植酸酶突變體YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V及其編碼基因和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及植酸酶突變體YkAPPA?L396V、YeAPPA?L396V及其編碼基因和應(yīng)用。通過將氨基酸序列如SEQ ID NO.1或3所示的植酸酶的第396位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸而獲得。相比于野生型，本發(fā)明的兩個(gè)植酸酶突變體YkAPPA?L396V和YeAPPA?L396V的胃蛋白酶抗性和明顯提高，有利于飼料酶開發(fā)和應(yīng)用。
【專利說明】
植酸酶突變體化APPA-L396V、YeAPPA-L396V及其編碼基因和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及植酸酶突變體YkAPPA-L396V、YeAPPA-L396V 及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植酸憐是植物性飼料中憐的最普遍的儲(chǔ)存形式，因單胃動(dòng)物體內(nèi)缺乏水解植酸及 其鹽的植酸酶而難W吸收，因此造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。此外，礦物鐵和蛋白質(zhì)通常與植酸 形成不溶性復(fù)合物而無法被吸收。因此，通過植酸酶將植酸礦物化是單胃動(dòng)物生產(chǎn)中提高 營(yíng)養(yǎng)元素的生物利用率，降低生產(chǎn)成本和保護(hù)環(huán)境的有效策略。
[0003] 從1907年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)植酸酶后，目前在細(xì)菌，真菌，植物，和一些動(dòng)物已鑒定了眾 多的植酸酶。根據(jù)催化機(jī)理，植酸酶是分為四大類:組氨酸酸性憐酸酶(HAP)、半脫胺酸憐酸 酶(CP)，紫色酸性憐酸酶(PAP)，和β-螺旋獎(jiǎng)植酸酶(BP)。大多數(shù)微生物植酸酶屬于HAP家 庭，是目前研究和商業(yè)應(yīng)用最廣泛的植酸酶。目前發(fā)現(xiàn)的ΗΑΡ植酸酶一般在pH 1.3-5.5和 45-7(TC具有最高活性，消化系統(tǒng)中強(qiáng)酸和高濃度蛋白酶卻常常會(huì)降低其生物功能活性。
[0004] 抗蛋白酶消化是植酸酶作為飼料添加劑的一個(gè)先決條件。植酸酶的敏感性與暴露 的蛋白酶切割位點(diǎn)及其側(cè)鏈結(jié)構(gòu)有關(guān)，因此改變植酸酶蛋白上胃蛋白酶切割位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)可 能有助于提高胃蛋白酶的穩(wěn)定性。本發(fā)明應(yīng)用定點(diǎn)突變技術(shù)改造植酸酶，分別獲得植酸酶 突變體YkAPPA-L396V和化APPA-L396V，其胃蛋白酶抗性明顯提高，擴(kuò)大了其在工業(yè)上的應(yīng) 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是通過定點(diǎn)突變的方法對(duì)植酸酶進(jìn)行改造，使改造后的植酸酶突變 體YkAPPA-L396V或化APPA-L396V在胃蛋白酶抗性上性質(zhì)更加優(yōu)良。
[0006] 本發(fā)明另一目的是提供編碼上述植酸酶突變體YkAPPA-L396V或化APPA-L396V的 基因。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述植酸酶突變體YkAPPA-L396V或化APPA-L396V 編碼基因的重組載體。
[000引本發(fā)明的另一目的是提供包含上述植酸酶突變體YkAPPA-L396V或化APPA-L396V 編碼基因的重組菌株。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其含有如前所述的植酸酶突變體YkAPPA-L396V或 化APPA-L396V的基因或如前所述的重組載體。
[0010] 本發(fā)明對(duì)克氏耶爾森氏菌(Yersinia kristensenii)來源植酸酶YkAPPA或小腸結(jié) 膜炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)來源植酸酶化APPA基因進(jìn)行點(diǎn)突變，該植酸酶的成熟 蛋白具有如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列，該成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4,所示的核巧酸序列編碼的。

[0019] 采用定點(diǎn)突變的方法，獲得了2個(gè)提高胃蛋白酶抗性的突變體，分別命名為 YkAPPA-L396V和化APPA-L396V，即YkAPPA或化APPA的第396位的亮氨酸突變?yōu)猷l(xiāng)氨酸。
[0020] 因此根據(jù)本發(fā)明的胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突變體YkAPPA-L396V，其氨基酸序 列如SEQ ID NO.5所示
[0021] 沈Q ID NO.5
[0022]
[0025] 本發(fā)明還提供了編碼上述胃蛋白酶抗性提高的植酸酶突變體化APPA-L396V和 化八口?4-1^396￥的基因序列，其核巧酸序列如569 10^.7和8所示。
[0026] SEQ ID NO.7
[0027]
cagcctgccatatttaa
[0030] 將上述編碼胃蛋白酶抗性提高的突變酶化APPA-L396V或化APPA-L396V的閱讀框 插入到所述載體的EcoRI和Notl限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核巧酸序列可操作的與表達(dá)調(diào) 控序列相連接。本發(fā)明優(yōu)選的載體為祀T-22M + )，得到突變體的重組原核表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明 優(yōu)選的宿主菌為化21 (DE3)。所述植酸酶突變體的核巧酸序列位于T7啟動(dòng)子的下游并受其 調(diào)控。相比于野生型，本發(fā)明的兩個(gè)植酸酶突變體YkAPPA-L396V和化APPA-L396V的胃蛋白 酶抗性和明顯提高，有利于飼料酶開發(fā)和應(yīng)用。
【附圖說明】
[0031] 圖1為改造前后的植酸酶的蛋白酶抗性比較；
[0032] 圖2為改造前后的植酸酶的耐酸性比較。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)驗(yàn)材料
[0034] 原核表達(dá)載體祀T-22b (+)購(gòu)自Novagen公司。大腸桿菌化21 (DE3)細(xì)胞、PfU DNA聚 合酶、限制性內(nèi)切酶和連接酶購(gòu)自天根公司。植酸鋼和蛋白酶購(gòu)自Sigma公司，其它都為國(guó) 產(chǎn)試劑，均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到。大腸桿菌培養(yǎng)基LB的組份為1%蛋白腺，0.5% 酵母提取物和l%NaCI(pH7.0)。
[0035] 實(shí)施例1:突變基因的獲得
[0036] 采用0verlapPCR方法產(chǎn)生化APPA和化APPA的突變體化APPA-L396V和化APPA- L396V。該方法W含有野生植酸酶基因的重組質(zhì)粒祀ASY-T3-YkAPPA和祀ASY-T3-YeAPPA為 模板，通過兩輪PCR反應(yīng)引入突變。擴(kuò)增突變基因完整編碼序列的上下游引物帶有EcoR I和 Not I識(shí)別序列，分別為YkAPPA F'orward: 5 ' -cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3 ' 和 YkAPPA Reverse:5'-gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcG-3'；YeAPPA Forward:5'- cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3 ' 和YeAPPA Reverse：5'- gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcg-3 '。在特定位置引入突變的上下游引物為YkAPPA- L396V Forward:5'-AGGTG町GAATTTTTCGGCCTCACCTTA-3'，化APPA-L396V Reverse:5'- TAAGGTGAGGCCGAAAAATTCA盡CACCT-3'，YkAPPA-L396A Forward :5'- CAATGCAGATAAG心GATTTGAAAAAc-3' ，YkAPPA-L396A Reverese:5'- GTTTTTCAAATCT^CTTATCTGCATTG-3 '，Y e A P P A - L 3 9 6 V Forward :5'- TGCCGAGAAA^GATATGAAAAACAAC-3 >，Y e AP P A - L 3 9 6 V Reverese : 5 ' - GTTGTTTTTCATATCTACTTTCTCGGCA-3'。所需的突變基因連接到PEASY-T3載體上并經(jīng)測(cè)序證 實(shí)。酶切位點(diǎn)用斜^^出。突變核巧酸用下劃線標(biāo)出。
[0037] 實(shí)施例2:突變植酸酶與野生酶在細(xì)菌中表達(dá)與純化
[0038] 除去信號(hào)膚序列的野生酶和突變酶，插入到表達(dá)載體祀T-22K + )上并轉(zhuǎn)化到大腸 桿菌化2UDE3)細(xì)胞中，經(jīng)終濃度為2mM的誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-β-D-半乳糖巧)誘導(dǎo)表達(dá)植 酸酶。粗酶液經(jīng)Ni-NTA(儀-次氮基Ξ乙酸)柱和DEAE(二乙基氨基乙基)柱進(jìn)行純化。經(jīng)純化 后的野生酶和突變酶在SDS-PAGE電泳時(shí)均表現(xiàn)為一條約46kDa的特異性蛋白條帶(數(shù)據(jù)未 顯示）。
[0039] 實(shí)施例3:突變植酸酶與野生酶的蛋白酶抗性比較
[0040] 野生酶YkAPPA和化APPA與突變酶YkAPPA-L396V和化APPA-L396V分別用不同濃度 的胃蛋白酶(pH2)和膜蛋白酶(pH7)在37°C下處理化后，分析處理樣品中的剩余酶活，研究 蛋白酶對(duì)植酸酶活性的影響。蛋白酶和植酸酶比例在1/1000到1/20之間。植酸酶活性使用 硫酸亞鐵鋼藍(lán)法測(cè)定。W1.5mmol/L植酸鋼為底物，在37°C下反應(yīng)30min，用TCA終止反應(yīng)，再 用顯色液（1%四水合鋼酸錠，3.2%濃硫酸，7.32%硫酸亞鐵)進(jìn)行顯色。對(duì)照是在加酶液之 前先加入TCA混勻使酶變性，其它相同。根據(jù)顯色后的700nm光吸收計(jì)算酶活。
[0041 ] 突變酶化APPA-L396V和YeAPPA-L396V的膜蛋白酶抗性分別與野生酶化APPA和 化APPA類似，當(dāng)膜蛋白酶處理濃度從1/1000上升至1/20時(shí)，突變體YKAPPA-L396V的酶活基 本不變，野生酶YkAPPA可保持一半W上酶活(圖1)。
[0042] 突變酶YkAPPA-L396V和化APPA-L396V的胃蛋白酶抗性明顯高于野生酶（圖1)。在 1/1000至1/20的胃蛋白濃度下，突變酶YkAPPA-L396V可保持16.8%和10.8%^上酶活，而 野生酶YkAPPA幾乎完全失去活性。當(dāng)胃蛋白濃度為1/1000和1/500時(shí)，突變酶化APPA-L396V 分別保持16.5 %和12.9 % W上酶活，而野生酶YeAPPA則完全失活。因此植酸酶化APPA和 化APPA的第396位亮氨酸在蛋白酶切割中起重要作用。
[0043] 實(shí)施例4:突變植酸酶與野生酶的耐酸性比較
[0044] 野生酶和突變酶在pH 1-4下37°C處理化，研究酶的酸穩(wěn)定性。突變酶化APPA- L396V與化APPA-L396V在抑1.5-3下的穩(wěn)定性明顯高于野生酶（圖2)。在抑1.5-3下，突變酶 YkAPPA-L396V保持81.9% W上的酶活，而野生酶YkAPPA只保持68.5%的酶活性。在抑1.5-3 下，突變酶化APPA-L162V可保持7.4%的酶活，而野生酶化APPA則完全失去活性。
[0045] 實(shí)施例5:突變植酸酶與野生酶的酶學(xué)性質(zhì)比較
[0046] 野生酶和突變酶在不同抑(1-12)和不同溫度(3〇-80°(：)下反應(yīng)3〇111111，確定最適抑 和最適溫度。酶在抑1-9下37 °C處理化，研究其pH穩(wěn)定性。在60°C下將酶液分別處理0，2，5， 10，20，30，60min后進(jìn)行測(cè)定熱穩(wěn)定性。所用的緩沖液為:0.1mol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液，pH l-3;0.1mol/L醋酸鋼-醋酸緩沖液，pH 3-6;0.1mol/L Tris-鹽酸緩沖液，pH 6-8;0.1mol/L 甘氨酸-氨氧化鋼緩沖液，pH 8-12。
[0047] 突變酶YkAPPA-L396V與野生酶的酶學(xué)性質(zhì)比較如表1。突變酶YkAPPA-L396V的最 適抑和最適溫度相似，分別是抑4.5和55°C。突變酶化APPA-L396V在60°C下30min的熱穩(wěn)定 性與野生酶相似，可保持16.4%的酶活。突變酶YkAPPA-L396V在pH 2-10下處理化后，保持 與野生酶相似的酶活。突變酶化APPA-L396V在pH 1下處理化具有較好的耐酸性，可保持 80.3 %的酶活，而野生酶YkAPPA只保持63.7 %的酶活。
[004引突變酶化APPA-L396V與野生酶的酶學(xué)性質(zhì)比較如表1。突變酶化APPA-L396V的最 適pH和最適溫度與野生酶相似，分別是pH 5和45°C。突變酶YeAPPA-L396V在60°C下處理 30min的熱穩(wěn)定性與野生酶相似。突變酶化APPA-L396V在抑3-9下處理化與野生酶保持相似 的穩(wěn)定性;在pH 2下處理化較野生酶具有更好的耐酸性，可保持40.2 %的酶活，而野生酶 化APPA只保持18.4 %的酶活。
[0049]表1改造前后的植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)比較
[(Κ)加 ]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 植酸酶YkAPPA突變體YkAPPA-L396V，其特征在于，通過將氨基酸序列如SEQ ID NO.l 所示的植酸酶的第396位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸而獲得。2. 植酸酶YeAPPA突變體YeAPPA-L396V，其特征在于，通過將氨基酸序列如SEQ ID N0.3 所示的植酸酶的第396位亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸而獲得。3. 植酸酶突變體基因，其特征在于，其編碼權(quán)利要求1所述的植酸酶Y k A P P A突變體 YkAPPA-L396V或權(quán)利要求2所述的植酸酶YeAPPA突變體YeAPPA-L396V。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的植酸酶突變體基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如 SEQIDN0.7SSEQIDN0.8K*。5. 包含權(quán)利要求3所述的植酸酶突變體基因的重組載體。6. 包含權(quán)利要求3所述的植酸酶突變體基因的重組菌株。7. -種制備穩(wěn)定性改良的植酸酶突變體的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 用權(quán)利要求5的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 2) 培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組的植酸酶基因表達(dá)；以及 3) 回收并純化所表達(dá)的植酸酶突變體YkAPPA-L396V或植酸酶突變體YeAPPA-L396V。8. 權(quán)利要求1所述的植酸酶突變體YkAPPA-L396V的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求2所述的植酸酶突變體YeAPPA-L396V的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/16GK106011102SQ201610527405
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】楊培龍, 牛燦芳, 姚斌, 聞治國(guó), 李秀梅, 王亞茹, 羅會(huì)穎, 馬銳
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所