N-氨甲酰-d-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶突變體及其工程菌的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】N?氨甲酰?D?對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶突變體及其工程菌的構(gòu)建，通過(guò)定向進(jìn)化技術(shù)獲得的5個(gè)突變體與N?氨甲酰?D?對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的區(qū)別分別為：N?氨甲酰?D?對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第193位的半胱氨酸突變?yōu)樘於０?；?00位的蘇氨酸突變?yōu)楸彼?；?26位的天冬酰胺突變?yōu)槔野彼?；?43位的半胱氨酸突變?yōu)樘於０?；?50位的半胱氨酸突變?yōu)槔野彼?；并進(jìn)行工程菌構(gòu)建，將其應(yīng)用于D?對(duì)羥基苯甘氨酸的生產(chǎn)中，和野生酶相比，在對(duì)氧氣的耐受性、酸堿的耐受性及酶活方面有很大提升。
【專利說(shuō)明】
N-氨甲醜-D-對(duì)超基苯甘氨酸水解酶突變體及其工程菌的 構(gòu)建
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種編碼N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解 酶突變體及其工程菌的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0002] D-氨基酸及其衍生物是醫(yī)藥及食品領(lǐng)域的重要原材料，被廣泛地用于半合成抗 生素、多膚激素、擬除蟲菊醋、殺蟲劑和甜味劑等的中間物，因而引起越來(lái)越多的興趣，特別 是作為半合成抗生素的側(cè)鏈原料一一D-型氨基酸更受到人們的關(guān)注。D-對(duì)徑基苯甘氨酸 值-P-HPG)是制備β-內(nèi)酷胺類抗生素（如青霉素、頭抱菌素）的重要原料W及合成多種多 膚類激素和農(nóng)藥的主要側(cè)鏈，廣泛用于藥學(xué)領(lǐng)域。
[0003] D-對(duì)徑基苯甘氨酸作為非天然氨基酸，它不能利用自然微生物發(fā)酵生產(chǎn)，目前其 制備方法主要有化學(xué)法和生物酶法兩大類?；瘜W(xué)制備反應(yīng)條件相對(duì)比較劇烈、污染大、產(chǎn) 率低并且費(fèi)用高，已逐漸被反應(yīng)條件溫和，無(wú)需高溫高壓，成本低，無(wú)污染，底物轉(zhuǎn)化率和光 學(xué)活性都較高的生物酶法所代替。酶法的技術(shù)原理是：用D-乙內(nèi)酷脈酶（也稱為D-海因 酶）將Dk對(duì)徑基苯海因不對(duì)稱水解成Ν-氨甲酯基-D-對(duì)徑基苯甘氨酸，然后在Ν-氨甲 酷-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶（簡(jiǎn)稱DCase)的作用下，將N-氨甲酯基-D-對(duì)徑基苯甘氨 酸不可逆水解成D-p-HPG(D-對(duì)徑基苯甘氨酸）。
[0004] 但工業(yè)生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，從微生物細(xì)胞中分離、提取N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水 解酶制成固定化酶的技術(shù)已有使用，但酶的成本過(guò)高，且產(chǎn)品收率也偏低，而且由于細(xì)胞含 酶活力偏低，采用常規(guī)細(xì)胞固定化技術(shù)可增加酶活穩(wěn)定性，但固定化細(xì)胞酶活降得更低而 難W使用。因此，在生產(chǎn)D-對(duì)徑基苯甘氨酸的過(guò)程中，由于DCase催化效率低、穩(wěn)定性差的 缺點(diǎn)，導(dǎo)致中間物N-氨甲酯基-D-對(duì)徑基苯甘氨酸大量積累，終產(chǎn)物D-對(duì)徑基苯甘氨酸產(chǎn) 率低。
[0005] 雖然天然酶分子在自然條件下已進(jìn)化了千百萬(wàn)年，但是因?yàn)樘烊幻阜肿哟嬖诘沫h(huán) 境與實(shí)際應(yīng)用環(huán)境的不同，酶分子仍然藏著巨大的進(jìn)化潛力。運(yùn)用分子定向進(jìn)化技術(shù)比如 易錯(cuò)PCR技術(shù)、DNA改組技術(shù)和定點(diǎn)突變技術(shù)等對(duì)微生物來(lái)源的酶進(jìn)行分子改性和人工進(jìn) 化在近些年中取了令人矚目的進(jìn)展，運(yùn)種分子水平上的人工定向進(jìn)化技術(shù)是通過(guò)體外重組 來(lái)改造祀基因，并定向篩選具有預(yù)期性狀的突變體，從而改造具有新功能的改性的酶，大大 加速了蛋白質(zhì)的進(jìn)化進(jìn)程。其中，突變作為蛋白質(zhì)工程中的一種重要手段，在轉(zhuǎn)氨酶的改 造中已經(jīng)發(fā)揮了重要的作用，不僅可W闡明轉(zhuǎn)氨酶的一些特殊機(jī)理，而且能夠在一定程度 上改良轉(zhuǎn)氨酶的動(dòng)力學(xué)活性。因此，在生物工程中，利用突變來(lái)解決相關(guān)問(wèn)題的做法日益受 到重視，本發(fā)明旨在制得N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的突變體，W提高酶活及氧 氣、酸堿耐受性，并將其應(yīng)用于D-對(duì)徑基苯甘氨酸的生產(chǎn)中，從而創(chuàng)造具有新功能的改性 的酶，W大大加速蛋白質(zhì)的進(jìn)化進(jìn)程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體，其中相 比于野生酶，所述N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的基因表達(dá)的突變酶，在對(duì) 氧氣的耐受性、對(duì)酸堿的耐受性及酶活方面有顯著提升。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的 DNA序列。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的 突變酶的氨基酸序列。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的 基因編碼序列。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含有突變水解酶基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法。
[0011] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的 重組表達(dá)質(zhì)粒。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體構(gòu)建的 工程菌。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體在 D-對(duì)徑基苯甘氨酸的生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體在 D-對(duì)徑基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的 編碼基因在D-對(duì)徑基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種重組表達(dá)質(zhì)粒及其在D-對(duì)徑基苯甘氨酸生產(chǎn)中 的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述基因工程菌在D-對(duì)徑基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng) 用。
[001引為達(dá)到上述目的W及本發(fā)明的其他目的和優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明先采用易錯(cuò)PCR技術(shù)和 DNA改組技術(shù)相結(jié)合的方法，W從海洋鏈霉菌中篩選的N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解 酶基因作為模板基因，對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)突變。N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的序列與 Genebank的登陸號(hào)為AF320814的酶序列同源性為97%，因此可W認(rèn)定為同一種酶，其是由 304個(gè)氨基酸組成，其編碼DNA的序列包括9巧bp，其編碼DNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO. 1和沈Q ID NO. 2所示。
[0019] 本發(fā)明的篩選體系是W反應(yīng)體系的抑升高引起指示劑顏色變化作為篩選指標(biāo)將 正突變檢出。氨甲酯水解酶催化反應(yīng)后，使反應(yīng)體系的抑得到提高，而該方法使用的酪紅 指示劑能在抑大于6. 3時(shí)由黃色變?yōu)榧t色。
[0020] 通過(guò)上述方法，本發(fā)明篩選到了 5個(gè)酶活性及氧氣受耐性、酸堿耐受性均較高的 突變體，本發(fā)明所獲得的5個(gè)突變體與N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的區(qū)別分別 為：
[0021] N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第193位的半脫氨酸突變?yōu)?天冬酷胺；
[0022] N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第200位的蘇氨酸突變?yōu)楸?氨酸；
[0023] N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第226位的天冬酷胺突變?yōu)?酪氨酸；
[0024] N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第243位的半脫氨酸突變?yōu)?天冬酷胺；
[0025] N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第250位的半脫氨酸突變?yōu)?酪氨酸；
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，重組質(zhì)?？寺∩鲜龅乃鯪-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變 體的編碼序列。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明所述的N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的DNA序列克隆 入宿主細(xì)胞，并將所述宿主細(xì)胞的發(fā)酵菌體用于D-對(duì)徑基苯甘氨酸的生產(chǎn)中。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明，將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞獲得基因工程菌。
[0029] 相比于野生型N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶（野生酶），本發(fā)明的5個(gè)突 變體的酶活、抗氧化性和耐高溫性均得到提高，顯示出在D-對(duì)徑基苯甘氨酸生產(chǎn)中的潛在 應(yīng)用價(jià)值。因此，適于將本發(fā)明提供的N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體、N-氨 甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的編碼基因、N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶 突變體的重組質(zhì)粒、N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體的基因工程菌應(yīng)用于D-對(duì) 徑基苯甘氨酸的生產(chǎn)制造中。
【具體實(shí)施方式】
[0030] W下描述用于掲露本發(fā)明W使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明。W下描述中的優(yōu) 選實(shí)施例只作為舉例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可W想到其他顯而易見的變型。在W下描述中界定 的本發(fā)明的基本原理可W應(yīng)用于其他實(shí)施方案、變形方案、改進(jìn)方案、等同方案W及沒(méi)有背 離本發(fā)明的精神和范圍的其他技術(shù)方案。
[0031] W下實(shí)施例中，所使用的基因-pET28a-D化se是指從海洋鏈霉菌Streptomyces sp. 7-145(CGMCC NO. 7914)中篩選出的EH：ase基因和祀T28a組建的重組子，其N-氨甲 酷-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶基因序列及編碼的氨基酸序列分別如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示。
[0032] 實(shí)施例1、N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶基因的克隆
[0033] 1. 1PCR 擴(kuò)增
[0034] 引物設(shè)計(jì)
[0035] DCase-Fl :CGGGATCC GCTCGTCAGATGATATTCGCAG
[0036] DCase-Rl :CTTACGATACTTGCCGACGATCTTG
[0037] DCase-F2 :CAAGATCGTCGGCAAGTATCGTAAG
[0038] DCase-R2 :GAGATGGTGGAAGGACGTCAGGTGG
[0039] DCase-F3 :CCACCTGACGTCCTTCCACCATCTC
[0040] DCase-R3 :CCCAAGCTTGAGTTCCGCGATCAGACC
[0041] W祀T28a-DCase質(zhì)粒為模板，使用引物DCase-Fl和DCase-R3進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò) 增體系：2XPCRmix 10μ1，(Μ &0 8μ1，模板 DM 1μ1(約 50ng-200ng)，上、下游引物各 0. 5 μ 1 (濃度為 20 μ Μ)。
[004引 PCR反應(yīng)條件為：96 °C，2min預(yù)變性；96 °C，Imin變性，50 °C，30S退火，72 °C延伸 lmin(30個(gè)循環(huán)）；最后72°C延伸5min，4°C下保存。
[0043] 1. 2含N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的質(zhì)粒構(gòu)建
[0044] PCR擴(kuò)增結(jié)束后，先使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120伏，割膠后，用膠 回收試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）回收900bp左右的目的DNA片段，接著用 BamHI和Hindlll進(jìn)行雙酶切，將所獲得的DNA片段和載體祀T-28a連接（寶生物工程有 限公司），之后將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公 司），在含卡那霉素抗生素的LB平板上篩選。
[0045] 重組子用限制性內(nèi)切酶BamHI和Hindlll進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。酶切產(chǎn)物在此進(jìn)行電 壓為120伏的瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證片段大小分別為900bp左右的片段和5300bp左右的載 體。
[0046] 1. 3表達(dá)N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的基因工程菌株構(gòu)建
[0047] 用質(zhì)粒提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取重組子質(zhì)粒，然后按 常規(guī)方法轉(zhuǎn)化入E. coli BL21 (北京全式金生物技術(shù)有限公司），即獲得N-氨甲酯水解酶基 因的大腸桿菌工程菌。
[0048] 實(shí)施例2、N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶表達(dá)基因的定向突變
[004引 2.1引物設(shè)計(jì)
[0050] DCase-Fl :CGGGATCC GCTCGTCAGATGATATTCGCAG
[0051] DCase-Rl :CTTACGATACTTGCCGACGATCTTG
[0052] DCase-F2 :CAAGATCGTCGGCAAGTATCGTAAG
[0053] DCase-R2 :GAGATGGTGGAAGGACGTCAGGTGG
[0054] DCase-F3 :CCACCTGACGTCCTTCCACCATCTC
[00巧]DCase-R3 :CCCAAGCTTGAGTTCCGCGATCAGACC
[0056] W祀T28a-DCase重組子為模板，用引物DCase-F2和DCase-R2進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增， 易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系巧Oul):模板基因20ng，上下引物各300pmol，dATPO. 2mm，dGTPO. 2mm， dCTPlmm，dTTPlmm，MgClz 7mm，MnClz 0. 1mm，Taq 酶 2.抓（天根生化科技有限公司）。
[0057] PCR 條件為：96°C，5min 預(yù)變性；96°C，30s 變性，50°C，30s 退火，72°C延伸 30s(30 個(gè)循環(huán)）；最后72°C延伸5min，4°C下保存。
[0058] 2. 2含N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變基因的質(zhì)粒構(gòu)建
[0059] PCR擴(kuò)增結(jié)束后，先使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120伏，割膠后，用膠 回收試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）回收400bp左右的目的DNA片段，將所獲 得的DNA片段和載體PMD18-T載體連接（寶生物工程有限公司），之后將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公司），在含氨節(jié)青霉素的LB平板上篩 選。之后挑取單菌落，確定突變率。
[0060] 2. 3N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變庫(kù)的構(gòu)建
[0061] W 祀T28a-DCase 重組子為模板，分別用引物 DCase-Fl、DCase-Rl 和 DCase-F3、 DCase-R3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（50ul):模板基因20ng，上下引物各300pmol，M拆〇4 1mm. KOD-PIUS 聚合酶 lU (Toyobo 公司）。
[0062] PCR 條件為：95°C，5min 預(yù)變性；95°C，30s 變性，54°C，30s 退火，68°C延伸 30s(30 個(gè)循環(huán)）；最后68°C延伸5min，4°C下保存。
[0063] 段基因的PCR結(jié)果為混合模板，用引物DCase-Fl和DCase-R3進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR擴(kuò)增體系為：模板基因2化g，上下引物各3(K)pmol，Μ拆〇4 1mm，K0D-P1US聚合酶 llKToyobo 公司）。
[0064] PCR 條件為：95°C，5min 預(yù)變性；95°C，30s 變性，54°C，30s 退火，68°C延伸 lmin(30 個(gè)循環(huán)）；最后68°C延伸5min，4°C下保存。
[0065] 2. 4含N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變基因的質(zhì)粒構(gòu)建
[0066] PCR擴(kuò)增結(jié)束后，先使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓為120伏，割膠后，用膠 回收試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）回收900bp左右的目的DNA片段，接著用 BamHI和Hindlll進(jìn)行雙酶切，將所獲得的DNA片段和載體祀T-28a連接（寶生物工程有 限公司），之后將鏈接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞（北京全式金生物技術(shù)有限公 司），在含卡那霉素抗生素的LB平板上篩選。
[0067] 重組子用限制性內(nèi)切酶BamHI和Hindlll進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。酶切產(chǎn)物在此進(jìn)行電 壓為120伏的瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證片段大小分別為900bp左右的片段和5300bp左右的載 體。
[0068] 實(shí)施例3、N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變庫(kù)的篩選
[0069] 3. 1含N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變庫(kù)的工程菌構(gòu)建
[0070] 用質(zhì)粒提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取重組子質(zhì)粒，然后按 常規(guī)方法轉(zhuǎn)化入E.coli BL2U北京全式金生物技術(shù)有限公司），轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于含氨節(jié)抗生 素的LB平板（膜蛋白腺1%，酵母提取物0.5%，氯化鋼1%，瓊脂1.5% )上，37°C培養(yǎng)。
[0071] 3. 2N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶突變體篩選與鑒定
[007引挑取單菌落培養(yǎng)于含200ul含卡那抗生素巧Oug/ml)的96孔板上，當(dāng)0D600達(dá)到 0. 6時(shí)，加入1MIPTG使其終濃度為0. 2mM，18°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0073] 每孔取出150ul菌液與96孔板上，放置-80°C，冰凍1.化，隨后放置室溫解凍比。
[0074] 取解凍好的菌液20ul轉(zhuǎn)移入96孔板中，分別進(jìn)行抗氧化（雙氧水終濃度2mM處 理20min，25°C )和耐高溫（65°C處理30min)處理。
[00巧]在處理好的菌液中加入200ul反應(yīng)液巧g/L N-氨甲酯基-D-對(duì)徑基苯甘氨酸，ImM 邸ΤΑ和0. 01 %的酪紅，P冊(cè).0)充分混合，分別用沒(méi)處理的N-氨甲酯水解酶和d地2〇作為陽(yáng) 性跟陰性對(duì)照，37°C解育30min，發(fā)生顏色從淡黃色變成紅色的即為陽(yáng)性菌落。
[0076] 3. 3篩選結(jié)果
[0077] 通過(guò)上述篩選，我們共獲得五個(gè)重組蛋白抗氧化性和熱穩(wěn)定性提高的突變體，通 過(guò)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)它們的突變位點(diǎn)分別是C193N、T200A、N226Y、C243N和C250Y。具體內(nèi)容見表 1 ：
[0078] 表1五個(gè)DCase突變體的氨基酸序列和基因序列變化的結(jié)果
[0079] 1_0080」

[0081] 實(shí)施例4、突變重組酶與未突變酶抗氧化性和耐高溫性的對(duì)比
[0082] 4.1目的蛋白的富集
[0083] 分別將實(shí)施案例3. 2中的菌液轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，待種子成 熟后按4%接種量轉(zhuǎn)接至20〇111比日（卡那抗生素終濃度5〇11肖/1111)培養(yǎng)基中，隨后實(shí)時(shí)監(jiān)控 0D600,待0D600到0. 6時(shí)，加入1MIPTG使其終濃度為0. 2mM，18°C誘導(dǎo)表達(dá)1地。
[0084] 4. 2粗酶的制備
[00財(cái)將4. 1所得菌液進(jìn)行離屯、處理，去除上清。用lOOmM，PH7. 5的憐酸鹽緩沖液重懸， 于高壓均質(zhì)破碎儀（美國(guó)P皿）進(jìn)行破碎。將得到粗酶液與4°C，13000巧m/min離屯、30min， 取上清，置于4°C備用。
[0086] 4. 3粗酶液的抗氧化處理和熱處理
[0087] 分別取4. 2中制得的粗酶液500ul與1. 5ml離屯、管中，一式五份，同時(shí)平行做Ξ組 實(shí)驗(yàn)。
[0088] 處理一：在離屯、管中，依次加入雙氧水使其終濃度為lmM，2mM，3mM，4mM，5mM，處理 比后，放置4°C備用。具體結(jié)果見表2:
[0089] 表2經(jīng)雙氧水處理后DCase和突變體酶的酶活情況比較
[0090]
[0091] 處理二：將所得的酶液置于65°C的金屬浴（北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司）中 分別處理0min，30min，60min，90min，120min，之后放置4°C備用。具體結(jié)果見表3 :
[0092] 表3經(jīng)65°C高溫處理后DCase和突變體酶的酶活情況比較
[0093]
[0094] 4. 4酶促水解反應(yīng)
[0095] 將4. 3中處理過(guò)的粗酶液500ul加入400ul的lOOmM的N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯 甘氨酸，進(jìn)行水解反應(yīng)，37°C，200巧m。30min后，加入500ul的10%鹽酸終止反應(yīng)。
[0096] 4. 5、酶活的測(cè)定
[0097] 將4. 4中的反應(yīng)物稀釋3倍后，13000巧m/min離屯、lOmin，取上清進(jìn)行高效液相色 譜檢測(cè)。
[0098] HPLC測(cè)定方法如下：甲醇（含0. 01 % TFA)和水（含0. 01 % TFA)為流動(dòng)相，比例 為5:95,流速為1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為267nm。檢測(cè)不同物質(zhì)峰面積和保留時(shí)間及相同物 質(zhì)的不同峰面積，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品值計(jì)算樣品酶活的絕對(duì)數(shù)值。
[0099] 1U酶活定義為1分鐘產(chǎn)生lumol D-對(duì)徑基苯甘氨酸所需的酶量。
[0100] 剩余酶活力計(jì)算公式=酶經(jīng)抗氧化或者高溫處理后的酶活^酶在零度保溫后的 酶活X 100%。
[0101] 通過(guò)上述數(shù)據(jù)比較可W發(fā)現(xiàn)，相比于野生酶，N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解 酶的突變體在對(duì)氧氣的耐受性、對(duì)酸堿的耐受性及酶活方面有很大提升。
[0102] 上述實(shí)施例顯示，N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸水解酶的5個(gè)突變酶在可溶性表 達(dá)和單位菌體酶活方面都優(yōu)于野生型，同時(shí)也進(jìn)一步表明，N-氨甲酯-D-對(duì)徑基苯甘氨酸 水解酶的突變體在D-對(duì)徑基苯甘氨酸的生產(chǎn)中具有很大的應(yīng)用潛力。因此，采用定性進(jìn)化 技術(shù)改造工業(yè)用酶是一個(gè)十分有效的手段。
[0103] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，上述描述中所示的本發(fā)明的實(shí)施例只作為舉例而并不 限制本發(fā)明。本發(fā)明的目的已經(jīng)完整并有效地實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的功能及結(jié)構(gòu)原理已在實(shí)施例 中展示和說(shuō)明，在沒(méi)有背離所述原理下，本發(fā)明的實(shí)施方式可W有任何變形或修改。
[0104]
[0105]
[0106]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的突變體，其特征在于，所述突變體的氨 基酸序列由以下任一項(xiàng)所述的氨基酸序列組成： N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第193位的半胱氨酸突變?yōu)樘於?酰胺； N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第200位的蘇氨酸突變?yōu)楸?酸； N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第226位的天冬酰胺突變?yōu)槔野?酸； N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第243位的半胱氨酸突變?yōu)樘於?酰胺； N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第250位的半胱氨酸突變?yōu)槔野?酸； 其中所述N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列為如SEQ ID NO. 2所示 的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶序列。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶突變體的DNA序 列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的DNA序列，其特征在于，由以下任一項(xiàng)所述的DNA序列組成： A、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第577bp~ 579bp的TGC突變?yōu)锳AT ; B、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第598bp~ 600bp的ACC突變?yōu)镚CT ; C、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第676bp~ 678bp的AAC突變?yōu)門AT ; D、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第727bp~ 729bp的TGC突變?yōu)锳AC ; E、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第748bp~ 750bp的TGC突變?yōu)門AT。4. 一種重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)?？寺∮腥鐧?quán)利要求1所述的N-氨甲 酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶的突變體的編碼序列。5. -種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是將權(quán)利要求4中所述的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞而獲得。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶突變體在D-對(duì)羥基苯 甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的N-氨甲酰-D-對(duì)羥基苯甘氨酸水解酶突變體的編碼基因在 D-對(duì)羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組質(zhì)粒在D-對(duì)羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的工程菌在D-對(duì)羥基苯甘氨酸生產(chǎn)中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，將如權(quán)利要求2所述的DNA序列克隆入 宿主細(xì)胞，并將所述宿主細(xì)胞的發(fā)酵菌體用于D-對(duì)羥基苯甘氨酸的生產(chǎn)。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK106011117SQ201510457039
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2015年7月30日
【發(fā)明人】趙德, 楊兆勇, 任麗, 任敏, 李亞?wèn)|, 金媛媛, 王國(guó)勤, 羅尚菊, 易丹, 王翠娟
【申請(qǐng)人】重慶桑禾動(dòng)物藥業(yè)有限公司