工程化酮還原酶多肽及其用于制備(3r,5s)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種工程化酮還原酶多肽及其用于制備(3R,5S)?6?氯?3,5?二羥基己酸叔丁酯的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，反應(yīng)過程中采用了本發(fā)明的工程化酮還原酶多肽，其不僅酶用量低，而且反應(yīng)時(shí)間短、底物濃度高，更加適合產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
【專利說明】
工程化酬還原酶多化及其用于制備(3R，5S)-6-氯-3,5-二哲 基己酸放T醋的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥和生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體設(shè)及一種工程化酬還原酶多膚及其用 于制備(3R，5S)-6-氯-3,5-二徑基己酸叔下醋的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] (3R，5S)-6-氯-3,5-二徑基己酸叔下醋是一種手性藥物擱塊，可W用于合成包括 羅蘇伐他汀(Rosuvas化tin)等藥物，其結(jié)構(gòu)如式1所示。
[0003]
[0004] (3R，5S)-6-氯-3,5-二徑基己酸叔下醋的常見合成方法如式2所示，其關(guān)鍵步驟在 于合成3-位的手性徑基中屯、，將含有幾基的前體6-氯-(5S)-徑基-3-幾基己酸叔下醋直接 還原成手性醇無疑是較為理想的方法。
[0005]
[0006] 該反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)方法主要有化學(xué)法和生物法。化學(xué)法例如Angew.化em. Int. Ed. 2000 ，39:4306-4307等報(bào)道，低溫下使用易燃易爆試劑，工藝復(fù)雜且環(huán)境友好性不高，產(chǎn)物de值 較低（93%)。生物法中的整細(xì)胞催化法如《化學(xué)反應(yīng)工程與工藝》，2006,26:554-559和 Korean J.化em.化g.，2013,30:166-171等報(bào)道，存在底物濃度低（<50旨/〇，酶用量大（〉 50g/L)，ee值低(95 % )等問題。游離的酬還原酶催化如W0 2008042876等報(bào)道，底物濃度低 (13g/U，酶用量高(酬還原酶3.3%，GDH 3.3%，輔酶0.67% )，產(chǎn)物收率低(66.7% )。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工程化酬還原酶多膚及其用于制 備(3R，5S)-6-氯-3,5-二徑基己酸叔下醋的方法。
[000引為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種工程化酬還原酶多膚，能夠W6- 氯-(5S)-徑基-3-幾基己酸叔下醋為底物，在適合的條件下將其還原為(3R，5S)-6-氯-3,5- 二徑基己酸叔下醋，所述的酬還原酶多膚的氨基酸序列與序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、 22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。其中，序 列2為來自化ndida magnoliae的野生型酬還原酶，其他的序列通過易錯(cuò)PCR等隨機(jī)突變和 活性位點(diǎn)盒式突變(CASTing)等定點(diǎn)突變方法獲得，突變體獲得增強(qiáng)的活性和穩(wěn)定性，可W 通過高通量篩選化TS)等方法探知，上述的改變氨基酸序列和篩選突變體庫方法，均為本領(lǐng) 域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)。
[0009] 本發(fā)明提供了一種編碼多膚的多核巧酸。優(yōu)選地，所述的多核巧酸選自序列1、3、 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列，其表達(dá)的 蛋白如上文所示。
[0010] 本發(fā)明提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與適合指導(dǎo)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的控 制序列可操作地連接的多核巧酸。該表達(dá)載體為祀T30a。
[0011] 本發(fā)明還提供一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含上述的表達(dá)載體，如大腸桿菌、枯 草芽抱桿菌、地衣芽抱桿、黑曲霉、釀酒酵母和畢赤酵母等。優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞為大腸桿 困。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種使用上述酬還原酶多膚生物催化制備(3R，5S)-6-氯-3,5-二 徑基己酸叔下醋的方法，所述方法W6-氯-(5S)-徑基-3-幾基己酸叔下醋為底物，在適于將 其還原為（3R，5S)-6-氯-3,5-二徑基己酸叔下醋的反應(yīng)條件下與上述的酬還原酶多膚接 觸。
[0013] 優(yōu)選地，所述反應(yīng)是在輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的存在下，在pH為6.0~7.0、溫度為25 °C~30°C的緩沖溶液中進(jìn)行的，其中，所述的輔酶為NADP，所述的輔酶再生系統(tǒng)為葡萄糖和 葡萄糖脫氨酶。常見的輔因子再生系統(tǒng)包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脫氨酶、甲酸和甲酸 脫氨酶、葡萄糖-6-憐酸和葡萄糖-6-憐酸脫氨酶、仲醇(如異丙醇)和仲醇脫氨酶、亞憐酸和 亞憐酸脫氨酶、分子氨和氨化酶W及電化學(xué)等方法。
[0014] 優(yōu)選地，所述葡萄糖脫氨酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的牌號為 EW002的葡萄糖脫氨酶。
[0015] 由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)：在制備（3R， 55)-6-氯-3,5-二徑基己酸叔下醋過程中，采用了包括來源于〔曰11(11(13 1]1曰即〇11曰0 1尸〇 0705的野生型酬還原酶多膚和及其工程化還原酶多膚的系統(tǒng)酬還原酶，與現(xiàn)有技術(shù)相比， 酶用量降低至0.25%，底物濃度提高至lOOg/L，反應(yīng)時(shí)間縮短至6小時(shí)，底物轉(zhuǎn)化率99%，具 有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于W下實(shí)施 例。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可W根據(jù)具體使用的不同要求做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施 條件為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。
[0017] 實(shí)施例1(酬還原酶的制備）：
[0018] 采用常規(guī)方法制備獲得了酬還原酶催化劑:序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43的基因片段由蘇州金唯智生物科技有限公司 合成，與祀T30a(Novagen)質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)入感受態(tài)E. CO1 i BL21 (DE3)菌株，篩選 得到陽性克隆子，接種到含有抗性的液體LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)至0D600至0.8,加入誘導(dǎo) 劑IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)，離屯、收集沉淀，加入憐酸鹽緩沖液懸浮，冰水浴中超聲波破碎10 分鐘，離屯、取上清，冷凍得到酬還原酶酶粉。
[0019] 實(shí)施例2(酬還原酶的篩選）
[0020] 由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43在 大腸桿菌中表達(dá)獲得的酬還原酶2mg，G畑(采購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，牌號EW002) 2mg，NADP Img，底物6-氯-(5S)-徑基-3-幾基己酸叔下醋50mg、葡萄糖50mg加至裝有2mL 0.05ΜΞ乙醇胺緩沖液的5mL反應(yīng)器中，30°C 1000巧m攬拌，化后取樣HPLC檢測，序列43的轉(zhuǎn) 化率和ee均為>99%，因此采用序列43作為進(jìn)一步研究對象。
[0021] 實(shí)施例3(酶催化反應(yīng)）
[0022] 底物6-氯-(5S)-徑基-3-幾基己酸叔下醋6g、葡萄糖20g加至裝有50mL 50mM pH 6.5的憐酸鹽緩沖溶液的lOOmL反應(yīng)器中，加入由序列43在大腸桿菌中表達(dá)獲得的酬還原酶 15mg，G畑(采購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司，牌號EW002) 15mg，NADP 3mg，在25°C下，用濃 度為15%的碳酸鋼溶液調(diào)節(jié)控制抑6.0-6.5，攬拌6小時(shí)，HPLC/MS檢測反應(yīng)完全，加入等體 積乙酸乙醋過濾后取有機(jī)相，水相用等體積乙酸乙醋萃取3次，合并有機(jī)相旋蒸獲得產(chǎn)物 (3R，5S)-6-氯-3，5-二徑基己酸叔下醋的淡黃色液體5.5g，de值99.9%，純度99.0%。
[0023] 上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此項(xiàng)技術(shù)的人 ±能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)W實(shí)施，并不能W此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明 精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種工程化酮還原酶多肽，能夠以6-氯_(5S)_羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，在適 合的條件下將其還原為(3R，5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯，其特征在于，所述的酮還原 酶多肽的氨基酸序列與序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、 40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。2. -種編碼如權(quán)利要求1所述的多肽的多核苷酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其選自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。4. 一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含與適合指導(dǎo)在宿主細(xì)胞中表達(dá)的控制序列可操作 地連接的權(quán)利要求3所述的多核苷酸。5. -種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其為大腸桿菌。7. -種使用權(quán)利要求1中所述的酮還原酶多肽生物催化制備（3R，5S)-6-氯-3,5-二羥 基己酸叔丁酯的方法，其特征在于，所述方法以6-氯_(5S)_羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底 物，在適于將其還原為(3R，5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的反應(yīng)條件下與權(quán)利要求1所 述的酮還原酶多肽接觸。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備(3R，5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，其特征在 于，所述反應(yīng)是在輔酶和輔酶再生系統(tǒng)的存在下，在pH為6.0~7.0、溫度為25 °〇30 °C的緩沖 溶液中進(jìn)行的，其中，所述的輔酶為NADP，所述的輔酶再生系統(tǒng)為葡萄糖和葡萄糖脫氫酶。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備(3R，5S)-6-氯-3,5-二羥基己酸叔丁酯的方法，其特征在 于，所述葡萄糖脫氫酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的牌號為EW002的葡萄糖脫 氫酶。
【文檔編號】C12P7/62GK106011094SQ201610596347
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月27日
【發(fā)明人】付敏杰, 張濤
【申請人】蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司