一種Pfu DNA聚合酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種Pfu DNA聚合酶及其制備方法，該方法包括構(gòu)建Fast Pfu DNA聚合酶的原核構(gòu)建獲得表達(dá)菌株的步驟，將菌株接種到培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體；菌體經(jīng)破菌、純化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。本發(fā)明采用分子進(jìn)化技術(shù)對普通Pfu酶進(jìn)行改造，制備新型的Fast Pfu聚合酶，具有快速、高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是新一代的高保真DNA聚合酶。
【專利說明】
-種Pfu DNA聚合酶及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)試劑領(lǐng)域，特別是制備化St押U DM聚合酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Pfu DNA聚合酶（Pfu DNA polymerase)，又稱Pfu聚合酶，或P化酶，是在嗜熱的古 核生物火球菌屬內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，一類能在活體內(nèi)進(jìn)行DNA復(fù)制的酶，該酶含有2個(gè)蛋白亞基(P45 和P50)，為多聚體，分子量約為90kDa，該酶同時(shí)具有5 ' -3 '聚合酶活性和3 ' -5 '外切核酸酶 活性。因此在聚合反應(yīng)中可糾正錯(cuò)誤滲入的堿基，保真性極高。體外實(shí)驗(yàn)中，在聚合酶鏈反 應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)中，使用P化聚合酶可W快速，高保真的擴(kuò)增DNA片 段。然而P化酶擴(kuò)增靈敏度不高，延伸速度緩慢（化b/分鐘)給眾多的使用者帶來了不便，影 響了 Pfu酶的應(yīng)用推廣。
[0003] 有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加 W研究創(chuàng)新，W期創(chuàng)設(shè)一種Pfu DNA聚合酶 及其制備方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種Pfu DNA聚合酶及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明的一種P化DNA聚合酶的制備方法，包括構(gòu)建化St P化DNA聚合酶的表達(dá) 載體并獲得表達(dá)菌株的步驟。
[0006] 進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。
[0007] 進(jìn)一步的，所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程菌獲得表達(dá)菌株。
[000引進(jìn)一步的，P化DNA聚合酶的制備方法包括W下步驟：
[0009] (1)合成引物Pr-1和Pr-2，w全基因合成化St押U DNA聚合酶的DNA序列為模板， 用對應(yīng)的引物PCR獲得的產(chǎn)物Nde 1和趾01雙酶切后連接到用相同的酶酶切好的表達(dá)載體 上，轉(zhuǎn)化D冊a，測序獲得正確的陽性表達(dá)質(zhì)粒，然后運(yùn)種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)工程菌，獲得表達(dá)菌 株，其中引物序列如下所示：
[0010] Pr-1：ATGATTTTAG ATGTGGAT；
[0011] Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT；
[001^ (2)將步驟（1)中獲得的菌株接種到37°C的LB培養(yǎng)基中，250rmp震蕩培養(yǎng)到0D600 = 0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，為了提高蛋白可溶性表達(dá)的比例，同時(shí)將培養(yǎng)溫度降 至20°C，低溫誘導(dǎo)表達(dá)過夜（1化），化轉(zhuǎn)離屯、收集菌體；
[OOU] (3)步驟(2)中的菌體經(jīng)破菌、純化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。
[0014] 進(jìn)一步的，所述原核表達(dá)載體為祀T30a、或地AD/His。
[0015] 進(jìn)一步的，所述工程菌為化21(DE3)、0rigami 2(DE3)或Rosetta(DE3)。
[0016] 進(jìn)一步的，步驟(2)中，用于誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)劑為1口了6或心阿拉伯糖，其中優(yōu)選ImM 的IPTG。
[0017] 進(jìn)一步的，步驟(3)中，用于破菌的破菌緩沖液為Tis-化1或PBS，優(yōu)選20mM Tris， 250mMNaCl，p冊.0。
[001引全基因合成化St P化DNA聚合酶的DNA序列，PCR獲得具有連接位點(diǎn)的產(chǎn)物，連接 到祀T30a載體上，轉(zhuǎn)化D冊a，測序獲得正確的陽性表達(dá)質(zhì)粒:pET30a-Fast PfU;轉(zhuǎn)化入化21 (DE3)，獲得表達(dá)菌株。
[0019] 本發(fā)明的一種化St押U DNA聚合酶，具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，編碼 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO: 2所示的核巧酸序列，該新型 聚合酶具有快速、高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是新一代的高保真DM聚合酶。
[0020] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有W下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] 本發(fā)明采用分子進(jìn)化技術(shù)對普通Pfu酶進(jìn)行改造，制備新型的化St P化聚合酶，具 有快速、高靈敏度、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是新一代的高保真DNA聚合酶;使用化St押U聚合 酶能獲得更理想的擴(kuò)增結(jié)果，并大幅度縮短擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間，其保真度高于P化酶，是普通化q 酶的50倍;Fast P化聚合酶擴(kuò)增速度為普通Pfu酶的數(shù)倍，72°C保溫30秒可延伸化bW上，擴(kuò) 增長度可達(dá)20化，能高效擴(kuò)增《化b片段;靈敏度高，可從0.05ng人基因組DNA模板中擴(kuò)增出 1.2化特定基因片段。
[0022] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予W實(shí)施，W下W本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發(fā)明中實(shí)施例一得到的化St押U DNA聚合酶電泳圖；
[0024] 圖2是本發(fā)明中實(shí)施例二得到的化St押U DNA聚合酶電泳圖；
[0025] 圖3是本發(fā)明中實(shí)施例一得到的化St Pfu DNA聚合酶進(jìn)行靈敏度檢測電泳結(jié)果 圖；
[0026] 圖4是本發(fā)明中實(shí)施例一得到的化St押U DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增大片段測試電泳結(jié) 果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)描述。W下實(shí)施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[002引實(shí)例一 :Fast押U DNA聚合酶的制備
[0029] (l)Fast P化DNA聚合酶表達(dá)菌株的獲得:全基因合成化St押U DNA聚合酶的DNA 序列（SEQ ID N0:1)，合成引物Pr-1和Pr-2，W合成好的基因?yàn)槟０?，用對?yīng)的引物，通過 PCR獲得的產(chǎn)物Me 1和化01雙酶切后連接到用相同的酶酶切好的祀T30a載體上，轉(zhuǎn)化D冊a， 測序獲得正確的陽性表達(dá)質(zhì)粒:pET30a-化St Pfu;然后運(yùn)種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化化21(DE3)，獲得表 達(dá)菌株;其中引物序列如下所示：
[0030] Pr-1:ATGATTTTAGATGTGGAT;
[0031] Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT；
[00創(chuàng) （2)將步驟（1)中獲得的菌株按1:100的比例接種到37 °C的LB培養(yǎng)基中，25化mp震 蕩培養(yǎng)到0D600 = 0.6時(shí)，加入誘導(dǎo)劑ImM的IPTG，為了提高蛋白可溶性表達(dá)的比例，同時(shí)將 培養(yǎng)溫度降至20°C，低溫誘導(dǎo)表達(dá)過夜（1化），化轉(zhuǎn)離屯、收集菌體；
[0033] (3)菌體質(zhì)量與破菌緩沖液體積（50mM Tis-Hcl，pH 8.0,500mM NaCl)按1:10混 合，即Ig菌體加入10ml緩沖液，超聲破菌，1化轉(zhuǎn)離屯、30min收集上清液，過Ni柱純化，如下：
[0034] (3.1)平衡：用平衡緩沖液(20mM Tr iS-HC1，P冊.0，500mMNaCl，20mM咪挫)平衡柱 子，平衡緩沖液及樣品中不可有抓TA、Arg等物質(zhì)，直至抑達(dá)到8.0,紫外檢測讀數(shù)穩(wěn)定，一般 為5-10個(gè)柱體積，檢測調(diào)零后上樣；
[0035] (3.2)上樣:樣品應(yīng)保持澄清，如發(fā)現(xiàn)沉淀渾濁則需要離屯、，收集流出；
[0036] (3.3)平衡:上樣結(jié)束，用平衡緩沖液平衡層析柱，直到紫外檢測讀數(shù)回到基線或 相對穩(wěn)定；
[0037] (3.4)預(yù)洗：用預(yù)洗緩沖液(20mM Tris-肥1，p冊.0，500mMNaCl，50mM咪挫)預(yù)洗，收 集洗脫組分；
[003引 （3.5)洗脫：用洗脫液(20mM Tris-HCl，p冊.0，500mMNaCl，200mM咪挫）洗脫目標(biāo)蛋 白，收集洗脫組分；
[0039] (3.6)洗柱：用洗柱緩沖液(20mM化iS-肥1，P冊.0，500mMNaCl，500mM咪挫)沖洗層 析柱，收集洗脫組分；
[0040] (4)為了去除蛋白中微量的但會(huì)影響后期實(shí)驗(yàn)的宿主殘留DNA或質(zhì)粒DNA，運(yùn)部分 樣品會(huì)再經(jīng)過陰離子柱純化(Q S巧harose化St Flow),具體步驟如下：
[0041 ] (4.1)平衡：用緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0)平衡柱子，直至pH達(dá)到8.0，紫外檢 測讀數(shù)穩(wěn)定，一般為5-10個(gè)柱體積，檢測調(diào)零后上樣；
[0042] (4.2)上樣:樣品應(yīng)保持澄清，如發(fā)現(xiàn)沉淀渾濁則需要離屯、，樣品中離子強(qiáng)度不宜 超過5ms/cm，收集流出；
[0043] (4.3)平衡:上樣結(jié)束，用平衡液平衡層析柱，直到紫外檢測讀數(shù)回到基線或相對 穩(wěn)定；
[0044] (4.4)洗脫:用不同鹽濃度：
[0045] 20mM Tris-肥 1，抑8.0,50mMNaCl;
[0046] 20mMTris-HCl，p冊.0，lOOmMNaCl;
[0047] 20mMTris-HCl，p冊.0，200mMNaCl;
[0048] 20mM Tris-肥1，抑8.0,300mMNaCl;
[0049] 20mM Tris-肥1，抑8.0,500mMNaCl;
[0050] (5)分步洗脫，分步收集各個(gè)洗脫組分，因?yàn)闅埩鬌NA-般在高鹽組分中，所W收集 低鹽洗脫的蛋白質(zhì)樣品，得到目標(biāo)產(chǎn)物化St押U DNA聚合酶，如圖1所示，泳道MK:分子量標(biāo) 記;泳道1:蛋白產(chǎn)品（3yg，洗脫后）；泳道2:蛋白產(chǎn)品（3yg，未洗脫），其中，F(xiàn)ast P化DNA聚 合酶儲(chǔ)存溶液：20mM Tris-HCl (pH 8.0)，ImM DTT，0.1mM 抓 TAaOOmMKCl，0.5% (v/v) Nonidet P40,0.5%(v/v)Tween20and 50%(v/v)甘油。
[0化1] 實(shí)例二:Fast押u DNA聚合酶的制備
[0052] 本實(shí)施例的步驟和實(shí)例一相同，其區(qū)別在于:步驟(2)中，將菌株按1:20接種到LB 培養(yǎng)基中；步驟(3)中，菌體質(zhì)量與破菌緩沖液體積(50mM Tis-Hcl，pH 8.0,500mM NaCl)按 1:5混合，即Ig菌體加入5ml破菌緩沖液;得到的目標(biāo)產(chǎn)物化St押u DNA聚合酶，如圖2所示， 如圖所示:我們能夠得到與理論分子量大小相符的目的蛋白。
[0053] 對實(shí)施例一得到的化St押U DNA聚合酶進(jìn)行靈敏度檢測，如下：
[0化4] 在50μ1擴(kuò)增體系中，分別W50ng-0.05ng人基因組DM為模板，對特定基因片段 (1.2化)進(jìn)行的擴(kuò)增。
[0055] 其中反應(yīng)體系如下：
[0056] 5 X 化stP化 Buf f er (含Mgh) 10μ1;上游引物0.2-1.0μΜ(終濃度）；下游引物0.2- 1.0μΜ(終濃度）；dNTPs(各ΙΟπιΜΗμΙ;模板0.05ng-50ng(基因組）；化St 押U DNA聚合酶0.25 山1(1.2抓）；(1地2至5〇41。
[0057] PCR程序如下：30次循環(huán)：94Γ，90秒；94Γ，20秒；60°C，20秒；72Γ，化b/30秒；72 °(：，300秒;4°(：，保溫。
[0化引擴(kuò)增后的電泳圖如圖3所示：泳道1: 50ng ;泳道2 : 5ng ;泳道3 : 0.5ng ;泳道4 : 0.05ng;泳道M:DNA Ladder 200。
[0059] 對實(shí)施例一得到的化St押u DM聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增大片段測試，如下：
[0060] 在50μ1擴(kuò)增體系中，λΟΝΑ為模板，擴(kuò)增化b-20化片段。
[0061] 其中反應(yīng)體系如下：
[0062] 5X化st押uBuffer(含Mg2+)10μl;上游引物0.2-1.0μM(終濃度）；下游引物0.2- 1.0μΜ(終濃度）；dNTPs(各lOmM) 1山；模板50ng;Fast 押U DNA聚合酶0.25μ1 (1.2抓）；d地20 至50μ1。
[0063] PCR程序如下：30次循環(huán)：94°C，300秒；94°C，20秒；68°C，化b/30秒；72°C，300秒；4 C,保溫。
[0064] 擴(kuò)增后的電泳圖如圖4所示：泳道1: Ikb;泳道2:化b;泳道3:4kb;泳道4:化b;泳道 5:8化；泳道6:10化；泳道7:12化；泳道8:20化；泳道1^/化11(11110臟1曰'1?5'。
[0065] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和 變型，運(yùn)些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種FastPfu DNA聚合酶的制備方法，其特征在于:包括構(gòu)建FastPfu DNA聚合酶的 序列改造和并獲得表達(dá)菌株的步驟，F(xiàn)ast Pfu DNA聚合酶具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基 酸序列，編碼SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如SEQ ID NO: 2所示的核苷酸 序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述表達(dá)序列為DNA結(jié)合蛋白和Pfu蛋 白融合。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述表達(dá)載體為原核表達(dá)載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化工程菌獲得表達(dá)菌 株。5. 根據(jù)1至4任一權(quán)利要求所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 合成引物Pr-Ι和Pr-2,以全基因合成Fast Pfu DNA聚合酶的DNA序列為模板，用對 應(yīng)的引物PCR獲得的產(chǎn)物Nde 1和Xho 1雙酶切后連接到用相同的酶切好的表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化 DH5a，測序獲得正確的陽性表達(dá)質(zhì)粒，然后這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)工程菌，獲得表達(dá)菌株;其中 引物序列如下所示： Pr-1：ATGATTTTAG ATGTGGAT； Pr-2：TCGAGCTAGGATTTTTTAATGTT； (2) 將步驟(1)中獲得的菌株接種到培養(yǎng)基中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體； (3) 步驟(2)中的菌體經(jīng)破菌、純化后，得到所述Fast Pfu DNA聚合酶。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于:所述原核表達(dá)載體為pET-30a或pBAD/ His〇7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于:所述工程菌為BL21(DE3)、0rigami 2 (DE3)或Rosetta(DE3)。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，用于誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)劑為 IPTG或L-阿拉伯糖。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)中，用于破菌的破菌緩沖液為 Tis-Hcl或PBS。10. -種Fast Pfu DNA聚合酶，其特征在于：由權(quán)利要求1至8任一制備方法得到，具有 如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，編碼SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的DNA分子具有如 SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
【文檔編號(hào)】C12N15/54GK106011100SQ201610640034
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月8日
【發(fā)明人】石加加, 陳飛, 劉寬, 張冰
【申請人】吳江近岸蛋白質(zhì)科技有限公司