一種耐堿性α-淀粉酶及其基因工程菌的構建方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種耐堿性α?淀粉酶及其基因工程菌的構建方法和應用，屬于酶工程領域。本發(fā)明采用基因工程技術將來源于堿性芽孢桿菌(Bacillus sp.LS?04)的耐堿性α?淀粉酶基因克隆入pPIC9k質粒，以P.pastoris為表達宿主細胞，經甲醇誘導重組耐堿性α?淀粉酶表達活力達到3120U/mL。本發(fā)明的耐堿性α?淀粉酶在pH8.0–11.0范圍內對淀粉均變現出良好的催化活性，可被應用于紡織退漿或洗滌助劑等領域。
【專利說明】
-種耐堿性α-淀粉酶及其基因工程菌的構建方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程和基因工程技術領域，具體設及一種耐堿性α-淀粉酶及其基因 工程菌的構建方法和應用。
【背景技術】
[0002] 淀粉酶是一類W淀粉、長鏈糊精和糖原等葡聚糖為底物的一類酶的總稱，按產生 底物異構類型的不同可W分為α-淀粉酶和0-淀粉酶兩種;按淀粉水解方式的不同還可W內 切型、外切型、脫枝和轉移等4個種類。α-淀粉酶即為內切型淀粉酶的一種，其水解產物通常 為短鏈糊精、寡糖和葡萄糖，在食品、制藥、酒精、有機酸W及飼料和洗涂行業(yè)具有廣泛應 用。
[0003] 普通α-淀粉酶的作用抑范圍較窄，一般在抑5.0-8.0之間，而在該抑范圍之外的理 化條件下催化活力急劇下降而無法滿足工藝使用需求。通常采取的措施是改變加工工藝， 分段處理，W滿足淀粉酶的使用條件，運樣處理的結果是能源消耗大，費時費力且為環(huán)保處 理帶來壓力。因此，隨著行業(yè)發(fā)展的細化和不同加工處理領域條件的限制，對淀粉酶催化性 質、性能的要求也越來越高，而傳統(tǒng)的普通α-淀粉酶更是無法滿足各應用領域的需求，從而 產生了對特殊淀粉酶如耐酸性淀粉酶、耐堿性淀粉酶或低溫淀粉酶的巨大需求。其中，耐堿 性曰-淀粉酶是指一類可W在堿性環(huán)境中(Ρ朋.0-11.0)對淀粉產生水解作用的一類淀粉酶， 在洗涂和紡織退漿等特殊的堿性處理工藝環(huán)境中對提高洗涂效率、改進退漿工藝等具有重 要應用和巨大需求。在2005年和2008年丹麥Novozymes公司前后推出了堿性α-淀粉酶產品 并在紡織退漿和洗涂劑中取得了較好應用效果。我國的中國科學院微生物所、武漢大學和 江南大學等科研院校亦相繼對堿性α-淀粉酶進行了大量研究，但截止目前我國在該酶的生 產領域尚屬空白，因此堿性α-淀粉酶已成為我國當前酶制劑行業(yè)亟待開發(fā)的品種之一。
[0004] 自1971年日本研究者化rikosM首次報道堿性α-淀粉酶W來，關于堿性α-淀粉酶 的研究報道陸續(xù)增多并主要集中在產生菌種的篩選、培養(yǎng)和酶的分離純化和性質研究。堿 性α-淀粉酶的產生菌株通常是一類嗜堿微生物，該類微生物通常是一類酶表達量極低的原 始野生菌株，通過傳統(tǒng)誘變選育很難得到滿足工業(yè)化生產需求的生產菌株。近年來隨著基 因工程和蛋白質工程技術的發(fā)展而逐漸在堿性α-淀粉酶的基因克隆、異源表達和酶分子改 造等方面加大了研究力度，同時也是目前快速對堿性α-淀粉酶基因進行克隆、改造和高效 表達一條重要途徑。

【發(fā)明內容】

[0005] 根據W上現有技術的不足，本發(fā)明所要解決的技術問題是提出一種耐堿性α-淀粉 酶及其基因工程菌的構建方法和應用，目的是使耐堿性α-淀粉酶具有異源高效表達性。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0007] -種耐堿性α-淀粉酶，所述耐堿性α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 [000引編碼耐堿性α-淀粉酶的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009] -種含有權利要求1所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌。
[0010] 所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構建方法，所述構件方法包括如下步驟：
[0011] 步驟一，克隆耐堿性α-淀粉酶的基因到重組表達質粒載體；
[0012] 步驟二，將重組表達質粒載體轉化到宿主細胞中。
[0013] 所述重組表達質粒載體為pPIC9k質粒。
[0014] 所述宿主細胞為P.pastoris GS115。
[0015] 步驟一所述克隆耐堿性α-淀粉酶的基因的制備方法為：W堿性芽抱桿菌染色體 DNA為模板，W簡并引物AlamyFl和AlamyRl為擴增引物，擴增引物序列分別如SEQ ID NO. 3 和如SEQ ID NO.4所示，通過PCR擴增方法得到耐堿性α-淀粉酶基因，將該基因與克隆載體 相連得到重組質粒，并使用氯化巧轉化法導入大腸桿菌，之后進行抽提重組質粒。優(yōu)選的 是，W嗜堿芽抱桿菌(Bacillus SP丄S-04)基因組DNA為模板并利用簡并引物，通過聚合酶 鏈式反應(PCR)技術擴增得到耐堿性α-淀粉酶全部編碼基因，將該基因與克隆載體PMD19- simple相連接獲得重組質粒pMD-Alamy04并使用氯化巧轉化法導入大腸桿菌化.coli) JM109,抽提重組質粒并測序獲得該基因的核巧酸序列及其編碼蛋白質的氨基酸序列信息。
[0016] 所述嗜堿芽抱桿菌(Bacillus sp.LS-04)為本發(fā)明人在研究中篩選獲得并發(fā)現具 有耐堿性α-淀粉酶分泌能力的菌株，并已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中屯、，保藏編號為CGMCC No. 11899，保藏日期2015年12月22日，保藏地點：中國科學院微 生物研究所。該嗜堿芽抱桿菌的相關保藏證明已于2016年4月6日提交專利申請時提交，其 申請的專利號為201610207503.5。
[0017] 所述簡并引物是通過對GenBank中公布的部分堿性α-淀粉酶基因序列進行比對和 分析而設計得到的。
[0018] 本發(fā)明中從嗜堿芽抱桿菌(Bacillus SP丄S-04)中克隆得到的耐堿性α-淀粉酶基 因具有W下特征：
[0019] (1)核巧酸數目為1545bp;
[0020] (2)6的6+〇含量為49.6%;
[0021 ] (3)與NCBI中 W公布的Exiguobacterium sp.ATlb全基因組序列（GenBank登錄號： CP001615.1)中的一段序列（1378199bp-1379741bp)的相似度最高(96%)，但仍有4%的核 巧酸序列信息的差異，表明本發(fā)明中獲得的一種耐堿性α-淀粉酶是一條未報道的新基因。
[0022] 本發(fā)明中從嗜堿芽抱桿菌(Bacillus sp.LS-04)中克隆得到的耐堿性α-淀粉酶具 有W下特征
[0023] (1)所含氨基酸數目為514個；
[0024] (2)蛋白質分子量MW=57.3邸a;
[0025] (3)蛋白質氨基端1-28個氨基酸為信號膚序列；
[00%] (4)蛋白質成熟膚等電點pl = 6.58;
[0027] (5)酶的反應溫度為30-70°C，優(yōu)選反應溫度為40-60°C ;
[002引 （6)酶的反應抑為8.0-11.0，優(yōu)選反應抑為9.0-10.0;
[0029] (7)酶在50°C、pH9.0條件下的半衰期為90min;
[0030] 步驟一所述克隆耐堿性α-淀粉酶的基因到重組表達質粒載體的方法為:通過耐堿 性α-淀粉酶成熟膚編碼基因設計引物對，W所述重組質粒為模板進行PCR擴增，使用限制性 核酸內切酶對PCR產物進行雙酶切并與同等雙酶切的表達質粒連接、轉化獲得重組表達質 粒載體。優(yōu)選的是，W耐堿性α-淀粉酶成熟膚編碼基因為基礎設計一對引物，引物對的序列 如沈9 10^.5和如569 10^.6所示，^重組質粒910-413111704為模板進行?〇?擴增，使用 限制性核酸內切酶EcoRI和Notl對PCR產物進行雙酶切并與同等雙酶切的表達型質粒 pPIC9k相連接，轉化E. coli JM109，獲得重組質粒pPIC9k-Alamy04，抽提該重組質粒并使用 限制性核酸內切酶Sail進行線性化酶切，膠回收酶切產物并通過電穿孔法導入宿主菌 P.pastoris GS115感受態(tài)細胞，再利用營養(yǎng)缺陷型平板和淀粉檢測平板篩選獲得具有耐堿 性α-淀粉酶表達能力的基因工程菌，即攜帶耐堿性α-淀粉酶基因的重組酵母。
[0031 ] 所述p.pastoris GS115感受態(tài)細胞，其制備方法為：接種p.pastoris GS115單菌 落于裝有15血YEPD培養(yǎng)基的Ξ角瓶(250mL)中，于30°C、200巧m培養(yǎng)1加后取0.5mL培養(yǎng)基 接種至裝有50mL新鮮YEPD培養(yǎng)基的Ξ角瓶(250mL)中，繼續(xù)在相同的條件下培養(yǎng)12h后于4 °C下離屯、收集細胞并用40mL冰水預冷的無菌雙蒸水洗涂兩次，然后使用20mL冰水預冷的 Imol/L山梨醇溶液洗涂一次，再使用0.2mL Imol/L山梨醇溶液重懸細胞，即制得酵母的感 受態(tài)細胞。
[0032] 所述電穿孔法，其操作步驟為：取10化線性化重組質粒與80化酵母感受態(tài)細胞均 勻混合后轉移至冰預冷的電機杯(0.2cm)中，置于冰上放置5min后利用電穿孔儀進行電擊 (電場強度設定為7500V/cm)，電擊結束后立即加入ImL冰水預冷的Imol/L山梨醇溶液，混勻 后取0.5mL液體涂布于營養(yǎng)缺陷型平板。
[0033] 所述YEPD培養(yǎng)基配方為:每L含有酵母膏l(xiāng)Og，膜蛋白腺20g，葡萄糖20邑。
[0034] 所述營養(yǎng)缺陷型平板為MD平板，配方為:每L含有酵母氮基3.4g，硫酸錠lOg，生物 素〇.4mg，葡萄糖20g，瓊脂粉15邑。
[0035] 所述淀粉檢測平板配方為:每L含有酵母氮基3.4g，硫酸錠lOg，生物素0.4mg，甲醇 5g，可溶性淀粉5g，瓊脂粉15g。
[0036] 所述構建方法得到的工程菌在耐堿性α-淀粉酶生產中的應用。
[0037] A、種子搖瓶培養(yǎng)
[0038] 挑取重組酵母在淀粉檢測平板中劃線培養(yǎng)36-4化后，接種一個單菌落至15-20mL 液態(tài)YEPD培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)20-2化后離屯、收集菌體并將菌體全部轉移至 25-35mL BMGY培養(yǎng)基，繼續(xù)在30°C、200巧m條件下培養(yǎng)12-2化后作為種子液備用。
[0039] 所述BMGY培養(yǎng)基配方為：每L含有酵母膏l(xiāng)Og，蛋白腺20g，酵母氮基3.4g，硫酸錠 lOg，生物素0.4mg，甘油lOg，憐酸鐘緩沖液（lmol/L，p冊.0) lOOmL。
[0040] 所述搖瓶均為250mLS角瓶。
[0041] B、液態(tài)搖瓶發(fā)酵
[0042] 離屯、收取上述25-30mL種子液中菌體并全部轉移至35-45mL BMMY培養(yǎng)基，于30°C、 20化pm條件下培養(yǎng)，每隔12-24h向搖瓶中補加0.2-0.4mL甲醇，同時吸取ImL發(fā)酵液并離屯、 收取上清，進行耐堿性α-淀粉酶活力測定。
[0043] 所述ΒΜΜΥ培養(yǎng)基配方為:每L含有酵母膏l(xiāng)Og，蛋白腺20g，酵母氮基3.4g，硫酸錠 lOg，生物素0.4mg，甲醇5mL，憐酸鐘緩沖液（lmol/L，p冊.0) lOOmL。
[0044] 所述搖瓶均為250mLS角瓶。
[0045] 所述耐堿性α-淀粉酶活力測定方法為：
[0046] a、采用水楊巧法測定:準確吸取適當稀釋的酶液0.5mL，加入ImLl%可溶性淀粉溶 液(溶于抑9.5的甘氨酸-氨氧化鋼緩沖液)及0.5mL P朋.5的甘氨酸-氨氧化鋼緩沖液，于40 °C保溫30min后加入3mLDNS試劑沸水浴lOmin，冷卻后加水稀釋至25mL，測定520nm處吸光 值。
[0047] b、堿性淀粉酶活力定義為:在上述反應條件下，每小時水解1%的可溶性淀粉生成 Img還原糖所需的淀粉酶的量為一個酶活力單位化)。
[004引本發(fā)明有益效果是：
[0049] 1、本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶基因與NCBI中W公布的Exiguobacterium sp .AUb全 基因組序列(GenBank登錄號:CP001615.1)中的一段序列（1378199bp- 13797"bp)的相似度 最高(96%)，但仍有4%的核巧酸序列信息的差異，表明本發(fā)明中獲得的一種耐堿性α-淀粉 酶是一條未報道的新基因；
[0050] 2、本發(fā)明的基因工程菌利用酵母α-化Ctor信號膚引導獲得了耐堿性α-淀粉酶成 熟膚的細胞外高效分泌表達。
[0051 ] 3、本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶在Ρ冊.0-11.0范圍內對淀粉均變現出良好的催化活 性，可被應用于紡織退漿或洗涂助劑等領域。
[0052] 4、本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶具有良好的耐堿性能，在抑11.0條件下發(fā)揮最大催化 活力的50% W上。
【附圖說明】
[0053] 下面對本說明書附圖所表達的內容及圖中的標記作簡要說明：
[0054] 圖1是本發(fā)明的重組質粒pPIC-Alamy04物理圖譜；
[0055] 圖2是本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶不同溫度與相對酶活力的關系圖；
[0056] 圖3是本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶不同抑與相對酶活力的關系圖；
[0057] 圖4是本發(fā)明的耐堿性α-淀粉酶不同時間、溫度與相對酶活力的關系圖。
【具體實施方式】
[0058] 下面對照附圖，通過對實施例的描述，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，W幫助本領 域技術人員對本發(fā)明的發(fā)明構思、技術方案有更完整、準確和深入的理解。
[0化9]實施例1
[0060] 耐堿性α-淀粉酶基因克隆：
[0061] 具體包括：
[0062] Α、堿性芽抱桿菌(Bacillus sp.化S-04染色體DNA提取
[0063] 使用SDS抽提法，具體步驟如下：
[0064] 將堿性芽抱桿菌在液體培養(yǎng)基(每L培養(yǎng)基含有:酵母膏5g，蛋白腺lOg，氯化鋼5g， K此P〇4 Ig，使用Na2C〇3調節(jié)抑至9.5)中培養(yǎng)12h后，離屯、收集取3mL菌體并使用0.25mL20mg/ mL溶菌酶溶液重選細胞;于37°C水浴中放置30min后加入55化10%SDS(十二烷基硫酸鋼） 溶液并于65°C水浴中保溫60min;使用等體積酪:氯仿抽提兩次后再用等體積氯仿抽提一 次，取上清并加入2倍體積的無水乙醇混勻后于室溫沉淀20min，離屯、收集核酸沉淀并使用 75 %乙醇洗涂沉淀，收集核酸沉淀并于室溫干燥15min后加入SOiiL雙蒸水，置于4°C備用。
[0065] B、耐堿性α-淀粉酶基因擴增和序列測定
[0066] W堿性芽抱桿菌(Bacillus spjLS-04染色體DNA為模板，W簡并引物AlamyFl(5 '-CGATGTTYAAGAARCGACAAGGMATT-3')和AlamyRl (5 '-TATTATTGNTGTGTRTAGATGGAA-3')為擴 增引物，使用PCR方法擴增得到耐堿性α-淀粉酶基因片段。
[0067] PCR擴增體系（50yL)如下： 模板 DNA 0.5 mL dNTP 4 |_山 冊q DNA potym閒a說： 0.5 μΕ
[006引 上、下游引物 各0.5μΙ_ DNA polymerase bul'ffer .5 jiL' 熟蒸氷 游,5
[0069] PCR產物經膠回收純化后取化L，加入化L T4DNA連接酶、化L T4DNA連接酶緩沖液 和化L載體pMD-simple，于16°C下反應4h后通過氯化巧轉化法導入E. coli JM109感受態(tài)細 胞，使用抗性LB平板篩選陽性轉化子并獲得重組質粒pMD-Alamy04;抽提重組質粒并委托生 工生物工程(上海)股份有限公司完成目的基因的序列測定，測定的耐堿性α-淀粉酶基因序 列為沈Q ID NO. 1。
[0070] 所述抗性LB平板配方為每L培養(yǎng)基含有:酵母膏5g，蛋白腺lOg，氯化鋼lOg，氨節(jié)青 霉素 lOOmg。
[0071 ] C、耐堿性α-淀粉酶基因編碼多膚鏈分析
[0072] 將耐堿性α-淀粉酶基因序列（SEQ ID Ν0.1)導入生物信息學分析軟件DNAMAN進行 蛋白質翻譯分析，獲得其所編碼多膚鏈的氨基酸序列:SEQ ID NO.2。
[0073] 實施例2
[0074] 耐堿性α-淀粉酶基因工程菌的構建：
[0075] 具體包括：
[0076] Α、不含信號膚編碼序列耐堿性α-淀粉酶基因的克隆
[0077] 取實施例1中獲得的重組質粒pMD-Alamy04為模板，W引物AlamyF2 ( 5 '- ACGAATTCGCAACTCCACAGAACGGTACGATGATGCA-3<)和AlamyR2(5<- TAGCGGCCGCTTATTGTTGTGTATAGATGGAA-3')為擴增引物，獲得不含信號膚編碼序列的淀粉酶 基因。PCR反應體系同實施例1所述。
[0078] B、耐堿性α-淀粉酶基因表達載體的構建
[0079] 膠回收上述步驟中的PCR產物并使用限制性核酸內切酶EcoRI和Notl在37°C下酶 切作用化，然后于65°C加熱滅酶20min;將上述淀粉酶基因的酶切產物與同樣酶切處理的表 達型質粒pPIC化相連接，獲得重組質粒pPIC-Alamy04。所述連接方法和陽性克隆的篩選方 法同實施例1所述。
[0080] 所得重組質粒pPIC-Alamy04,耐堿性α-淀粉酶基因插入到pPIC9k多克隆位點 EcoRI和Notl之間，使不含信號膚的耐堿性α-淀粉酶基因在pPIC化質粒所攜帶的醇脫氨酶 強啟動子(A0XI)和酵母α-化ctor信號膚的作用下進行細胞外分泌表達。重組質粒pPIC- Alamy04的物理圖譜如圖1所示。
[0081 ] C、重組酵母的構建
[0082] 在35化(2yg)重組質粒pPIC-Alamy04溶液中加入化L(IOU)限制性核酸內切酶Sail 和4yLSal酶切緩沖液并于37°C反應4h后，于65°C下滅酶20min，然后使用DNA純化試劑盒進 行純化并使用30化雙蒸水進行洗涂，得到線性化質粒溶液;取10化線性化質粒溶液與60化 P.pastoris GS115感受態(tài)細胞混勻后使用電穿孔法進行轉化;立即在上述處理后的混合液 中加入5(Κ)化山梨醇溶液(0.5mol/L)，混勻后全部吸出并涂布于營養(yǎng)缺陷型平板(MD)，于30 °C培養(yǎng)4d后挑取單菌落并點種淀粉檢測平板，繼續(xù)培養(yǎng)3d后于平板中加入lOmL甘氨酸-氨 氧化鋼緩沖液(PH9.5)并在5(TC培養(yǎng)箱中靜置30min后，倒出緩沖液并自然驚干平板后使用 盧卡式艦液進行染色，經艦液染色后出現透明圈的轉化子即為具有胞外表達耐堿性α-淀粉 酶能力的重組酵母。
[0083] 實施例3重組酵母發(fā)酵產耐堿性α-淀粉酶及性質研究
[0084] 挑取重組酵母在淀粉檢測平板中劃線培養(yǎng)40h后，接種一個單菌落至20mL液態(tài) YEPD培養(yǎng)基，于30°C、200巧m條件下培養(yǎng)20h后離屯、收集菌體并將菌體全部轉移至30mL BMGY培養(yǎng)基，繼續(xù)在30°C、200rpm條件下培養(yǎng)1化后離屯、收集菌體并全部轉移至40mL BMMY 培養(yǎng)基，于30°C、200rpm條件下培養(yǎng)，每隔12h向搖瓶中補加0.2ml甲醇，發(fā)酵96h后，發(fā)酵液 中耐堿性α-淀粉酶活力達到3120U/mL，其活力單位約是原始菌種的44倍，表明重組耐堿性 曰-淀粉酶實現了異源高效表達。重組耐堿性α-淀粉酶最適作用溫度為50°C(圖2)，最適作用 抑為9.5(圖3)，在50°C、pH9.5條件下的半衰期為90min(圖4)。
[0085] 上面結合附圖對本發(fā)明進行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實現并不受上述方式 的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構思和技術方案進行的各種非實質性的改進，或未經改 進將本發(fā)明的構思和技術方案直接應用于其它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內。本發(fā) 明的保護范圍應該W權利要求書所限定的保護范圍為準。
【主權項】
1. 一種耐堿性α-淀粉酶，其特征在于，所述耐堿性α-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根據權利要求1所述耐堿性α-淀粉酶，其特征在于，編碼耐堿性α-淀粉酶的核苷酸序 列如SEQ ID NO.2所示。3. -種含有權利要求1所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌。4. 根據權利要求3所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述構 件方法包括如下步驟： 步驟一，克隆耐堿性α-淀粉酶的基因到重組表達質粒載體； 步驟二，將重組表達質粒載體轉化到宿主細胞中。5. 根據權利要求4所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述重 組表達質粒載體為pPIC9k質粒。6. 根據權利要求4所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構建方法，其特征在于，所述宿 主細胞為P.pastoris GS115。7. 根據權利要求4所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構建方法，其特征在于，步驟一 所述克隆耐堿性α-淀粉酶的基因的制備方法為：以堿性芽孢桿菌染色體DNA為模板，以簡并 引物AlamyFl和AlamyRl為擴增引物，擴增引物序列分別如SEQIDN0.3和如SEQIDN0.4所 示，通過PCR擴增方法得到耐堿性α-淀粉酶基因，將該基因與克隆載體相連得到重組質粒， 并使用氯化鈣轉化法導入大腸桿菌，之后進行抽提重組質粒。8. 根據權利要求7所述耐堿性α-淀粉酶的基因工程菌的構建方法，其特征在于，步驟一 所述克隆耐堿性α-淀粉酶的基因到重組表達質粒載體的方法為:通過耐堿性α-淀粉酶成熟 肽編碼基因設計引物對，引物對的序列如SEQ ID NO.5和如SEQ ID NO.6所示，以所述重組 質粒為模板進行PCR擴增，使用限制性核酸內切酶對PCR產物進行雙酶切并與同等雙酶切的 表達質粒連接、轉化獲得重組表達質粒載體。9. 根據權利要求4至8任一項所述構建方法得到的工程菌在耐堿性α-淀粉酶生產中的 應用。
【文檔編號】C12N15/81GK106011107SQ201610498392
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】李松, 湯斌, 楊倩, 魏勝華, 陶玉貴, 葛飛, 朱龍寶, 李婉珍
【申請人】安徽工程大學