一種工程化酮還原酶多肽及其用于制備孟魯斯特中間體的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種工程化酮還原酶多肽及其用于制備孟魯斯特中間體的方法，在制備孟魯斯特中間體的過程中，采用本發(fā)明的工程化酮還原酶多肽，與現(xiàn)有技術(shù)相比，酶用量低、反應(yīng)時間短、底物濃度高，更加適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
【專利說明】
-種工程化酬還原酶多化及其用于制備孟魯斯特中間體的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物制藥和生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種工程化酬還原酶多膚及 其制備孟魯斯特中間體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 孟魯斯特(Montelukast，CAS號158966-92-8)是一種選擇性白Ξ締受體括抗劑 (LTRA)，用于預(yù)防和治療哮喘、支氣管收縮和過敏性鼻炎，具有重要的市場價值。孟魯斯特 的分子結(jié)構(gòu)專利于2012年8月3日到期，因此能夠有效地合成其有效成分2-(3-(3-(化)-2- (7-氯哇嘟基）乙締基)苯基)-(35)-3-?丙基）苯甲酸甲醋的方法具有廣闊的應(yīng)用前景。一 條常見的合成路線如下式所示：
[0003]
[0004] 化學(xué)法工藝中利用(-)-二異松羨基氯棚燒類催化劑（（-)-DIP-Cl)進(jìn)行不對稱加 氨催化(J.Am.Chem. Soc. 1996，118，2521 和W0 2008/009970)。（-)-DIP-Cl存在原子經(jīng)濟(jì)性 差，操作步驟繁瑣，分離復(fù)雜，污染嚴(yán)重等問題。生物轉(zhuǎn)化方法如Org. Process 1?63.06￥.2010，14，193和￥0 2009/04298441等報(bào)道，該方法存在酶量較高(3%)，反應(yīng)時間 長(24h)，底物濃度低（12 % )和有機(jī)溶劑用量(60 % )較高等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工程化酬還原酶多膚及其制備 孟魯斯特中間體的方法。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種能夠?qū)⒌孜?-(3-(3-(化)-2-(7-氯哇嘟基） 乙締基）苯基)-3-酬丙基)苯甲酸甲醋轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物2-(3-(3-(化)-2-(7-氯哇嘟基）乙締基） 苯基)-(35)-3-?丙基)苯甲酸甲醋的工程化酬還原酶多膚，其特征在于，所述酬還原酶多 膚的氨基酸序列與SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、 38、40、42和44中的任一序列具有至少90 %的同源性。其中，序列2為來自Candida magnoliae的野生型酬還原酶，其他的序列通過易錯PCR等隨機(jī)突變和活性位點(diǎn)盒式突變 (CASTing)等定點(diǎn)突變方法獲得，突變體獲得增強(qiáng)的活性和穩(wěn)定性，可W通過高通量篩選 化TS)等方法探知，上述的改變氨基酸序列和篩選突變體庫方法，均為本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技 術(shù)。
[0007] 本發(fā)明提供了一種編碼多膚的多核巧酸。優(yōu)選地，所述多核巧酸選自SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列，其表 達(dá)的蛋白如上文所示。
[0008] 本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與適于在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)被編碼 的多膚的表達(dá)的控制序列可操作地連接的多核巧酸。優(yōu)選地，該多核巧酸的序列為SEQ ID N0：43〇
[0009] 本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含上述表達(dá)載體。優(yōu)選地，該宿主 細(xì)胞為大腸桿菌。
[0010] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備孟魯斯特中間體的方法，所述方法W化合物 1為底物，在適于將其還原為化合物2的反應(yīng)條件下與所述的酬還原酶多膚接觸，其中：
[0011] 所述化合物1的結(jié)構(gòu)式為：
,〇
[0015] 優(yōu)選地，所述還原反應(yīng)是在輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的存在下進(jìn)行的，其中，所述的輔 酶為NADP，所述的輔酶再生系統(tǒng)為葡萄糖和葡萄糖脫氨酶。
[0016] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的葡萄糖脫氨酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的牌 號為EW002的葡萄糖脫氨酶。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的還原反應(yīng)在助溶劑條件下進(jìn)行，所述的助溶劑為甲苯。
[0018] 由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：在制備孟魯斯 特中間體的過程中，采用了本發(fā)明的工程化酬還原酶，克服了現(xiàn)有技術(shù)中反應(yīng)性能欠佳的 問題，其酶用量低(2 % )，反應(yīng)時間短（1化），底物濃度高，可達(dá)20 %，更加適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于W下實(shí)施 例。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可W根據(jù)具體使用的不同要求做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施 條件為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0020] 實(shí)施例1(酬還原酶的制備）：
[0021] 采用常規(guī)方法制備獲得了酬還原酶催化劑:序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43基因片段由蘇州金唯智生物科技有限公司合 成，與祀T30a(Novagen)質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)E.coli BL2UDE3)菌株，篩選得 到陽性克隆子，接種到含有抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至0D600至0.8，加入誘導(dǎo)劑 IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)16小時，離屯、收集沉淀，加入憐酸鹽緩沖液懸浮，冰水浴中超聲波破碎10分 鐘，離屯、取上清，冷凍得到酬還原酶酶粉。
[0022] 實(shí)施例2(酬還原酶的篩選）
[0023] 由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43分 別在大腸桿菌中表達(dá)獲得的酬還原酶2mg，葡萄糖脫氨酶(采購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公 司，牌號EW002)2mg，NADP Img，底物2-(3-(3-(化)-2-(7-氯哇嘟基）乙締基）苯基)-3-酬丙 基)苯甲酸甲醋50mg、葡萄糖50mg加至裝有2mL 0.05ΜΞ乙醇胺緩沖液的5mL反應(yīng)器中，30°C 10(Κ)巧m攬拌，比后取樣HPLC檢測，序列43的轉(zhuǎn)化率和ee均為>99%，因此采用序列43作為進(jìn) 一步研究對象。
[0024] 實(shí)施例3(酶催化反應(yīng)）：
[0025] 向50mL反應(yīng)Ξ口瓶中依次加入lOOmg酬還原酶（由序列43在大腸桿菌中表達(dá)獲 得），20mg葡萄糖脫氨酶(采購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，牌號EW002)和5mg NADP的Ξ 乙醇胺緩沖液，5g底物2-(3-(3-(化)-2-(7-氯哇嘟基）乙締基)苯基)-3-酬丙基)苯甲酸甲 醋，3.5g葡萄糖，20血0.05M pH 7.0Ξ乙醇胺緩沖液，5血甲苯，溫度調(diào)節(jié)至30°C，9(K)r/min 攬拌，15%化2〇)3溶液維持抑至7.0，反應(yīng)12h，HPLC檢測轉(zhuǎn)化率99%，加入甲醇30ml，60°C回 流化，過濾后向?yàn)V液中滴加去離子水至不再有固體析出，過濾取濾餅60°C下加入甲醇至恰 好溶解后，滴加去離子水至不再有固體析出，過濾得到產(chǎn)品4.2g，純度99 %，含量99 %。
[0026] 上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人 ±能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加 W實(shí)施，并不能W此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明 精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能夠?qū)⒌孜?-(3-(3-( (E)-2-(7-氯喹啉基）乙烯基)苯基)-3-酮丙基)苯甲酸甲 酯轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物2-(3-(3-( (E)-2-(7-氯喹啉基）乙烯基)苯基)-(3S)-3-羥丙基）苯甲酸甲酯 的工程化酮還原酶多肽，其特征在于，所述酮還原酶多肽的氨基酸序列與SEQ ID N0:2、4、 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42 和 44中的任一序列具有至 少90 %的同源性。2. -種編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽的多核苷酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其選自SEQ ID ΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43 中的任一序列。4. 一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與適于在宿主細(xì)胞中指導(dǎo)被編碼的多肽的表達(dá)的 控制序列可操作地連接的權(quán)利要求3所述的多核苷酸。5. -種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌。7. -種制備孟魯斯特中間體的方法，其特征在于，所述方法以化合物1為底物，在適于 將其還原為化合物2的反應(yīng)條件下與權(quán)利要求1所述的酮還原酶多肽接觸，其中： 所述化合物1的結(jié)構(gòu)式為： 所述化合物2的結(jié)構(gòu)：8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述還原反應(yīng)是在輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的 存在下進(jìn)行的，其中，所述的輔酶為NADP，所述的輔酶再生系統(tǒng)為葡萄糖和葡萄糖脫氫酶。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脫氫酶為購自蘇州漢酶生物 技術(shù)有限公司生產(chǎn)的牌號為EW002的葡萄糖脫氫酶。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的還原反應(yīng)在助溶劑條件下進(jìn)行，所 述的助溶劑為甲苯。
【文檔編號】C12N15/53GK106011092SQ201610440251
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】原海亮
【申請人】蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司