用于‘秋綠芥藍’雜交種子純度鑒定的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定 ‘秋綠芥藍’雜交種子純度的 SSR 分子標記組，SSR分子標記組由BOE456和BOE622組成。利用該分子標記組中的BOE456和BOE622的引物序列進行PCR驗證，可對‘秋綠芥藍’雜交種子和其母本、父本種子進行有效區(qū)分，快速、準確檢測出雜交種子純度。本方法具有快速、準確、低成本、操作簡單等優(yōu)點。
【專利說明】
用于‘秋綠芥藍’雜交種子純度鑒定的引物及方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及分子檢測領域，具體涉及一種用于‘秋綠芥藍’雜交種子純度鑒定的引物及方法。
【背景技術】
[0002]芥藍是起源于華南地區(qū)的一種特色葉菜，為甘藍的一個變種?！锞G芥藍’是以612早為母本(自交不親和系)，Sb06F為父本育成的一代雜交種。具有生長勢強，產量高，抗病抗逆型強的特點。是華南地區(qū)推廣面積較多的品種。但是由于有限的親本資源以及雜交品種的不斷涌現，使得品種間，尤其是雜交品種之間的遺傳差異越來越小，蔬菜種子的真實性與品種純度鑒定也越來越難，加之‘秋綠芥藍’是利用自交不親和系配制而成的雜交一代，母本在制種過程中有少量的自交結實率，常常會出現假雜種，導致種子純度下降，給生產造成巨大損失。為了避免這種損失，需要對種子的純度和真?zhèn)芜M行鑒定。目前品種的純度和真?zhèn)舞b定是以形態(tài)學標記為依據，這種鑒定方法雖然從農業(yè)生產角度具有穩(wěn)定可靠的優(yōu)點，但是在大規(guī)模檢測中存在耗時較多，錯誤率較高的缺點，因而不利于大規(guī)模推廣。
[0003]因此為了保證優(yōu)良品種發(fā)產生最大的經濟效益，因此一種快速、準確、有效的品種鑒定方法非常重要。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于利用SSR分子標記技術提供一種用于快速、準確鑒定“秋綠芥藍”雜交種子純度的引物及方法。
[0005]本發(fā)明所采取的技術方案是:一種用于鑒定‘秋綠芥藍’雜交種子純度的SSR分子標記組，SSR分子標記組由B0E456和B0E622組成。
[0006]優(yōu)選的，SSR分子標記B0E456的引物對序列如下所示:
B0E456-F: 5’- GATGCTTTCGTTTCTGGTGATGG -3’(SEQ ID NO:3)
B0E456-R: 5’- TCTGATTGTGGCTGCTGGTATGTT-3’(SEQ ID NO:4)。
[0007]優(yōu)選的，SSR分子標記B0E622的引物對序列如下所示:
B0E622-F: 5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT -3’ (SEQ ID NO:5)
B0E622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT -3’ (SEQ ID NO:6)。
[0008]—種用于‘秋綠芥藍’雜交種子純度鑒定的方法，包括如下步驟:
1)提取芥藍幼苗基因組DNA;
以芥藍基因組DNA為模板，使用B0E456和/或B0E622的SSR引物進行PCR擴增；
2)對擴增的產物進行凝膠電泳；
對電泳結果進行分析，只有同時具有親本特異性條帶的單株為雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種。
[0009]本發(fā)明的有益效果是:將‘秋綠芥藍’雜交種子與其母本、父本種子區(qū)分開來，快速檢測出雜交種子的純度。本方法具有快速、準確、低成本，操作簡單等優(yōu)點，能夠替代傳統(tǒng)雜交種子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應用價值。
【附圖說明】
[0010]圖1為引物B0E456‘秋綠芥藍’種子純度鑒定PCR產物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜(Pl:母本a ；P2:父本b:Fl為雜交一代種子)；
圖2為引物B0E622‘秋綠芥藍’種子純度鑒定PCR產物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，其中I孔為M，2孔父本，3孔母本，其它15株分別是雜交種的1-15個單株；
圖3為‘秋綠芥藍，商品種種植后取葉片DNA進行電泳跑膠的圖片，其中I孔為Marker，2孔父本，3孔母本，其它20株分別是雜交種的1-20個單株，其中19株為假雜種。
【具體實施方式】
[0011]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0012]實施例1‘秋綠芥藍’雜交種子純度檢測方法的建立
1、篩選純度鑒定的SSR引物。
[0013]從所公布的甘藍SSR引物及EST-SSR引物在雙親間進行篩選，選出共顯性差異標記條帶的兩對引物序列如下所示:
B0E456-F: 5’- GATGCTTTCGTTTCTGGTGATGG -3’(SEQ ID NO:3)
B0E456-R: 5’- TCTGATTGTGGCTGCTGGTATGTT-3’(SEQ ID NO:4)
B0E622-F: 5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT-3’(SEQ ID NO:5)
B0E622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT-3’(SEQ ID NO:6)
二種標記帶型清晰、重復性好。引物能產生的母本特異性標記和的父本特異性標記。
[0014]2、利用上述特異性引物對‘秋綠芥藍’雜交種子進行純度鑒定。
[0015](I)芥藍DNA的提取
實驗材料為‘秋綠芥藍’商品種及其母本、父本幼嫩真葉DNA ο步驟如下:
①用液氮在2ml的離心管內用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時迅速加入100yL 2%CTAB提取緩沖液，混勻后置于65°C水浴中溫浴50min(每隔5min搖動一次)。
[0016]②靜置至室溫后在4°C下12000rpm離心lOmin，將上清(約800yL)轉移到新的2ml離心管。
[0017]③加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1),顛倒混勻，靜置3_5分鐘，在4°C下12000rpm離心lOmin，將上清液轉入新的1.5mI離心管中。
[0018]④加2/3體積340yL預冷的異丙醇，緩慢混勻(緩慢顛倒20次)，置于一20°C下培養(yǎng)30mino
[0019]⑤在4°C下13000rpm離心10111；!_11，棄上清，加入200-30(^1^預冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀(兩次)，微干。
[0020]⑥加入10yL無菌水溶解。
[0021](2)SSR-PCR 擴增:
PCR 體系(20yL)
DNA 模板:5ng引物-F:0.25 mmol.L—1引物-R:0.25 mmol.L—1dNTP^^mmol-r1Mg2+:0.15mmo1.L—11XPCR buffe: 2.0yLTaq酶:0.2UddH20補足至20yLPCR擴增程序
94°C預變性5min后，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸40s，35個循環(huán)后，72°C保持7min，然后置于4°C保存待檢測。
[0022](3)凝膠電泳
擴增產物在雙垂直非變性濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，120V穩(wěn)壓1.5個小時，電泳結束后進行0.l%AgN03銀染15min ；銀染后用2%Na0H、0.4%甲醛、0.04%Na2C03顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。
[0023](4)擴增結果
兩種引物在‘秋綠芥藍’父母本及雜交種子分別能擴增出兩條特異帶;其中B0E456引物母本Pl擴增出的a條帶，母本p2號擴增出b的條帶(見圖1);B0E622引物擴增出來的條帶如圖2所示。
[0024]回收B0E456引物擴增出來的特異條帶，送上海生物工程有限公司測序。條帶的序列如SEQ ID NO: 1-2所示，雜交種子中與父本、母本擴增產物的序列相符。
[0025]實施例2檢測準確度驗證
采用實施例1的方法對從白云基地的種子純度鑒定田取的100株‘秋綠芥藍’，對其單株編號，提取單株DNA進行檢測(部分電泳圖見圖3)，種子純度為99%，與田間調查結果一致，準確率為100%。
[0026]以上實施例表明，本發(fā)明的方法可將‘秋綠芥藍’雜交種子與其父母本種子進行有效區(qū)分，快速、準確檢測出種子純度。并且選取任何一個引物均能準確鑒別。
【主權項】
1.一種用于鑒定‘秋綠芥藍’雜交種子純度的SSR分子標記組，SSR分子標記組由B0E456和B0E622組成，SSR分子標記B0E456包括母本612早和父本Sb06F，其母本612早的核苷酸序列如SEQ ID勵:1所示，父本51306?的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，SSR分子標記 B0E622可由引物對:B0E622-F:5’_ GTCTCGCTCGCCTAACACTT -3 ’ 和 B0E622-R: 5’-AGAGCGGGAGGAGGGATGGT -3 ’ 擴增得到。2.—種用于鑒定‘秋綠芥藍’雜交種子純度的引物組，由用于擴增SSR分子標記B0E456的弓I物對和用于擴增SSR分子標記B0E622的弓I物對共同組成。3.根據權利要求2所述的引物組，其特征在于:SSR分子標記B0E456的引物對序列如下所示: B0E456-F: 5’- GATGCTTTCGTTTCTGGTGATGG -3’(SEQ ID NO:3) B0E456-R: 5’- TCTGATTGTGGCTGCTGGTATGTT-3’(SEQ ID NO:4)。4.根據權利要求2或3所述的引物組，其特征在于:SSR分子標記B0E622的引物對序列如下所示: B0E622-F: 5’- GTCTCGCTCGCCTAACACTT -3’ (SEQ ID NO:5) B0E622-R: 5’- AGAGCGGGAGGAGGGATGGT -3’ (SEQ ID NO:6)。5.—種用于‘秋綠芥藍’雜交種子純度鑒定的方法，包括如下步驟: 提取芥藍幼苗基因組DNA; 以芥藍基因組DNA為模板，使用權利要求3和/或4所述的SSR引物進行PCR擴增； 對擴增的產物進行凝膠電泳； 對電泳結果進行分析，只有同時具有親本特異性條帶的單株為雜交種，缺少其中的任意一條帶記為假雜種。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011280SQ201610578398
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月21日
【發(fā)明人】陳漢才, 李桂花, 王亭亭, 張艷, 黎庭耀
【申請人】廣東省農業(yè)科學院蔬菜研究所