冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法。包括以下步驟：A、采樣，采集子囊孢子未彈射的野生冬蟲夏草子座，保存，B、分離，取冬蟲夏草子座中的菌種于無(wú)菌條件下接種于平板中，C、培養(yǎng)，將含有菌種的平板在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，得到中國(guó)被毛孢菌落，D、純化，將步驟C中的菌落轉(zhuǎn)移至新的平板中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得中國(guó)被毛孢純菌種。本發(fā)明較容易獲得中國(guó)被毛孢純菌種，適用于冬蟲夏草菌種的分離。
【專利說明】
冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的 培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 冬蟲夏草是我國(guó)獨(dú)有珍貴的特產(chǎn)，又稱作蟲草。因其醫(yī)療保健功效強(qiáng)大，故與鹿 茸、人參齊名，被列位于Ξ大補(bǔ)品。研究初期，有人曾把冬蟲夏草歸于肉座目 (Hypocreeales)，但是根據(jù)近期的系統(tǒng)分類，冬蟲夏草應(yīng)歸屬于真菌界(Fungi)、子囊菌口 (Ascomycota)、子囊菌綱（Ascomycetes)、糞殼菌亞綱（Sordariomycetidae)、肉座菌目、麥 角菌科(Clavicipifaceae)、蟲草屬(Cordyceps)。所W，冬蟲夏草是麥角菌科真菌冬蟲夏草 菌寄生在騙幅科昆蟲騙幅蛾越冬幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體。
[0003] 冬蟲夏草是由于騙幅蛾幼蟲被中國(guó)被毛抱菌侵染，幼蟲體淪為營(yíng)養(yǎng)寄主而形成 的。通常在初冬季節(jié)，騙幅蛾幼蟲接觸到中國(guó)被毛抱菌，便會(huì)被侵染。未僵死的幼蟲逐漸蠕 動(dòng)到近地表處，直至蟲體營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡，幼蟲死亡，此時(shí)整個(gè)蟲體被中國(guó)被毛抱菌絲體充 滿，形成僵蟲。蟲體僵死后，便進(jìn)入了冬蟲夏草的有性生長(zhǎng)階段，首先蟲體頭部會(huì)逐漸長(zhǎng)出 子座原基，等到春末夏初，子座原基便開始發(fā)育，長(zhǎng)出形狀如草的子座，即蟲草的繁殖器官。
[0004] 冬蟲夏草對(duì)其生長(zhǎng)環(huán)境條件的獨(dú)特需求，致使其分布區(qū)域有局限性，僅分布于我 國(guó)云南、貴州、西藏、青海、四川西部及甘肅南部地區(qū)，通常生長(zhǎng)于海拔為3000-5000m的高山 草甸中。由于其生長(zhǎng)環(huán)境特殊、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)等原因，目前還沒有實(shí)現(xiàn)人工栽培。
[0005] 每年夏秋季，冬蟲夏草菌開始在侵染幼蟲的體內(nèi)生長(zhǎng)，數(shù)月后菌絲充滿幼蟲體腔， 入冬時(shí)形成僵蟲，很快在±壤凍結(jié)前，從僵蟲蟻裂線長(zhǎng)出子座芽。到來年春夏，子座芽繼續(xù) 生長(zhǎng)，伸出地面。至化月中下旬，子座頭部漸漸膨大，子座和子囊發(fā)育成熟。當(dāng)年入秋后冬蟲 夏草開始有性世代，在當(dāng)年±壤凍結(jié)前從被侵染的寄主蟲體頭部長(zhǎng)出短小的子座。在青海 玉樹，9月下旬就已經(jīng)可W挖到被寄生的蟲體，頭部的子座高約1cm且不露出±面，次年5月 化凍后，±壤溫濕度適合子囊菌生長(zhǎng)，子座W每天3-4mm的速度長(zhǎng)出地面，形似小草，子座出 上初為淡綠色，后變?yōu)樽霞t色，一般在露出地面部分達(dá)20-50mm時(shí)不再繼續(xù)生長(zhǎng)。到6月中 旬，子座頭部漸漸肥大，7月下旬子囊抱子長(zhǎng)成。8-9月逐漸成熟并從子囊殼散發(fā)出來，繼續(xù) 對(duì)寄主幼蟲進(jìn)行寄生。
[0006] 1980年W來，科研人員不斷地對(duì)冬蟲夏草菌的分離培養(yǎng)和冬蟲夏草的人工栽培進(jìn) 行深入研究。研究人員先后分離、報(bào)道的與冬蟲夏草有關(guān)的無(wú)性型菌種多達(dá)20多個(gè)學(xué)名， 2005年的中國(guó)菌物學(xué)會(huì)對(duì)冬蟲夏草及其無(wú)性型進(jìn)行了研討。中國(guó)菌物學(xué)會(huì)理事長(zhǎng)李玉教授 主持，中國(guó)科學(xué)院院±魏江春研究員作了冬蟲夏草菌及其相關(guān)類群分子系統(tǒng)學(xué)分析的專題 報(bào)告。會(huì)議確認(rèn)冬蟲夏草菌的拉下學(xué)名是Cordyc巧S sinensis,其無(wú)性型是中國(guó)被毛抱。國(guó) 際承認(rèn)的無(wú)性型拉下學(xué)名為Hirs;rtella sinensisLiu,Guo,化et Zeng。
[0007] 雖然大量科學(xué)研究證明冬蟲夏草的無(wú)性型是中國(guó)被毛抱，然而仍存在只要分離自 冬蟲夏草的菌種即其無(wú)性型的認(rèn)識(shí)。最常見的如騙幅蛾擬青霉化ecilomyces hepiali 化en et Dai,sp.Nov,目前已被廣泛用于保健食品的生產(chǎn)。研究證明，它雖然分離自冬蟲夏 草，但不是冬蟲夏草的無(wú)性型。
[0008] 根據(jù)過去的經(jīng)驗(yàn)，在冬蟲夏草產(chǎn)區(qū)之外，通過冬蟲夏草的組織或子囊抱子彈射分 離出中國(guó)被毛抱菌種的成功率很低。所W，要實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的人工栽培，做好冬蟲夏草菌種 的分離和培養(yǎng)工作十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌 種的培養(yǎng)方法。
[0010] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案:一種冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱 純菌種的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0011] A、采樣，采集子囊抱子未彈射的野生冬蟲夏草子座，保存，
[0012] B、分離，取冬蟲夏草子座中的菌種于無(wú)菌條件下接種于平板中，
[0013] C、培養(yǎng)，將含有菌種的平板在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，得到中國(guó)被毛抱菌落，
[0014] D、純化，將步驟C中的菌落轉(zhuǎn)移至新的平板中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得中國(guó)被毛抱純菌種。
[0015] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，在步驟B中，接種方法 為:在無(wú)菌潔凈區(qū)內(nèi)，將冬蟲夏草子座部分伸入到預(yù)先培養(yǎng)合格的平板中，蓋上皿蓋，使子 囊抱子自然彈射至平板的培養(yǎng)基表面上。
[0016] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，彈射時(shí)間不小于7天， 每天光照12h，光照強(qiáng)度為30化X。
[0017] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，冬蟲夏草子座的蟲體 部分露在平板外部，蟲體部分用含有無(wú)菌水的無(wú)菌紗布覆蓋包扎、保濕。
[0018] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，在步驟C中，含有菌種 的平板在程控霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15Γ，培養(yǎng)時(shí)間為50天。
[0019] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，在步驟D中，所述的菌 落經(jīng)過2-3次純化培養(yǎng)。
[0020] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，所述的平板的制備方 法是:馬鈴馨去皮洗凈，稱取300g馬鈴馨，切成小塊狀，加水煮爛，過濾，加入瓊脂和葡萄糖， 繼續(xù)加熱，并攬拌混勻，冷卻，加入蠶蛹粉提取液、酵母粉提取液、玉米粉提取液，再補(bǔ)加水 定容至lOOOmL，即為PDA培養(yǎng)基，分裝后滅菌，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無(wú)菌環(huán)境下倒入培養(yǎng) 皿中，凝固后形成平板。
[0021] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)基在37Γ培養(yǎng)箱 培養(yǎng)24h，確定無(wú)菌生長(zhǎng)后倒入到培養(yǎng)皿中。
[0022] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，在步驟B中，接種方法 還包括:子囊抱子彈射7d后將剩余子座內(nèi)核用酒精消毒后，從子座和蟲體連接處剪去蟲體， 在無(wú)菌條件下用消毒后的綴子剝?nèi)プ幼鈱雍稚z組織，至露出類白色內(nèi)部菌絲，用綴 子撕下少許白色菌絲，用消毒后的剪刀剪成小段，放入平板中培養(yǎng)。
[0023] 在上述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法中，在步驟B中，接種方法 還包括:子囊抱子彈射7d后將剩余子座內(nèi)核用酒精消毒后，從子座和蟲體連接處剪去蟲體， 將蟲體外部消毒后，用刀切開，取少量蟲體內(nèi)部組織放入平板中培養(yǎng)。
[0024] 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0025] 1、子囊抱子分離法較容易獲得中國(guó)被毛抱純菌種，適用于冬蟲夏草菌種的分離。
[00%] 2、子囊抱子分離純化或得菌種的方法方便快捷，且成功率高。
[0027] 3、改良的PDA培養(yǎng)基對(duì)中國(guó)被毛抱的生長(zhǎng)有顯著的促進(jìn)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下述實(shí)施例中所用的試劑，如無(wú)特殊說明，可W從常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到。W 下實(shí)施例中的定量數(shù)據(jù)，均設(shè)置Ξ次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[00巧]實(shí)施例1
[0030] 在本實(shí)施例中，平板的制備方法是：馬鈴馨去皮洗凈，稱取300g馬鈴馨，切成小塊 狀，加水煮爛，過濾，加入瓊脂15-20g和葡萄糖20g，繼續(xù)加熱，并攬拌混勻，冷卻，加入蠶蛹 粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉提取液，再補(bǔ)加水定容至1000mL，PDA培養(yǎng)基，分裝后滅 菌，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無(wú)菌環(huán)境下倒入培養(yǎng)皿中，凝固后形成平板。培養(yǎng)基在37Γ培 養(yǎng)箱培養(yǎng)2地，確定無(wú)菌生長(zhǎng)后倒入到培養(yǎng)皿中。蠶蛹粉提取液、酵母粉提取液選用市售的 蠶蛹粉提取物、酵母粉提取物、玉米粉提取物加水形成，市售產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合中國(guó)藥 典，其中蠶蛹粉提取液、酵母粉提取液和玉米粉提取液中的固形物與馬鈴馨的重量比為 0.1-1:0.1-1:0.1-1:100，優(yōu)選為 0.5-0.7:0.6-0.8:0.3-0.5。
[0031] 冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛抱純菌種的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[0032] A、采樣，采集子囊抱子未彈射的野生冬蟲夏草子座，保存，優(yōu)選地，在4Γ冷藏保 存，在本實(shí)施例中，野生冬蟲夏草子座來自四川省阿巧藏族弟族自治州黑水縣，海拔3000- 4000米，高寒草甸，
[0033] B、分離，取冬蟲夏草子座中的菌種于無(wú)菌條件下接種于平板中，平板是指裝有培 養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，
[0034] C、培養(yǎng)，將含有菌種的平板在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，得到中國(guó)被毛抱菌落，
[0035] D、純化，將步驟C中的菌落轉(zhuǎn)移至新的平板中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得中國(guó)被毛抱純菌種。
[0036] 在步驟B中，接種方法為:將超凈工作臺(tái)用0.1 %新潔爾滅擦拭，保持lOmin后打開 超凈工作臺(tái)風(fēng)機(jī)和紫外燈自凈30minW上，得到無(wú)菌潔凈區(qū)，在無(wú)菌潔凈區(qū)內(nèi)，按照潔凈區(qū) 要求進(jìn)行更衣和物料傳遞。將冬蟲夏草子座部分伸入到預(yù)先培養(yǎng)合格的平板中，蓋上皿蓋， 使子囊抱子自然彈射至平板的培養(yǎng)基表面上。優(yōu)選地，彈射時(shí)間不小于7天，每天光照12h， 光照強(qiáng)度為3(K)Lx。冬蟲夏草子座的蟲體部分露在平板外部，蟲體部分用含有無(wú)菌水的無(wú)菌 紗布覆蓋包扎、保濕。
[0037] 在步驟C中，含有菌種的平板在程控霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15Γ，培養(yǎng)時(shí)間 為50天。
[0038] 在步驟D中，所述的菌落經(jīng)過2-3次純化培養(yǎng)。需要說明的是，如果經(jīng)過2次純化，是 指將前一個(gè)新的平板中培養(yǎng)的菌種移到另一個(gè)新的平板中繼續(xù)培養(yǎng)，依次類推。
[0039] 實(shí)施例2
[0040] 本實(shí)施例與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，在步驟B中，接種方法為:子囊抱子 彈射7d后將剩余子座內(nèi)核用酒精消毒后，從子座和蟲體連接處剪去蟲體，在無(wú)菌條件下用 消毒后的綴子剝?nèi)プ幼鈱雍稚z組織，至露出類白色內(nèi)部菌絲，用綴子撕下少許白色 菌絲，用消毒后的剪刀剪成小段，放入平板中培養(yǎng)進(jìn)行步驟C和D。
[0041 ] 實(shí)施例3
[0042] 本實(shí)施例與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，在步驟B中，接種方法為:子囊抱子 彈射7d后將剩余子座內(nèi)核用酒精消毒后，從子座和蟲體連接處剪去蟲體，將蟲體外部消毒 后，用刀切開，取少量蟲體內(nèi)部組織放入平板中培養(yǎng)進(jìn)行步驟C和D。
[0043] 實(shí)施例4
[0044] 本實(shí)施例與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，在步驟C中，含有菌種的平板在程控 霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15 °C，培養(yǎng)時(shí)間為30天。
[0045] 對(duì)比例1
[0046] 本實(shí)施例與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于，平板的制備方法是：馬鈴馨去皮洗 凈，稱取300g馬鈴馨，切成小塊狀，加水煮爛，過濾，加入瓊脂15-20g和葡萄糖20g，繼續(xù)加 熱，并攬拌混勻，冷卻，分裝后滅菌，將滅過菌的PDA培養(yǎng)基在無(wú)菌環(huán)境下倒入培養(yǎng)皿中，凝 固后形成平板。培養(yǎng)基在37Γ培養(yǎng)箱培養(yǎng)2地，確定無(wú)菌生長(zhǎng)后倒入到培養(yǎng)皿中。
[0047] 其余步驟同實(shí)施例1。
[004引對(duì)比例2
[0049] 將實(shí)施例1獲得的中國(guó)被毛抱純菌種接種到對(duì)比例1的平板中，溫度15Γ培養(yǎng)20 天。
[0050] 對(duì)比例3
[0051] 將實(shí)施例1獲得的中國(guó)被毛抱純菌種接種到實(shí)施例1的平板中，溫度15Γ培養(yǎng)20 天。
[00對(duì)分析
[0053] 1、實(shí)施例1、實(shí)施例4與對(duì)比例1在分別按步驟D培養(yǎng)，得到不同固體培養(yǎng)基對(duì)中華 被毛抱生長(zhǎng)的影響表
[0化4]
[0056]中國(guó)被毛抱在普通PDA固體培養(yǎng)基中15°C培養(yǎng)30d，肉眼幾乎不可見或僅可見針尖 大小菌落，培養(yǎng)50dW上，菌落直徑可達(dá)0.2-0.3cm左右，而在實(shí)施例1和實(shí)施例4的PDA固體 培養(yǎng)基中15 °C培養(yǎng)30d，菌落直徑可達(dá)0.8-1.0cm左右，培養(yǎng)50d W上，菌落直徑可達(dá)2.0- 3.0cm左右。在實(shí)施例1和4的固體培養(yǎng)基上的中國(guó)被毛抱菌落，菌絲潔白、粗壯，富有光澤， 呈現(xiàn)疏松的棉花糖狀。實(shí)驗(yàn)表明，在PDA基礎(chǔ)上，加入一定比例的蠶蛹粉提取液、酵母粉提取 液、玉米粉提取液，制成改良PDA培養(yǎng)基，可顯著促進(jìn)中國(guó)被毛抱的生長(zhǎng)。
[0化7] 2、實(shí)施例1、2和3的分析
[005引實(shí)施例1-3均能獲得中華被毛抱純菌種。但實(shí)施例2和3組織分離操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需 要多次純化(至少5次），得到純菌種的成功率不高，實(shí)施例1子囊抱子分離純化或得菌種的 方法方便快捷，且成功率高。因此用實(shí)施例1的方法獲得中華被毛抱純菌種的效果最好。 [0化9] 3、對(duì)比例2和3的分析
[0060]
[0061] 對(duì)比例2在顯微鏡下僅可見極少數(shù)菌絲，對(duì)比例3肉眼可見大量菌絲球。
[0062] 菌絲觀察方法:a，制備染色液:乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液(用于真菌固定和染色）：石 炭酸（結(jié)晶酪)20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉藍(lán)0.05g，蒸饋水20mL。將棉藍(lán)溶于蒸饋水中，再 加入其他成分，微加熱使其溶解，冷卻后用;b，裝片鏡檢:在載玻片上滴ImL乳酸石炭酸棉藍(lán) 染色液，從被侵染的騙幅蛾幼蟲體內(nèi)挑取適量帶抱子的蟲體液，混合入載玻片的液滴中，并 將菌絲分散開。用低倍鏡觀察，必要時(shí)轉(zhuǎn)換高倍鏡鏡檢并記錄觀察結(jié)果。
[0063] 將實(shí)施例1-3分離純化獲得純培養(yǎng)物冷藏保存，取其中3個(gè)平板培養(yǎng)物進(jìn)行菌種鑒 定。經(jīng)過DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序，與DNA分子鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比較分析，同時(shí)進(jìn)行了宏觀 和微觀形態(tài)觀察，結(jié)果表明實(shí)施例1-3的人工培養(yǎng)物為冬蟲夏草菌其無(wú)性型為中國(guó)被毛抱。
[0064] 本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的技術(shù)人員可W對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替 代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神或者超越所附權(quán)利要求書所定義的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 采樣，采集子囊孢子未彈射的野生冬蟲夏草子座，保存， B、 分離，取冬蟲夏草子座中的菌種于無(wú)菌條件下接種于平板中， C、 培養(yǎng)，將含有菌種的平板在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，得到中國(guó)被毛孢菌落， D、 純化，將步驟C中的菌落轉(zhuǎn)移至新的平板中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得中國(guó)被毛孢純菌種。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于， 在步驟B中，接種方法為:在無(wú)菌潔凈區(qū)內(nèi)，將冬蟲夏草子座部分伸入到預(yù)先培養(yǎng)合格的平 板中，蓋上皿蓋，使子囊孢子自然彈射至平板的培養(yǎng)基表面上。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于， 彈射時(shí)間不小于7天，每天光照12h，光照強(qiáng)度為300Lx。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于， 冬蟲夏草子座的蟲體部分露在平板外部，蟲體部分用含有無(wú)菌水的無(wú)菌紗布覆蓋包扎、保 濕。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于， 在步驟C中，含有菌種的平板在程控霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15°C，培養(yǎng)時(shí)間為50天。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于， 在步驟D中，所述的菌落經(jīng)過2-3次純化培養(yǎng)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述的平板的制備方法是：馬鈴薯去皮洗凈，稱取300g馬鈴薯，切成小塊狀，加水煮爛，過 濾，加入瓊脂和葡萄糖，繼續(xù)加熱，并攪拌混勻，冷卻，加入蠶蛹粉提取液、酵母粉提取液和 玉米粉提取液，再補(bǔ)加水定容至l〇〇〇mL，即為PDA培養(yǎng)基，分裝后滅菌，將滅過菌的TOA培養(yǎng) 基在無(wú)菌環(huán)境下倒入培養(yǎng)皿中，凝固后形成平板。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于， 培養(yǎng)基在37 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，確定無(wú)菌生長(zhǎng)后倒入到培養(yǎng)皿中。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在于， 在步驟B中，接種方法還包括:子囊孢子彈射7d后將剩余子座內(nèi)核用酒精消毒后，從子座和 蟲體連接處剪去蟲體，在無(wú)菌條件下用消毒后的鑷子剝?nèi)プ幼鈱雍稚z組織，至露出 類白色內(nèi)部菌絲，用鑷子撕下少許白色菌絲，用消毒后的剪刀剪成小段，放入平板中培養(yǎng)。10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的冬蟲夏草無(wú)性型中國(guó)被毛孢純菌種的培養(yǎng)方法，其特征在 于，在步驟B中，接種方法還包括:子囊孢子彈射7d后將剩余子座內(nèi)核用酒精消毒后，從子座 和蟲體連接處剪去蟲體，將蟲體外部消毒后，用刀切開，取少量蟲體內(nèi)部組織放入平板中培 養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK106010978SQ201610356226
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月25日
【發(fā)明人】林海萍, 朱旭偉, 虞方伯, 龍正海, 張心齊, 趙學(xué)
【申請(qǐng)人】浙江農(nóng)林大學(xué)