單價(jià)h5疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及單價(jià)H5N1疫苗。更具體地，本發(fā)明涉及單價(jià)H5疫苗株的開發(fā)，使用工程化成引發(fā)進(jìn)化枝交叉保護(hù)的血凝素(HA)。本發(fā)明還涉及表位?嵌合H5和表達(dá)表位?嵌合H5的反向遺傳學(xué)(RG)流感病毒。
【專利說明】單價(jià)H5疫苗
[0001] 相關(guān)申請的交叉參考
[0002] 本申請?jiān)O(shè)及2013年12月23日提交的美國臨時(shí)專利申請序列號61/920,187并要求 其權(quán)益。各申請通過引用納入本文。
[0003] 序列提交
[0004] 本申請與電子格式的序列表一起提交。序列表命名為 2577234PCTSequenceListing.txt ,2014年12月4日創(chuàng)建，且大小為53化。電子格式的序列表 中的信息通過引用全文納入本文。
【背景技術(shù)】
[0005] 本發(fā)明設(shè)及單價(jià)H5N1疫苗。更具體地，本發(fā)明設(shè)及單價(jià)冊疫苗株的開發(fā)，使用工程 化成引發(fā)進(jìn)化枝交叉保護(hù)的血凝素化A)。本發(fā)明還設(shè)及表位-嵌合H5和表達(dá)表位-嵌合冊的 反向遺傳學(xué)(RG)流感病毒。
[0006] 本文用于闡明本發(fā)明背景和提供關(guān)于實(shí)踐的額外細(xì)節(jié)的出版物和其它材料通過 引用納入，為了方便起見在參考書目中各自分組。
[0007] 高致病性禽流感化PAI)病毒亞型冊N1在人和家禽中的重現(xiàn)依然是公共健康的嚴(yán) 重問題(concern)。自從其十年前在亞洲出現(xiàn)，高致病性禽流感H5N1病毒已傳播到3大洲超 過60個(gè)國家，并在東南亞和非洲的家禽中間流行（endemic)^ei;ris等，2007)。其導(dǎo)致包括 人在內(nèi)的數(shù)種哺乳動(dòng)物疾病，通常帶來致命后果。迄今，冊N1導(dǎo)致全球641個(gè)人類病例，包括 380例死亡化ttp，2013)。盡管迄今沒有觀察到病毒持續(xù)的人際間傳播，仍然憂慮的是如果 獲得人傳播，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重流行性疾病(Guan等，2004; Imai等，2012)。
[000引疫苗接種仍是最有效和經(jīng)濟(jì)上節(jié)儉的策略W抗擊有大流行潛質(zhì)的禽流感病毒帶 來的威脅(Baz等.2013)。然而，如果流行性疾病突然出現(xiàn)并迅速蔓延，生產(chǎn)有效疫苗是一項(xiàng) 挑戰(zhàn)。因此，正努力W開發(fā)普遍的疫苗，其使用更少的抗原并誘導(dǎo)交叉保護(hù)反應(yīng)。評估高度 保守的流感病毒離子通道蛋白（M2)(Wu等，2007)及核蛋白（NP)，所述評估關(guān)于誘導(dǎo)交叉保 護(hù)性細(xì)胞免疫和病毒清除(化en和SiAbarao, 2009)。然而，運(yùn)些蛋白的特異性抗體是弱免疫 原性且允許感染。因此，開發(fā)基于流感病毒血凝素化A)的疫苗仍是預(yù)防HPAI流感病毒感染 的最有利選擇，所述HA是流感病毒免疫的主要決定簇(Gambotto等，2008)。冊N1病毒由于血 凝素序列不同而在抗原性上可區(qū)分，產(chǎn)生不同冊N1譜系或進(jìn)化枝(Aubin等，2005;WH0等， 2008)。由于HA序列尤其是中和表位區(qū)內(nèi)的變化，常規(guī)基于HA的冊N1疫苗看來對冊N1的異源 株或系統(tǒng)發(fā)育上變異的進(jìn)化枝無效（Shore等，2013)。因此，開發(fā)采用抗原性不同的Ξ重或 更多病毒株混合物的策略W引起廣泛保護(hù)。然而，個(gè)體疫苗毒種的傳播或共表達(dá)重組疫苗 的開發(fā)耗時(shí)、對技術(shù)要求高且昂貴。
[0009]因此，重要的是開發(fā)大流行前的單價(jià)疫苗，所述疫苗誘導(dǎo)進(jìn)化枝交叉保護(hù)抵御抗 原性不同的冊N1株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明設(shè)及單價(jià)H5N1疫苗。更具體地，本發(fā)明設(shè)及單價(jià)冊疫苗株的開發(fā)，使用工程 化成引發(fā)進(jìn)化枝交叉保護(hù)的血凝素化A)。本發(fā)明還設(shè)及表位-嵌合H5和表達(dá)表位-嵌合冊的 反向遺傳學(xué)(RG)流感病毒。
[0011] 因此，在第一方面，本發(fā)明提供禽流感病毒株的修飾的H5蛋白、經(jīng)分離的修飾的H5 蛋白或純化的修飾的H5蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，禽流感病毒株是A/印尼/CDC669/2006 (冊N1)。此毒株的天然全長冊蛋白示于GenBank登錄號ABI36428并由具有GenBank登錄號 CY014481所示核巧酸序列的核酸編碼。此核酸的核巧酸序列示于SEQ ID N0:1。此毒株的天 然全長H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID N0:2。此毒株的天然、成熟H5蛋白（即沒有信號膚 的冊蛋白）由具有SEQ ID NO: 3所示核巧酸序列的核酸編碼。天然、成熟H5蛋白的氨基酸序 列示于SEQ ID N0:4。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的、成熟冊蛋白具有S155N、T156A和R189K修 飾。運(yùn)些修飾分別對應(yīng)全長冊蛋白中殘基17U172和205的修飾。修飾的、成熟冊蛋白的氨基 酸序列示于SEQ ID N0:6,其由具有SEQ ID N0:5所示核巧酸序列的核酸編碼。修飾的、全長 冊蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 8,其由具有SEQ ID NO: 7所示核巧酸序列的核酸編 碼。修飾的冊有時(shí)也在本文中稱為表位-嵌合冊化C冊）。
[0012] 在第二方面，本發(fā)明提供含本文所述修飾的H5蛋白的重組禽流感病毒。重組禽流 感病毒可包括在禽流感病毒遺傳背景中的修飾的H5蛋白。禽流感病毒可W是主要病毒株。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組禽流感病毒可用作疫苗。該重組禽流感病毒可納入免疫試劑 盒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組禽流感病毒可用作血凝素抑制化I)試驗(yàn)中的診斷參照 病毒。該重組禽流感病毒可納入血凝素抑制化I)試驗(yàn)試劑盒。在一些實(shí)施方式中，所述重組 禽流感病毒通過反向遺傳學(xué)過程產(chǎn)生。
[0013] 在第Ξ方面，本發(fā)明提供單價(jià)H5疫苗W預(yù)防對象中的疾病，其中所述疾病與禽流 感病毒冊N1亞型相關(guān)。根據(jù)此方面，所述單價(jià)冊疫苗包括預(yù)防有效量的免疫原性劑。在一個(gè) 實(shí)施方式中，所述免疫原性劑包括本文所述修飾的冊蛋白或其抗原性部分或者編碼本文所 述修飾的H5蛋白的核酸或其抗原性部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原性部分包括本文 所述修飾的H5蛋白的表位。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，所述對象可W是人、家養(yǎng)動(dòng)物(狗、貓、 猴等）；牲畜巧、牛、綿羊、山羊、豬等）、野鳥(大雁、野鴨等)和家養(yǎng)禽類(雞、鴨、碟等）。在一 個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫原性劑是含本文所述修飾的H5蛋白的病毒或是本文所述重組病 毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒或重組病毒失活。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒或重 組病毒是減毒病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒或重組病毒采用病毒體或病毒樣顆粒 的形式。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒或重組病毒是蛋衍生或細(xì)胞培養(yǎng)物衍生。在另一個(gè) 實(shí)施方式中，所述免疫原性劑是含本文所述修飾的冊蛋白的裂解病毒或是裂解病毒抗原性 制備物。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫原性劑是修飾的冊蛋白或其抗原性部分。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，所述修飾的冊蛋白或其抗原性部分已分離。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾的H5 蛋白或其抗原性部分通過表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)系統(tǒng)是任何表達(dá)系 統(tǒng)，如病毒表達(dá)載體，其中修飾的H5蛋白或其抗原性部分在病毒表面呈現(xiàn)或展示。在一個(gè)實(shí) 施方式中，所述病毒表達(dá)載體是任何病毒表達(dá)載體，如修飾的痘苗病毒表達(dá)載體、腺病毒表 達(dá)載體、痘病毒表達(dá)載體、桿狀病毒表達(dá)載體等。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體是桿狀 病毒表達(dá)載體，呈現(xiàn)或展示修飾的H5蛋白或其抗原性部分的病毒是桿狀病毒。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，所述免疫原性劑是編碼修飾的H5蛋白或其抗原性部分的核酸，其能在對象中表 達(dá)。
[0014] 在第四方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生針對禽流感病毒的保護(hù)性免疫的方法，所述方法包 括給對象施用預(yù)防有效量的本文所述的單價(jià)冊疫苗。
[0015] 在第五方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療禽流感病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括 給對象施用預(yù)防有效量的本文所述的單價(jià)H5疫苗。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述預(yù)防或治療可 延遲禽流感發(fā)作或減緩發(fā)展速度。
[0016] 在第六方面，本發(fā)明提供本文所述的單價(jià)冊疫苗用于刺激針對禽流感病毒的免疫 應(yīng)答的應(yīng)用。
[0017] 在第屯方面，本發(fā)明提供本文所述的重組禽流感病毒用于制備引起對象中的保護(hù) 性免疫應(yīng)答的藥物的應(yīng)用。
[0018] 在第八方面，本發(fā)明提供本文所述的重組禽流感病毒用于制備預(yù)防對象患上冊N1 亞型禽流感的藥物的應(yīng)用。
[0019] 在第九方面，本發(fā)明提供本文所述重組禽流感病毒用于制備藥物的應(yīng)用，所述藥 物用于延遲冊N1亞型禽流感感染對象中的冊N1亞型禽流感發(fā)作或減緩所述疾病的速度。
[0020] 在第十方面，本發(fā)明提供制備疫苗的方法，包括使用本文所述修飾的H5蛋白或本 文所述重組禽流感病毒。
[0021 ]在第十一方面，本發(fā)明提供本文所述修飾的冊蛋白或本文所述重組禽流感病毒用 于疫苗開發(fā)的應(yīng)用。
[0022] 在第十二方面，本發(fā)明提供本文所述修飾的H5蛋白或本文所述重組禽流感病毒， 用于疫苗開發(fā)。
[0023] 附圖簡要說明
[0024] 圖1A和1B顯示在不同進(jìn)化枝的抗原性表位中鑒定可變氨基酸。比對不同主要進(jìn)化 枝的冊蛋白序列。冊N1HA進(jìn)化枝的氨基酸共有序列（SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4和SEQ ID 顯：5)在等同于刖抗原性位點(diǎn)化（氨基酸殘基136-141、165-169、202-204、220-221和234- 236處的框內(nèi)）和化(氨基酸殘基69-75處的框內(nèi)）、Sa(氨基酸殘基120-121和152-163處的框 內(nèi)）和Sb(183-194處的框內(nèi)）的位置處突出。圖2A和2B顯示用免疫的小鼠血清進(jìn)行的進(jìn)化枝 交叉測試。在第28天(最終免疫后14天)從小鼠中收集血清樣品，小鼠分別用RG-EC H5、A/越 南/1203/2004、A/印尼/CDC669/2006免疫。圖2A:針對不同冊N1進(jìn)化枝的HI效價(jià)。圖2B:針對 不同H5N1進(jìn)化枝的病毒中和效價(jià)。進(jìn)化枝號列于相應(yīng)各病毒名前。各點(diǎn)表示算術(shù)平均值(η = 10)±SD。
[0025] 圖3A-3H顯示保護(hù)小鼠抵御用進(jìn)化枝1.0、進(jìn)化枝2.1、進(jìn)化枝2.2或進(jìn)化枝2.3冊N1 病毒的致死攻擊(challenge)。結(jié)果分別W存活百分比（圖3A、3C、3E和3G)和體重百分比（圖 3B、3D、3F和3H)形式表示(在試驗(yàn)開始時(shí)）。各小鼠組(n = 8)分別用RG-EC冊、A/越南/1203/ 2004，A/印尼/CDC669/2006或PBS皮下免疫。最終疫苗接種后3周，W5MLD50的進(jìn)化枝1.0(A/ 越南/1203/2004)(圖 3A、3B)、進(jìn)化枝 2.1A/印尼/CDC669/2006(圖 3C、3D)、進(jìn)化枝 2.3.4A/安 徽/l/05(圖3E、3F)或進(jìn)化枝2.2.1.1A/埃及/3300-NAMRU3/2008(圖3G、3hH)HPAI冊Nl病毒 株鼻內(nèi)感染小鼠。在14天觀察期中監(jiān)測小鼠。
[00%] 圖4顯示接種疫苗的小鼠中肺組織的組織病理學(xué)。顯示用進(jìn)化枝2.3.4A/Anhui/1/ 05或進(jìn)化枝2.2.1. 1A/埃及/3300-NAMRU3/2008冊N1株攻擊后5天，蘇木精和伊紅染色的小 鼠肺切片顯微照片。小鼠分別用RG-EC冊、A/越南/1203/2004、A/印尼/CDC669/2006或PBS 免疫。免疫株和攻擊株相應(yīng)顯不。
[0027]圖5顯示接種小鼠肺中病毒感染滴度的測量結(jié)果。小鼠分別用RG-EC H5、A/越南/ 1203/2004、A/印尼/CDC669/2006 或 PBS 皮下免疫。用 5MLD50 的進(jìn)化枝 1.0(A/越南/1203/ 2004)、進(jìn)化枝2.1A/印尼/CDC669/2006、進(jìn)化枝2.3.4A/安徽/1/05或進(jìn)化枝2.2.1. 1A/埃 及/3300-MMRU3/2008攻擊后5天，從小鼠中收集肺樣品。肺中病毒負(fù)荷的結(jié)果W logioTCIDso均值形式表示。各點(diǎn)表示算術(shù)平均值(n = 2) ±SD。
[002引發(fā)明詳述
[0029] 本發(fā)明設(shè)及單價(jià)H5N1疫苗。更具體地，本發(fā)明設(shè)及單價(jià)冊疫苗株的開發(fā)，使用工程 化成引發(fā)交叉進(jìn)化枝保護(hù)的血凝素化A)。本發(fā)明還設(shè)及表位-嵌合H5和表達(dá)表位-嵌合冊的 反向遺傳學(xué)(RG)流感病毒。
[0030] 除非另有定義，本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語應(yīng)具有與發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員 通常理解相同的含義。
[0031] 術(shù)語"約"或"大致"指在某一值的統(tǒng)計(jì)意義范圍內(nèi)。運(yùn)種范圍可W在一數(shù)量級內(nèi)， 優(yōu)選給定值或范圍的50%內(nèi)，更優(yōu)選20%內(nèi)，更加優(yōu)選10%內(nèi)，甚至更優(yōu)選5%內(nèi)。術(shù)語"約" 或"大致"涵蓋的允許偏差取決于研究的特定系統(tǒng)，且能由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易理解。
[0032] 術(shù)語"佐劑"指提高對抗原免疫應(yīng)答的化合物或混合物。佐劑能用作緩慢釋放抗原 的組織儲(chǔ)存庫，且也用作非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答的淋己系統(tǒng)激活因子化ood等，1984)。通 常，沒有佐劑情況下用單獨(dú)抗原進(jìn)行初級攻擊無法引發(fā)體液或細(xì)胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但 不限于弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑，皂巧，礦物膠如氨氧化侶，表面活性物質(zhì)如溶血卵 憐脂、復(fù)合多元醇、聚陰離子、膚、油或控乳劑、匙孔戚血藍(lán)蛋白，W及可能用于人的佐劑如 N-乙酷-胞壁酷蘇氨酷-D-異谷氨酷胺（thr-MDP)、N-乙酷-正胞壁酷-k丙氨酷-D-異谷 氨酷胺、N-乙酷胞壁酷-k丙氨酷-D-異谷氨酷胺酷丙氨酸-2-0--2'-二棟桐酷-s-n-甘 油-3-?基憐酷氧)-乙胺、BCG(卡介苗）和厭氧短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。 所述佐劑優(yōu)選是藥學(xué)上可接受的。
[0033] 本文所用的"施用"指用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意多種方法和遞送系統(tǒng)傳遞。例 如，施用可腹腔內(nèi)、腦內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服、透粘膜、皮下、透皮、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、外用、腸胃外、經(jīng) 植入物、銷內(nèi)、淋己內(nèi)、病變內(nèi)、屯、包或硬膜外進(jìn)行。藥劑或組合物還可在氣溶膠中施用，如 用于肺和/或鼻內(nèi)遞送。例如，施用可進(jìn)行一次、多次和/或在一個(gè)或多個(gè)延長期中進(jìn)行。
[0034] 術(shù)語"運(yùn)載體"指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑(vehiC1 e)。運(yùn) 種藥物運(yùn)載體可W是無菌液體，如水和油，包括石油、動(dòng)物、植物或合成來源的那些，如花生 油、大豆油、礦物油、芝麻油等。水或水性溶液鹽水溶液W及水性右旋糖和甘油溶液優(yōu)選用 作運(yùn)載體，尤其用于可注射溶液。合適的藥物運(yùn)載體描述于《雷明頓：藥物科學(xué)和實(shí)踐》 (Remington:The Science and Practice of Pharmacy),第21 版,D.B.Troy編，己爾的摩的 利平科特?威廉斯·威爾金斯出版公司化ippincott,Williams&Wilkins),2006,在此通過 引用納入本文。
[0035] 本文所用的短語巧5N1亞型禽流感病毒相關(guān)疾病"指由H5N1亞型禽流感病毒導(dǎo)致 或與其相關(guān)的任何疾病、疾病狀態(tài)或素亂。
[0036] 本文所用的術(shù)語"有效量"或"預(yù)防有效量"包括提供所需效果的無毒但充足量的 藥劑或化合物。例如，用于調(diào)整免疫應(yīng)答的預(yù)防有效量是提供調(diào)整對象免疫應(yīng)答的所需效 果的藥劑或化合物量。類似地，用于治療或預(yù)防禽流感病毒相關(guān)疾病的預(yù)防有效量是提供 治療或預(yù)防對象疾病的所需效果的藥劑或化合物量。所需實(shí)際量因?qū)ο蠖?，取決于因素 如所治療物種、對象的年齡和一般情況、所治療病癥的嚴(yán)重性、施用的具體藥劑和施用模式 等。因此，不能指定確切"有效量"。然而，對于任何給定情況，合適的"有效量"可由本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員僅通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。
[0037] 本文所用的術(shù)語"血凝素5(Η5?；?禽流感病毒的H5"或巧5蛋白"指A/印尼/ CDC669/2006化5Ν1)的天然產(chǎn)生冊蛋白。
[0038] 術(shù)語"修飾的血凝素5"或"禽流感病毒的修飾的Η5"或"修飾的冊"或"表位-嵌合 冊"指Α/印尼/CDC669/2006化5Ν1)的冊蛋白，其修飾成包含S155Ν、Τ156Α和R189Κ修飾。
[0039] 本文所用冊蛋白的氨基酸位置編號指SEQ ID Ν0:4中示范性給出的氨基酸位置。 SEQ ID ^:4代表毒株4/印尼/〔0〔669/2006化5化）的血凝素氨基酸序列，但沒有氨基末端 信號膚。換言之，如果參照位置155的氨基酸（氨基酸155)，所述氨基酸殘基意味著對應(yīng)于 SEQ ID側(cè):4的氨基酸155。術(shù)語"5155礦或叮156心'或啼18船'分別示范性指位置155、156和 189的氨基酸-根據(jù)SEQ ID N0:4氨基酸位置編號-在氨基酸155處是氨基酸天冬酷胺(N)而 不是天然絲氨酸(S)，氨基酸156處是丙氨酸(A)而不是天然蘇氨酸(T)，氨基酸189處是賴氨 酸化)而不是天然精氨酸(R)。
[0040] "免疫原性組合物"或"免疫組合物"指包括至少一種抗原的物質(zhì)組合物，所述抗原 在宿主中引發(fā)免疫應(yīng)答，即對感興趣組合物或疫苗的細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。通 常，"免疫應(yīng)答"包括但不限于W下效應(yīng)的一個(gè)或多個(gè):產(chǎn)生或激活抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、 抑制性T細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或γ-δΤ細(xì)胞，特異性針對納入感興趣組合物或疫苗 的一個(gè)或多個(gè)抗原。所述宿主優(yōu)選展示治療或保護(hù)性免疫應(yīng)答，從而提高對新感染的抗性 和/或減少疾病的臨床嚴(yán)重性。運(yùn)種保護(hù)如下證明：受感染宿主正常展示的癥狀減少或缺 乏，受感染宿主的恢復(fù)時(shí)間更快和/或病毒效價(jià)降低。
[0041 ]本文所用的"個(gè)體"或"對象"或"動(dòng)物"指支持負(fù)鏈RNA病毒感染的脊椎動(dòng)物，特別 是流感病毒感染，包括但不限于鳥(如水禽和雞及哺乳動(dòng)物成員如犬、貓、狼、關(guān)、曬齒動(dòng) 物(racine、鼠等）、馬、牛、綿羊、山羊、豬和靈長類，后者包括人。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述對 象是人。
[0042]術(shù)語"分離的"指參照材料從其天然環(huán)境如細(xì)胞或病毒中移出。因此，分離的生物 材料可沒有一些或所有細(xì)胞組分，即其中天然出現(xiàn)天然材料的細(xì)胞組分(如細(xì)胞質(zhì)或膜組 分）。如果材料在細(xì)胞提取物或上清中存在，其應(yīng)視作分離的。在核酸分子的情況中，分離的 核酸包括PCR產(chǎn)物、分離的mRNA、cDNA或限制性片段。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分離的核酸優(yōu)選 從發(fā)現(xiàn)其的染色體中切除，更優(yōu)選不再連接或郵鄰非編碼區(qū)（但可連接其天然調(diào)控區(qū)或其 部分），或者在染色體中發(fā)現(xiàn)時(shí)位于分離核酸分子所含基因上游或下游的其它基因。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，分離的核酸缺少一個(gè)或多個(gè)內(nèi)含子。分離的核酸分子包括插入質(zhì)粒、粘粒、 人工染色體等的序列，即當(dāng)其形成部分嵌合重組核酸構(gòu)建體時(shí)。因此，在一個(gè)特定實(shí)施方式 中，重組核酸是分離的核酸。分離的蛋白可與其在細(xì)胞中相關(guān)聯(lián)的其它蛋白或核酸或兩者 相關(guān)聯(lián)，或與細(xì)胞膜(如果是膜相關(guān)蛋白）相關(guān)聯(lián)。分離的細(xì)胞器、細(xì)胞或組織從生物體中發(fā) 現(xiàn)其的解剖位置中移出。分離的材料可W但不必純化。
[0043] 術(shù)語"主要病毒株"指用于構(gòu)建高生長或減毒疫苗株的病毒株。運(yùn)些主要病毒株通 常向疫苗病毒貢獻(xiàn)6個(gè)基因區(qū)段(PB1、PB2、PA、NP、NA、M和NS)。主要病毒株可W是也用作疫 苗組分的毒株，包括病毒株A/PR/8/34。
[0044] 本文所用的術(shù)語"調(diào)節(jié)"用于免疫應(yīng)答時(shí)，指直接或間接地增加或減少針對抗原的 免疫應(yīng)答。疫苗一般增強(qiáng)針對抗原的免疫應(yīng)答。
[0045] 短語"藥學(xué)上可接受"指生理上可耐受的分子實(shí)體和組合物，且通常在施用人時(shí)不 產(chǎn)生過敏或類似的不良反應(yīng)，如胃不舒服、頭暈等。
[0046] 本文所用的術(shù)語"多核巧酸"或"核酸"可互換使用，且指定含一個(gè)或多個(gè)核巧酸或 寡核巧酸或其片段的分子，包括但不限于RNA或DNA核巧酸或其組合。
[0047] 術(shù)語"多膚"指氨基酸聚合物且不指特定長度的產(chǎn)物；因此，膚、寡膚和蛋白包括在 多膚定義內(nèi)。此術(shù)語不指或排除多膚的翻譯后修飾，例如糖基化、乙酷化、憐酸化等。
[0048] 本文所用的術(shù)語"純化的"指在減少或消除不相關(guān)材料即污染物存在的條件下分 離材料，所述不相關(guān)材料包括從中獲得該材料的天然材料。例如，純化的病毒顆粒優(yōu)選基本 沒有宿主細(xì)胞或培養(yǎng)物組分，包括組織培養(yǎng)物或卵蛋白、非特定病原體等。本文所用的術(shù)語 "基本沒有"在分析測試材料的背景下操作性使用。基本沒有污染物的純化材料優(yōu)選至少約 50 %純;更優(yōu)選至少約90 %純，更加優(yōu)選至少約99 %純。純度可通過色譜、凝膠電泳、免疫測 定、組成分析、生物測定和本領(lǐng)域已知其它方法評估。
[0049] 純化方法為本領(lǐng)域熟知。病毒顆粒能通過超濾或超離屯、純化，優(yōu)選連續(xù)離屯、。其它 純化方法可行且本文也考慮。純化材料可包含小于約50%，優(yōu)選小于約75%，最優(yōu)選小于約 90%的細(xì)胞組分、介質(zhì)、蛋白或與之初始相關(guān)的其它不需要組分或雜質(zhì)（根據(jù)上下文的需 要）。術(shù)語"基本純"指示用本領(lǐng)域已知常規(guī)純化技術(shù)能實(shí)現(xiàn)的最高純度。
[0050] 本文所用的術(shù)語"反向遺傳學(xué)系統(tǒng)"指通過遺傳工程方法產(chǎn)生流感病毒顆粒、多 膚、病毒體(Viron)或核酸的方法。運(yùn)些方法包括但不限于"質(zhì)粒系統(tǒng)"，如化f fmann (2002)， 美國專利申請公開號2002/0164770和美國專利號8，293，247所述，各通過引用全文納入本 文。一般而言，反向遺傳系統(tǒng)能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳工程方法用特異序列產(chǎn)生 病毒顆粒、多膚和/或核酸。
[0051] 術(shù)語"治療有效量"指給人或動(dòng)物施用時(shí)足W在所述人或動(dòng)物中產(chǎn)生治療效果的 藥劑量。有效量易由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)過程確定。
[0052] 本文所用的術(shù)語"治療（treating)"和"治療（traetment)"指W任何方式治愈病癥 或癥狀，防止病癥或疾病建立，或另外預(yù)防、阻礙、延遲、減輕或逆轉(zhuǎn)病癥或疾病發(fā)展或者其 它不需要癥狀的任何和所有應(yīng)用。
[0053] 本文所用的單價(jià)冊疫苗株基于HA序列開發(fā)，所述序列工程化成引發(fā)進(jìn)化枝交叉保 護(hù)。來自印尼株(A/印尼/CDC669/2006)的冊用作骨架序列。3個(gè)氨基酸突變成表達(dá)來自骨干 中其它循環(huán)H5N1的免疫原性表位。表達(dá)表位-嵌合H5的反向遺傳學(xué)(RG)流感病毒能用多個(gè) H5單抗中和，所述抗體無法中和野生型A/印尼/CDC669/2006。在針對不同進(jìn)化枝的HI和病 毒中和中檢測到高效價(jià)，使用來自表位-嵌合冊N1免疫小鼠的血清。有RG-表位-嵌合冊N1的 單價(jià)疫苗保護(hù)小鼠免于不同進(jìn)化枝的H5N1致死攻擊，包括來自Ξ價(jià)通用H5疫苗的3個(gè)毒株。 運(yùn)些結(jié)果表明此單一冊N1病毒引起的廣泛免疫應(yīng)答使該單一病毒能用作單價(jià)冊通用疫苗。
[0054] 因此，在第一方面，本發(fā)明提供禽流感病毒株的修飾的H5蛋白、經(jīng)分離的修飾的H5 蛋白或純化的修飾的H5蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，禽流感病毒株是A/印尼/CDC669/2006 (冊N1)。此毒株的天然全長冊蛋白示于GenBank登錄號ABI36428并由具有GenBank登錄號 CY014481所示核巧酸序列的核酸編碼。此核酸的核巧酸序列示于SEQ ID N0:1。此毒株的天 然全長H5蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID N0:2。此毒株的天然、成熟H5蛋白（即缺乏信號膚 的冊蛋白）由具有SEQ ID NO: 3所示核巧酸序列的核酸編碼。天然、成熟H5蛋白的氨基酸序 列示于SEQ ID N0:4。在一個(gè)實(shí)施方式中，修飾的、成熟冊蛋白具有S155N、T156A和R189K修 飾。運(yùn)些修飾分別對應(yīng)全長冊蛋白中殘基17U172和205的修飾。修飾的、成熟冊蛋白的氨基 酸序列示于SEQ ID N0:6,其由具有SEQ ID N0:5所示核巧酸序列的核酸編碼。修飾的、全長 冊蛋白的氨基酸序列示于SEQ ID NO: 8,其由具有SEQ ID NO: 7所示核巧酸序列的核酸編 碼。修飾的冊有時(shí)也在本文中稱為表位-嵌合冊化C冊）。
[0055] 在第二方面，本發(fā)明提供含本文所述修飾的H5蛋白的重組禽流感病毒。重組禽流 感病毒可包括在禽流感病毒遺傳背景中的修飾的H5蛋白。禽流感病毒可W是主要病毒株。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組禽流感病毒可用作疫苗。該重組禽流感病毒可納入免疫試劑 盒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述重組禽流感病毒可用作血凝素抑制化I)試驗(yàn)中的診斷參照 病毒。該重組禽流感病毒可納入血凝素抑制化I)試驗(yàn)試劑盒。在一些實(shí)施方式中，所述重組 禽流感病毒通過反向遺傳學(xué)過程產(chǎn)生。
[0056] 近期開發(fā)的反向遺傳系統(tǒng)能用于操作流感病毒基因組(Palese等，1996;化umann 和Kawaoka，1999; Neumann等，1999;化dor等，1999;美國專利申請公開號2004/0029251)。例 如，已證明質(zhì)粒驅(qū)動(dòng)表達(dá)來自PO1 I啟動(dòng)子的8個(gè)流感vRNA和來自PO1II啟動(dòng)子的所有mRNA 可引起傳染性甲型流感病毒形成化of fmann等2000;美國專利申請公開號2002/0164770，通 過引用納入W參考其關(guān)于最小質(zhì)粒反向遺傳系統(tǒng)的描述和關(guān)于遺傳工程方法的描述）。運(yùn) 些重組方法允許特定產(chǎn)生流感病毒類型，所述類型具有多膚氨基酸序列的特定改變。含所 需取代的HA分子可W是重組流感病毒的一部分。重組流感病毒可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的任何方式制備，包括基因工程法如"僅質(zhì)粒"系統(tǒng)化offmann等，2002)。重組流感病毒可獲 自冊N1病毒。重組流感病毒可具有疫苗開發(fā)所用化N1病毒的遺傳背景，如A/PR/8/34病毒或 任何甲型流感病毒，包括冷適應(yīng)株和減毒株。對應(yīng)于HA分子序列的核酸可分離自病毒并測 序。
[0057] 分析和修飾特異性核酸及蛋白的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。根據(jù)本發(fā)明，可采 用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的傳統(tǒng)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。運(yùn)類技術(shù)在文獻(xiàn)中已充 分解釋。參見例如Green和Sambrook,2012,《分子克隆》(Molecular Cloning),第4版.（紐約 州冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社（Cold Spring化rbor Laboratory Press) );Glove;r, 1985，《DNA克隆》（DNA Cloning)(牛津的I化出版社（I化Press));《寡核巧酸合成》 (Oligonucleotide Synthes i s Gait編.1984);《核酸雜交》（Nucleic Acid Hybridization) (B.D.化mes&S.J. Higgins編.1984);《轉(zhuǎn)錄和翻譯》（Transcript ion And Translation)(B.D.化mes&S.J.Higgins編.（1984));《培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞》（Qllture0fAnimal Cells) (R. I .Freshney ,Alan R.Liss公司（Alan R.Liss, Inc.), 1987);《固定化細(xì)胞和酶》 (Immobilized Cells And EnzymesKiRL出版社，1986) ;B.Pe;rbal,《分子克隆實(shí)踐指南》(A Practical Guide To Mole州lar Cloning) (1984);Ausubel等，1992,《新編分子生物學(xué)實(shí) 驗(yàn)指南KCurrent Protocols in Molecular Biology)(約翰威利父子出版公司（John Wi ley&Sons)，包括定期更新）。運(yùn)些技術(shù)包括定點(diǎn)突變，采用有經(jīng)改變核巧酸的寡核巧酸w 產(chǎn)生帶突變的PCR產(chǎn)物（如Stra1:agene生產(chǎn)的"Quikchange"試劑盒）。
[0058] 在第Ξ方面，本發(fā)明提供單價(jià)H5疫苗，用于預(yù)防對象中的疾病，其中所述疾病與禽 流感病毒冊N1亞型相關(guān)。根據(jù)此方面，所述單價(jià)H5疫苗包括預(yù)防有效量的免疫原性劑。在一 個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫原性劑包括本文所述修飾的冊蛋白或其抗原性部分或者編碼本文 所述修飾的冊蛋白的核酸或其抗原性部分。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述抗原性部分包括本 文所述修飾的H5蛋白的表位。在另外一個(gè)實(shí)施方式中，所述對象可W是人、家養(yǎng)動(dòng)物（狗、 貓、猴等）；牲畜（馬、牛、綿羊、山羊、豬等）、野鳥(野碟、野鴨等)和家養(yǎng)禽類(雞、鴨、碟等）。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫原性劑是含本文所述修飾的H5蛋白的病毒或是本文所述重組 病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒或重組病毒失活。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒或 重組病毒是減毒病毒。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒或重組病毒采用病毒體或病毒樣顆 粒的形式(美國專利號8,592,197)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述病毒或重組病毒是蛋衍生或 細(xì)胞培養(yǎng)物衍生。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫原性劑是含本文所述修飾的H5蛋白的裂 解病毒或是裂解病毒抗原性制備物。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫原性劑是修飾的H5蛋白或其抗原性部分。在另一個(gè) 實(shí)施方式中，所述修飾的冊蛋白或其抗原性部分已分離。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾的 H5蛋白或其抗原性部分通過表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)系統(tǒng)是任何表達(dá) 系統(tǒng)，如病毒表達(dá)載體，其中修飾的冊蛋白或其抗原性部分在病毒表面呈現(xiàn)或展示。在一個(gè) 實(shí)施方式中，所述病毒表達(dá)載體是任何病毒表達(dá)載體，如改良痘苗病毒表達(dá)載體、腺病毒表 達(dá)載體、痘病毒表達(dá)載體、桿狀病毒表達(dá)載體等。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述表達(dá)載體是桿狀 病毒表達(dá)載體，呈現(xiàn)或展示修飾的H5蛋白或其抗原性部分的病毒是桿狀病毒。在另一個(gè)實(shí) 施方式中，所述免疫原性劑是編碼修飾的H5蛋白或其抗原性部分的核酸，其能在對象中表 達(dá)。運(yùn)類載體或表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)生和應(yīng)用為本領(lǐng)域熟知。參見例如美國專利號8,592,558。
[0060] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫原性劑是含修飾的冊蛋白的病毒或重組病毒。所 述病毒或重組病毒可W是含本文所述修飾的H5蛋白的滅活病毒，含本文所述修飾的H5蛋白 的活病毒致病形式，W及病毒制品和/或片段，其中所述制品和/或片段包括本文所述修飾 的冊蛋白。運(yùn)種免疫原性劑的產(chǎn)生和應(yīng)用為本領(lǐng)域熟知。參見例如美國專利號8,592,558。 [0061 ]提高流感疫苗效力的策略包括使用佐劑(Wood和Wi 11 iams，同上），共施用免疫刺 激分子(Salgaller和Lodge, 199)和粘膜免疫策略。粘膜免疫策略包括在微膠囊中包封病毒 (美國專利號5,075，109、5,820,883和5,853,763)和使用免疫增強(qiáng)的膜運(yùn)載體(胖0 98/ 0558)。另外，口服施用的免疫原的免疫原性能用紅血球(rbc)或rbc影泡（美國專利號5， 643,577)或用藍(lán)舌抗原(美國專利號5,690,938)增強(qiáng)。也參見美國專利號8,592,558。
[0062] 若必要，免疫原性劑可一中性或鹽形式配制成組合物。藥學(xué)上可接受鹽包括酸加 成鹽（與膚的游離氨基形成），其用無機(jī)酸例如鹽酸或憐酸或者有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石 酸、馬來酸等形成。與游離簇基形成的鹽還可獲自無機(jī)基礎(chǔ)如氨氧化鋼、鐘、錠、巧或鐵，有 機(jī)基礎(chǔ)如異丙胺、Ξ甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
[0063] 本發(fā)明所述藥物組合物的配制能根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法學(xué)完成。一 般，合適的組合物可根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知方法制備且包括藥學(xué)上可接受稀釋劑、 佐劑和/或賦形劑。所述稀釋劑、佐劑和賦形劑必須在與其它組合物成分相容方面是"可接 受的"且對其受體無害。參見例如《雷明頓:藥物科學(xué)和實(shí)踐》，第21版，D.B.Troy編，己爾的 摩的利平科特?威廉斯·威爾金斯出版公司，2006,在此通過引用納入本文。還參見美國專 利號8,592,558。
[0064] 藥學(xué)上可接受稀釋劑的示例是軟化水或蒸饋水;鹽溶液;基于植物的油如花生油、 紅花油、橄攬油、棉花巧油、玉米油、芝麻油如花生油、紅花油、橄攬油、棉花巧油、玉米油、芝 麻油、落花生油或挪子油;硅油，包括聚硅氧烷，如聚甲基硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基 聚硅氧烷;揮發(fā)性娃酬;礦物油如液體石蠟、軟石蠟或角整燒;纖維素衍生物如甲基纖維素、 乙基纖維素、簇甲基纖維素、簇甲基纖維素鋼或徑丙基甲基纖維素;低級燒醇，例如乙醇或 異丙醇;低級芳燒醇;低級聚亞烷基二醇或低級亞烷基二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二 醇、丙二醇、1,3-下二醇或甘油;脂肪酸醋如棟桐酸異丙醋、肉豆違酸異丙醋或油酸乙醋;聚 乙締化咯燒酬;瓊脂；角叉菜膠;黃著膠或阿拉伯樹膠和凡±林。一種或多種運(yùn)載體通常形 成1 % -99.9 %重量的組合物。所述稀釋劑最優(yōu)選鹽水。
[0065] 對于作為注射溶液或懸液施用，無毒腸胃外可接受稀釋劑或運(yùn)載體能包括林格氏 溶液、中鏈甘油Ξ醋(MCT)、等滲鹽水、憐酸鹽緩沖鹽水、乙醇和1，2丙二醇?？诜玫暮线m運(yùn) 載體、稀釋劑、賦形劑和佐劑的一些示例花生油、液體石蠟、簇甲基纖維素鋼、甲基纖維素、 藻酸鋼、阿拉伯樹膠、黃著膠、右旋糖、薦糖、山梨醇、甘露醇、明膠和卵憐脂。另外，運(yùn)些口服 制劑可包含合適的調(diào)味劑和著色劑。用于膠囊形式時(shí)，膠囊可包被有化合物如延遲分解的 單硬脂酸甘油醋或雙硬脂酸甘油醋。
[0066] 佐劑通常包括軟化劑、乳化劑、增稠劑、防腐劑、殺菌劑和緩沖劑。用于組合物制備 的佐劑或免疫刺激組分包括但不限于侶鹽、礦物油、分枝桿菌產(chǎn)物(如弗氏完全或不完全佐 劑)或載劑如植物糖巧皂巧、膽固醇和憐脂酷膽堿的混合物，其提供載劑用于在籠狀結(jié)構(gòu)上 呈現(xiàn)數(shù)個(gè)蛋白拷貝。出于本說明書目的，佐劑是加強(qiáng)、增加、緩和或提高對免疫原或抗原的 免疫應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑通常增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但對其中之一的反應(yīng)增加而缺乏另 一種能夠定義佐劑。此外，佐劑和其應(yīng)用為免疫學(xué)家熟知并一般用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答，此時(shí)免 疫原劑量受限、免疫原為弱免疫原性或施用途徑是次佳的。因此，術(shù)語"輔佐量(adjuvating amount)"是能增強(qiáng)對給定免疫原或抗原的免疫應(yīng)答的佐劑量。等于"輔佐量"的質(zhì)量可變且 取決于多種因素，包括但不限于免疫原特征、所施用免疫原的量、宿主種類、施用途徑和免 疫原施用操作。"輔佐量"能通過施用特定環(huán)境組的常規(guī)實(shí)驗(yàn)容易定量。運(yùn)在普通技術(shù)人員 范圍內(nèi)且通常采用常規(guī)劑量反應(yīng)測定不同量的所施用免疫原和佐劑。反應(yīng)如下測量:測定 對免疫原的血清抗體效價(jià)或細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)，用酶聯(lián)免疫吸附測定、放射免疫分析、血凝試驗(yàn) 等。佐劑的應(yīng)用為本領(lǐng)域熟知。參見例如美國專利號8，592，558。
[0067] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑加入的量為每劑約10化g-約lOmg。在另一個(gè)實(shí)施方 式中，所述佐劑加入的量為每劑約50化g-約lOmg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑加入的量 為每劑約5(K)yg-約5mg。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑加入的量為每劑約75化g-約2.5mg。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述佐劑加入的量為每劑約Img。
[0068] 用于口服施用的固體形式可包含人和獸醫(yī)藥物實(shí)踐中可接受的粘合劑、甜味劑、 崩解劑、稀釋劑、調(diào)味劑、涂層劑、防腐劑、潤滑劑和/或延時(shí)劑。合適的粘合劑包括阿拉伯樹 膠、明膠、玉米淀粉、黃著膠、藻酸鋼、簇甲基纖維素或聚乙二醇。合適的甜味劑包括薦糖、乳 糖、葡萄糖、阿斯己甜或糖精。合適的崩解劑包括玉米淀粉、甲基纖維素、聚乙締化咯燒酬、 瓜爾豆膠、黃原膠、皂±、藻酸或瓊脂。合適的稀釋劑包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高 嶺±、纖維素、碳酸巧、娃酸巧或憐酸氨巧。合適的調(diào)味劑包括薄荷油，冬青、樓桃、澄或覆盆 子味的油。合適的涂層劑包括丙締酸和/或甲基丙締酸和/或其醋、蠟、脂肪醇、玉米蛋白、蟲 膠或教質(zhì)的聚合物或共聚物。合適的防腐劑包括苯甲酸鋼、維生素 Ε5α-生育酪、抗壞血酸、 對徑基苯甲酸甲醋、對徑基苯甲酸丙醋或亞硫酸鋼。合適的潤滑劑包括硬脂酸儀、硬脂酸、 油酸鋼、氯化鋼或滑石。
[0069] 除了上述試劑，用于口服施用的液體形式可包含液體運(yùn)載體。合適的液體運(yùn)載體 包括水，油如橄攬油、花生油、芝麻油、葵花油、紅花油、落花生油、挪子油、液體石蠟、乙二 醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、異丙醇、甘油、脂肪醇、甘油Ξ醋或其混合物。
[0070] 用于口服施用的懸液還可包括分散劑和/或懸浮劑。合適的懸浮劑包括簇甲基纖 維素鋼、甲基纖維素、徑丙基甲基纖維素、聚乙締化咯燒酬、藻酸鋼或乙酷醇。合適的分散劑 包括卵憐脂、脂肪酸聚氧乙締醋如硬脂酸、聚氧乙締山梨醇單或二油酸醋、硬脂酸醋或月桂 酸醋、聚氧乙締山梨糖醇酢單或二油酸醋、硬脂酸醋或月桂酸醋等。用于口服施用的乳劑還 可包括一種或多種乳化劑。合適的乳化劑包括上面所示例的分散劑或天然樹膠如瓜爾豆 膠、阿拉伯樹膠或黃著膠。
[0071] 本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚了解制備腸胃外可施用組合物的方法，并更詳細(xì)描述于例如 《雷明頓:藥物科學(xué)和實(shí)踐》，第21版，D.B.Troy編，己爾的摩的利平科特?威廉斯·威爾金 斯出版公司，2006，在此通過引用納入本文。
[0072] 所述組合物可納入任何合適的表面活性劑如陰離子、陽離子或非離子型表面活性 劑例如山梨酸醋或其聚氧乙締衍生物。還可納入懸浮劑如天然樹膠、纖維素衍生物或無機(jī) 材料如火成娃石W及其它成分如羊毛脂。
[0073] 組合物制備使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法。運(yùn)種組合物通常制備為注射 劑，作為液體溶液或懸液;也可制備適合溶于或懸于注射前液體的固體形式。所述制劑還可 乳化?；钚悦庖咴猿煞滞ǔＥc賦形劑混合，所述賦形劑是藥學(xué)上可接受的且與活性成分 相容。
[0074] 在第四方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生針對禽流感病毒的保護(hù)性免疫的方法，所述方法包 括給對象施用預(yù)防有效量的本文所述單價(jià)冊疫苗。
[0075] 本發(fā)明的組合物可采用固體、液體或氣溶膠形式W合適的藥物有效劑量給對象施 用。固體組合物示例包括藥丸、乳膏和植入式劑量單位。藥丸可口服施用。治療性乳膏可外 用施用。植入式劑量單位可局部施用，例如在腫瘤位點(diǎn)，或可植入W系統(tǒng)性釋放治療組合 物，例如皮下。液體組合物示例包括適于肌肉內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)注射的制劑W及用于 外用和眼內(nèi)施用的制劑。氣溶膠制劑示例包括用于肺施用的吸入制劑。
[0076] 所述組合物可通過標(biāo)準(zhǔn)施用途徑施用。待用于任何給定環(huán)境的具體施用途徑取決 于多種因素，包括待治療疾病性質(zhì)、疾病的嚴(yán)重性和程度、待遞送的特定化合物所需劑量W 及所需疫苗或組合物的潛在副作用。例如，在要求合適濃度的所需疫苗或組合物直接遞送 到待治療位點(diǎn)的情況下，施用可W是區(qū)域性的而不是全身。區(qū)域施用提供遞送極高局部濃 度的所需疫苗或組合物到需要位點(diǎn)的能力，并因而適合實(shí)現(xiàn)所需治療或預(yù)防效果而同時(shí)避 免其它身體器官暴露于疫苗或組合物且由此可能降低副作用。施用策略為本領(lǐng)域熟知。參 見例如美國專利號8,592,558。
[0077] -般，所述組合物可通過外用、口服、直腸、經(jīng)鼻、皮內(nèi)、腹腔內(nèi)或腸胃外（例如靜脈 內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)）途徑施用。另外，所述組合物可納入持續(xù)釋放基質(zhì)如生物可降解聚合物， 將聚合物植入需要遞送位置如腫瘤位點(diǎn)附近。所述方法包括單一劑量施用，W重復(fù)劑量在 預(yù)定時(shí)間間隔施用，持續(xù)施用預(yù)定時(shí)間段。本文所用的持續(xù)釋放基質(zhì)是由材料構(gòu)成的基質(zhì)， 通常是可由酶或酸/堿水解或者通過溶解來降解的聚合物。一旦插入體內(nèi)，酶和體液對基質(zhì) 起作用。所述持續(xù)釋放基質(zhì)理想上由生物相容性材料選擇，如脂質(zhì)體、聚丙交醋(聚乳酸）、 聚乙交醋（乙醇酸聚合物）、聚丙交醋-乙交醋(乳酸和乙醇酸共聚物）、聚酸酢、聚原酸醋、多 膚、透明質(zhì)酸、膠原、硫酸軟骨素、簇酸、脂肪酸、憐脂、多糖、核酸、多聚氨基酸、氨基酸如苯 丙氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、多核巧酸、聚乙締丙締、聚乙締化咯燒酬和娃酬。優(yōu)選的生物降 解性基質(zhì)是聚丙交醋、聚乙交醋或聚丙交醋-乙交醋(乳酸和乙醇酸共聚物)之一的基質(zhì)。
[0078] 若需要，含適合持續(xù)或間歇性釋放的免疫原性劑的裝置或組合物能實(shí)際植入體內(nèi) 或局部應(yīng)用W相對緩釋運(yùn)類材料到體內(nèi)。
[0079] 施用表達(dá)載體或宿主細(xì)胞可包括經(jīng)直接口服、全身注射遞送，或遞送到選定組織 或細(xì)胞，或經(jīng)遞送到分離自對象或相容供體的細(xì)胞來間接遞送。關(guān)于基于核酸的組合物，本 發(fā)明考慮運(yùn)類組合物的所有遞送模式。
[0080] 所述組合物還可W脂質(zhì)體形式施用。脂質(zhì)體一般獲自憐脂或其它脂質(zhì)，并通過分 散于水介質(zhì)的單或多層水化液晶形成。能使用任何無毒、生理上可接受和可代謝液體，所述 液體能形成脂質(zhì)體。采用脂質(zhì)體形式的組合物可包含穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑等。優(yōu)選的液 體是中性和合成的憐脂和憐脂酷膽堿(卵憐脂）。形成脂質(zhì)體的方法為本領(lǐng)域熟知。
[0081] 就任何特定對象而言所施用化合物的有效劑量水平取決于多種因素，包括:所治 療疾病類型和疾病階段;所用化合物的活性;所用組合物;對象的年齡、體重、總體健康、性 別和飲食;施用時(shí)間；施用途徑;化合物隔離速率；治療持續(xù)時(shí)間；與治療聯(lián)用或一致的藥 物，W及本領(lǐng)域熟知的其它相關(guān)因素。
[0082] 蛋白質(zhì)性質(zhì)的藥物活性物質(zhì)可存在的量為每劑Ing-lOmg。一般，根據(jù)本發(fā)明，施用 方案的范圍應(yīng)為0. ：Lyg-10mg抗體，特別是1 .Oyg-l .Omg范圍，更特別是1 .Oyg-lOOyg范圍，所 有落入運(yùn)些范圍內(nèi)的個(gè)體數(shù)字也是發(fā)明的一部分。如果施用通過連續(xù)輸注發(fā)生，更合適的 劑量范圍可為每小時(shí)O.Olyg-lOmg單位/千克體重，所有落入運(yùn)些范圍內(nèi)的個(gè)體數(shù)字也是發(fā) 明的一部分。
[0083] 施用一般是腸胃外，如靜脈內(nèi)。腸胃外施用的制劑包括無菌的水性或非水性溶液、 懸液和乳液。非水性溶劑包括但不限于丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄攬油和可注射有機(jī)醋 如油酸乙醋。水性溶劑可選自水、醇/水性溶液、乳液或懸液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外 載劑包括氯化鋼溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鋼、乳酸林格氏液或固定油。靜脈內(nèi)載 劑包括液體和營養(yǎng)物補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏葡萄糖的那些)等。防腐劑也可 存在，例如抗菌劑、抗氧化劑、馨合劑、惰性氣體等。
[0084] 所述藥物組合物還可包括蛋白質(zhì)運(yùn)載體，例如血清白蛋白或免疫球蛋白，尤其是 人來源的。其它生物活性劑可根據(jù)預(yù)期用途存在于本發(fā)明的藥物組合物中。
[0085] 在第五方面，本發(fā)明提供預(yù)防或治療禽流感病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括 給對象施用預(yù)防有效量的單價(jià)H5疫苗。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述預(yù)防或治療可延遲禽流感 發(fā)作或減緩發(fā)展速度。單價(jià)冊疫苗如上所述。合適的組合物、施用和劑量如上所述。
[0086] 在第六方面，本發(fā)明提供單價(jià)H5疫苗用于刺激針對禽流感病毒的免疫應(yīng)答的應(yīng) 用。單價(jià)冊疫苗如上所述。
[0087] 在第屯方面，本發(fā)明提供本文所述修飾的冊蛋白或本文所述重組禽流感病毒用于 制備引發(fā)對象中的保護(hù)性免疫應(yīng)答的藥物的應(yīng)用。
[0088] 在第八方面，本發(fā)明提供本文所述修飾的冊蛋白或本文所述重組禽流感病毒用于 制備預(yù)防對象患上冊N1亞型禽流感的藥物的應(yīng)用。
[0089] 在第九方面，本發(fā)明提供本文所述修飾的H5蛋白或本文所述重組禽流感病毒用于 制備藥物中的應(yīng)用，所述藥物用于延遲冊N1亞型禽流感感染的對象中的冊N1亞型禽流感發(fā) 作或減緩所述疾病的速度。
[0090] 在第十方面，本發(fā)明提供制備疫苗的方法，包括采用本文所述修飾的H5蛋白或本 文所述重組禽流感病毒。
[0091 ]在第十一方面，本發(fā)明提供本文所述修飾的冊蛋白或本文所述重組禽流感病毒用 于疫苗開發(fā)的應(yīng)用。
[0092] 在第十二方面，本發(fā)明提供本文所述修飾的H5蛋白或本文所述重組禽流感病毒， 用于疫苗開發(fā)。
[0093] 如本文所示，基于表位工程化W開發(fā)廣泛免疫原性的冊W呈現(xiàn)來自不同主要冊N1 株的代表性表位。在小鼠模型中顯示表達(dá)針對多個(gè)H5N1進(jìn)化枝的表位-嵌合H5的單價(jià)疫苗 應(yīng)用，所述模型用系統(tǒng)發(fā)育變異的冊N1株攻擊。
[0094] 除非另有說明，本發(fā)明實(shí)踐采用化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA、遺傳學(xué)、免 疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)基因生物學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)，其在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。參見例 如Maniatis等，《分子克隆》(Molecular Cloning)(紐約州冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社）； Sambrook等，1989，《分子克隆》，第2版(紐約州冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社）；Sambrook和 Russell ,2001，《分子克隆》，第3版（紐約州冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社）；Green和 Sambrook, 2012,《分子克隆》，第4版(紐約州冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社）；Ausube 1等， 1992,《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(約翰威利父子出版公司，包括定期更新）；Glover，1985， 《D N A克隆》（牛津的I化出版社）；R U S S e 11，19 8 4，《植物分子生物學(xué)：實(shí)驗(yàn)室課程手冊》 (Molecular biology of plants:a laboratory course manual)(紐約州冷泉港的冷泉港 實(shí)驗(yàn)室出版社）；Anand,《復(fù)雜基因組的分析技術(shù)KTechniques for the Analysis of Complex Genomes),(紐約的學(xué)術(shù)出版社（Academic Press), 1992) ;Guth;rie和Fink,《酵母 遺傳學(xué)和分子生物學(xué)指南》(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology)(紐約的 學(xué)術(shù)出版社，1991);Harlow和Lane, 1988,《抗體》(Antibodies),(紐約州冷泉港的冷泉港實(shí) 驗(yàn)室出版社）；《核酸雜交》（8.0.化11163&5.1.化旨旨1113編.1984);《轉(zhuǎn)錄和翻譯》（8.0.化11163& S.J.Higgins編.1984);《培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞KR.I.化eshn巧，Alan R丄iss公司，1987);《固定化 細(xì)胞和酶》（I化出版社，1986);B.Perbal，《分子克隆實(shí)踐指南K1984);專著《酶學(xué)方法》 (Methods In Enzymology)(紐約的學(xué)術(shù)出版社）；《酶學(xué)方法》，卷154和155(Wu等編），《細(xì)胞 和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》（Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology) (Mayer和Wa化er編，倫敦的學(xué)術(shù)出版社，1987);《實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊》化amlbook Of Experiment! Immunology),卷I-IV(D.Μ.Weir和C.C.Blackwell編，1986) ;Riott,《基礎(chǔ)免 疫學(xué)HEssential Immunology ),第6版，牛津的布萊克威爾出版公司（Blackwel 1 Scientific Publications), 1988;Fire等，《RNA干擾技術(shù)：從基礎(chǔ)科學(xué)到藥物開發(fā)》（RNA Interference Technology :From Basic Science to Drug Development),劍橋的劍橋大 學(xué)出版社（Cambridge University Press ), 2005; Schepers,《RNA干擾實(shí)踐》（RNA Intederence in Practice),威利-VCH出版公司（Wil巧-VCH)，2005;Engelke，《RNA干擾 (RNAi):siRNA技術(shù)的螺栓與螺母KRNA Interference(RNAi):The Nuts&Bolts of siRNA Technology)，DNA出版社(DNA Press)，2003;Gott，《RNA干擾、編輯和修飾:方法和操作(分 子生物學(xué)方法）》（RNA Inte;rference,Editing,and Modification:Methods and P;rotocols(Methods in Molecular Biology)),新澤西州托托華的胡馬納出版社（Human Press),2004;Sohail,《通過RNA干擾的基因沉默：技術(shù)和應(yīng)用》（Gene Silencing by RNA Interference:Technology and Application),CRC,2004。 實(shí)施例
[OOM]本發(fā)明通過參考W下實(shí)施例闡明，所述實(shí)施例W舉例方式提供且不意在W任何方 式限制本發(fā)明。采用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或W下具體描述的技術(shù)。
[0096] 實(shí)施例1、材料和方法
[0097] 道德聲明：所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)日本國立傳染病研究所(NIID)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南完成。 實(shí)驗(yàn)操作由新加坡的新加坡國立大學(xué)淡馬錫生命科學(xué)研究院機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì) 評估并批準(zhǔn)。（IACU巧比準(zhǔn)號Τα-12-01)。
[0098] 設(shè)及人Η5Ν1株的所有實(shí)驗(yàn)在生物安全3級（Β化-3)密閉度的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，遵照 CDC/NIH和W冊建議并由新加坡糧農(nóng)與獸醫(yī)局(AVA)批準(zhǔn)。
[0099] 病毒和細(xì)胞系:冊Ν1人流感病毒Α/印尼/CDC669/2006獲自印度尼西亞共和國衛(wèi)生 部(Μ0Η)。來自不同系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化枝或亞進(jìn)化枝的Η5Ν1病毒通過反向遺傳學(xué)捶救。簡言之， Η5Ν1病毒的血凝素化Α)和神經(jīng)氨酸酶(ΝΑ)基因在NCBI流感病毒數(shù)據(jù)庫的序列基礎(chǔ)上合成 (金斯瑞(GenScript))，所述病毒來自進(jìn)化枝1.0(Α/越南/1203/2004)、進(jìn)化枝2.2.1.1 (Α/ 埃及/3300-NAMRU3/2008)、進(jìn)化枝2.2(Α/斑頭雁/青海/12/05)、2.3.2.1 (Α/秋田市/1/08)、 2.3 (Α/安徽/1/05和Α/江蘇/2/07)、4 (Α/碟/貴陽/337/06)、7.0 (Α/雞/ 山西/2/06)和7.1 (Α/ 越南/NCVD-03/08)。合成的ΗΑ和ΝΑ基因克隆到雙啟動(dòng)子質(zhì)粒W用于甲型流感病毒反向遺傳 學(xué)(Prabakaran等，2009曰）。雙啟動(dòng)子質(zhì)粒獲自佐治亞州亞特蘭大的美國疾病控制與預(yù)防中 屯、。重配病毒如下捶救:將含HA和NAW及剩余6個(gè)流感病毒基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到共培養(yǎng)的293T 和MDCK細(xì)胞，所述流感病毒基因獲自高生長主要毒株A/波多黎各/8/34化1N1)，使用脂質(zhì)體 2000(英杰公司（Invitrogen Co巧.））。轉(zhuǎn)染后72h，培養(yǎng)基接種到雞胚或MDCK細(xì)胞中。來自 第二傳代的重配病毒的HA和NA基因進(jìn)行測序W確認(rèn)所引入HA和NA基因的存在W及沒有突 變。病毒儲(chǔ)液在10天大雞胚的尿囊腔中繁殖，收獲含尿囊液的病毒并在80°C等分保存。病毒 含量通過前述標(biāo)準(zhǔn)血凝試驗(yàn)測定化e等，2008)。
[0100] MDCK細(xì)胞維持于含10%胎牛血清(FBS;美國生命技術(shù)公司化ife Technologies)) 的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM;美國生命技術(shù)公司）d293T維持于含5%FBS的化ti- MEMI(美國生命技術(shù)公司）。4她后，收集轉(zhuǎn)染的上清并通過標(biāo)準(zhǔn)血凝試驗(yàn)測定病毒效價(jià)。然 后，通過Muench-Reed法（Reed和Muench , 1938)計(jì)算重配病毒的組織培養(yǎng)物感染劑量50 (TCIDso)。
[010。 mAb的生產(chǎn)和表征:使用不同冊中和性mAb組(panel)DmAb如前所述產(chǎn)生。簡言之， BALB/c小鼠免疫2次（隔2周），運(yùn)是通過皮下注射個(gè)體BEI-滅活冊N1病毒(A/印尼/CDC669/ 2006、A/越南/1203/2004或A/安徽/1/05)進(jìn)行的，所述病毒混合有Montanide ISA563佐劑 (法國賽比克(Seppic))。小鼠在脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合前3天接受額外靜脈注射同一病毒 抗原。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清通過免疫巧光測定篩選。產(chǎn)生特異性mAb的雜交瘤通過有限稀 釋、擴(kuò)增和進(jìn)一步繼代培養(yǎng)來克隆。使雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清澄清并如下所述測試血凝抑制 活性。
[0102] 血凝抑制試驗(yàn):血凝抑制化I)試驗(yàn)如前所述進(jìn)行(Pra化U等,2009)。簡言之，mAb或 受體破壞酶(RDE)處理的血清在V形底96孔板中連續(xù)稀釋(2倍)并混合4HA單位的H5病毒。平 板室溫解育30分鐘，向各孔加入1 %雞RBC。血凝抑制終點(diǎn)是其中未觀察到血凝的最高抗體 稀釋。
[0103] 微量中和試驗(yàn):mAb或血清針對H5株的中和活性通過前述微量中和試驗(yàn)分析化e 等，2013)。簡言之，抗體樣品連續(xù)2倍稀釋并與100TCID50的不同冊株進(jìn)化枝一起室溫解育 化，一式兩份接種于96孔板中生長的MDCK細(xì)胞。中和效價(jià)評價(jià)為其中未通過光學(xué)顯微鏡觀 察到細(xì)胞病變效應(yīng)的最高抗體稀釋。
[0104] 免疫和攻擊:無特異性病原體的雌性BALB/c小鼠（6周齡)獲自新加坡國立大學(xué)實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中屯、。每實(shí)驗(yàn)組10只小鼠，用lOOuKHA效價(jià)，128)攜帶通用HA的滅活RG冊N1病毒或 其它滅活冊 N1 病毒(A/印尼/CDC669/2006 和 A/越南/1203/2004)，與佐劑 MontanideISA563 (油包水乳劑;法國賽比克)一起皮下接種疫苗2次，定期間隔14天。有相同佐劑的PBS用作參 照疫苗對照。在第28天從每實(shí)驗(yàn)組10只小鼠收集血清。測量血凝抑制活性和血清進(jìn)化枝交 叉中和抗體的水平。
[0105] 最終疫苗接種后3周，小鼠轉(zhuǎn)至動(dòng)物BSk3防范設(shè)施。每組8只小鼠用5個(gè)50 %小鼠 致死劑量(MLD50)的進(jìn)化枝1.0(A/越南/1203/2004)、進(jìn)化枝2.UA/印尼/CDC669/2006)、進(jìn) 化枝2.3(A/安徽/1/05)和進(jìn)化枝2.2.1.1 (A/埃及/3300-NAMRU3/2008)HPAI 冊N1病毒株鼻 內(nèi)攻擊。定鼻內(nèi)攻擊實(shí)驗(yàn)所需的流感病毒的MLD50是預(yù)先確定的。每日觀察小鼠 W監(jiān)測體重 和死亡率。連續(xù)監(jiān)測，直至動(dòng)物死亡或直至攻擊后14天。
[0106] 病理組織學(xué)分析:解剖小鼠，肺保存在10 % (wt/vol)中性緩沖福爾馬林中，石蠟包 埋，切片。切片用化st-choice(Amersco)脫蠟，并在順序漸進(jìn)乙醇浴中再水合。載玻片用蘇 木精和伊紅染色，通過光學(xué)顯微鏡(英國的奧林己斯(Olympus))進(jìn)行病理學(xué)評價(jià)。通過數(shù)字 成像系統(tǒng)(美國的尼康(Wkon))捕捉圖像。
[0107] 統(tǒng)計(jì)分析:數(shù)據(jù)表示為算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)或標(biāo)準(zhǔn)誤差（SE)。進(jìn)行非配對 雙尾學(xué)生t檢驗(yàn)W確定2組均值之間差異的顯著性水平。單向方差分析(AN0VA)還用于檢驗(yàn) 組間差異，Tuk巧真實(shí)顯著差異化SD)事后檢驗(yàn)用于確定哪些組顯著與眾不同。所有統(tǒng)計(jì)分 析用SigmaStat 2.0(Jandel公司（Jandel Corporation))軟件完成。顯著性水平表示為 0.05的P值。
[0108] 實(shí)施例2、來自單一冊上不同進(jìn)化枝的主要冊表位組合
[0109] 分離自2006年人致死病例的A/印尼/CDC669/06是來自進(jìn)化枝2的代表性株之一， 進(jìn)化枝2是冊系統(tǒng)發(fā)育樹中最大的進(jìn)化枝(Shore等，2013)。此研究中，CDC669的冊選作表位 嵌合H5化C冊）的骨架。等同于H1結(jié)構(gòu)中的那些(Caton等，1982)的主要抗原位點(diǎn)的蛋白序 列在來自不同進(jìn)化枝的冊N1中比對（圖1)。氨基酸位置155、156和189被示為冊上所有抗原 區(qū)的一些最大變化位點(diǎn)。3個(gè)氨基酸突變成其它進(jìn)化枝位置上的其它主要形式，其不同于野 生型CDC669上初始的那些。3個(gè)突變單獨(dú)表示為S155N、T156A和R189K。設(shè)及表位的剩余氨基 酸保持未變W維持進(jìn)化枝2.1CDC669的抗原特性。因此，不同進(jìn)化枝的代表性表位在單一 H5 上共同展示W(wǎng)引發(fā)進(jìn)化枝交叉免疫。
[0110] 實(shí)施例3、鑒定表位-嵌合冊
[0111] 表位-嵌合冊在有PR8背景的RG冊N1病毒中表達(dá)。冊在受感染MDCK細(xì)胞中的表達(dá) 用mAb 2D9測定，mAb 2D9是廣泛識(shí)別冊的mAb(Prabakaran等，2009b)。血凝活性用EC冊在 HA試驗(yàn)中檢測。中和性mAb組如前在小鼠中產(chǎn)生，小鼠單獨(dú)用進(jìn)化枝1.0 (A/越南/1203/ 2004)、進(jìn)化枝2.UA/印尼/CDC669/2006)或進(jìn)化枝2.3(A/安徽/1/05)免疫。進(jìn)行用運(yùn)些mAb 的HI試驗(yàn)W比較EC冊與野生型CDC669之間的抗原性。如表1所示，EC冊能通過所有測試的 冊mAb來識(shí)別及中和，除了進(jìn)化枝1特異性mAb即11G12化e和Kwang, 2013) <XDC669無法與許 多產(chǎn)生自其它冊N1的mAb相互作用。一些能中和CDC669的mAb在HI試驗(yàn)中顯示針對EC冊的 更高效價(jià)。觀察表明EC H5從CDC669呈現(xiàn)不同抗原特性。表位中的突變允許EC H5易受用變 異單抗中和的影響。
[0112] 實(shí)施例4、血清中的交叉進(jìn)化枝中和抗體效價(jià)
[0113] 血凝抑制化I)效價(jià)測量抑制HA功能的抗體應(yīng)答的功效。如圖2A所示，在第28天，來 自RG-EC單價(jià)疫苗免疫小鼠的血清有效誘導(dǎo)針對不同進(jìn)化枝異源病毒的HAI效價(jià)。相較于來 自其它異源單價(jià)株的血清，用來自RG-EC組的血清觀察到針對進(jìn)化枝1、進(jìn)化枝2、進(jìn)化枝4和 進(jìn)化枝7的所有所測試的毒株的更高效價(jià)。RG-EC H5接種小鼠的樣品針對進(jìn)化枝1.0(A/越 南/1203/2004)或進(jìn)化枝2.UA/印尼/CDC669/2006)的HI效價(jià)低于同源疫苗接種組。進(jìn)行病 毒中和W確定負(fù)責(zé)針對流感的保護(hù)性免疫的功能性抗體（圖2B)。在HI和病毒中和試驗(yàn)中都 觀察到類似的比較結(jié)果，證實(shí)表位-嵌合冊顯示提高的進(jìn)化枝交叉免疫原性并表明EC冊相 比其它單價(jià)株能引起更廣泛的針對多個(gè)冊N1進(jìn)化枝的保護(hù)。
[0114] 實(shí)施例5、接種疫苗后的攻擊研究
[0115] 最終免疫后3周，所有小鼠組用5MLD50的HPAI冊N1病毒株鼻內(nèi)攻擊，所述病毒株 來自進(jìn)化枝1. 〇(A/越南/1203/2004)、進(jìn)化枝2.1 (A/印尼/CDC669/2006)、進(jìn)化枝2.3(A/安 徽/1/05)和進(jìn)化枝2.2.1.1 (A/埃及/3300-NAMRU3/2008)。用RG-EC H5免疫的小鼠組獲得 100%針對進(jìn)化枝2.1、進(jìn)化枝2.2和進(jìn)化枝2.3病毒的保護(hù)（圖3(：、36和36)^及針對進(jìn)化枝 1.0的87.5%存活率(圖3A)。然而，用其它單價(jià)冊N1疫苗免疫的小鼠僅分別顯示針對任何異 源攻擊的50%-75%存活率。
[0116] 不同組的多種體重下降趨勢指示感染進(jìn)程。在用RG-EC冊株免疫的小鼠組中，不 同異源冊N1分別攻擊后沒有觀察到小鼠體重的顯著降低（《13.3 % )(圖3B、3D、3F和3G)。然 而，接種有其它單一 H5N1株的小鼠針對任何異源攻擊顯示至少17%的體重減少，盡管體重 在攻擊后6天逐步恢復(fù)。RG-EC冊組在CDC669同源攻擊后呈現(xiàn)與CDC669組（<1.9%)類似的 體重減少，而在其它異源攻擊后相較于CDC669疫苗接種顯示防止體重減少方面有顯著改 進(jìn)。
[0117] 對接種有不同單價(jià)冊N1株并用進(jìn)化枝2.3 (A/安徽/1/05)或進(jìn)化枝2.2.1.1 (A/埃 及/3300-NAMRU3/2008)HPAI冊N1病毒攻擊的小鼠進(jìn)行組織病理學(xué)研究。在感染后第5天， 接種有進(jìn)化枝1. 〇(A/越南/1203/2004)、進(jìn)化枝2.1 (A/印尼/CDC669/2006)或PBS的小鼠的 肺在異源攻擊后有肺損傷，由中度到重度壞死性支氣管炎和帶相關(guān)肺水腫的組織細(xì)胞性肺 泡炎組成（圖4)dRG-EC H5免疫小鼠在進(jìn)化枝2.3(A/安徽/1/05)攻擊后沒有損傷且針對進(jìn) 化枝2.2.1.1 (A/埃及/3300-NAMRU3/2008)冊N1病毒攻擊僅有極少支氣管炎。
[0118] 此外，通過測量小鼠肺中的病毒效價(jià)，在病毒攻擊后于H5接種小鼠內(nèi)評估肺中的 病毒負(fù)荷（圖5)。在病毒攻擊后第4天收集肺，此時(shí)在感染但未治療小鼠中檢測到大于106的 高病毒效價(jià)，所述小鼠在次日內(nèi)死亡。RG-EC H5免疫小鼠在進(jìn)化枝2.3 (A/安徽/1/05)或進(jìn) 化枝2.2.1.1 (A/埃及/3300-NAMRU3/2008)攻擊后相較其它單價(jià)疫苗接種顯示最低病毒負(fù) 荷。進(jìn)化枝l.〇(A/越南/1203/2004)攻擊后，RG-EC H5接種小鼠肺的病毒效價(jià)比進(jìn)化枝2.1 (A/印尼/CDC669/2006)免疫組低至少10倍，盡管接種同源株的組呈現(xiàn)甚至更低效價(jià)。
[0119] 所有運(yùn)些結(jié)果表明RG-EC H5免疫相較其它單價(jià)疫苗提供更有效保護(hù)抵御變異的 異源攻擊。
[0120] 實(shí)施例6、討論
[0121] 流感A/H5N1病毒的新亞譜系快速進(jìn)化被認(rèn)為是下一次大流行最有可能的根源 (Watanbe等，2011)。考慮到目前批準(zhǔn)用于冊N1病毒的疫苗在其生產(chǎn)時(shí)間線和誘導(dǎo)進(jìn)化枝交 叉保護(hù)性免疫應(yīng)答能力方面的限制，需要針對運(yùn)些病毒的更新的流感預(yù)防疫苗方法 (Prieto-Lara和Llanos-Mendez，2010)。此研究中呈現(xiàn)的表位-嵌合冊滿足作為單價(jià)廣譜疫 苗的需求，其針對可變的循環(huán)性冊N1。開發(fā)的單一 H5N1對多種針對不同H5N1進(jìn)化枝的單抗 和抗血清具有廣泛反應(yīng)性，在小鼠中引起有效的針對致死的冊N1攻擊的進(jìn)化枝交叉保護(hù)。
[0122] HA抗原性位點(diǎn)內(nèi)的顯著氨基酸變化導(dǎo)致出現(xiàn)抗原性不同的流感H5N1病毒 (Plotkin等，2002)。各進(jìn)化枝內(nèi)的冊N1持續(xù)進(jìn)化已產(chǎn)生多個(gè)第二、第Ξ和第四級進(jìn)化枝，運(yùn) 由其系統(tǒng)發(fā)育聚類和遺傳距離定義，尤其是進(jìn)化枝2(化ore等，2013; Sun等，2013;化unan 等，2013)。目前，全球傳播并導(dǎo)致人感染的大部分病毒在進(jìn)化枝1和2中鑒定，如進(jìn)化枝1.1、 2.1.3.2、2.2.1和2.3.4(Forrest等，2009;化ng等，2009)。因此，來自運(yùn)些進(jìn)化枝的不同疫 苗組合由不同研究組和管理機(jī)構(gòu)選擇W生產(chǎn)通用H5N1疫苗。近期，進(jìn)化枝2.2.1A/埃及/ N03072/2010、進(jìn)化枝2.3.2.1A/湖北/1/2010和進(jìn)化枝2.3.4A/安徽/1/2005由W冊根據(jù)其設(shè) 及人致命病例的歷史選擇為疫苗候選。在實(shí)驗(yàn)室的先前研究中，含進(jìn)化枝1.0A/越南/1203/ 2004、進(jìn)化枝2.1.3.2A/印尼/CDC669/2006和進(jìn)化枝2.3.4A/安徽/1/2005的冊的疫苗制劑 被證實(shí)有效抵御多個(gè)冊N1進(jìn)化枝(Prabakaran等，2010)。鑒于所有運(yùn)些推薦，為了產(chǎn)生能引 起交叉保護(hù)抵御所有運(yùn)些主要H5N1(引起人感染）的單價(jià)冊，優(yōu)選來自進(jìn)化枝2代表性循環(huán) 株的冊。許多冊mAb在實(shí)驗(yàn)室中用不同抗原產(chǎn)生。應(yīng)注意從CDC669產(chǎn)生的針對所有冊N1進(jìn)化 枝的廣譜H5mAb多于任何其它H5N1株化Je等，2010 ; Ho等，2009 ; Prabakaran等，2009a; Prabakaran等，2009b)，表明CDC 669的交叉進(jìn)化枝免疫原性。總之所述研究中，進(jìn)化枝 2.1.3.2的A/印尼/CDC669/2006被選為單價(jià)通用冊的骨架。如結(jié)果所示，表位中進(jìn)一步突變 后，來自CDC669的EC冊獲得對那些先前無反應(yīng)mAb的反應(yīng)性并維持對CDC669mAb的初始反 應(yīng)性。此發(fā)現(xiàn)為該單一EC冊應(yīng)用于潛在通用冊N1疫苗創(chuàng)造條件。
[0123] 在抗原位點(diǎn)的所有氨基酸變化中，在Sa(155，156aa)、訊（189aa)和化（138-141)位 點(diǎn)發(fā)現(xiàn)3個(gè)明顯變化化averin等，2002)。5曰和Sb中的3個(gè)氨基酸突變成其它主要形式W產(chǎn)生 表位-嵌合冊。Ca中的可變區(qū)保持與野生型CDC669相同，有助于進(jìn)化枝2.1的抗原特性。作為 受體結(jié)合位點(diǎn)的一部分，130環(huán)的氨基酸在不同進(jìn)化枝中高度可變化ensley等，2009; Stevens等，2006)。例如，在第140個(gè)氨基酸上鑒定了超過7個(gè)氨基酸選擇。與相鄰位點(diǎn)的其 它變化一起，130環(huán)的可能氨基酸組合數(shù)極高?？赡苄枰Y選W確定通用冊疫苗的最合適形 式。因此，此研究中的該區(qū)域未變。在未來的工作中，突變能引入此位點(diǎn)W提高和擴(kuò)增EC H5 疫苗的免疫原性譜。
[0124] EC-冊無法與進(jìn)化枝1特異性單抗mAb 11G12反應(yīng)化e和Kwang，2013)，指示對進(jìn)化 枝1的免疫原性相對較弱。通過第189個(gè)氨基酸上突變成進(jìn)化枝1.0的同一形式，87.5%的 RG-EC冊免疫小鼠在進(jìn)化枝1.0的VN1203攻擊后存活。盡管未實(shí)現(xiàn)100%保護(hù)，RG-EC冊的 表現(xiàn)比野生型CDC669好很多，后者針對VN1203的存活率為50%。運(yùn)能進(jìn)一步通過誘導(dǎo)Sa區(qū) 的其它突變來改善，如由mAb 11G12祀向的表位152aa。有祀向不同表位的多個(gè)單抗的試驗(yàn) 能用作動(dòng)物試驗(yàn)前預(yù)測冊抗原性的快速方法并且也提供改善線索。
[0125] 表位的抗原性差異使得現(xiàn)有疫苗難W勝任全球流感預(yù)防（Fouchier和Smith, 2010)。采用多價(jià)疫苗會(huì)顯著增加疫苗成本并延遲針對突然流感爆發(fā)的疫苗開發(fā)進(jìn)展。就流 感冊N1而言簡單和廣泛防護(hù)性疫苗的可用性是防范未來流感大流行的高優(yōu)先級問題。研究 不僅提供廣譜的單價(jià)疫苗候選，而且還有助于新流感疫苗開發(fā)方法。不再使用來自大爆發(fā) 或嚴(yán)重病例的毒株，在單一 HA上產(chǎn)生表位嵌合冊的表位改造可避免病毒株適應(yīng)和多種抗原 共表達(dá)中的困難。針對全球冊N1的廣譜單價(jià)冊疫苗大幅降低疫苗開發(fā)和生產(chǎn)的成本。單一 HA的新表位組合能容易設(shè)計(jì)并測試W預(yù)防新出現(xiàn)冊N1所介導(dǎo)的感染。
[0126] 在描述本發(fā)明的上下文(尤其是W下權(quán)利要求的上下文）中使用術(shù)語V'和"an"和 "the" W及類似指代被解釋為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾。術(shù) 語"包會(huì)V'具嘗V'包括"和"含有"作為開放式術(shù)語解釋(即意味著"包括但不限于"），除非 另有說明。列舉本文值的范圍僅意在用作單獨(dú)指所述范圍內(nèi)各單獨(dú)值的快捷方法，除非本 文另有說明，且各單獨(dú)值納入本說明書，就好像本文單獨(dú)引用的那樣。例如，如果公開了范 圍10-15,則也公開11、12、13和14。本文所述全部方法W任何合適順序進(jìn)行，除非本文另有 說明或與上下文明顯矛盾。使用本文提供的任何和所有實(shí)施例或示范性語言(例如"如"）僅 意在更好闡明本發(fā)明且不對發(fā)明范圍構(gòu)成限制，除非另外要求權(quán)利。本說明書的語言不應(yīng) 被解釋為指示任何非要求權(quán)利的元素對本發(fā)明實(shí)施關(guān)鍵。
[0127] 應(yīng)理解本發(fā)明的方法和組合物能納入多種實(shí)施方式形式，其中僅一些在本文中公 開。本文描述本發(fā)明的實(shí)施方式，包括
【發(fā)明人】已知完成本發(fā)明的最佳模式。本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員閱讀前面描述后可清楚了解運(yùn)些實(shí)施方式的變化。
【發(fā)明人】預(yù)期技術(shù)人員會(huì)酌情采用運(yùn) 類變化，且
【發(fā)明人】希望本發(fā)明通過本文特定所述W外的方式實(shí)施。因此，在適用法律允許的 情況下，本發(fā)明包括所附權(quán)利要求中引用主題的所有修改和等價(jià)物。此外，本發(fā)明涵蓋其上 述元素在其所有可能變化中的任何組合，除非本文另有說明或與上下文明顯矛盾。
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的修飾的H5蛋白，其選自具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列的修飾的H5 蛋白和具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列的修飾的H5蛋白。2. 如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的H5蛋白，其是具有SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列 的修飾的H5蛋白。3. 如權(quán)利要求1所述的分離的修飾的H5蛋白，其是具有SEQ ID N0:8所示的氨基酸序列 的修飾的H5蛋白。4. 一種編碼權(quán)利要求1所述的修飾的H5蛋白的核酸分子。5. 如權(quán)利要求4所述的核酸分子，具有SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。6. 如權(quán)利要求4所述的核酸分子，具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。7. -種包含權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核酸分子的載體。8. -種包含權(quán)利要求7所述的載體的宿主細(xì)胞。9. 一種包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白的重組禽流感病毒。10. 如權(quán)利要求9所述的重組禽流感病毒，包含編碼所述修飾的H5蛋白的核酸分子。11. 如權(quán)利要求10所述的重組禽流感病毒，具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列。12. 如權(quán)利要求10所述的重組禽流感病毒，具有SEQ ID NO:7所示核苷酸序列。13. -種包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白的組合物。14. 一種包含權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒的組合物。15. 如權(quán)利要求13或14所述的組合物，其還包含藥學(xué)上可接受運(yùn)載體。16. 如權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的組合物，其還包含佐劑。17. 如權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的組合物，其是疫苗。18. -種在對象中引起針對禽流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給對 象施用預(yù)防有效量的權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物。19. 一種治療或預(yù)防禽流感病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括給對象施用權(quán)利要求 13-17中任一項(xiàng)所述的組合物。20. -種治療或預(yù)防禽流感病毒感染的方法，所述方法包括給需要這種治療的對象施 用治療有效量的權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物。21. -種預(yù)防對象患上禽流感相關(guān)疾病的方法，所述方法包括給對象施用預(yù)防、治療或 免疫有效量的權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物。22. -種在禽流感感染對象中延遲禽流感相關(guān)疾病發(fā)作或減緩所述疾病的速度的方 法，所述方法包括給對象施用預(yù)防、治療或免疫有效量的權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組 合物。23. -種疫苗，包含（i)一種或多種選自如下一組的免疫原性劑：（a)如權(quán)利要求1-3中 任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，（b)如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核酸分子，（c)如權(quán)利要求 7所述的載體，（d)如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒和(e)其組合，以及(ii) 藥學(xué)上可接受運(yùn)載體和/或賦形劑。24. 如權(quán)利要求23所述的疫苗，其中所述賦形劑是一種或多種佐劑。25. -種在對象中引起針對禽流感病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括給對 象施用預(yù)防有效量的權(quán)利要求22或23所述的疫苗。26. -種治療或預(yù)防禽流感病毒相關(guān)疾病的方法，所述方法包括給對象施用權(quán)利要求 23或24所述的疫苗。27. -種治療或預(yù)防禽流感病毒感染的方法，所述方法包括給需要這種治療的對象施 用治療有效量的權(quán)利要求23或24所述的組合物。28. -種預(yù)防對象患上禽流感相關(guān)疾病的方法，所述方法包括給對象施用預(yù)防、治療或 免疫有效量的權(quán)利要求23或24所述的疫苗。29. -種在禽流感感染對象中延遲禽流感相關(guān)疾病發(fā)作或減緩所述疾病的速度的方 法，所述方法包括給對象施用預(yù)防、治療或免疫有效量的權(quán)利要求23或24所述的疫苗。30. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核 酸分子，如權(quán)利要求7所述的載體，如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒，如權(quán) 利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求23或24所述的疫苗，用于在對象中引起 保護(hù)性免疫應(yīng)答。31. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核 酸分子，如權(quán)利要求7所述的載體，如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒，如權(quán) 利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求23或24所述的疫苗，用于防止對象患上 禽流感相關(guān)疾病。32. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核 酸分子，如權(quán)利要求7所述的載體，如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒，如權(quán) 利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求23或24所述的疫苗，用于在禽流感感染 對象中延遲禽流感相關(guān)疾病發(fā)作或減緩所述疾病的速度。33. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核 酸分子，如權(quán)利要求7所述的載體，如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒，如權(quán) 利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求23或24所述的疫苗用于制備引起對象中 的保護(hù)性免疫應(yīng)答的藥物的應(yīng)用。34. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核 酸分子，如權(quán)利要求7所述的載體，如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒，如權(quán) 利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求23或24所述的疫苗用于制備治療或預(yù)防 對象中的禽流感病毒相關(guān)疾病的藥物的應(yīng)用。35. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核 酸分子，如權(quán)利要求7所述的載體，如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒，如權(quán) 利要求13-17中任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求23或24所述的疫苗用于制備延遲禽流感 感染對象中的禽流感相關(guān)疾病發(fā)作或減緩所述疾病的速度的藥物的應(yīng)用。36. -種用于針對禽流感免疫對象的試劑盒，包含（i) 一種或多種選自如下一組的免疫 原性劑：（a)如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，（b)如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所 述的核酸分子，（c)如權(quán)利要求7所述的載體，（d)如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流 感病毒，（e)如權(quán)利要求23或24所述的疫苗和(f)其組合，以及(ii)其應(yīng)用的說明材料。37. 如權(quán)利要求36所述的試劑盒，還包含施用器。38. -種制備疫苗的方法，所述方法使用一種或多種選自如下一組的免疫原性劑：（a) 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，（b)如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核酸分 子，（c)如權(quán)利要求7所述的載體，（d)如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒和 (e)其組合。39. -種或多種免疫原性劑用于疫苗開發(fā)的應(yīng)用，所述免疫原性劑選自（a)如權(quán)利要求 1 -3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，（b)如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核酸分子，（c)如權(quán) 利要求7所述的載體，（d)如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒和(e)其組合。40. 選自（a)如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的修飾的H5蛋白，（b)如權(quán)利要求4-6中任一 項(xiàng)所述的核酸分子，（c)如權(quán)利要求7所述的載體，（d)如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組 禽流感病毒和(e)其組合的一種或多種免疫原性劑，用于疫苗開發(fā)。41. 一種或多種免疫原性劑的應(yīng)用，所述免疫原性劑選自（a)如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng) 所述的修飾的H5蛋白，（b)如權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)所述的核酸分子，（c)如權(quán)利要求7所述 的載體，（d)如權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)所述的重組禽流感病毒和(e)其組合。
【文檔編號】C12N7/01GK106029686SQ201480076083
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月12日
【發(fā)明人】F·何, H-S·J·光, P·木根
【申請人】淡馬錫生命科學(xué)研究院有限公司