一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的引物、試劑盒及其方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的引物、試劑盒及其方法，該引物包括Vp1?B1基因分子標(biāo)記的2條正向引物和1條反向引物，TaPHS1基因分子標(biāo)記的1條正向引物和1條反向引物，PM19?A1基因分子標(biāo)記的1條正向引物和1條反向引物，通過(guò)兩次PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳實(shí)現(xiàn)的。第一次PCR反應(yīng)中用三對(duì)引物對(duì)全部待測(cè)材料進(jìn)行檢測(cè)，第二次PCR反應(yīng)中用一對(duì)引物對(duì)第一次PCR反應(yīng)中不能很好區(qū)分的材料進(jìn)行檢測(cè)。綜合兩次PCR可明確鑒定全部主效休眠等位基因，利用含有多對(duì)引物組合的第一次PCR反應(yīng)可明確鑒定三個(gè)主效休眠位點(diǎn)的強(qiáng)休眠等位基因。本發(fā)明為小麥品種資源和育種群體后代休眠等位基因的有效鑒定和選擇提供一種簡(jiǎn)單、快速和準(zhǔn)確的方法。
【專利說(shuō)明】
-種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的引物、試劑盒及其 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種通量鑒定小麥種子主效休眠基 因的引物、試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 穗發(fā)芽(Pre-harvest sprouting,簡(jiǎn)稱PHS)是指收獲前遇到陰雨天氣時(shí)巧粒在穗 上發(fā)芽的現(xiàn)象，是一種世界性的氣候農(nóng)業(yè)災(zāi)害。穗發(fā)芽不僅降低產(chǎn)量而且嚴(yán)重劣化巧粒品 質(zhì)和種用價(jià)值。我國(guó)長(zhǎng)江中下游、西南冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)是穗發(fā)芽危害頻繁和嚴(yán)重的地 區(qū)，黃淮和北部冬麥區(qū)也時(shí)有發(fā)生，受穗發(fā)芽危害的麥區(qū)約占全國(guó)小麥總面積的83%，對(duì)小 麥的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)生產(chǎn)極為不利。選育和推廣抗穗發(fā)芽小麥品種是解決運(yùn)一問(wèn)題的最有效途 徑。
[0003] 穗發(fā)芽是受遺傳基因控制和環(huán)境因素影響的復(fù)雜數(shù)量性狀。巧粒休眠特性是影響 小麥穗發(fā)芽抗性的主要遺傳因素。國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用不同的遺傳分析群體，在2B、2D、3A、3B、 30、44、48、40和70等染色體上定位出了多個(gè)控制小麥巧粒休眠的9化位點(diǎn)(數(shù)量性狀遺傳位 點(diǎn)），并建立了與基因位點(diǎn)連鎖的分子標(biāo)記。近年來(lái)的研究表明，位于染色體3化、3AS和4AL 的3個(gè)QTL位點(diǎn)是控制巧粒休眠的主效基因，與小麥種質(zhì)資源的穗發(fā)芽性狀密切相關(guān)。染色 體3化上的種子特異性的轉(zhuǎn)錄因子化1-B1，在促進(jìn)種子成熟和維持胚休眠方面發(fā)揮重要作 用。目前已報(bào)道化1-B1基因位點(diǎn)的突變類型（等位基因）有6個(gè)，編號(hào)分別為化1-Bla~化1- Blaf。該基因等位變異與小麥種子休眠關(guān)系緊密，攜有化1-Bla的品種休眠性最差，表現(xiàn)穗 發(fā)芽敏感；攜有Vpl-Blb和Vpl-Blf的品種休眠性強(qiáng)，表現(xiàn)抗穗發(fā)芽。位于染色體3AS上的 化PHS1基因具有促進(jìn)種子休眠的作用，該基因內(nèi)含子3區(qū)域發(fā)生的單堿基突變導(dǎo)致功能缺 失的翻譯蛋白，含有該突變等位基因的品種巧粒休眠性降低，表現(xiàn)易穗發(fā)芽。目前報(bào)道的 化PHS1等位基因有2個(gè)，分別控制種子的強(qiáng)、弱休眠特性。位于染色體4AL的PM19-A1基因編 碼受脫落酸ΑΒΑ誘導(dǎo)的質(zhì)膜蛋白19,是種子休眠的正向調(diào)控因子，有些品種在該基因啟動(dòng)子 區(qū)發(fā)生18bp核巧酸片段的缺失，導(dǎo)致種子休眠性降低、易穗發(fā)芽;含有該18bp核巧酸片段的 等位基因的品種則休眠性強(qiáng)、抗穗發(fā)芽。
[0004] 研究表明，在多季節(jié)、多環(huán)境條件下，上述主效基因能解釋絕大部分的小麥種子休 眠變異和穗發(fā)芽表型變異。通過(guò)聚合優(yōu)良抗性基因的分子育種手段提高種子休眠性，培育 抗穗發(fā)芽品種，是降低小麥穗發(fā)芽危害的最有效途徑。目前，能用于穗發(fā)芽抗性分子標(biāo)記輔 助選擇的有效標(biāo)記較少。近年來(lái)，有學(xué)者針對(duì)不同的休眠等位基因設(shè)計(jì)了與之緊密連鎖的 功能分子標(biāo)記，但對(duì)每一種等位基因的檢測(cè)都需要采用一對(duì)不同的標(biāo)記引物和一次PCR反 應(yīng)。對(duì)于多基因控制性狀的分子標(biāo)記鑒定，運(yùn)些標(biāo)記檢測(cè)方法均存在步驟繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力， 且費(fèi)用成本高等缺點(diǎn)，特別不適合大規(guī)模小麥種質(zhì)資源和育種分離群體后代的鑒定工作， 很難在科學(xué)研究或育種實(shí)踐中普遍應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地通量鑒定Ξ 個(gè)小麥種子主效休眠基因的引物、試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的 引物，所述小麥種子主校休眠基因?yàn)榛?-B1基因、TaP服1基因和PM19-A1基因；其中，
[0007] 所述化1-B1基因的分子標(biāo)記引物包括2條正向引物和1條反向引物，正向引物1序 列如沈9 10齡.1所示：5'-4〔4了4了64了66644了〇：6-3'，正向引物2序列如569 10齡.2所示： 5'-TCTGATACCATATATACTTGC-3'，反向引物序列如SEQIDNo.3所示：5'- TCTCACCAGTGTTCTCTA-3'；
[000引所述化P服1基因的分子標(biāo)記引物包括1條正向引物和1條反向引物，正向引物序列 如569 10齡.4所示：5'-6644〔464了6〔44圳44464-3'，反向引物序列如569 10齡.5所示： 5'-AGGATGTGAGACCAGTTGAC-3'；
[0009] 所述PM19-A1基因的分子標(biāo)記引物包括1條正向引物和1條反向引物，正向引物序 列如569 10齡.6所示：5'-〔6了6466了66刊641'1'〔6-3'，反向引物序列如沈9 10齡.7所示： 5 '-TGGTGAAGTGGAGTGTAGT-3 '。
[0010] 上述的引物在通量鑒定小麥種子主效休眠基因的應(yīng)用。
[0011] -種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的試劑盒，包含如權(quán)利要求1所述的引物。
[0012] 一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的試劑盒，它還包括Buffer、MgCl2、dNTP和 Taq 酶。
[0013] 上述試劑盒在通量鑒定小麥種子主效休眠基因的應(yīng)用。
[0014] 上述引物通量鑒定小麥種子休眠基因的方法，它包括W下步驟：
[001引 S1.使用化1-B1基因的分子標(biāo)記正向引物1和反向引物、TaPHSl基因的分子標(biāo)記引 物和PM19-A1基因的分子標(biāo)記引物形成的引物組合，對(duì)小麥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并染色鑒定等位基因，其中，1224bp擴(kuò)增條帶鑒定為化PHS1位點(diǎn)的弱 休眠等位基因，強(qiáng)休眠等位基因沒(méi)有擴(kuò)增條帶;4846口、6776口、45抓口、6146口的擴(kuò)增條帶分別 鑒定為化1-B1位點(diǎn)的等位基因化1-Bla、化1-B化、化1-Bld和化1-Blf，其中化1-B化和化1- Blf為強(qiáng)休眠等位基因，Vpl-Bla為弱休眠等位基因；195bp和177bp的擴(kuò)增條帶分別鑒定為 PM19-A1位點(diǎn)的強(qiáng)休眠等位基因和弱休眠等位基因；
[0016] S2.使用化1-B1基因的分子標(biāo)記正向引物2和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，并將擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并染色鑒定等位基因，其中，有擴(kuò)增條帶的鑒定為等位基化1-Ble，沒(méi) 有擴(kuò)增條帶的為等位基因化1-Blc。
[0017] 本發(fā)明具有W下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物組合，在第一次PCR反應(yīng)中可W鑒別Ξ 個(gè)主效休眠位點(diǎn)的強(qiáng)休眠等位基因，對(duì)于第一次PCR反應(yīng)不能很好鑒別的等位基因化1-Blc 和化1-Ble，通過(guò)第二次PCR反應(yīng)十分容易區(qū)分。所W綜合兩次PCR結(jié)果，可W明確地鑒定Ξ 個(gè)主效休眠位點(diǎn)的全部休眠等位基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，本發(fā)明鑒定主效休眠等位基 因結(jié)果可靠、重復(fù)性好，為小麥品種資源休眠等位基因的有效鑒定和選擇提供一種簡(jiǎn)單、快 速和準(zhǔn)確地通量鑒定Ξ個(gè)小麥主效休眠等位基因的引物、試劑盒及其檢測(cè)方法，解決了傳 統(tǒng)分子標(biāo)記技術(shù)在數(shù)量性狀多基因檢測(cè)過(guò)程中存在的操作繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)和費(fèi)用成本高的難 題。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1為主效休眠等位基因在第一次PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增片段凝膠電泳圖；圖中，字母a ~f分別代表等位基因化1-Bla~化為標(biāo)準(zhǔn)分子量D2000;
[0019] 圖2為等位基因化1-Blc和化1-Ble在第二次PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增片段凝膠電泳圖；圖 中，Μ為標(biāo)準(zhǔn)分子量D2000;
[0020] 圖3為部分四川小麥品種主效休眠等位基因的第一次PCR鑒定圖；圖中，泳道1~15 表示供試小麥品種，Μ為標(biāo)準(zhǔn)分子量D2000;
[0021] 圖4為部分四川小麥品種主效休眠等位基因的第二次PCR鑒定圖；圖中，泳道12~ 15表示與第一次PCR對(duì)應(yīng)的供試品種，e代表等位基因化l-Ble，M為標(biāo)準(zhǔn)分子量D2000。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于W 下所述。
[0023] 實(shí)施例1 :DNA的提取及PCR引物設(shè)計(jì)
[0024] (l)DNA的提取及檢測(cè)
[0025] 采用CTAB方法提取小麥種子總DNA，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。
[0026] (2)PCR引物設(shè)計(jì)
[0027] 分析比較等位基因序列的突變特征，針對(duì)基因擴(kuò)增區(qū)域，采用Prime巧生物學(xué)軟件 設(shè)計(jì)基因特異性分子標(biāo)記引物，保證引物間連續(xù)互補(bǔ)不超過(guò)4bpW防止發(fā)生交叉錯(cuò)配，引物 序列見(jiàn)表1。第一次PCR反應(yīng)采用化1-B1基因正向引物1、反向引物，TaPHSl基因正、反向引物 對(duì)和PM19-A1基因正、反向引物對(duì)組成的引物組合。第一次PCR實(shí)質(zhì)是多重PCR，是在傳統(tǒng)PCR 原理的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)壌即在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物撰對(duì)多個(gè)DNA模板或同 一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增出多個(gè)目的DNA片段。第二次PCR為普通PCR，采用化1-B1基因正向引 物2和反向引物形成的引物對(duì)對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，不同等位基因的預(yù)期擴(kuò)增目的片段 大小見(jiàn)表2。
[002引表1:PCR引物序列
[0033] 注:表中-表示沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物;/表示未進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0034] 實(shí)施例2 :PCR體系的建立及測(cè)序驗(yàn)證
[0035] 進(jìn)一步優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和熱循環(huán)條件，利用實(shí)施例1的引物組合對(duì)含有不同等位 基因的小麥材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增及檢測(cè)：
[0036] 第一次（多重)PCR反應(yīng)體系總體積為20ul，包括1XPCR Buffer(Mg^hee)、2.5mM MgCl2、300uM dNTP、2U的Taq酶和400ng的模板DNA，PHS1基因上下游引物分別為lOpmol， VP1-B1基因上下游引物分別為12pmol，PM19-Al基因上下游引物分別為2pmol。
[0037] 第一次（多重)PCR擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min，95°C變性30S，62°C退火30S，72°C 延伸lmin，10個(gè)循環(huán)。94°C變性30S，56°C退火30S，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸 10min〇
[003 引第二次PCR反應(yīng)體系總體積為20ul，包括lXPCRBuffer(Mg2卞ree)、1.5mMMgCl2、 200uM dNTP、0.抓的化q酶和l(K)ng的模板DNA，上下游引物分別為5pmol。
[0039] 第二次PCR擴(kuò)增條件為：95 °C預(yù)變性5min，94°C變性30S，55 °C退火30S，72°C延伸 30S，30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0040] 第一次(多重)PCR產(chǎn)物用3.5 %的瓊脂糖凝膠電泳0.5-化，第二次PCR產(chǎn)物用1.5 % 的瓊脂糖凝膠電泳0.化，EB染色后用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。每個(gè)等位基因材料均能擴(kuò) 出唯一一條清晰的帶，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2。由圖1可知，第一次（多重)PCR反應(yīng)可W明確地鑒定 VPl-Bla(484bp)、P1-B化（677bp)、VP1-Bld(459bp)、VP1-Blf(614bp)，VP1-Blc(4(nbp)和 VPl-Ble(40化p)擴(kuò)增片段相近，在第一個(gè)PCR反應(yīng)檢測(cè)中不能很好區(qū)分。TaPHSl位點(diǎn)的強(qiáng)休 眠等位基因無(wú)擴(kuò)增條帶，弱休眠等位基因產(chǎn)生1224bp擴(kuò)增片段。PM19-A1位點(diǎn)的強(qiáng)、弱休眠 等位基因則分別產(chǎn)生19化P和177bp的擴(kuò)增條帶;在第二次PCR反應(yīng)中用一對(duì)引物對(duì)第一次 PCR反應(yīng)中不能很好區(qū)分的材料進(jìn)行檢測(cè)，第二次PCR反應(yīng)可W明確地區(qū)分VPl-Blc(無(wú)擴(kuò)增 產(chǎn)物)和VPl-Ble(237bp)，結(jié)果如圖2所示。
[0041] 進(jìn)一步利用相應(yīng)的引物對(duì)上述擴(kuò)增片段直接測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別與GeneBank中對(duì) 應(yīng)的VP1-B1、TaP服巧日PM19-A1等位基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，證明每個(gè)等位基因的特異性擴(kuò) 增片段與預(yù)期結(jié)果吻合。所W，綜合兩次PCR的結(jié)果，能夠明確地鑒定Ξ個(gè)休眠主效位點(diǎn)的 全部等位基因類型。尤其是利用第一次（多重)PCR可W-次性鑒定Ξ個(gè)位點(diǎn)的強(qiáng)休眠等位 基因，可W作為抗穗發(fā)芽育種過(guò)程中強(qiáng)休眠等位的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，加快優(yōu)良抗性 基因在小麥遺傳背景中的快速聚合。
[0042] 實(shí)施例3:四川育成小麥品種主效休眠等位基因的鑒定
[0043] 利用本發(fā)明的分子標(biāo)記，鑒定98份四川小麥育成品種在Ξ個(gè)主效休眠位點(diǎn)的等位 基因組成。DNA提取及分子標(biāo)記PCR檢測(cè)方法同實(shí)施例1和實(shí)施例2。結(jié)果如圖3、圖4所示，圖3 表示利用第一次（多重)PCR對(duì)其中15份供試材料主效休眠基因的鑒定結(jié)果，對(duì)于泳道12~ 15檢測(cè)材料中不能分辨的VPl-Ble和VPl-Blc等位基因，繼續(xù)利用第二次PCR進(jìn)行鑒別，結(jié)果 表明均為等位基因 VPl-Ble，如圖4所示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，98份四川小麥育成品種在VP1-B1位 點(diǎn)存在5種等位基因類型。其中，64份材料含有￥口1-816，頻率為65.3%，21份材料含有￥口1- Blc，頻率為21.4%，12份材料含有VPl-Bla，頻率為12.2%，含有￥?1-8化和￥?1-81(1的材料 均只有1份，未檢測(cè)到強(qiáng)休眠等位基因 VPl-Blf?？梢?jiàn)，四川小麥在VP1-B1位點(diǎn)的強(qiáng)休眠等位 基因頻率極低，在抗穗發(fā)芽育種中應(yīng)加強(qiáng)VPl-Blb和VPl-Blf強(qiáng)休眠等位基因的利用。四川 小麥品種在化PHS1位點(diǎn)出現(xiàn)巧巾等位基因，即強(qiáng)休眠等位基因和弱休眠等位基因，頻率分別 為98 %和2 %。四川小麥品種在PM19-A1位點(diǎn)出現(xiàn)巧巾等位基因，即強(qiáng)休眠等位基因和弱休眠 等位基因，頻率分別為3%和97%。上述檢測(cè)結(jié)果表明，四川小麥抗穗發(fā)芽育種應(yīng)加強(qiáng)對(duì) VP1-B1和PM19-A1位點(diǎn)的種子強(qiáng)休眠基因的引進(jìn)和利用，本發(fā)明建立的強(qiáng)休眠主效等位基 因特異性分子標(biāo)記及檢測(cè)方法為小麥抗穗發(fā)芽分子育種提供了強(qiáng)有力技術(shù)手段。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的引物，其特征在于，所述小麥種子主校休眠 基因?yàn)閂pl-Bl基因、TaPHSl基因和PM19-A1基因；其中， 所述Vpl-Bl基因的分子標(biāo)記引物包括2條正向引物和1條反向引物，正向引物1序列如 SEQ ID No. 1所示，正向引物2序列如SEQ ID No. 2所示，反向引物序列如SEQ ID No. 3所 示； 所述TaPHSl基因的分子標(biāo)記引物包括1條正向引物和1條反向引物，正向引物序列如 SEQ ID No. 4所示，反向引物序列如SEQ ID No. 5所示； 所述PM19-A1基因的分子標(biāo)記引物包括1條正向引物和1條反向引物，正向引物序列如 SEQ ID No. 6所示，反向引物序列如SEQ ID No. 7所示。2. 如權(quán)利要求1所述的引物在通量鑒定小麥種子主效休眠基因的應(yīng)用。3. -種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的試劑盒，其特征在于，包含如權(quán)利要求1所述 的引物。4. 如權(quán)利要求3所述的一種通量鑒定小麥種子主效休眠基因的試劑盒，其特征在于，它 還包括 BufTer、MgCl2、dNTP 和 Taq 酶。5. 如權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在通量鑒定小麥種子主效休眠基因的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求1所述的引物通量鑒定小麥種子主效休眠基因的方法，其特征在于，它包 括以下步驟：51. 使用Vpl-Bl基因的分子標(biāo)記正向引物1和反向引物、TaPHSl基因的分子標(biāo)記引物 和PM19-A1基因的分子標(biāo)記引物形成的引物組合，對(duì)小麥DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳并染色鑒定等位基因，其中，1224 bp擴(kuò)增條帶鑒定為TaPHSl位點(diǎn)的弱休 眠等位基因，強(qiáng)休眠等位基因沒(méi)有擴(kuò)增條帶;484 bp、677 bp、459 bp、614 bp的擴(kuò)增條帶分 別鑒定為Vpl-Bl位點(diǎn)的等位基因 Vpl-Bla、Vpl-Blb、Vpl-Bld和Vpl-Blf，其中Vpl-Blb和 Vpl-Blf為強(qiáng)休眠等位基因，Vpl-Bla為弱休眠等位基因；195 bp和177bp的擴(kuò)增條帶分別鑒 定為PM19-A1位點(diǎn)的強(qiáng)休眠等位基因和弱休眠等位基因；52. 使用Vpl-Bl基因的分子標(biāo)記正向引物2和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，并將擴(kuò)增產(chǎn) 物進(jìn)行凝膠電泳并染色鑒定等位基因，其中，有擴(kuò)增條帶的鑒定為等位基Vpl-Ble，沒(méi)有擴(kuò) 增條帶的為等位基因 Vpl-Blc。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011301SQ201610632831
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月3日
【發(fā)明人】陳靜, 王威, 徐登安, 張紫晉
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所