一種融合基因室內(nèi)質(zhì)控品、制作方法及其固定液的配方的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種采用固定的細(xì)胞懸液制作常見融合基因室內(nèi)質(zhì)控品的方法及其固定液的配方。本發(fā)明可用于室內(nèi)質(zhì)量控制的融合基因檢測包括：BCR?ABL P210(b2a2型和b3a2型)、BCR?ABL P190、PML?RaRa(L型和S型)和AML1?ETO四種融合基因。該方法所使用的固定液價(jià)格低廉，無毒無害；一管質(zhì)控品能同時(shí)完成4種融合基因的室內(nèi)質(zhì)控，方便經(jīng)濟(jì)；而目前市場上尚無可售的融合基因質(zhì)控品，該發(fā)明填補(bǔ)了目前業(yè)內(nèi)無融合基因質(zhì)控品的空白。
【專利說明】
-種融合基因室內(nèi)質(zhì)控品、制作方法及其固定液的配方
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種采用固定的細(xì)胞懸液制作常見 融合基因室內(nèi)質(zhì)控品、制作方法及其固定液的配方。
【背景技術(shù)】
[0002] 白血病的發(fā)病率日趨升高，最近10年來的發(fā)病率幾乎是此前的兩倍。隨著醫(yī)療水 平及技術(shù)的發(fā)展，白血病的分類、治療及預(yù)后評價(jià)體系都得到了系統(tǒng)性的提升和完善。祀向 治療藥物的問世使分子診斷成為疾病診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測過程中不可或缺的一部分。其 中融合基因的檢測不僅輔助疾病分類和診斷，還與用藥及治療方案的選擇息息相關(guān)。特別 像BCR-ABL P210和BCR-A化P190融合基因，是診斷慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的特征性分子 標(biāo)志物；同時(shí)也是指導(dǎo)格列衛(wèi)等酪氨酸激酶抑制劑的祀標(biāo)，其還可發(fā)生于B系的急性淋己細(xì) 胞白血病(B-A化）；PMkRaRa是急性早幼粒細(xì)胞白血病(M3)的診斷指標(biāo)，而M3的治療是區(qū)別 于其他急性髓系白血病(AML)的;AML1-ET0融合基因也是AML的一個(gè)診斷指標(biāo)，同時(shí)也是預(yù) 后良好的一個(gè)預(yù)后指標(biāo)。
[0003] 運(yùn)些分子祀標(biāo)，同時(shí)又是診斷指標(biāo)，在臨床應(yīng)用上發(fā)揮著相當(dāng)大的作用；同時(shí)也承 載著臨床檢測需求的壓力。既然與疾病的諸多環(huán)節(jié)相關(guān)，那么其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定 性自然成為行業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)，即其質(zhì)量控制顯得尤為重要。由于國內(nèi)相關(guān)檢測起步較晚，而 融合基因檢測的目標(biāo)是RNA，一種非常容易被環(huán)境中到處充斥著的RNA酶降解的核酸，所W 用于監(jiān)控實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量的質(zhì)控物一直沒有面市。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于目前市面上尚無融合基因檢測室內(nèi)質(zhì)控品銷售，而室內(nèi)質(zhì)控又是衡量和評估 一個(gè)實(shí)驗(yàn)室檢測體系的精確度和穩(wěn)定性的重要方法和質(zhì)量指標(biāo)，故本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種配置 融合基因質(zhì)控品的方法和用于配置質(zhì)控品的固定液。
[0005] -種用于配置細(xì)胞懸液作為質(zhì)控品的固定液，包括70-75 %的無水冰乙醇和1-5 % 的冰醋酸，溶劑為水。
[0006] 更進(jìn)一步具體的方案中，所述固定液WlOOml計(jì)算，包括4°C預(yù)冷無水乙醇70ml，冰 醋酸1ml，其余為水。
[0007] 配制好后的固定液在4°C冷藏保存。
[000引所述水為選自DEPC水。所述無水乙醇和冰醋酸均選自分析純(AR)。
[0009] 本發(fā)明還提供了使用上述固定液配置融合基因室內(nèi)質(zhì)控品的方法，其包括W下步 驟：
[0010] (1)提取已知融合基因表達(dá)的樣本中的有核細(xì)胞；
[0011] 間用固定液重懸有核細(xì)胞沉淀，離屯、棄上清;再加固定液重懸，獲得融合基因室內(nèi) 質(zhì)巧品。
[0012] 若W收集的全血樣品中的白細(xì)胞配置融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，其配制方法包括W下 步驟：
[0013] (1)采用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞的方法提取已知融合基因表達(dá)的樣本中的有核 細(xì)胞。
[0014] 間用固定液重懸有核細(xì)胞沉淀，離屯、棄上清;再加固定液重懸即可。
[0015] 所述固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。
[0016] 所述 10X 紅細(xì)胞裂解液配方為：NH4C1 82g，NaHC038.4g，抓 TA-Na2 3.72g，加 d地20定容至1000ml。
[0017] 若W收集的培養(yǎng)細(xì)胞配制融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，其配制方法包括W下步驟：
[0018] (1)消化收集表達(dá)已知融合基因的培養(yǎng)細(xì)胞，離屯、棄上清。
[0019] 間用固定液重懸細(xì)胞沉淀，離屯、棄上清;再加固定液重懸。
[0020] 所述固定液包括包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。
[0021] 有核細(xì)胞可W選自BCR-ABL P210融合基因 b2a2型陽性、b3a2型陽性，BCR-A化 P190融合基因陽性，PMkRaRa融合基因 L型陽性、S型陽性和AML1-ET0融合基因陽性等樣本。 運(yùn)些有核細(xì)胞可W單獨(dú)經(jīng)固定液重懸后，配制成質(zhì)控品，也可W將它們中的兩種或兩種W 上的有核細(xì)胞經(jīng)固定液重懸后，等體積混合，備用。還可W進(jìn)一步將混合后的細(xì)胞懸液按 lOOul/份分裝備用。
[0022] 本發(fā)明還提供了用于一種融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，所述質(zhì)控品包括有核細(xì)胞和細(xì)胞 固定液，所述細(xì)胞固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。
[0023] 有核細(xì)胞可W選自BCR-ABL P210融合基因 b2a2型陽性、b3a2型陽性，BCR-A化 P190融合基因陽性，PML-RaRa融合基因 L型陽性、S型陽性和AML1-ET0融合基因陽性中等樣 本中的一種或多種。
[0024] 本發(fā)明還提供了使用上述質(zhì)控品進(jìn)行臨床檢測過程質(zhì)量控制的方法，其包括W下 步驟：
[00巧](1)取質(zhì)控品，加入1ml生理鹽水，靜置5min后離屯、棄上清。再加1ml生理鹽水洗涂一 次。
[0026] 間按實(shí)驗(yàn)室日常融合基因檢測流程，同臨床樣本一起進(jìn)行操作。
[0027] 據(jù)統(tǒng)計(jì)，BCR-A化 P210、BCR-ABL P190、PMkRaRa和ML1-ET0四種融合基因的樣本 檢測量占所有融合基因檢測量的90% W上。幾乎每一個(gè)開展融合基因檢測的實(shí)驗(yàn)室都會開 展運(yùn)四項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)室檢測的精密度和穩(wěn)定性對疾病的診斷，特別是治療后微小殘留病灶(MRD) 的監(jiān)測具有非常重要的影響。故對該四種常見融合基因檢測的質(zhì)量控制在實(shí)驗(yàn)室檢測中顯 得尤為重要。
[0028] 作為質(zhì)控品，其基本要求如下：(1)接近于臨床樣品的狀態(tài)或保存于與臨床樣品相 似的基質(zhì)中，如血清類質(zhì)控品；間穩(wěn)定性好，易于保存;如-20°C保存至少半年，最好是一年； 間處理方法和過程與臨床樣本一致，能監(jiān)控整個(gè)檢測流程;(4)對環(huán)境和人員無毒無害。作為 檢測RNA的融合基因項(xiàng)目，其質(zhì)控品的穩(wěn)定性是個(gè)難W解決的大問題。因?yàn)榭諝庵?，人的?液，皮膚等到處都存在著RNA酶，故RNA非常容易降解。穩(wěn)定RNA，保存RNA是質(zhì)控品制作的關(guān) 鍵所在。其次作為質(zhì)控品，其狀態(tài)，檢測過程需與臨床樣本保持一致，那么最接近臨床樣本 的物質(zhì)就是細(xì)胞懸液。本發(fā)明利用無水乙醇、冰醋酸及DEPC水配置固定液，一方面固定了細(xì) 胞，避免細(xì)胞之間的粘附聚集，易于均勻分裝使用;一方面其中的冰醋酸穩(wěn)定了細(xì)胞中的核 酸成分，不易變性降解。并且穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)已證明，該方法制作的細(xì)胞懸液質(zhì)控品于-20°C條 件下至少能保存9個(gè)月。而配置固定液的成分價(jià)格低廉，無毒無害，配置方法簡單，易于實(shí)驗(yàn) 室大批量配置使用。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 實(shí)施例1:
[0030] 全血有核細(xì)胞的提取及細(xì)胞懸液的固定:在1.5ml離屯、管中加入1ml IX紅細(xì)胞裂 解液，取全血樣本0.5ml，顛倒混勻。400化pm離屯、3min，吸棄上清，加紅細(xì)胞裂解液洗涂一 次，加入細(xì)胞沉淀等體積的固定液50ul，即為配置好的質(zhì)控品。
[0031] 所述固定液包括4°C預(yù)冷無水乙醇(AR)，70-75ml;冰醋酸(AR)，l-5ml ;DEPC水定容 至100ml; 4°C冷藏保存。
[0032] 實(shí)施例2:
[0033] 質(zhì)控品的RNA提?。喝?shí)施例1中質(zhì)控品加入1ml生理鹽水，靜置5min后離屯、棄上 清。再加1ml生理鹽水洗涂一次。加1 ml Total RNA Isolation Reagent,反復(fù)吹吸直至無 明顯細(xì)胞團(tuán)塊，加入氯仿200μ1，縱滿混勻30s，冰上靜置10min<a4,000巧m，4°C離屯、lOmin。 用移液器吸取上清液45化1轉(zhuǎn)移至另一離屯、管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻后在 冰上靜置10minJ4,000巧m，4°C離屯、lOmin。然后用75%的乙醇和無水乙醇分別洗涂離屯、一 次。室溫干燥5min，加入50μ1 DEPC-肥0溶解。
[0034] 實(shí)施例3:
[0035] 逆轉(zhuǎn)錄:取實(shí)施例2中RNA溶液4ul(濃度約200ng/ul)加 lul Primer mix(ReverTra Ace qPCR RT Kit)和 3ulDEPC-H20 混勻，70°C 預(yù)變性 5min;冰上驟冷 Imin 后加入 5*RT buffer4ul(ReverTra Ace qPCR RT Kit),Enzyme Mix lul(ReverTra Ace qPCR RT Kit), 并加 DEPC-H20 7ul至總體積為20ιιΚ37Γ60π?η反應(yīng)后98°C5min滅活，所得即為待檢質(zhì)控品 的cDNA。
[0036] 實(shí)施例4:
[0037] 不同配方固定液的比較實(shí)驗(yàn):按實(shí)施例1中方法提取有核細(xì)胞4份，分別加入4種不 同配方的固定液，4°C固定1天后和-20°C固定一天后分別進(jìn)行檢測。按實(shí)施例2和3中方法得 到cDNA。檢巧U4份待比較樣品的內(nèi)參A化基因，W判斷RNA是否降解。A化基因檢測的引物探針 如下表1所示；試劑配置如下表2所示；加入實(shí)施例3中所得cDNA各化1。按如下程序進(jìn)行檢 ?i:95°C預(yù)變性30s;95°C10s，58°C35s，共40個(gè)循環(huán);58°C時(shí)采集巧光。T冊NDERBI畑Probe qPCR Mix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。A化基因檢測拷貝數(shù)取L0G10后，下降值不 得>-7.5%。由所得結(jié)果可知(表3)，序號1(染色體核型分析常用配方)和序號3(本發(fā)明的 固定液)在4 °C固定1天后和-20°C固定一天后，A化內(nèi)參沒有降低，即RNA沒有降解。而序號1 由于冰醋酸含量大，具有刺激性，對工作人員的健康不利。而本發(fā)明的固定液配方則沒有運(yùn) 個(gè)問題。
[00；3 引 表1:
[0039]
[0044] 注:*配方1為染色體核型分析實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞懸液固定液，該固定液對染色體的形 態(tài)無影響;配方2為RNA提取過程中的洗涂液，可去除殘留的蛋白、鹽離子、提取試劑中殘留 的苯酪等有機(jī)物;配方3即本發(fā)明；配方4是常規(guī)病理的細(xì)胞固定液，用于細(xì)胞的固定。
[0045] 實(shí)施例5:
[0046] 不同樣品細(xì)胞間的干擾實(shí)驗(yàn):不同人的白細(xì)胞之間會發(fā)生粘附、聚集，然后其內(nèi)容 的核酸降解。由于質(zhì)控品的使用量較大，需要將同一種融合基因陽性但來自不同患者的白 細(xì)胞進(jìn)行混合。本實(shí)驗(yàn)旨在確定不同人白細(xì)胞在固定后是否會發(fā)生相互粘附而降解。按實(shí) 施例1方法獲取固定后的4份不同人員樣本，將樣品1和2進(jìn)行混合，樣品3和4進(jìn)行混合。按實(shí) 施例巧P3方法取得cDNA，按實(shí)施例4中方法檢測A化內(nèi)參基因。由所得結(jié)果(表4)可知，混合 后，內(nèi)參基因未降低，即RNA未發(fā)生降解。故本發(fā)明的固定液配方可W避免不同來源細(xì)胞 的粘附降解。
[0047]表4:
[004引
[0049] 實(shí)施例6:
[0050] 可操作性實(shí)驗(yàn)：旨在評估該類型質(zhì)控品在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室流程及不同人員操作過程中 產(chǎn)生的誤差是否能滿足作為質(zhì)控品的穩(wěn)定性要求。按實(shí)施例1配置6份BCR-A化P210陽性的 質(zhì)控品；選兩名實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員A和B，按照實(shí)施例2和3方法獲取cDNA，檢測BCR-ABL P210和 ABL，統(tǒng)計(jì)偏倚率。BCR-ABL P210的引物探針如下表5所示;試劑配置如下表6所示;A化檢測 按實(shí)施例4進(jìn)行，各加入所得cDNA各化1。按如下程序進(jìn)行檢測:95°C預(yù)變性30s; 95 °C 10s，58 °C35s，共40個(gè)循環(huán);58°C時(shí)采集巧光。BCR-A化P210和A化基因檢測拷貝數(shù)取LOGIO后，偏倚 不得>±7.5%。由所得結(jié)果(表7)可知，兩名技術(shù)員分別進(jìn)行質(zhì)控品檢測后，其偏倚率在要 求范圍內(nèi)。即該類型質(zhì)控品的可操作性符合其作為質(zhì)控品的要求。
[0化1] 表5:
[0化2]
[0化6] 表7: 「00571
[0化引實(shí)施例7:
[0059] 保存穩(wěn)定性及臨床適用性實(shí)驗(yàn)：
[0060] 選取已知BCR-A化P210b2a2型和b3a2型陽性樣品各兩份、BCR-ABL P190陽性樣品 4份、PMkRaRa L型和S型陽性樣品各4份;AML1-ET0陽性樣品2份，按實(shí)施例1方案制備成固 定的細(xì)胞懸液。取6種融合型別陽性的細(xì)胞懸液各300ul，混勻后lOOul/管分裝好，-20±2°C 保存?zhèn)溆?。制備成的常見融合基因室?nèi)質(zhì)控品。
[0061] 按配置好后當(dāng)天，一周，兩周，一個(gè)月，兩個(gè)月，Ξ個(gè)月，6個(gè)月和9個(gè)月等時(shí)間點(diǎn)進(jìn) 行保存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。質(zhì)控品檢測方法同實(shí)施例2進(jìn)行RNA提取;檢測采用成品試劑盒，來自上 海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司，W驗(yàn)證該質(zhì)控品是否適用于經(jīng)CFDA認(rèn)證的成品檢測系統(tǒng)進(jìn) 行室內(nèi)質(zhì)量控制使用。試劑配置如表8.每個(gè)PCR反應(yīng)管中加15U1RNA;按如下程序進(jìn)行檢測： 42°C30min;94°C預(yù)變性5min;94°C15s，60°C60s，共40個(gè)循環(huán);60°C時(shí)采集巧光。檢測所得拷 貝數(shù)取L0G10后，偏倚不>±7.5%，則認(rèn)為質(zhì)控品仍在有效范圍內(nèi)，若某次偏離范圍，則再 取一管重新檢測W排除偶然因素。由所得結(jié)果(表9)可知，-20±2°C保存9個(gè)月后，質(zhì)控品仍 穩(wěn)定可使用。且該質(zhì)控品適用于市面上的成品檢測試劑盒。
[0062] 表8:
[0063]
[0067] 注:沖210包含b2a2和b3a2兩種型別。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于配置細(xì)胞懸液作為質(zhì)控品的固定液，其特征在于，包括70-75%的冰乙醇和 1-5%的冰醋酸，溶劑為水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定液，其特征在于，包括70 %的冰乙醇和1 %的冰醋酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定液，其特征在于，所述的水為DEPC水。4. 配置融合基因室內(nèi)質(zhì)控品的方法，其包括以下步驟： ⑴提取已知融合基因表達(dá)的樣本中的有核細(xì)胞； ⑵用固定液重懸有核細(xì)胞沉淀，離心棄上清;再加固定液重懸，獲得融合基因室內(nèi)質(zhì)控 品； 所述固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 以收集的全血樣品中的白細(xì)胞配置融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，其配制方法包括以下步驟： ⑴采用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞的方法提取已知融合基因表達(dá)的樣本中的有核細(xì)胞； ⑵用固定液重懸有核細(xì)胞沉淀，離心棄上清;再加固定液重懸。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述紅細(xì)胞裂解液配方為：NH4C1 82g， NaHC038 · 4g，EDTA-Na2 3 · 72g，加 ddH20定容至 1000ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 以收集的培養(yǎng)細(xì)胞配制融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，其配制方法包括以下步驟： ⑴消化收集表達(dá)已知融合基因的培養(yǎng)細(xì)胞，離心棄上清； ⑵用固定液重懸細(xì)胞沉淀，離心棄上清;再加固定液重懸。8. 根據(jù)權(quán)利要求4至8之一所述的方法，其特征在于，所述有核細(xì)胞選自BCR-ABL P210 融合基因 b2a2型陽性、b3a2型陽性，BCR-ABL P190融合基因陽性，PML-RaRa融合基因 L型陽 性、S型陽性和AML1-ETO融合基因陽性中的一種或多種。9. 一種融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，包括有核細(xì)胞和細(xì)胞固定液，其特在在于，所述細(xì)胞固定 液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。10. 使用權(quán)利要求9所述的質(zhì)控品進(jìn)行臨床檢測過程質(zhì)量控制的方法，其包括以下步 驟： ⑴取質(zhì)控品，加入lml生理鹽水，靜置5min后離心棄上清。再加 lml生理鹽水洗滌一次； ⑵按實(shí)驗(yàn)室日常融合基因檢測流程，同臨床樣本一起進(jìn)行操作。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011240SQ201610345672
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】鄒媛, 陳紅梅, 夏成青
【申請人】合肥艾迪康臨床檢驗(yàn)所有限公司