一種致肝膿腫肺炎克雷伯菌分子檢測試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種致肝膿腫肺炎克雷伯菌分子檢測試劑盒及其應(yīng)用，本發(fā)明提供了致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列pagO和luxR，這兩個基因特異性的存在于致肝膿腫肺炎克雷伯菌中，可作為肺炎克雷伯菌肝膿腫的診斷標記物?；谶@兩個基因設(shè)計的引物可用于制備致肝膿腫肺炎克雷伯菌分子檢測試劑盒，可以用于肺炎克雷伯菌肝膿腫的診斷或其早期診斷，具有極大的商業(yè)化開發(fā)價值。
【專利說明】
-種致肝賊腫肺炎克雷伯菌分子檢測試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及疾病診斷領(lǐng)域，具體設(shè)及一種致肝脈腫肺炎克雷伯菌分子檢測試劑盒 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯菌化.pneumoniae subsp.pneumonia)，屬于腸桿菌科細菌。常寄生于 人體皮膚、鼻咽部和腸道等處，為條件致病菌。在臨床上，可引起肺炎和尿路感染等 (Podschun R,Ullmann U.Klebsiella spp.as nosocomial pathogens :epidemiology, taxonomy , typing methods ,and pathogenicity factors.Clinical microbiology reviews. 1998; 11 (4): 589-603)。1980年到1990年，臺灣地區(qū)Liu等人首次報道了7例由高毒 力肺炎克雷伯菌引起的嚴重肝脈腫伴眼內(nèi)炎病例化iu Y，畑eng D，Lin C.Klebsiella pneumoniae liver abscess associated with septic endophthalmitis.Arch Intern Med 1986; 146:1913-16)。此后，肺炎克雷伯菌肝脈腫開始全球流行，特別是在亞洲。與普通 的肺炎克雷伯菌相比，致肝脈腫肺炎克雷伯菌侵襲力強、致死率高。除了導(dǎo)致肝脈腫，致肝 脈腫肺炎克雷伯菌還可W引起嚴重的腦膜炎、眼內(nèi)炎和肺脈腫等(Siu LK，Yeh KM，Lin JC， Fung CP , Chang FY.Klebsiella pneumoniae liver abscess : a new invasive syn化ome.The Lancet Infectious diseases.2012;12(ll):881-7)。對于運樣高毒力的肺 炎克雷伯菌感染，盡快診斷，及時治療，對降低嚴重并發(fā)癥的發(fā)生，改善預(yù)后具有重要的臨 床價值。但是，目前沒有一種快速簡便的方法用于致肝脈腫肺炎克雷伯菌的檢測鑒定。
[0003] 隨著肺炎克雷伯菌肝脈腫病例報道的增加和致肝脈腫肺炎克雷伯菌研究的深入， 幾個與致肝脈腫肺炎克雷伯菌相關(guān)的表型相繼被提出，包括菌落高粘性表型和芙膜多糖血 清型K1型/K2型等。肺炎克雷伯菌可分泌多糖類物質(zhì)于細胞表面，從而使菌落產(chǎn)生高粘性表 型，用W抵抗巨隧細胞和中性粒細胞的吞隧。但最近研究發(fā)現(xiàn)，只有50%不到的致肝脈腫肺 炎克雷伯菌表現(xiàn)為菌落高粘性（Qu TT，Zhou JC，Jiang Y，Shi KR，Li B,化en P，et al. Clinical and microbiological characteristics of Klebsiella pneumoniae liver abscess in Blast Qiina.BMC infectious diseases.2015;15:161)。芙膜多糖血清 抗原ΚΙ型和Κ2型是致肝脈腫肺炎克雷伯菌的主要血清型，但仍有20% W上的致肝脈腫肺炎 克雷伯菌不屬于K1/K2血清型。此外，血清型K1型或K2型也被發(fā)現(xiàn)存在于普通肺炎克雷伯菌 (Sun Y,Wu Η,Shen D.Clinical and Molecular Analysis of Klebsiella pneumoniae Causing Liver Abscess in China. Journal of molecular microbiology and biotechnology. 2016; 26(4): 245-51)。因此，為了能夠在分子水平更快速有效的鑒定致肝 脈腫肺炎克雷伯菌，我們通過對致肝脈腫肺炎克雷伯菌和普通肺炎克雷伯菌的基因組比 較分析，找到致肝脈腫肺炎克雷伯菌的特異性基因序列。利用運些特異性序列，通過簡單的 PCR方法，可W快速地鑒定致肝脈腫肺炎克雷伯菌，為由該病原菌引起的感染的及時診斷和 治療、改善患者預(yù)后提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供了致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列pagO,所述的基 因特異性序列pagO為SEQ ID N0.1所示。
[0005] 本發(fā)明的另一個目的在于提供了基于致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列 pagO 設(shè)計的引物，引物為:pagO_F: TGCTCTTGAAACTATCCCTCC，pagO_R: GGCAATAACTCCCGTCCA。
[0006] 本發(fā)明還有一個目的在于提供了致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列l(wèi)uxR，所 述的基因特異性序列111誠為56〇10^.2所示。
[0007] 本發(fā)明還有一個目的在于提供了基于致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列 luxR設(shè)計的引 物，引 物為：luxR_F:CTTTGCCGGCATGGAACATA，luxR_R: TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA 〇
[0008] 本發(fā)明還有一個目的在于提供了致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列pagO或 基于pagO設(shè)計的引物在制備致肝脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，包括用于制備肺 炎克雷伯菌肝脈腫早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明還有一個目的在于提供了致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列l(wèi)uxR或 基于luxR設(shè)計的引物在制備致肝脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，包括用于制備肺 炎克雷伯菌肝脈腫早期診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的最后一個目的在于提供了一種致肝脈腫肺炎克雷伯菌分子檢測試劑盒， 所述的試劑盒包括引物：
[0011] pag0_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0012] pag0_R：GGCAATAACTCCCGTCCA
[0013] luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA
[0014] luxR_R:TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。
[001引為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)措施：
[0016] 致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列pagO,所述的基因特異性序列pagO為SEQ ID NO. 1 所示。
[0017] 基于pagO序列設(shè)計的引物均為本發(fā)明的保護范圍，優(yōu)選的，pagO的引物為:pag0_ F: TGCTCTTGAAACTATCCCTCC;pag0_R:GGCAATAACTCCCGTCCA。
[001引致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列l(wèi)uxR，所述的基因特異性序列l(wèi)uxR為SEQ ID NO.2所示。
[0019]基于luxR序列設(shè)計的引物均為本發(fā)明的保護范圍，優(yōu)選的，luxR的引物為：luxR的 引物為：luxR_F: CTTTGCCGGCATGGAACATA; luxR_R: TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。
[0020] 本發(fā)明的保護范圍還包括致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列pagO或基于 pagO設(shè)計的引物在制備致肝脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，包括制備肺炎克雷伯 菌肝脈腫早期診斷試劑盒。
[0021] 本發(fā)明的保護范圍還包括致肝脈腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列l(wèi)uxR或基于 luxR設(shè)計的引物在制備致肝脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒中的應(yīng)用，包括制備肺炎克雷伯 菌肝脈腫早期診斷試劑盒。
[0022] -種致肝脈腫肺炎克雷伯菌檢測試劑盒，包括：
[0023] pagO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0024] pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA [00 巧]luxR_F:CTTTGCCGGCATGGAACATA
[0026] luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA 〇
[0027] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有W下特點：
[00%] 1.目前尚無很好的用于致肝脈腫肺炎克雷伯菌鑒定的分子標志物，本發(fā)明通過測 序2株分離自中國大陸的致肝脈腫肺炎克雷伯菌和1株非致肝脈腫肺炎克雷伯菌，聯(lián)合網(wǎng)上 公布的45株致肝脈腫肺炎克雷伯菌和103株非致肝脈腫肺炎克雷伯菌的全基因組數(shù)據(jù)，通 過比對分析，得到了用于在致肝脈腫肺炎克雷伯菌中高度特異的兩段序列。
[0029] 2.本發(fā)明提供的2段致肝脈腫肺炎克雷伯菌特異的序列，可W作為制備致肝脈腫 肺炎克雷伯菌檢測試劑盒
[0030] 3.本發(fā)明提供的2段致肝脈腫肺炎克雷伯菌特異的序列，可W作為分子標志物，用 于肺炎克雷伯菌肝脈腫的早期診斷。特別是在血液等其他體液來源標本的病原菌培養(yǎng)結(jié)果 出報告前，利用患者血液標本或肝臟脈腔脈液，采用快速的PCR方法檢測致肝脈腫肺炎克雷 伯菌特異性基因 pagO或/和luxR的有無，結(jié)合患者臨床表現(xiàn)和影像學資料，可從陜速對肺炎 克雷伯菌肝脈腫做出診斷，提高肺炎克雷伯菌肝脈腫的治療成功率。
【具體實施方式】
[0031] 具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本 領(lǐng)域的常規(guī)方案。
[0032] 實施例1:
[0033] 特異性序列的開發(fā)和驗證：
[0034] 特異性基因序列的篩選過程結(jié)合第二代測序技術(shù)（Next-Generation Sequencing，NGS)，比較基因組學（Comparative Genomics)及生物信息學 (Bioinformatics)方法，并采用科學的統(tǒng)計學方法，對序列在多個肺炎克雷伯菌基因組中 分布的特異性進行檢驗，并且在分離的致肝脈腫肺炎克雷伯菌及非致肝脈腫肺炎克雷伯菌 中進行PC閲金證，W確定序列在致肝脈腫肺炎克雷伯菌中的特異性。具體實施過程如下：
[0035] 選取2株分離自中國大陸的致肝脈腫肺炎克雷伯菌和1株非致肝脈腫肺炎克雷伯 菌用于全基因組測序，測序結(jié)果用SPAdes(v3.5)軟件進行拼接，用PATRIC在線分析平臺進 行基因預(yù)測和功能注釋。得到的測序結(jié)果聯(lián)合美國國立生物信息中屯、(National Center for Bi otechnology Information,NCBI)公布的45株致肝脈腫肺炎克雷伯菌和103株非致 肝脈腫肺炎克雷伯菌的全基因組數(shù)據(jù)，通過比對分析，篩選只存在于致肝脈腫肺炎克雷伯 菌基因組中的基因，得到了兩段在致肝脈腫肺炎克雷伯菌中高度特異的序列pag0(SEQ ID NO.1所示)和luxR(SEQ ID NO.2所示煙于運兩段特異的序列設(shè)計引物，開發(fā)得到一套用于 鑒定致肝脈腫肺炎克雷伯菌的引物：
[0036] pagO的引物為：
[0037] pag0_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0038] pag0_R：GGCAATAACTCCCGTCCA
[0039] luxR的引物為：
[0040] luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA [0041 ] luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA 〇
[0042] 實施例2:
[0043] 基因特異性驗證：
[0044] pagO和luxR致肝脈腫肺炎克雷伯菌特異性基因在臨床分離菌株中的驗證，其具體 步驟是：
[0045] 1.選擇臨床分離的致肝脈腫和非致肝脈腫肺炎克雷伯菌菌株，用于檢測pagO(SEQ ID N 0.1所示)和luxR(SEQ ID NO.2所示)在致肝脈腫肺炎克雷伯菌中的特異性。選擇肝脈 腫患者脈腔中分離的40株肺炎克雷伯菌作為檢測組(致肝脈腫組），另選取非肺炎克雷伯菌 肝脈腫患者中分離的肺炎克雷伯菌36株作為陰性對照組(非致肝脈腫組）。同時也選取了臨 床上分離的常見其他致病菌(其他致病菌組）W進一步驗證運些因子在致肝脈腫肺炎克雷 伯菌中的特異性:包括金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、尿腸球菌、糞腸球菌。
[0046] 2. 2個預(yù)測基因特異性引物的設(shè)計：針對pagO和luxR特異性序列設(shè)計的引物如 下：
[0047] pagO的引物為：
[0048] pag〇_F:TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0049] pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA
[0化0] luxR的引物為：
[0051 ] luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA [0化。luxR_R: TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA
[0053] 3.細菌基因組的提取:將選取的76株肺炎克雷伯菌按照常規(guī)方式提取DM。
[0化4] 4.PCR檢測pagO和luxR基因在Ξ組菌（致肝脈腫組、非致肝脈腫組和其他致病菌 組）中的存在情況:PCR反應(yīng)采用Premix TaqVersion 2.0(化1(曰1?曰，(：〇(16:03314)試劑盒。根 據(jù)試劑盒說明，設(shè)置的PCR反應(yīng)體系為25u 1，其中PremiX Taq 12.5u 1，基因組DNA模板1U1 (約lOOng)，上下游引物0.加 l(lOuM)，加去離子水10.5u巧h充至總體積25ul。
[0055] PCR 條件為：94°C 變性 5111111;95^3〇3,55^3〇3,72^3〇3,30個循環(huán)；72^7111111;反應(yīng) 結(jié)束后各取5ul反應(yīng)產(chǎn)物用于DNA的瓊脂糖凝膠電泳，電泳膠用漠化乙錠化thi dium bromid)染色5min后，在美國伯樂(Bio-Rad)凝膠成像分析儀上拍照分析。
[0056] 結(jié)果見表1，如表1所示，pagO和luxR在致肝脈腫肺炎克雷伯菌中的檢出陽性率分 別為100%，而在非致肝脈腫的肺炎克雷伯菌中全為2.78%。在其他致病菌組中，包括金黃 色葡萄球菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、尿腸球菌、糞腸球菌均為陰性。
[0057] W上結(jié)果可W證明，pagO或luxR在致肝脈腫肺炎克雷伯菌中具有很高的特異性， 可W分別或結(jié)合作為診斷肺炎克雷伯菌肝脈腫的分子標記物。
[005引表1 pagO和luxR在臨床菌株中的PCR檢測的結(jié)果
[0化9]
[0060] 實施例3:
[0061] pagO和luxR序列或基于其序列設(shè)計的引物在制備肺炎克雷伯菌肝脈腫診斷試劑 盒中的應(yīng)用：
[0062] 本實驗設(shè)計思路如下:將臨床獲得的血培養(yǎng)樣品分為血培養(yǎng)陽性組和健康人陰性 組，其中血培養(yǎng)陽性組指所有血中培養(yǎng)出細菌的樣品，不僅僅局限于血中培養(yǎng)出肺炎克雷 伯菌，包括培養(yǎng)出其他致病菌的樣品。用PCR檢測陽性血培養(yǎng)樣品和陰性血培養(yǎng)樣品中特異 性因子（即pagO和luxR)的存在情況，最后把PCR結(jié)果與患者最終臨床診斷對應(yīng)分析，W此來 判斷本發(fā)明提供的方法對肺炎克雷伯菌肝脈腫的檢出率。
[0063] 1.臨床血培養(yǎng)樣品的收集:共收集2組血培養(yǎng)樣品，血培養(yǎng)陽性組69瓶、健康人血 培養(yǎng)陰性組40瓶。
[0064] 2. PCR檢測pagO和luxR在血培養(yǎng)樣品中的存在情況：
[0065] 2.1模板的制備:在無菌條件下，抽取3ml培養(yǎng)瓶中的血液，SOOOrpm，離屯、2min。棄 去上清，沉淀用200ul雙蒸水吹打混勻成懸液。懸液在100°C煮沸l(wèi)Omin，然后用1300化pm，離 屯、5min，上清液作為PCR檢測的模板。
[0066] 2.2PCR檢測pagO和luxR基因序列標記物及其組合在兩組血培養(yǎng)樣品中的存在情 況:PCR反應(yīng)采用Premix TaqVersion2.0(TaKaRa，Code:D331A)試劑盒。根據(jù)試劑盒說明，設(shè) 置的PCR反應(yīng)體系為25ul，其中Premix Taq 12.加1，基因組DNA模板化1，上下游引物0.加1 (10碰），加去離子水10.511巧|'充至總體積25111。？〇?反應(yīng)條件為:94°(：變性5111111;951：303,55 °C 30s，72°C 30s，30個循環(huán);72°C7min;反應(yīng)結(jié)束后各取加1反應(yīng)產(chǎn)物用于DNA的瓊脂糖凝膠 電泳，電泳膠用漠化乙錠化thidium bromid)染色5min后，在美國伯樂(Bio-Rad)凝膠成像 分析儀上拍照分析。
[0067] pagO的引物為：
[006引 pag0_F:TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0069] pag0_R：GGCAATAACTCCCGTCCA
[0070] luxR的引物為：
[0071] luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA [00。] luxR_R:TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA
[0073]血培養(yǎng)陽性組中PCR檢測結(jié)果及最終病人確診結(jié)果見表2。規(guī)定，pagO和luxR中只 要一個擴增結(jié)果為陽性即該樣本為陽性。健康人血培養(yǎng)陰性組無任何條帶擴出，均為陰性， 因此結(jié)果不在表2和表3中示出。表2中"確診結(jié)果"欄V'表示病人的最終診斷為肺炎克雷伯 菌肝脈腫，表示病人排除肺炎克雷伯菌肝脈腫診斷，為其他疾病。特異性因子欄（即"pa g爐、"luxR"、"pagO+luxR")中V'表示個標記物擴增結(jié)果為陽性，表示所檢測的因子 全陰性。
[0074] 表2血培養(yǎng)陽性組病人最終確診結(jié)果和PCR擴增結(jié)果
[0075]
[0076]
[0077]
[0078] 其中表2中，特異性因子在10號病例的血培養(yǎng)樣品中PCR結(jié)果全為陽性，但一開始 10號病例在臨床上并未診斷為肺炎克雷伯菌肝脈腫，
【申請人】懷疑因子出現(xiàn)了假陽性;但兩 周后，隨著病情進展，患者發(fā)現(xiàn)肝脈腫，確診為肺炎克雷伯菌肝脈腫，從而排除了特異性因 子假陽性結(jié)果;運個病例也說明，特異性因子具有早期診斷肺炎克雷伯菌肝脈腫的作用。
[0079] 表3血培養(yǎng)陽性組中各標記物的陽性率和假陽性率
[0080]
[0081 ] pagO在肺炎克雷伯菌肝脈腫患者的血培養(yǎng)樣品中PC郎日性率為97.37%，在非肺炎 克雷伯菌肝脈腫患者血培養(yǎng)樣品中的陽性率僅為〇%，在血培養(yǎng)陰性組的陽性率為0%; luxR在肺炎克雷伯菌肝脈腫患者的血培養(yǎng)樣品中PCR陽性率為92.11 %，在非肺炎克雷伯菌 肝脈腫患者血培養(yǎng)樣品中的陽性率為0%，在血培養(yǎng)陰性組的陽性率為0% ;pag〇+luxR在肺 炎克雷伯菌肝脈腫患者的血培養(yǎng)樣品中PCR陽性率為97.37%，在非肺炎克雷伯菌肝脈腫 患者血培養(yǎng)樣品中的陽性率僅為〇%，在血培養(yǎng)陰性組的陽性率為0%。^上結(jié)果說明pagO 和luxR在肺炎克雷伯菌肝脈腫患者血培養(yǎng)陽性標本中具有很高的特異性，可W分別或結(jié)合 作為肺炎克雷伯菌肝脈腫快速診斷的分子標志物。
【主權(quán)項】
1. 一種致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列，所述的基因特異性序列pa go 為SEQ ID N0.1 所示。2. -種致肝膿腫肺炎克雷伯菌基因特異性序列2 t/zT?，所述的基因特異性序列2 t/zT? 為SEQ ID NO .2所示。3. 基于權(quán)利要求1所述特異性序列設(shè)計的引物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的引物，其特征在于:/7 a g· 0 _F: TGCTCTTGAAACTATCCCTCC， p a M _R:GGCAATAACTCCCGTCCA〇5. 基于權(quán)利要求2所述特異性序列設(shè)計的引物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的引物，其特征在于：2 u 7? _F : CTTTGCCGGCATGGAACATA， 2 uxT? _R:TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。7. 權(quán)利要求1所述的特異性序列或權(quán)利要求3所述的引物在制備致肝膿腫肺炎克雷伯 菌檢測試劑盒中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2所述的特異性序列或權(quán)利要求5所述的引物在制備致肝膿腫肺炎克雷伯 菌檢測試劑盒中的應(yīng)用。9. 一種致肝膿腫肺炎克雷伯菌分子檢測試劑盒，包括： p a gO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC p a gO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA luxR _￥： CTTTGCCGGCATGGAACATA luxR _R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA〇
【文檔編號】C12Q1/04GK106011154SQ201610669762
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月15日
【發(fā)明人】張彥亮, 陶臻, 黃巖, 俞楊, 黃金偉, 江建平, 葉美萍
【申請人】南京市第醫(yī)院, 南京市第一醫(yī)院