一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒，包括檢測CYP1A1基因上單核苷酸多態(tài)性位點Msp I基因上單核苷酸多態(tài)性位點CYP17基因上單核苷酸多態(tài)性位點MspA1I、MDM2基因上單核苷酸多態(tài)性位點309和NQ01基因上單核苷酸多態(tài)性位點C609T，能特異性擴(kuò)增出包含5個SNPs位點的DNA片段的引物對。本發(fā)明通過檢測與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生密切關(guān)聯(lián)的五個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型來評估子宮內(nèi)膜癌患病的風(fēng)險級別與程度，并根據(jù)受檢者的檢測結(jié)果來指導(dǎo)人們預(yù)防子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，降低內(nèi)膜癌的發(fā)生概率。
【專利說明】
一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]子宮內(nèi)膜癌是一種常見的女性生殖道惡性腫瘤，在歐美國家為女性生殖器官三大惡性腫瘤之首，在我國60年代后開始呈現(xiàn)發(fā)病率提高及年輕化的趨勢。子宮內(nèi)膜癌大約占婦女惡性腫瘤的7%左右，每年其新發(fā)病例及死亡病例數(shù)量分別占婦女惡性腫瘤的3.9%和1.7%。有分子遺傳學(xué)研究顯示，子宮內(nèi)膜癌由于原癌基因激活、抑癌基因失活及DNA錯配修復(fù)基因改變等細(xì)胞調(diào)節(jié)路徑逐步改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖功能失調(diào)。
[0003]最近的研究表明，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與CYP1A1、CYP1B1、CYP17、MDM2和NQOl這5個遺傳易感基因密切相關(guān)。CYPlAl又稱細(xì)胞色素P4501A1，是一種重要的細(xì)胞色素P450系氧化代謝酶。該酶廣泛存在于肝外組織中，具有芳烴羥化酶(AHH)活性，參與代謝一些外源性化合物及前致癌物。CYPlBl由于具有激活環(huán)境中的前致癌物并催化雌激素轉(zhuǎn)化為具有基因毒性的兒茶酚雌激素，被認(rèn)為是多種癌癥的候選致病基因。CYPlBl基因Leu432Val存在多態(tài)性，有野生型C/C、雜合型C/G、突變型G/G三種基因型。CYP17是雌激素生物合成限速步驟中編碼關(guān)鍵酶的基因，其變異是雌激素生物合成與代謝上調(diào)的早期信號，性激素生物合成途徑中酶編碼基因的這種變異具有增加子宮內(nèi)膜癌危險的可能性。因此，CYP17被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜癌可疑性的潛在標(biāo)記物。
MDM2基因的一個常見單核苷酸多態(tài)位點309(rs22797444)，在第二個MDM2啟動子加強(qiáng)區(qū)域，通過自發(fā)性T-G轉(zhuǎn)換，增加轉(zhuǎn)錄激活因子Spl啟動子的親和力，提高M(jìn)DM2信使RNA以及蛋白表達(dá)水平。因此，MDM2癌基因SNPs與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生存在相關(guān)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒，該試劑盒精密性高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0005]本發(fā)明的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒，包括檢測CYPlAl基因上單核苷酸多態(tài)性位點Msp 1工￥?181基因上單核苷酸多態(tài)性位點1^11432￥&1、0￥?17基因上單核苷酸多態(tài)性位點MspAl1、MDM2基因上單核苷酸多態(tài)性位點309和NQOl基因上單核苷酸多態(tài)性位點C609T，能特異性擴(kuò)增出包含5個SNPs位點的DNA片段的引物對。
[0006]優(yōu)選，還包括檢測單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件和DNA測序反應(yīng)組件，所述PCR反應(yīng)組件包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20，所述PCR產(chǎn)物純化組件包括SAP酶、ExoI酶、ddH20，所述DNA測序反應(yīng)組件包括BigDye mix,EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20。
[0007]優(yōu)選，所述引物對為:DCYPlAlMsp I正向引物:GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAGCYPlAlMsp I反向引物:AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT2 ) CYPIBI Leu43 2Va I 正向引物:TTGTGCCTGTCACTATTCCTCACYPlBlLeu432Val反向引物:AGCCAGGATGGAGATGAAGAG、
3 )CYP17MspA11 正向引物:CCCATACGAACCGAATAGACYP17MspA11 反向引物:AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG4)MDM2SNP309正向引物:CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3MDM2SNP309反向引物:AGCAAGTCGGTGCTTACCTG5 )NQO IC609T正向引物:TGGCACAGTTTCAAGGTTTATGNQOIC609T反向引物:TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC。
[0008]優(yōu)選，所述試劑盒組分及其含量包括，
PCR反應(yīng)體系:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5ul，25mM dNTP混合液0.2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH2019.175ul;
PCR純化體系:lU/ul SAP酶0.75ul，10U/ul ExoI酶0.375ul，ddH203.875ul。
[0009]本發(fā)明所述的檢測試劑盒，保存溫度為-20°C。
[0010]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果:
(I)本發(fā)明通過檢測與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生密切關(guān)聯(lián)的五個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型來評估子宮內(nèi)膜癌患病的風(fēng)險級別與程度，并根據(jù)受檢者的檢測結(jié)果來指導(dǎo)人們預(yù)防子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，降低內(nèi)膜癌的發(fā)生概率。
[0011](2)本發(fā)明所述的子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒，整個操作方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合推廣。
【具體實施方式】
[0012]為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。
[0013]實施例1:
子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
(I)DNA模板的提取
從受檢者的口腔黏膜上皮細(xì)胞中抽提基因組DNA。
[0014](2): PCR 擴(kuò)增反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，引物對，
DCYPlAlMsp I正向引物:GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAGCYPlAlMsp I反向引物:AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT
2) CYPIBI Leu43 2Va I 正向引物:TTGTGCCTGTCACTATTCCTCACYPlBlLeu432Val反向引物:AGCCAGGATGGAGATGAAGAG、
3)CYP17MspA11 正向引物:CCCATACGAACCGAATAGACYP17MspA11 反向引物:AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG4)MDM2SNP309正向引物:CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3MDM2SNP309反向引物:AGCAAGTCGGTGCTTACCTG
5)NQO IC609T正向引物:TGGCACAGTTTCAAGGTTTATGNQOIC609T反向引物:TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC。
[0015]PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系:10\?0?反應(yīng)緩沖液2.5111，251111 dNTP混合液0.2ul，5U/ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH2019.175ul。
[0016](3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物純化
使用檢測試劑盒中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物組件，PCR純化體系:lU/ul SAP酶0.75ul，1U/ul Exo01.375ul，ddH2O3.875ul。
[0017](4)DNA測序反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，反應(yīng)體系總體積為5ul，包含PCR純化產(chǎn)物Iul，25% Bigdye mixlul，3.2uM DNA測序引物Iul，去離子水2ul。
[0018]反應(yīng)條件為981€2111丨11，進(jìn)行25—30個循環(huán)961€308，551€308，601€411^11。
[0019](5)基因型分析
通過DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0020]以上所述的【具體實施方式】，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的【具體實施方式】而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒，其特征在于:包括檢測CYPlAl基因上單核苷酸多態(tài)性位點Msp 1工￥?181基因上單核苷酸多態(tài)性位點1^11432￥&1、0￥?17基因上單核苷酸多態(tài)性位點MspAl1、MDM2基因上單核苷酸多態(tài)性位點309和NQOl基因上單核苷酸多態(tài)性位點C609T，能特異性擴(kuò)增出包含5個SNPs位點的DNA片段的引物對。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒，其特征在于，還包括檢測單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件和DNA測序反應(yīng)組件，所述PCR反應(yīng)組件包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20，所述PCR產(chǎn)物純化組件包括SAP酶、ExoI酶、ddH20，所述DNA測序反應(yīng)組件包括BigDye mix,^ΤΑ溶液、100 %乙醇溶液、70 %乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒，其特征在于，所述引物對為 DCYPlAlMsp I正向引物:GGGAGGAAGAAGAGGAGGTAG CYPlAlMsp I反向引物:AGGTTCTTGAAAGCAGGGACT 2) CYPIBI Leu43 2Va I 正向引物:TTGTGCCTGTCACTATTCCTCA CYPlBlLeu432Val反向引物:AGCCAGGATGGAGATGAAGAG、 3)CYP17MspA11 正向引物:CCCATACGAACCGAATAGA CYP17MspA11 反向引物:AGTCAAGGTGAAGATCAGGGTAG 4)MDM2SNP309正向引物:CGGGAGTTCAGGGTAAAGGT3 MDM2SNP309反向引物:AGCAAGTCGGTGCTTACCTG 5)NQ01C609T 正向引物:TGGCACAGTTTCAAGGTTTATG NQOIC609T反向引物:TATTCTCCAGGCGTTTCTTCC。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種子宮內(nèi)膜癌遺傳易感基因檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒組分及其含量包括， 1)PCR反應(yīng)體系:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5ul，25mMdNTP混合液0.2ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH2019.175ul; 2)PCR純化體系:lU/ulSAP酶0.75ul，lOU/ul ExoI酶0.375ul，ddH203.875ul。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011305SQ201610652467
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月10日
【發(fā)明人】周煒, 歐陽小峰, 魏徵霄, 汪玲
【申請人】四川金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司