5 %⑶2細(xì)胞 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h;
[0185] 3、48h后，每孔加入20μΙ^度為5mg/mL的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二甲基四氮 唑溴鹽溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h;終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入200yL二甲基亞砜，低速振 蕩l〇min，用酶標(biāo)儀檢測各孔在492nm處的吸收值，計算得到各個濃度的嵌段共聚物的細(xì)胞 存活率。
[0186] 結(jié)果參見圖9,圖9為實施例1制備的氨基酸嵌段共聚物對MCF-7細(xì)胞的毒性結(jié)果 圖。結(jié)果表明，在各濃度的嵌段共聚物下細(xì)胞存活率均在80%以上，同樣證明本發(fā)明制備的 氨基酸嵌段共聚物具有良好的生物相容性。
[0187] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于使本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù) 人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，是能夠?qū)崿F(xiàn)對這些實施例的多種修改的，而這些 修改也應(yīng)視為本發(fā)明應(yīng)該保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種水溶性的氨基酸嵌段共聚物，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：式I中，R1選自氫、烷基或取代烷基； 式 I 和式 II 中，R2 選自-NH-或-R5 (Ofe) rNH-，其中，1?5為-0_、-O ⑶ NH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHC0-，1?10; R3選自氫、疏水基團和活性藥物基團中的一種或多種； R4選自苯甲基、膽固醇甲?；?、乙?；?、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基； 20^n^500；5^m^200〇2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，40<n<300; 100。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，R1選自Cl~C40的烷基； 或者，R1選自由巰基、糖殘基、醛基、羧基、乙烯基、炔基、丁二酰亞胺、馬來酰亞胺、生物 素、RGD類短肽、LHRH類短肽和葉酸中的一種或多種基團取代的烷基。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的氨基酸嵌段共聚物，其特征在于，心為甲基，R^-NH-，R3為氫， R4為乙?；?。5. -種水溶性的氨基酸嵌段共聚物的制備方法，包括以下步驟： 將第一嵌段共聚物和乙醇胺反應(yīng)，得到水溶性的氨基酸嵌段共聚物； 所述第一嵌段共聚物具有式III結(jié)構(gòu)：所述水溶性的氨基酸嵌段共聚物具有式I結(jié)構(gòu)：式III和式I中，R1選自氫、烷基或取代烷基； R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5 為-O-、-O ⑶ NH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHCO-，1 彡 r 彡 10; R4選自苯甲基、膽固醇甲酰基、乙?；?、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基； 20^n^500；5^m^200； 式I中，R3為氫。6. -種水溶性的氨基酸嵌段共聚物的制備方法，包括以下步驟： 將第二嵌段共聚物和乙醇胺反應(yīng)，得到水溶性的氨基酸嵌段共聚物； 所述第二嵌段共聚物具有式IV結(jié)構(gòu)：所述水溶性的氨基酸嵌段共聚物具有式II結(jié)構(gòu)：式IV和式II 中，R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5 為-ο-、-OCONH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHC0-，1?10; R4選自苯甲基、膽固醇甲酰基、乙酰基、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基； 20^n^500；5^m^200； 式II中，R3為氫。7. -種氨基酸高分子材料，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：式I中，R1選自氫、烷基或取代烷基； 式 I 和式 II 中，R2 選自-NH-或-R5 (CH2) rNH-，其中，R5為-0-、-0 ⑶ NH-、-0C0-、-NHCOO-或-NHC0-，1?10; R3選自芐氧羰基、膽酸基、脫氧膽酸基、反式維甲酸基、膽固醇甲酰基和C4~C20的烷基 中的一種或多種； R4選自苯甲基、膽固醇甲?；?、乙?；⒛懰峄?、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基； 20^n^500；5^m^200〇8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的高分子材料，其特征在于，所述高分子材料室溫下水溶性大于 lg/mL〇9. 一種高分子鍵合藥，具有式I或式II結(jié)構(gòu)：式I中，R1選自氫、烷基或取代烷基； 式 I 和式 II 中，R2 選自-NH-或-R5 (Ofe) rNH-，其中，1?5為-0_、-O ⑶ NH-、-OCO-、-NHCOO-或-NHC0-，1?10; R3選自甲氨蝶呤基團、DMXAA基團、紫杉醇基團、多西他賽基團、喜樹堿基團或修飾后的 活性藥物基團； R4選自苯甲基、膽固醇甲酰基、乙?；?、膽酸基、脫氧膽酸基或C4~C20的烷基； 20^n^500；5^m^200〇10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的高分子鍵合藥，其特征在于，所述高分子鍵合藥的存在狀態(tài) 為膠束、納米粒子、溶液、粉末或薄膜。
【文檔編號】A61K47/48GK106008964SQ201610340274
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】湯朝暉, 呂世賢, 于海洋, 馬勝, 周卉聰, 陳學(xué)思
【申請人】中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所