一種基于實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)快速篩查黃瓜中病原微生物的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)快速篩查黃瓜中病原微生物的方法，該方法結(jié)合傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法，以水煮法提取選擇性增菌后黃瓜中沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和單增李斯特氏菌的細(xì)菌基因組DNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)四種食源性致病菌進(jìn)行快速篩查。本發(fā)明采用的DNA提取方法，30min內(nèi)即可完成樣品DNA提取的全過(guò)程，實(shí)時(shí)熒光PCR方法，90min內(nèi)可完成樣品的全過(guò)程鑒定，具有高效、快速、實(shí)時(shí)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，為生鮮果蔬黃瓜中食源性致病菌的快速篩查提供了技術(shù)支撐。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種基于實(shí)時(shí)黃光PCR技術(shù)快速篩查黃瓜中病原微生物的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品微生物鑒定與應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及生鮮果蔬黃瓜中沙口氏 菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157 :H7和單增李斯特氏菌四種食源性致病菌的DNA提取及 實(shí)時(shí)巧光快速篩查方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 即食生鮮蔬菜和水果是食源性致病菌傳播的主要載體之一。即食生鮮蔬果屬于低 酸性食品，具有較高的含水量，同時(shí)含有多種營(yíng)養(yǎng)元素不耐高溫，因此消費(fèi)者在食用時(shí)往往 不烹調(diào)，簡(jiǎn)單清洗后便直接食用，由此極易招致病原微生物的侵染，存在食用安全隱患?，F(xiàn) 已有報(bào)道污染即食蔬果的食源性致病菌有:大腸桿菌0157 :H7、沙口氏菌、金黃色葡萄球菌 和單增李斯特氏菌等。然而，即食生鮮蔬果中食源性致病菌的分布具有不確定性和難控制 性，我國(guó)雖自2003年開(kāi)始啟動(dòng)了多種食源性致病菌的監(jiān)測(cè)計(jì)劃，但仍缺乏即食蔬菜水果中 致病菌污染水平的系統(tǒng)完整的統(tǒng)計(jì)資料。
[0003] 黃瓜（cucumber)作為即食蔬菜中較為常見(jiàn)的蔬菜品種之一，深受廣大消費(fèi)者喜 愛(ài)。黃瓜在種植、采收、膽藏、運(yùn)輸和銷(xiāo)售的過(guò)程中表面都有可能受到各種微生物的污染，而 在整個(gè)過(guò)程中如果完整性遭到破壞容易使汁液營(yíng)養(yǎng)物外流，運(yùn)無(wú)疑又加大了微生物感染的 幾率。因此，雖然中國(guó)還沒(méi)有出現(xiàn)食用生鮮蔬果而發(fā)生集體安全事件的案例，但其潛在的食 用安全隱患較大，那么，防治就顯得尤為重要。針對(duì)即食蔬果從農(nóng)田到餐桌的產(chǎn)業(yè)鏈，可通 過(guò)采收前、采后運(yùn)輸、流通銷(xiāo)售和產(chǎn)品膽藏等四個(gè)階段控制生鮮蔬果的微生物污染。
[0004] 因此，亟需針對(duì)即食生鮮蔬菜水果中的病原微生物展開(kāi)調(diào)查及安全性評(píng)估，確定 風(fēng)險(xiǎn)隱患和危害程度，為風(fēng)險(xiǎn)交流與管理、科普宣傳與解答公眾疑慮提供科學(xué)依據(jù)，并增加 民眾對(duì)致病菌的認(rèn)知、自覺(jué)采取安全的家庭加工和食用方式的意識(shí)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于在大樣本篩查生鮮黃瓜中的食源性致病菌時(shí)能夠快速、簡(jiǎn)便的 得到篩查結(jié)果，在第一時(shí)間控制食源性致病菌的蔓延，為食品安全突發(fā)事件爭(zhēng)取有效的時(shí) 間。本發(fā)明的快速篩查方法具有高效、快速、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術(shù)方案：
[0007] -種基于實(shí)時(shí)巧光PCR技術(shù)快速篩查黃瓜中病原微生物的方法，其特征在于它按 如下步驟進(jìn)行：
[000引（1)吸取選擇性增菌后的沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157 :H7和單增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL離屯、管中，13200rpm離屯、lOmin，棄上清，沉淀溶于10化L去離 子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin，取出后迅速冷凍于-20°C冰箱中l(wèi)Omin，去掉封口膜， 13200巧m離屯、3min，上清即為DNA;
[0009] (2)采用實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增引物及探針引物，對(duì)四種食源性致病菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；
[0010] 其中的實(shí)時(shí)巧光PCR反應(yīng)體系為20化，各成分含量為：2 XMix預(yù)混液10化，上下游 引物各化L，探針引物0.化L，R0X 0.化L，模板化L，無(wú)菌超純水補(bǔ)足20化，混勻后離屯、，在實(shí) 時(shí)巧光PCR儀上開(kāi)始循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為:95°C預(yù)變性lOmin，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為 95°(：變性153,60°(：退火1111111。
[0011] 本發(fā)明所述的快速鑒定方法，其中四種食源性致病菌指的是:沙口氏菌、金黃色葡 萄球菌、大腸桿菌0157: H7和單增李斯特氏菌。
[0012] 為了能更加清楚的說(shuō)明本發(fā)明的快速篩查方法，下面W生鮮果蔬黃瓜為樣本實(shí) 例，對(duì)本發(fā)明的快速篩查方法加 W說(shuō)明。
[OOU] -、材料和引物
[0014] (1)樣品：30份黃瓜樣品，由農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)置。
[0015] (2)主要儀器:高速冷凍離屯、機(jī)，實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增儀，恒溫水浴鍋。
[0016] (3)主要試劑：
[0017] PCR引物、探針由上海生工公司合成，引物序列見(jiàn)表1。
[001 引 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)試劑購(gòu)自TaKaRa公司。
[0019] 表1食源性致病菌鑒定定量PCR引物序列
[0020]
[0021] 二、生鮮果蔬黃瓜中食源性病原菌DNA提取
[0022] (1)稱取黃瓜樣品25g，按照國(guó)標(biāo)GB 4789各致病菌檢測(cè)方法進(jìn)行選擇性增菌；
[0023] (2)吸取選擇性增菌后的沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157:H7和單增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL離屯、管中，13200巧m離屯、lOmin，棄上清；
[0024] (3)沉淀溶于1(Κ)化去離子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin;
[0025] (4)取出后迅速冷凍于-20 °C冰箱中1 Omin;
[0026] (5)去掉封口膜，13200巧m離屯、3min，上清即為DM。
[0027] Ξ、黃瓜食源性致病菌DM的實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增篩查試驗(yàn)：
[002引1、PCR反應(yīng)體系組成：
[00巧]2XPremix Ex Taq(Probe qPCRHOyL，上游和下游引物 10皿ol/L各化L，探針 10μ mol/L，0.化L，R0X，0.化L，供試黃瓜細(xì)菌基因組DM模板，2yL，雙蒸水補(bǔ)足20μ1^;
[0030] 2、PCR反應(yīng)程序：
[0031] 95Γ預(yù)變性 10min;40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95Γ，15sec;6(TC，lmin);
[0032] 3、實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增結(jié)果：
[0033] 通過(guò)擴(kuò)增曲線的有無(wú)及Ct值的大小，判斷食源性病原菌的檢出與否，結(jié)果見(jiàn)附圖 1。擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性的樣品，再進(jìn)行進(jìn)一步的生化鑒定。
[0034] 本發(fā)明具有的積極效果在于：
[0035] (1)采用分子生物學(xué)鑒定方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相結(jié)合，有效的克服了因傳統(tǒng)方法 費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、繁瑣、且檢測(cè)周期過(guò)長(zhǎng)，難W滿足應(yīng)急預(yù)案處理的需要。
[0036] (2)本方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于其過(guò)程快速，簡(jiǎn)便，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，充分提高了生鮮果蔬黃 瓜中食源性致病菌鑒定的檢測(cè)效率。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定過(guò)程需要將近1周的時(shí)間相比，采用 本方法，2天即可完成樣本篩查的全過(guò)程。
[0037] (3)采用本發(fā)明方法對(duì)黃瓜樣品進(jìn)行篩查，一次性可篩查的樣本量相比傳統(tǒng)培養(yǎng) 法可大大提局。
【附圖說(shuō)明】：
[0038] 圖1為黃瓜樣品中四種食源性致病菌篩查鑒定的實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增圖譜;如圖標(biāo)注 分別為黃瓜樣品；陽(yáng)性對(duì)照樣本;空白對(duì)照樣本；
[0039] 圖2為普通綠黃瓜樣品中四種食源性致病菌篩查鑒定的實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增圖譜;如 圖標(biāo)注分別為普通綠黃瓜樣品；陽(yáng)性對(duì)照樣本;空白對(duì)照樣本；
[0040] 圖3為旱黃瓜樣品中四種食源性致病菌篩查鑒定的實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增圖譜;如圖標(biāo) 注分別為旱黃瓜樣品；陽(yáng)性對(duì)照樣本;空白對(duì)照樣本；
[0041] 圖4為荷蘭黃瓜樣品中四種食源性致病菌篩查鑒定的實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增圖譜;如圖 標(biāo)注分別為荷蘭黃瓜樣品；陽(yáng)性對(duì)照樣本;空白對(duì)照樣本；
【具體實(shí)施方式】
[0042] 為了能更加清楚的說(shuō)明本發(fā)明的方法，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描 述。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] W普通綠黃瓜為樣本，采用本發(fā)明方法快速篩查四種食源性致病菌。制備方法如 下：
[0045] (1)稱取黃瓜樣品25g，按照國(guó)標(biāo)GB 4789各致病菌檢測(cè)方法進(jìn)行選擇性增菌；
[0046] (2)吸取選擇性增菌后的沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157 :H7和單增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL離屯、管中，13200rpm離屯、lOmin，棄上清;沉淀溶于10化L去離 子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin;取出后迅速冷凍于-20°C冰箱中l(wèi)Omin;去掉封口膜， 13200巧m離屯、3min，上清即為DNA。
[0047] 實(shí)時(shí)巧光PCR檢測(cè)：
[0048] 1、對(duì)四種食源性致病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增，引物序列為：
[0049] SM-F:5 '-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3 '
[0050] SM-R:5 '-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3，
[0化 1 ] SM-P:5 '-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3 '
[0化 2 ]肝-F:5 '-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-3 '
[005；3 ]肝-R: 5 ' -GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3，
[0054] JP-P: 5 ' -FM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-TMRA-3 '
[0055] 0157:H7-F:5 '-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3 '
[0056] 0157:H7-R:5 '-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3 '
[0057] 0157:H7-P:5 '-FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-TAMRA-3 '
[0 化引 LST-F: 5 ' -CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3 '
[0059] LST-R:5 '-CGCGACCGAAGCCAACTA-3 '
[0060] LST-P:5 '-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-3 '
[0061] 2、反應(yīng)體系：
[0062] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCRHOyL，上游和下游引物 10皿ol/L各化L，探針 10μ mol/L，0.化L，R0X，0.化L，供試普通綠黃瓜細(xì)菌基因組DM模板，2yL，雙蒸水補(bǔ)足20yL。
[0063] 3、反應(yīng)程序：
[0064] 95°C預(yù)變性 10min;40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95°C，15sec;60°C，lmin);
[0065] 4、結(jié)果:普通綠黃瓜實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0066] 實(shí)施例2
[0067] W旱黃瓜為樣本，采用本發(fā)明方法快速篩查四種食源性致病菌。制備方法如下：
[0068] (1)稱取黃瓜樣品25g，按照國(guó)標(biāo)GB 4789各致病菌檢測(cè)方法進(jìn)行選擇性增菌；
[0069] (2)吸取選擇性增菌后的沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157 :H7和單增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL離屯、管中，13200rpm離屯、lOmin，棄上清;沉淀溶于10化L去離 子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin;取出后迅速冷凍于-20°C冰箱中l(wèi)Omin;去掉封口膜， 13200巧m離屯、3min，上清即為DNA。
[0070] 實(shí)時(shí)巧光PCR檢測(cè)：
[0071] 1、對(duì)四種食源性致病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增，引物序列為：
[0072] SM-F:5 '-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3 '
[0073] SM-R:5 '-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3，
[0074] SM-P:5 '-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3 '
[00 巧]肝-F:5 '-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-3 '
[0076] 肝-R:5 '-GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3 '
[0077] 肝-P:5 '-FAM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-TAMRA-3 '
[007引 0157:H7-F:5 '-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3 '
[00 巧]0157:H7-R:5 '-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3 '
[0080] 0157:H7-P:5，-FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-TAMRA-3 '
[0081 ] LST-F:5 '-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3 '
[0082] LST-R:5，-CGCGACCGAAGCCAACTA-3 '
[0083] LST-P:5，-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-3 '
[0084] 2、反應(yīng)體系：
[0085] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCRHOyL，上游和下游引物 10皿ol/L各化L，探針 10μ mol/L，0.化L，R0X，0.化L，供試普通綠黃瓜細(xì)菌基因組DM模板，2yL，雙蒸水補(bǔ)足20yL。
[00化]3、反應(yīng)程序：
[0087] 95°C預(yù)變性 10min;40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95°C，15sec;60°C，lmin);
[0088] 4、結(jié)果:普通綠黃瓜實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0089] 實(shí)施例3
[0090] W荷蘭黃瓜為樣本，采用本發(fā)明方法快速篩查四種食源性致病菌。制備方法如下：
[0091] (1)稱取黃瓜樣品25g，按照國(guó)標(biāo)GB 4789各致病菌檢測(cè)方法進(jìn)行選擇性增菌；
[0092] (2)吸取選擇性增菌后的沙口氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌0157:H7和單增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL離屯、管中，13200rpm離屯、lOmin，棄上清;沉淀溶于10化L去離 子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin;取出后迅速冷凍于-20°C冰箱中l(wèi)Omin;去掉封口膜， 13200巧m離屯、3min，上清即為DNA。
[0093] 實(shí)時(shí)巧光PCR檢測(cè)：
[0094] 1、對(duì)四種食源性致病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增，引物序列為：
[00 巧]SM-F:5 '-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3 '
[00化]SM-R:5 '-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3，
[0097] SM-P:5 '-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3 '
[009引 肝-F:5 '-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-3 '
[0099] 肝-R:5 '-GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3 '
[0100] JP-P: 5 ' -FM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-TMRA-3 '
[0101] 0157:H7-F:5 '-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3 '
[0102] 0157:H7-R:5 '-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3 '
[0103] 0157:H7-P:5 '-FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-TAMRA-3 '
[0104] LST-F:5 '-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3 '
[0105] LST-R:5 '-CGCGACCGAAGCCAACTA-3 '
[0106] LST-P:5 '-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-3 '
[0107] 2、反應(yīng)體系：
[010引 2XPremix Ex Taq(Probe qPCRHOyL，上游和下游引物 10皿ol/L各化L，探針 10μ mol/L，0.化L，R0X，0.化L，供試普通綠黃瓜細(xì)菌基因組DM模板，2yL，雙蒸水補(bǔ)足20yL。
[0109] 3、反應(yīng)程序：
[0110] 95°C 預(yù)變性 10min;40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95°C，15sec;60°C，lmin);
[0111] 4、結(jié)果:普通綠黃瓜實(shí)時(shí)巧光PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定四種食源性致病菌的PCR擴(kuò)增引物及探針引物，其特征在于，包括沙門(mén)氏菌 引物正向序列：5' -GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3'，反向序列：5' -AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3'， 探針序列：57 -FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3';金黃色葡萄球菌引物正向 序列：5 7 - TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-37，反向序列：57 -GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3'，探針序列：5' -FAM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-TAMRA-3';大腸桿菌0157: H7引物正向序列：5' -TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3'，反向序列： 57 -ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-37，探針序列：57 - FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-TAMRA-3';單增李斯特氏菌引物正向序列：57 -CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3'，反向序列:57 -CGCGACCGAAGCCAACTA-3'，探針序列：57 -FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-37 〇2. -種基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)快速篩查黃瓜中病原微生物的方法，其特征在于它按如 下步驟進(jìn)行： (1) 吸取選擇性增菌后的沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌〇157:H7和單增李斯特 氏菌的增菌液各lmL于2mL離心管中，13200rpm離心10min，棄上清，沉淀溶于100yL去離子水 中，封口膜封好，沸水浴lOmin，取出后迅速冷凍于-20 °C冰箱中l(wèi)Omin，去掉封口膜， 13200rpm離心3min，上清即為DNA; (2) 采用實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增引物及探針引物，對(duì)四種食源性致病菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增； 其中的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為20yL，各成分含量為：2 X Mix預(yù)混液10yL，上下游引物 各lyL，探針引物0.4yL，R0X 0.4yL，模板2yL，無(wú)菌超純水補(bǔ)足20yL，混勻后離心，在實(shí)時(shí)熒 光PCR儀上開(kāi)始循環(huán)。循環(huán)參數(shù)為:95 °C預(yù)變性lOmin，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為95 °C 變性 15s，60°C 退火 lmin。3. 利要求1、2所述的快速鑒定方法，其中四種食源性致病菌指的是:沙門(mén)氏菌、金黃色 葡萄球菌、大腸桿菌0157: H7和單增李斯特氏菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/14GK106011297SQ201610628283
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月30日
【發(fā)明人】趙新, 蘭青闊, 王永, 陳銳, 朱珠, 劉娜, 王成
【申請(qǐng)人】天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所