用于制藥廢水處理的交聯(lián)β-內(nèi)酰胺酶聚集體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于制藥廢水處理的交聯(lián)β?內(nèi)酰胺酶聚集體的制備方法，將重組β?內(nèi)酰胺酶基因序列轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coli Top10中，得到重組菌，再通過誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎、離心處理、取上清得到粗酶液；加入牛血清蛋白作為聚集劑及保護(hù)劑到粗酶液中，進(jìn)行沉淀并聚集，形成酶聚集體，將得到酶聚集體用雙功能試劑進(jìn)行交聯(lián)，從而制備得到交聯(lián)β?內(nèi)酰胺酶聚集體。本發(fā)明制備得到的交聯(lián)β?內(nèi)酰胺酶聚集體，經(jīng)測試酶活高，穩(wěn)定性好，可重復(fù)利用，用于抗生素廢水治理，其化學(xué)需氧量降低了72.9％，該交聯(lián)β?內(nèi)酰胺酶聚集體在制藥工業(yè)處理抗生素廢水中顯示出重要的應(yīng)用價值。
【專利說明】
用于制藥廢水處理的交聯(lián)e-內(nèi)醜胺酶聚集體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，更為具體地講，設(shè)及一種用于制藥廢水處理的交聯(lián) 0-內(nèi)酷胺酶聚集體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，我國制藥工業(yè)得到了迅猛發(fā)展，然而在制藥過程中排放的大量有毒有害 廢水則嚴(yán)重危害著人們的身體健康。因制藥工業(yè)廢水成分復(fù)雜、有機(jī)物含量高、毒性大、顏 色深、含鹽量高、可生化性差，對微生物生長有極強(qiáng)的抑制作用，難W自然降解。同時，制藥 工業(yè)廢水的化學(xué)需氧量(Chemical 0巧gen Demand,COD)可高達(dá)6000mg/LW上，因此，治理 制藥工業(yè)廢水，保障人們的身體健康已成為全球性課題。
[0003] 目前，國家和地方政府非常重視廢水處理工程。根據(jù)國內(nèi)外廢水處理現(xiàn)已采用的 工藝及運(yùn)行情況，當(dāng)前的制藥共工業(yè)廢水處理技術(shù)主要分為：物理處理技術(shù)、化學(xué)處理技 術(shù)、生物處理技術(shù)。生物處理技術(shù)因其處理成本低、經(jīng)濟(jì)效益好和無二次污染等優(yōu)點，受到 了許多制藥企業(yè)的青睞。生物處理技術(shù)是利用廢水中的有機(jī)物作為惟一的碳源或能源，從 廢水中選育菌種，對廢水中的物質(zhì)進(jìn)行降解的一種方法。該方法尤其對小分子有機(jī)物有良 好的降解效果。
[0004] β-內(nèi)酷胺酶是針對內(nèi)酷胺類抗生素分泌的一類酶，能催化水解6-氨基青霉燒酸 (6-ΑΡΑ)和7-氨基頭抱燒酸（7-ACA)及其Ν-酷基衍生物分子中β-內(nèi)酷胺環(huán)酷胺鍵，使β-內(nèi) 酷胺環(huán)裂解而被破壞，失去抗菌活性。
[0005] 交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)固定化方法，是2000年由荷蘭Delft大學(xué)化eldon小組在交 聯(lián)酶晶體(CLECs)的基礎(chǔ)上提出的一種新型的固定化技術(shù)。它首先W有機(jī)溶劑、非離子型聚 合物或鹽等作為沉淀劑使酶蛋白沉淀并聚集，形成酶聚集體;再進(jìn)一步將酶聚集體用雙功 能試劑進(jìn)行交聯(lián)，從而制備得到交聯(lián)酶聚集體。其中交聯(lián)酶聚集體中酶的活性位點并不遭 到破壞，蛋白質(zhì)形成了超分子結(jié)構(gòu)，抗生素通過聚集體的中間縫隙與酶的活性位點作用，從 而酶的活性位點避免了與外界的微環(huán)境直接作用，更好地降解抗生素。另外聚集體的形成 使得整個團(tuán)體形成了一個疏水基團(tuán)，運(yùn)樣微環(huán)境中的pH值、溫度、有機(jī)溶劑等對蛋白質(zhì)的構(gòu) 型影響顯著降低，從而提高了酶的耐受性，較游離酶溶液穩(wěn)定性顯著提高。相較于傳統(tǒng)固定 化方法，CLEAs技術(shù)具有對酶純度要求低，獲得的固定化酶穩(wěn)定性好、活性高、無需載體，成 本低廉，易于推廣等優(yōu)點。
[0006] 盡管CLEAs技術(shù)優(yōu)勢明顯，但它通用性不強(qiáng)，通常對一種酶優(yōu)化的制備條件可能對 另一種酶甚至是不同酶源的同一種酶均不適用，所W研究新酶的固定化體系還要不斷摸 索。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于制藥廢水處理的交聯(lián)β-內(nèi) 酷胺酶聚集體的制備方法，W獲得活性高，穩(wěn)定性好的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體，用于降解制 藥工業(yè)廢水中的內(nèi)酷胺類抗生素，達(dá)到降低制藥廢水化學(xué)需氧量的目的。
[0008] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明用于制藥廢水處理的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體的制備 方法，其特征在于，包括W下步驟：
[0009] (1)、將重組β-內(nèi)酷胺酶基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coli ToplO中，得到重組 菌，進(jìn)行原核體外重組表達(dá)；
[0010] (2)、將重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到誘導(dǎo)菌，對誘導(dǎo)菌進(jìn)行離屯、處理，得到菌體，然 后加入緩沖液，并進(jìn)行超聲破碎，離屯、處理，取上清，得到粗酶液；
[0011] (3)、取25111旨/血粗酶液11^加入1/^3粗酶液質(zhì)量的854(牛血清蛋白），作為聚集劑及 保護(hù)劑，放入25mL燒杯中冰浴條件下在磁力攬拌器上攬拌20分鐘；5mL 75%的硫酸錠溶液 作為沉淀劑，冰浴條件下，逐滴加入飽和硫酸錠(沉淀劑），攬拌1小時;常溫(25°C)條件下， 濃度0.5%的戊二醒作為交聯(lián)的雙功能試劑，逐滴加入戊二醒(雙功能試劑），交聯(lián)2小時;所 得懸液4°C條件下，400化pm離屯、15分鐘，得沉淀即為固化后的酶；
[0012] 固定化后的酶再懸浮于20ml的50mM憐酸鹽緩沖液(PH7.0)中，冰浴條件下攬拌30 分鐘，運(yùn)樣反復(fù)重復(fù)Ξ次，所得懸液4 °C條件下，40(K)rpm離屯、15分鐘，得沉淀即為所得的交 聯(lián)0-內(nèi)酷胺酶聚集體。
[0013] 作為進(jìn)一步的優(yōu)選，沉淀溫度為(TC，交聯(lián)溫度為常溫(25°C)。
[0014] 作為進(jìn)一步的優(yōu)選，交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體應(yīng)用于制藥工業(yè)廢水處理時，pH值為 7.5。
[0015] 作為進(jìn)一步的優(yōu)選，交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體應(yīng)用于制藥工業(yè)廢水處理時，溫度為 3(TC~5(rC。
[0016] 作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述制藥工業(yè)廢水優(yōu)選抗生素廢水。
[0017] 本發(fā)明的目的是運(yùn)樣實現(xiàn)的。
[0018] 本發(fā)明用于制藥廢水處理的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體的制備方法，將重組β-內(nèi)酷胺 酶基因序列轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coli ToplO中，得到重組菌，再通過誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破 碎、離屯、處理、取上清得到粗酶液;加入牛血清蛋白作為聚集劑及保護(hù)劑到粗酶液中，進(jìn)行 沉淀并聚集，形成酶聚集體，將得到酶聚集體用雙功能試劑進(jìn)行交聯(lián)，從而制備得到交聯(lián)β- 內(nèi)酷胺酶聚集體。本發(fā)明制備得到的交聯(lián)0-內(nèi)酷胺酶聚集體，經(jīng)測試酶活高，穩(wěn)定性好，可 重復(fù)利用，用于抗生素廢水治理，其化學(xué)需氧量降低了72.9%，該交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體在 制藥工業(yè)處理抗生素廢水中顯示出重要的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0019] 圖1是本發(fā)明中β-內(nèi)酷胺酶基因改造示意圖；
[0020] 圖2是本發(fā)明中重組β-內(nèi)酷胺酶基因重組表達(dá)示意圖；
[0021 ]圖3是本發(fā)明一種【具體實施方式】下獲取粗酶液的表達(dá)圖；
[0022] 圖4是本發(fā)明一種【具體實施方式】提供的硫酸錠溶液濃度(a)和含量(b)對所述交聯(lián) β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶活性影響圖；
[0023] 圖5是本發(fā)明一種【具體實施方式】提供的牛血清蛋白（BSA)對所述交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶 聚集體酶活性影響圖；
[0024] 圖6是本發(fā)明一種【具體實施方式】提供的戊二醒終濃度對所述交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集 體酶活性影響圖；
[0025] 圖7是本發(fā)明一種【具體實施方式】提供的不同抑值對所述交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶 活性影響圖；
[0026] 圖8是本發(fā)明一種【具體實施方式】提供的不同溫度對所述交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶 活性影響圖；
[0027] 圖9是本發(fā)明一種【具體實施方式】提供的所述交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體對抗生素廢水 化學(xué)需氧量的影響圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行描述，W便本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地 理解本發(fā)明。需要特別提醒注意的是，在W下的描述中，當(dāng)已知功能和設(shè)計的詳細(xì)描述也許 會淡化本發(fā)明的主要內(nèi)容時，運(yùn)些描述在運(yùn)里將被忽略。
[00巧]一、實施例
[0030] 1、重組β-內(nèi)酷胺酶基因的獲得
[0031] 本發(fā)明W對頭抱嚷朽具有耐藥性的GenBank:AF143804.1上的β-內(nèi)酷胺酶基因為 基礎(chǔ)，在其編碼區(qū)（核巧酸序列）的5'端和3'端分別設(shè)計限制性內(nèi)切酶Ncol即序列5'- ccatgg-3 '和EcoRI即5 ' -gaattc-3 '，在3 '端終止密碼子taa前插入6個His標(biāo)簽即組氨酸 catcaccatcaccatcac，得到改造的β-內(nèi)酷胺酶基因序列，改造重組的過程如圖1所示。
[0032] 核巧酸序列GenBank:AF143804.1是來自于美國國家生物技術(shù)信息中屯、(化tional Center for Biotechnology Information,NCBI)基因序列數(shù)據(jù)庫中的一種β-內(nèi)酷胺酶基 因序列。
[0033] 在本實施例中，南京金斯瑞生物有限公司依據(jù)改造的β-內(nèi)酷胺酶基因序列進(jìn)行合 成，其基因序列見序列表中的序列1。合成的β-內(nèi)酷胺酶基因克隆到pBAD-TLX表達(dá)載體中， 得到重組β-內(nèi)酷胺酶基因，具體如圖2所示。
[0034] 在本發(fā)明中，之所W在β-內(nèi)酷胺酶基因序列的5'端替換上限制性內(nèi)切酶Ncol和3' 端插入限制性內(nèi)切酶EcoRI，是因為Ncol和EcoRI產(chǎn)生的黏性末端可與表達(dá)（克?。┹d體 pBAD-TLX上的限制性內(nèi)切酶Nco巧此coRI產(chǎn)生的黏性末端進(jìn)行特異性結(jié)合，從而將β-內(nèi)酷 胺酶基因片段與表達(dá)(克隆)載體連接。
[0035] 2、重組β-內(nèi)酷胺酶的誘導(dǎo)表達(dá)
[0036] 在本實施例中，將重組β-內(nèi)酷胺酶基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌Ε. coli ToplO中， 得到重組菌，隨后進(jìn)行原核體外誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)條件為：將重組菌單克隆接種到20mL LB化uria-Bertani)培養(yǎng)基中，Amp(氨節(jié)青霉素)濃度為lOOyg/mL，放于37°C、轉(zhuǎn)速為180巧m 的搖床中過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌液按2%的接種量接種到200mL含有Amp的LB培養(yǎng)基中，放 于37°C、轉(zhuǎn)速為18化pm的搖床中培養(yǎng)至OD600為0.7左右，然后在16°C培養(yǎng)箱中靜置1.5小時 后，加入0.05mg/mL阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度調(diào)為16°C，搖床轉(zhuǎn)速換為10化pm，誘導(dǎo)細(xì) 菌至0〇6日日為2.5左右結(jié)束，得到誘導(dǎo)菌。
[0037] 3、獲取粗酶液
[003引在本實施例中，誘導(dǎo)菌離屯、得菌體，加入200mM化is-S化緩沖液超聲破碎，待破碎 液成透明狀，4°C離屯、機(jī)，12000g離屯、1小時，得上清和沉淀，取上清，得到粗酶液。在本實施 例中，將上清和沉淀加入2 X SDS上樣緩沖液，混勻，加入到SDS-PAGE聚丙締酷胺凝膠電泳中 檢測目的蛋白。從圖3中可看出目的蛋白在38W)a左右，成功獲得了可溶性目的蛋白即粗酶 液
[0039] 4、交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體的制備
[0040] 在本實施例中，用考馬氏亮藍(lán)法測上清蛋白濃度，根據(jù)濃度換算，取ImL粗酶液粗 酶液加入粗酶液質(zhì)量的BSA(牛血清蛋白），作為聚集劑及保護(hù)劑，放入25mL燒杯中冰浴 條件下在磁力攬拌器上攬拌20分鐘。冰浴條件下，逐滴加入飽和硫酸錠(沉淀劑），攬拌1小 時；常溫(25°C)條件下，逐滴加入戊二醒(雙功能試劑），交聯(lián)2小時；所得懸液4°C條件下， 400化pm離屯、15分鐘，得沉淀即為固化后的酶。固定化后的酶再懸浮于20ml的50mM憐酸鹽緩 沖液(pH7.0)中，冰浴條件下攬拌30分鐘，運(yùn)樣反復(fù)重復(fù)Ξ次，所得懸液4°C條件下，400化pm 離屯、15分鐘，得沉淀即為所得的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體。
[004。二、測試
[0042] 1、飽和硫酸錠濃度對交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶活性影響
[0043] 分別配制30% ,45% ,60% ,75%和85%的飽和硫酸錠溶液，對粗酶液進(jìn)行固定化， 測量交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體相對酶活，結(jié)果如圖4(a)所示。從圖4(a)可W看出，當(dāng)飽和硫酸 錠溶液濃度為75%時，本發(fā)明制備的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體相對酶活性可達(dá)57.1 %。
[0044] 2、飽和硫酸錠用量對交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶活性的影響
[0045] 加入不同量飽和硫酸錠對粗酶液進(jìn)行固定化，測量交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體相對酶 活性，結(jié)果如圖4(b)所示。從圖4(b)可W看出，當(dāng)加入75%的飽和硫酸錠溶液為5mL時，本發(fā) 明制備的交聯(lián)0-內(nèi)酷胺酶聚集體相對酶活性可達(dá)64%。
[0046] 3、牛血清蛋白（BSA)對交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶活性的影響
[0047] 加入不同質(zhì)量的牛血清蛋白充當(dāng)聚集劑及保護(hù)劑進(jìn)行固定化時，測量交聯(lián)β-內(nèi)酷 胺酶聚集體相對酶活性，結(jié)果如圖5所示。從圖5可W看出，當(dāng)加入的牛血清蛋白與粗酶液質(zhì) 量比為1:3時，本發(fā)明制備的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體相對酶活性93.1 %，說明牛血清蛋白有 利于保留聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶活性。
[004引4、戊二醒終濃度對交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶活性的影響
[0049] 加入不同終濃度的戊二醒溶液作為雙功能試劑進(jìn)行固定化時，測量交聯(lián)β-內(nèi)酷胺 酶聚集體相對酶活性，結(jié)果如圖6所示。從圖6可W看出，當(dāng)戊二醒終濃度為0.5%時，本發(fā)明 制備的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體相對酶活性為94.5%。
[0050] 5、ρΗ對交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶活穩(wěn)定性的影響
[0051] 將交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體放于不同pH的憐酸鹽緩沖液中，檢測其酶活穩(wěn)定性，結(jié) 果如圖7所示。從圖7中可W看出，本發(fā)明制備的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體在過酸或過堿的環(huán) 境下相對酶活性較低，但還是比粗酶液穩(wěn)定性高。在Ρ冊.5-抑8.5之間，交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚 集體相對酶活性較高。說明本發(fā)明制備出的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體具有較高的pH值穩(wěn)定 性。
[0052] 6、溫度對交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體酶活穩(wěn)定性的影響
[0053] 將交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體放于不同溫度的燒杯中，檢測其酶活穩(wěn)定性，結(jié)果如圖8 所示。從圖8可W看出，本發(fā)明制備的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體有很高的耐熱性，當(dāng)在70°C溫 度中放6小時，其仍能保持70%的酶活，而在30°C~50°C為最佳;而粗酶液在60°C環(huán)境中半 個小時就失去了 60 %酶活。
[0054] 7、交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體對廢水COD值的影響
[0055] 將濾紙放于錐形漏斗，將所述抗生素廢水過濾，去除懸浮物及顆粒物質(zhì)，得濾液； 將濾液高速離屯、，用化學(xué)需氧量快速測定儀檢測本發(fā)明制備的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體對廢 水處理前濾液的化學(xué)需氧量;將所述的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體放入濾液中，放于30°C搖床 中，轉(zhuǎn)速ISOrpm培養(yǎng)35小時，取處理后廢水離屯、，巧憶處理后廢水的化學(xué)需氧量。結(jié)果如圖9 所示。從圖9可W看出，本發(fā)明制備的交聯(lián)β-內(nèi)酷胺酶聚集體對廢水COD去除率可達(dá)72.9%， 運(yùn)說明本發(fā)明制備的交聯(lián)0-內(nèi)酷胺酶聚集體對抗生素廢水具有良好的降化學(xué)需氧量的效 果。從圖7還可W看出，pBAD細(xì)菌對廢水COD去除率也可達(dá)12%，所述pBAD細(xì)菌表示體內(nèi)導(dǎo)入 了pBAD-化X載體的E. coli Top 10宿主菌，對照組即沒有任何細(xì)菌處理的廢水。粗酶液加入 到廢水中不到半小時酶活就喪失，故并沒有粗酶液處理結(jié)果。
[0056] 盡管上面對本發(fā)明說明性的【具體實施方式】進(jìn)行了描述，W便于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù) 人員理解本發(fā)明，但應(yīng)該清楚，本發(fā)明不限于【具體實施方式】的范圍，對本技術(shù)領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員來講，只要各種變化在所附的權(quán)利要求限定和確定的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，運(yùn)些 變化是顯而易見的，一切利用本發(fā)明構(gòu)思的發(fā)明創(chuàng)造均在保護(hù)之列。
【主權(quán)項】
1. 一種用于制藥廢水處理的交聯(lián)β-內(nèi)酰胺酶聚集體的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 、將重組β-內(nèi)酰胺酶基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞大腸桿菌E.coli ToplO中，得到重組菌，進(jìn) 行原核體外重組表達(dá)； (2) 、將重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到誘導(dǎo)菌，對誘導(dǎo)菌進(jìn)行離心處理，得到菌體，然后加 入緩沖液，并進(jìn)行超聲破碎，離心處理，取上清，得到粗酶液； (3) 、取25mg/mL粗酶液lmL加入1/3粗酶液質(zhì)量的BSA(牛血清蛋白），作為聚集劑及保護(hù) 劑，放入25mL燒杯中冰浴條件下在磁力攪拌器上攪拌20分鐘；5mL 75 %的硫酸銨溶液作為 沉淀劑，冰浴條件下，逐滴加入飽和硫酸銨(沉淀劑），攪拌1小時;常溫(25°C)條件下，濃度 0.5 %的戊二醛作為交聯(lián)的雙功能試劑，逐滴加入戊二醛(雙功能試劑），交聯(lián)2小時;所得懸 液4 °C條件下，4000rpm離心15分鐘，得沉淀即為固化后的酶； 固定化后的酶再懸浮于20ml的50mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中，冰浴條件下攪拌30分鐘， 這樣反復(fù)重復(fù)三次，所得懸液4°C條件下，4000rpm離心15分鐘，得沉淀即為所得的交聯(lián)β-內(nèi) 酰胺酶聚集體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的重組β_內(nèi)酰胺酶基因采用以下 步驟獲取： 以對頭孢噻肟具有耐藥性的GenBank:AF143804.1上的β-內(nèi)酰胺酶基因為基礎(chǔ)，在其編 碼區(qū)（核苷酸序列）的5'端和3'端分別設(shè)計限制性內(nèi)切酶Ncol即序列5'-ccatgg-3'和EcoRI 艮P5'-gaattc-3'，在3'端終止密碼子taa前插入6個His標(biāo)簽即組氨酸catcaccatcaccatcac， 得到改造的內(nèi)酰胺酶基因序列； 依據(jù)改造的內(nèi)酰胺酶基因序列進(jìn)行合成，合成得到的內(nèi)酰胺酶基因克隆到PBAD-TLX表達(dá)載體中，得到重組β-內(nèi)酰胺酶基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)表達(dá)為： 將重組菌單克隆接種到20mL LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中，Amp(氨節(jié)青霉素)濃度為 100yg/mL，放于37°C、轉(zhuǎn)速為180rpm的搖床中過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的菌液按2%的接種量接 種到200mL含有Amp的LB培養(yǎng)基中，放于37°C、轉(zhuǎn)速為180rpm的搖床中培養(yǎng)至OD600為0.7左 右，然后在16°C培養(yǎng)箱中靜置1.5小時后，加入0.05mg/mL阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度調(diào) 為16°(：，搖床轉(zhuǎn)速換為100印111，誘導(dǎo)細(xì)菌至00 6()()為2.5左右結(jié)束，得到誘導(dǎo)菌。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的沉淀溫度為0°C，交聯(lián)溫度為常 溫(25。〇。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的交聯(lián)β_內(nèi)酰胺酶聚集體應(yīng)用于 制藥工業(yè)廢水處理時，pH值為7.5。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的交聯(lián)β_內(nèi)酰胺酶聚集體應(yīng)用于 制藥工業(yè)廢水處理時，溫度為30°C~50°C。
【文檔編號】C02F103/34GK106011119SQ201610343627
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月23日
【發(fā)明人】馮娟, 吳雪琴, 湯麗霞, 鄧文鳳, 廖茜, 仝亞沛
【申請人】電子科技大學(xué)