一種促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于蛋白酶領(lǐng)域，尤其涉及一種促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明將酶促進(jìn)劑8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羥基–3–(4–羥基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮與中性蛋白酶混合添加到豌豆蛋白粉中，對(duì)豌豆蛋白粉進(jìn)行酶解制備豌豆蛋白多肽粉。本發(fā)明的中性蛋白酶促進(jìn)劑提高了中性蛋白酶的活性，縮短了酶解時(shí)間，提高了酶解效率；豌豆蛋白粉酶解后經(jīng)冷凍干燥得到豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高；相比于未添加木瓜蛋白酶促進(jìn)劑的豌豆蛋白多肽粉，DPPH自由基清除率提高了10％～14％，能夠用于抗衰老、抗氧化的功能性食品的開發(fā)。
【專利說明】
-種促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白酶領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 中性蛋白酶別名沙雷膚酶，分子量為35~40KD，是一種在中性條件下活性較高的 蛋白酶，可用于各種蛋白質(zhì)水解，作為一種生物催化劑，它具有催化反應(yīng)速度快，無工業(yè)污 染等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)《GB 2760-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的規(guī)定，中性蛋白 酶可用作食品工業(yè)的加工助劑(酶制劑）。
[0003] 8-( (4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基）-5,7-二徑基-3-(4-?基苯基）-4H- 苯并化喃-4-酬是染料木素與1-(2,4-二甲基苯基)贓嗦經(jīng)化學(xué)合成得到的一種染料木素衍 生物。8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基）-5,7-二徑基-3-(4-?基苯基）-4H-苯 并化喃-4-酬的分子式為C2祖28N2化，分子量472.52，其結(jié)構(gòu)式如下：
[0004]
[0005] 目前，國內(nèi)外未見8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基）-5,7-二徑基-3- (4-徑基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬在促進(jìn)中性蛋白酶活性方面的應(yīng)用報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法及其 應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
[000引本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法，將中性蛋白酶促 進(jìn)劑8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基）-5,7-二徑基-3-(4-?基苯基）-4H-苯并 化喃-4-酬與中性蛋白酶混合，得到促進(jìn)活性的中性蛋白酶。
[0009] 其中，所述中性蛋白酶促進(jìn)劑的添加量為中性蛋白酶質(zhì)量的2~4%。
[0010] 其中，所述的中性蛋白酶促進(jìn)劑8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基）-5， 7-二徑基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬，為染料木素與1-(2,4-二甲基苯基)贓嗦的 化學(xué)合成物，具體制備過程如下:在50mL圓底燒瓶中加入染料木素 Immol、無水乙醇25mL和 37wt%甲醒水溶液0.08血，加熱至55~60°C，反應(yīng)液澄清后，加入1-(2，4-二甲基苯基)贓嗦 0.19mL，2(TC條件下攬拌4她，有固體析出，過濾，固體經(jīng)重結(jié)晶分離純化，得到中性蛋白酶 促進(jìn)劑。
[0011] 本發(fā)明的促進(jìn)活性原理為：中性蛋白酶促進(jìn)劑與中性蛋白酶的一個(gè)酪氨酸殘基W 一個(gè)氨鍵相互結(jié)合，兩個(gè)η鍵和一個(gè)賴氨酸殘基結(jié)合，Ξ個(gè)31鍵和一個(gè)色氨酸殘基結(jié)合，運(yùn)種 結(jié)合導(dǎo)致了中性蛋白酶構(gòu)象的改變，從而提高了中性蛋白酶的活性。
[0012] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種上述促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法在制備魏豆 蛋白多膚粉領(lǐng)域的應(yīng)用。
[0013] 上述魏豆蛋白多膚粉的制備方法，包括如下步驟：
[0014] (1)將中性蛋白酶促進(jìn)劑8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基)-5,7-二徑 基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬與中性蛋白酶混合，得到促進(jìn)活性的中性蛋白酶；
[0015] (2)將促進(jìn)活性的中性蛋白酶添加到魏豆蛋白粉中，魏豆蛋白粉進(jìn)行酶解后，制得 魏豆蛋白多膚粉。
[0016] 進(jìn)一步，將魏豆蛋白粉溶解于憐酸緩沖溶液中，加入中性蛋白酶和中性蛋白酶促 進(jìn)劑，經(jīng)酶解、滅酶、冷卻過濾后得到魏豆多膚液，魏豆多膚液再經(jīng)冷凍干燥得到魏豆蛋白 多膚粉。
[0017] 其中，所述中性蛋白酶促進(jìn)劑的添加量為中性蛋白酶質(zhì)量的2~4%，所述中性蛋 白酶的添加量為魏豆蛋白粉質(zhì)量的10~12%。
[0018] 所述的酶解pH值為6.5~7.0，酶解溫度為40~45°C，酶解時(shí)間為2~2.化。
[0019] 所述的滅酶溫度為95~100°C，滅酶時(shí)間為5~lOmin。
[0020] 將本發(fā)明制得的魏豆蛋白多膚粉Wll.9~13.8mg/mL的濃度添加到飲料中，能夠 制成抗氧化、抗衰老的功能性飲料。
[0021] 本發(fā)明的有益效果是：
[0022] 1、本發(fā)明的中性蛋白酶促進(jìn)劑提高了中性蛋白酶的活性，其與中性蛋白酶一起添 加到魏豆蛋白粉中，具有協(xié)同作用，縮短了酶解時(shí)間，提高了酶解效率。
[0023] 2、魏豆蛋白粉酶解后經(jīng)冷凍干燥得到魏豆蛋白多膚粉，清除自由基效率更高；相 比于未添加中性蛋白酶促進(jìn)劑的魏豆蛋白多膚粉，DPPH自由基清除率提高了 10~14%，能 夠用于抗衰老、抗氧化的功能的功能性食品開發(fā)。
【具體實(shí)施方式】
[0024] W下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0025] 實(shí)施例1
[0026] (1)將魏豆蛋白粉溶解于pH值為7.0的憐酸緩沖溶液中，形成魏豆蛋白粉質(zhì)量濃度 為7 %的分散液；
[0027] (2)向步驟(1)的分散液中加入占魏豆蛋白粉質(zhì)量12%的中性蛋白酶，同時(shí)加入占 中性蛋白酶質(zhì)量2%的中性蛋白酶促進(jìn)劑8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基)-5， 7-二徑基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬；
[002引（3)在抑值為7、溫度為45 °C的條件下水浴震蕩2.化，酶解結(jié)束后，酶解液在95 °C維 持lOmin滅酶，然后冷卻至20-25°C，過濾得到魏豆蛋白多膚液。
[0029]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，加入中性蛋白酶促進(jìn)劑后，魏豆蛋白的水解度提高28%，水解時(shí)間縮短 了23%。
[0030] 將魏豆蛋白多膚液經(jīng)真空冷凍干燥得魏豆蛋白多膚粉，將魏豆蛋白多膚粉W 12.8mg/mL的濃度添加到飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老等的功能性飲料，其DPPH自由基 清除率達(dá)93%，與未使用中性蛋白酶促進(jìn)劑相比，清除率提高了 14%。
[0031] 實(shí)施例2
[0032] (1)將魏豆蛋白粉溶解于pH值為6.7的憐酸緩沖溶液中，形成魏豆蛋白粉質(zhì)量濃度 為7 %的分散液；
[0033] (2)向步驟(1)的分散液中加入占魏豆蛋白粉質(zhì)量10%的中性蛋白酶，同時(shí)加入占 中性蛋白酶質(zhì)量4%的中性蛋白酶促進(jìn)劑8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基)-5， 7-二徑基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬；
[0034] (3)在pH值為6.7、溫度為40°C的條件下水浴震蕩酶解化，酶解結(jié)束后，酶解液在 100°C水浴維持5min滅酶，然后冷卻至20-25°C，過濾得到魏豆蛋白多膚液。
[0035] 用甲醒滴定法測(cè)定水解度，發(fā)現(xiàn)加入中性蛋白酶促進(jìn)劑后，魏豆蛋白的水解度提 高17 %，水解時(shí)間縮短了 10 %。
[0036] 將魏豆蛋白多膚液經(jīng)真空冷凍干燥得魏豆蛋白多膚粉，將魏豆蛋白多膚粉W 11.9mg/mL的濃度添加到飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性飲料，其DPPH自由 基清除率達(dá)85%，與未使用中性蛋白酶促進(jìn)劑相比，清除率提高了 4.9%。
[0037] 實(shí)施例3
[0038] (1)將魏豆蛋白粉溶解于pH值為6.5的憐酸緩沖溶液中，形成底魏豆蛋白粉質(zhì)量濃 度為7 %的分散液；
[0039] (2)向步驟(1)的分散液中加入占魏豆蛋白粉質(zhì)量11%的中性蛋白酶，同時(shí)加入占 中性蛋白酶質(zhì)量3%的中性蛋白酶促進(jìn)劑8-((4-(2,4-二甲氧基苯基)贓嗦-1-基）甲基)-5， 7-二徑基-3-(4-?基苯基)-4H-苯并化喃-4-酬；
[0040] (3)在抑值為6.5、溫度為42°C的條件下水浴震蕩2.化，酶解結(jié)束后，酶解液在100 °C維持5min滅酶，然后冷卻至20-25°C，過濾得到魏豆蛋白多膚液。
[0041] 用甲醒滴定法測(cè)量水解度，發(fā)現(xiàn)加入中性蛋白酶促進(jìn)劑后，魏豆蛋白的水解度提 高22 %，水解時(shí)間縮短了 16 %。
[0042] 將魏豆蛋白多膚液經(jīng)真空冷凍干燥得魏豆蛋白多膚粉，將魏豆蛋白多膚粉W 13.8mg/mL的濃度添加到飲料中，得到具有抗氧化、抗衰老等的功能性飲料，其DPPH自由基 清除率達(dá)89%，與未使用中性蛋白酶促進(jìn)劑相比，清除率提高了 10%。
[0043] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用W限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法，其特征在于，將中性蛋白酶促進(jìn)劑8-((4-(2,4-二 甲氧基苯基)哌嗪-1-基）甲基)-5,7-二羥基-3-(4-羥基苯基)-4H-苯并吡喃-4-酮與中性蛋 白酶混合，得到促進(jìn)活性的中性蛋白酶。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶促進(jìn)劑的添加量為中性蛋 白酶質(zhì)量的2~4%。3. -種權(quán)利要求1所述的促進(jìn)中性蛋白酶活性的方法在制備豌豆蛋白多肽粉領(lǐng)域的應(yīng) 用。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟： (1) 將中性蛋白酶促進(jìn)劑8-((4-(2,4_二甲氧基苯基)哌嗪-1-基）甲基）-5,7_二羥基-3-(4-羥基苯基)-4H-苯并吡喃-4-酮與中性蛋白酶混合，得到促進(jìn)活性的中性蛋白酶； (2) 將促進(jìn)活性的中性蛋白酶添加到豌豆蛋白粉中，豌豆蛋白粉進(jìn)行酶解后，制得豌豆 蛋白多肽粉。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，將豌豆蛋白粉溶解于磷酸緩沖溶液中，加 入中性蛋白酶和中性蛋白酶促進(jìn)劑，經(jīng)酶解、滅酶、冷卻過濾后得到豌豆多肽液，豌豆多肽 液再經(jīng)冷凍干燥得到豌豆蛋白多肽粉。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述中性蛋白酶促進(jìn)劑的添加量為中性蛋 白酶質(zhì)量的2~4%，所述中性蛋白酶的添加量為豌豆蛋白粉質(zhì)量的10~12%。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，酶解pH值為6.5~7.0，酶解溫度為40~45 °C，酶解時(shí)間為2~2.5h。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，滅酶溫度為95~100°C，滅酶時(shí)間為5~ 10min〇
【文檔編號(hào)】C12N9/96GK106011121SQ201610646753
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月8日
【發(fā)明人】張樹成, 臧慶佳, 楊進(jìn)潔
【申請(qǐng)人】煙臺(tái)雙塔食品股份有限公司