用于增強(qiáng)的氨基酸產(chǎn)生的微生物及相關(guān)方法【專利摘要】本公開涉及經(jīng)工程化用于增強(qiáng)產(chǎn)生所需氨基酸的重組微生物以及相關(guān)生物質(zhì)，和可尤其用作動(dòng)物飼料成分的組合物。本公開還提供相關(guān)的方法?！緦＠f明】用于増強(qiáng)的氨基酸產(chǎn)生的微生物及相關(guān)方法[0001]序列表的引用[0002]依據(jù)37(：.?.1?.§1.821，經(jīng)由￡?3-1613，同時(shí)以電子形式一起提交的呈計(jì)算機(jī)可讀取形式（CRF)的〃序列表〃（文件名為200606_415W0_SEQUENCE_LISnNG.txt)通過引用并入本文。序列表的電子拷貝于2015年1月16日創(chuàng)建并且其在磁盤上的大小為851千字節(jié)。發(fā)明領(lǐng)域[0003]本公開涉及用于增強(qiáng)的氨基酸產(chǎn)生的新型微生物及來源于重組Ci代謝微生物的飼料產(chǎn)品（其包含用于增強(qiáng)的氨基酸產(chǎn)生的工程化代謝途徑），及相關(guān)組合物和方法。[0004]背景[0005]在過去的幾十年，在整個(gè)飼料添加劑使用過程中，獲得了動(dòng)物飼料利用效率的改善。這些添加的物質(zhì)增加了動(dòng)物飼料組合物的營(yíng)養(yǎng)素-含量、能量_含量和/或抵御疾病性質(zhì)。對(duì)于商業(yè)動(dòng)物產(chǎn)生商日益增大的挑戰(zhàn)是谷物成本上漲。上漲的成本部分由于生物燃料和人類食物用途對(duì)谷物的競(jìng)爭(zhēng)性需求導(dǎo)致。隨著谷物和蛋白質(zhì)組分成本上漲，加上有限的飼料產(chǎn)生可用土地，將非常需要具有有益的營(yíng)養(yǎng)性和抵御疾病性的可替代低成本動(dòng)物飼料廣品。[0006]發(fā)明概述[0007]在第一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含第一外源核酸的重組Ci代謝微生物，所述第一外源核酸選自由編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸和編碼可操作地連接至編碼天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列組成的組，其中所述重組&代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴鈦碓吹奶荚限D(zhuǎn)化為所需的L-氨基酸，并且其中重組心代謝微生物的S13C低于-30%〇〇[0008]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組心代謝微生物還包含編碼貯存多肽（cachepolypeptide)的第二外源核酸。在另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供來源于本發(fā)明的重組Ci代謝微生物培養(yǎng)物的生物質(zhì)，及包含本發(fā)明的生物質(zhì)的組合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供氨基酸組合物，其包含從本發(fā)明的生物質(zhì)提取的一種或多種氨基酸。[0009]在另一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供動(dòng)物飼料，其包含本發(fā)明的生物質(zhì)或氨基酸組合物。在一些實(shí)施方案中，所述動(dòng)物飼料還包含選自由植物來源的物質(zhì)、動(dòng)物來源的物質(zhì)和微生物-來源的物質(zhì)組成的組的添加劑。[0010]在另一些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生所需L-氨基酸的方法，所述方法包括在天然氣來源的碳原料的存在下在足以產(chǎn)生所需L-氨基酸的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組&代謝微生物。在一些實(shí)施方案中，所述L-氨基酸展現(xiàn)了低于-30%。的S13C。[0011]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生富L-氨基酸的生物質(zhì)的方法，所述方法包括在天然氣來源的碳原料的存在下在培養(yǎng)基中在足以促進(jìn)重組心代謝微生物生長(zhǎng)為生物質(zhì)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組&代謝微生物。[0012]附圖簡(jiǎn)述[0013]圖1提供了在如實(shí)施例4所述從賴氨酸生物合成操縱子過表達(dá)單獨(dú)基因的莢膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus)巴斯(Bath)菌株中胞外L-賴氨酸產(chǎn)生水平的圖解描述。對(duì)于每個(gè)菌株，顯示在異源表達(dá)指定基因的菌株的細(xì)胞上清液檢測(cè)到的胞外L-賴氨酸濃度除以培養(yǎng)物光密度(〇D6QQnm)?；蛐完P(guān)鍵34和1067分別是空質(zhì)粒對(duì)照和在相同的啟動(dòng)子背景下表達(dá)非相關(guān)基因（熒光蛋白）的對(duì)照。所述圖顯示了指定基因的過表達(dá)導(dǎo)致胞外L-賴氨酸增加超過空質(zhì)粒對(duì)照(基因型關(guān)鍵34)和表達(dá)非相關(guān)基因（綠色熒光蛋白）的對(duì)照。[0014]圖2提供了如實(shí)施例5所述在異源表達(dá)不同的密碼子優(yōu)化序列（各自編碼相同的貯存蛋白質(zhì)（高賴氨酸含量多肽））的菌株的細(xì)胞生物質(zhì)樣品中檢測(cè)到的細(xì)胞相關(guān)的L-賴氨酸的濃度的圖解描述。基因型關(guān)鍵34是空質(zhì)粒對(duì)照。所述條表示每個(gè)實(shí)驗(yàn)基因型中的八個(gè)克隆的平均值。[0015]圖3提供了如實(shí)施例6所述于來自異源表達(dá)富賴氨酸貯存多肽(HighK)和dapA的菌株的培養(yǎng)物的干重生物質(zhì)中測(cè)定的細(xì)胞相關(guān)的L-賴氨酸水平的圖解描述。所述條表示每個(gè)實(shí)驗(yàn)基因型的八個(gè)克隆的平均值。實(shí)驗(yàn)菌株1186-1193中的所有HighK基因編碼相同的氨基酸序列，但具有不同的密碼子使用。所述圖說明這些基因的共表達(dá)導(dǎo)致一系列增強(qiáng)的細(xì)胞_相關(guān)的L-賴氨酸產(chǎn)生。[0016]圖4提供了如實(shí)施例6所述在異源表達(dá)富賴氨酸貯存多肽(HighK)和dapA的菌株的培養(yǎng)物上清液樣品中檢測(cè)到的胞外L-賴氨酸水平的圖示。所述條表示每個(gè)實(shí)驗(yàn)基因型的八個(gè)克隆的平均值?；诿拷M克隆的平均值，所述圖說明所述基因組合的表達(dá)導(dǎo)致胞外L-賴氨酸超過對(duì)照(基因型關(guān)鍵1067)8至23倍。[0017]詳述[0018]本公開提供具有利用相對(duì)低成本碳原料作為能量來源能力的新型重組Q代謝微生物，且此外提供所需的相關(guān)生物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)素產(chǎn)品、組合物。本發(fā)明的重組微生物經(jīng)工程化以用于增強(qiáng)的商業(yè)所需L-氨基酸產(chǎn)生。這些重組微生物以及來源其的生物質(zhì)和L-氨基酸組合物可用作動(dòng)物(諸如，例如牲畜、魚、禽類等）以及培養(yǎng)或發(fā)酵的微生物的營(yíng)養(yǎng)來源。[0019]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組&代謝微生物，其中所述重組&代謝微生物包含選自由以下組成的組的外源核酸:編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸和編碼可操作地連接至編碼天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列的外源核酸，其中所述重組&代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴馓荚限D(zhuǎn)化為所需的L-氨基酸，并且其中所述重組&代謝微生物展現(xiàn)了低于-30%。且通常低于-35%。的S13C。典型地，所述重組&代謝微生物是非光合&代謝微生物，且更典型地，其是甲烷營(yíng)養(yǎng)型微生物。[0020]在這些實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組微生物經(jīng)工程化以將為相較于更昂貴的碳水化合物相對(duì)低成本且豐富能源的天然氣-來源的原料(例如，天然氣或從天然氣來源的&底物(諸如例如甲烷））轉(zhuǎn)化為更高價(jià)值的營(yíng)養(yǎng)素。如本文所用，術(shù)語"天然氣-來源的原料"是指天然氣或從天然氣分離的任何組分(包括Ci底物)或從天然氣轉(zhuǎn)化的任何組分(如合成氣）。[0021]術(shù)語"天然氣"在本文中是指可通過常規(guī)方法(如多孔儲(chǔ)器的鉆孔和注水)或非常規(guī)方法(如具有低透氣性的地層的水力壓裂、水平鉆孔或定向鉆孔)獲得的天然存在的氣體混合物。所述氣體混合物由甲烷和其它化合物（包括其它Ci化合物）以及其它輕烷烴氣體(諸如例如乙烷、丙烷、丁烷、戊烷等）、二氧化碳、氮?dú)?、硫化氫等及其組合組成。非常規(guī)天然氣可從以下來源獲得:諸如例如在砂巖或碳酸鹽中形成的致密砂巖氣、在煤沉積物中形成且在煤顆粒中吸附的煤床甲烷、在細(xì)粒頁巖中形成且在粘土粒中吸附或保持在小孔或微裂隙內(nèi)的頁巖氣、為在低溫和高壓下在地方(諸如在海洋和永凍土下)處形成的天然氣和水的晶體組合的甲烷水合物。[0022]如本文所用，底物〃或〃Q化合物〃是指含有缺乏碳-碳鍵的分子或組分的任何碳。示例性(^底物包括合成氣、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸或其鹽、一氧化碳、二氧化碳、甲基化胺（如甲胺、二甲胺、三甲胺等）、甲基化硫醇、甲基鹵（如溴甲烷、氯甲烷、碘甲烷、二氯甲烷等）、氰化物或其任何組合。[0023]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，天然氣-來源的原料通常是天然氣、來自天然氣的心底物，或?yàn)楹铣蓺?。典型地，所?amp;底物是甲烷。利用天然氣-來源的碳底物作為原料的本發(fā)明重組Q代謝微生物展現(xiàn)了不同的同位素碳標(biāo)志，這在下文中更詳細(xì)描述。這種不同的同位素碳標(biāo)志也通過此類重組微生物的產(chǎn)物(如生物質(zhì)、L-氨基酸、L-氨基酸組合物等)展現(xiàn)。[0024]如本文所用，術(shù)語代謝微生物〃或〃Q代謝非光合微生物〃是指具有使用心底物作為能量來源或作為其主要能量和生物質(zhì)來源的能力的任何微生物，并且可使用或可使用其它碳底物(諸如糖和復(fù)合碳水化合物)用于能量和生物質(zhì)。例如，&代謝微生物可氧化&底物諸如甲烷或甲醇。Q代謝微生物包括細(xì)菌(諸如甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和嗜甲基菌)及酵母。在某些實(shí)施方案中，&代謝微生物不包括光合微生物，諸如藻類。在一些實(shí)施方案中，所述&代謝微生物將為〃專性&代謝微生物〃，意為其唯一能量來源是&底物。在另外的實(shí)施方案中，(^代謝微生物(如甲烷營(yíng)養(yǎng)菌)將在&底物原料的存在下培養(yǎng)(即使用&底物作為能量來源）。[0025]本發(fā)明的重組(^代謝微生物經(jīng)工程化以用于經(jīng)由工程化編碼核酸的L-氨基酸生物合成(AB)酶或其表達(dá)增強(qiáng)所需L-氨基酸的產(chǎn)生。術(shù)語"L-氨基酸生物合成酶〃和"AB酶〃在本文中可互換使用來指代參與重組宿主&代謝微生物產(chǎn)生L-氨基酸的酶。[0026]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含第一外源核酸的重組Q代謝微生物，所述第一外源核酸選自由編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸和編碼可操作地連接至編碼天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列的外源核酸組成的組。典型地，如下文更詳細(xì)地描述，所述重組Ci代謝微生物的S13C低于-30%。。通常，所述重組&代謝微生物是甲烷營(yíng)養(yǎng)型微生物。[0027]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組&代謝微生物還包含編碼貯存多肽的第二外源核酸。如本文所用，術(shù)語"貯存多肽"是指具有以下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列：（1)至少約10個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng);和(2)包含目的在于以一定水平增強(qiáng)的L-氨基酸，所述水平為氨基酸序列中氨基酸殘基總數(shù)的至少10%(按物種分）。典型地，所述貯存多肽不是AB(氨基酸生物合成)酶。[0028]如實(shí)施例所證實(shí)，貯存多肽可用于促進(jìn)本發(fā)明的重組&代謝微生物中所需L-氨基酸產(chǎn)生增強(qiáng)。在一些實(shí)施方案中，貯存多肽的氨基酸序列可為（1)至少約10個(gè)氨基殘基長(zhǎng)、至少約15、至少約20、至少約30、至少約40、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、至少約100、至少約150、至少約200、至少約250、至少約300、至少約350、至少約400、至少約450或至少約500個(gè)氨基酸殘基長(zhǎng);且(2)包含目的在于以一定水平增強(qiáng)的L-氨基酸，所述水平是氨基酸序列內(nèi)的氨基酸殘基總數(shù)的至少約10%(按物種分），或所述水平為氨基酸序列內(nèi)的氨基酸殘基的總數(shù)的至少約11%、至少約12%、至少約13%、至少約14%、至少約15%、至少約16%、至少約17%、至少約18%、至少約19%、至少約20%、至少約21%、至少約22%、至少約23%、至少約24%、至少約25%、至少約26%、至少約27%、至少約28%、至少約29%、至少約30%、至少約31%、至少約32%、至少約33%、至少約34%、至少約35%、至少約36%、至少約37%、至少約38%、至少約39%、至少約40%、至少約41%、至少約42%、至少約43%、至少約44%、至少約45%、至少約46%、至少約47%、至少約48%、至少約49%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%。本發(fā)明實(shí)踐中采用的貯存多肽可為天然存在的多肽或非-天然存在的多肽。編碼貯存多肽的第二外源核酸通常經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于從重組宿主&代謝微生物最佳表達(dá)。示例性貯存多肽是如實(shí)施例5和6所示的S9A家族肽酶（SEQIDNO:152)。經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于從莢膜甲基球菌巴斯最佳表達(dá)的編碼S9A家族肽酶的核酸序列提供為SEQIDN0:152、154、156、158、160、162、164和166。如本文所用，術(shù)語〃多肽〃和〃蛋白質(zhì)〃可互換使用指代氨基酸殘基聚合物。[0029]本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可通過搜索其中至少10%的總氨基酸含量為所需L-氨基酸的蛋白質(zhì)容易地鑒別適用于本發(fā)明的貯存多肽。這可例如通過查詢來自目標(biāo)生物的所有蛋白質(zhì)的序列數(shù)據(jù)庫(諸如例如GENBANK(萬維網(wǎng)址ncbi.nlm.nih.gov/genbank/))、然后計(jì)算每種蛋白質(zhì)的[所需氨基酸的發(fā)生]/[蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度]比率來進(jìn)行。這一分析的結(jié)果可基于所述比率過濾和分類以尋找合適的蛋白質(zhì)。[0030]用于本發(fā)明實(shí)踐中的編碼AB酶和貯存多肽的外源核酸通常經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于從重組宿主Q代謝微生物最佳表達(dá)。這些可編碼對(duì)于宿主(^微生物異源的物種是天然的酶或蛋白質(zhì)，或編碼天然存在的多肽的突變體(即變體）。當(dāng)?shù)谝煌庠春怂峋幋aAB酶時(shí)，所述外源核酸可為編碼參與L-氨基酸的生物合成的AB酶的核酸，所述L-氨基酸選自由以下組成的組:L-賴氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-蘇氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-鳥氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-酪氨酸。在一些實(shí)施方案中，所述L-氨基酸選自由L-賴氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-蘇氨酸等組成的組。在一些情況下，所述L-氨基酸選自由L-賴氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和L-蘇氨酸組成的組。合適的外源核酸包括編碼選自由以下組成的組的L-氨基酸生物合成酶的那些：[0031](i)L_賴氨酸生物合成酶，諸如例如:賴氨酸-敏感性天冬氨酸激酶III(lySC)、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶(asd)、二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、2，3，4，5-四氫吡啶-2，6_甲酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(dapD)、乙酰鳥氨酸/琥珀酰二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(argD)、琥珀酰-二氨基庚二酸脫琥珀酰酶(dapE)、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(dapF)、二氨基庚二酸二羧酶(lysA)等；[0032](ii)L-色氨酸生物合成酶，諸如例如分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)、鄰氨基苯甲酸合酶組分I(trpE)、鄰氨基苯甲酸合酶組分II(trpG)、鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(trpD)、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶（trpC)、色氨酸生物合成蛋白質(zhì)（trpC)、N-(5'磷酸核糖基）鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶(trpF)、吲哚-3-甘油磷酸合酶、色氨酸合酶a鏈(trpA)、色氨酸合酶0鏈(trpB)等；[0033](iii)L-甲硫氨酸生物合成酶，諸如例如高絲氨酸0-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(metA)、胱硫醚y-合酶(metB)、蛋白質(zhì)MalY、胱硫醚裂解酶(metC)、B12-依賴性甲硫氨酸合酶(metH)、5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(metE)等；[0034](iv)L-半胱氨酸生物合成酶，并且其中所述半胱氨酸生物合成酶選自由絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(CysE)、半胱氨酸合酶A、半胱氨酸合酶B等組成的組;及[0035](v)L-蘇氨酸生物合成酶，諸如例如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、PLP-依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合酶等。[0036]以上的酶可見于多種異源物種中，包括微生物諸如例如大腸桿菌(E.coli)和谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)。在某些特定的實(shí)施方案中，所述外源核酸編碼具有下文表A所示的SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148或150的任一條序列的L-氨基酸生物合成酶。如上所述，所述外源核酸通常經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于從重組&代謝微生物最佳表達(dá)。編碼AB酶的示例性核酸序列還提供在表A中。這些核酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于在莢膜甲基球菌巴斯中表達(dá)。[0037]表A.示例性氨基酸生物合成酶[0042]適用于本發(fā)明實(shí)踐中的外源核酸包括編碼變體AB酶序列的那些，所述序列與參考或親本野生型多肽序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一，諸如例如對(duì)應(yīng)于SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148或150的任一者的參考序列，前提是所述變體保留目標(biāo)L-氨基酸生物合成酶活性。在某些實(shí)施方案中，所述AB酶變體多肽將包含在相對(duì)于參考或親本野生型AB酶的預(yù)定位置處的至少一個(gè)氨基酸取代(如1、2、3、5、6、7、8、9或10或更多或多達(dá)20、25或30個(gè)取代），前提是變體保留了目標(biāo)AB酶活性。所述AB酶變體多肽可另外包含一個(gè)或多個(gè)保守性取代。"保守性取代"在本領(lǐng)域中被認(rèn)為是將一種氨基酸取代為具有類似性質(zhì)的另一種氨基酸。示例性保守性取代在本領(lǐng)域中是熟知的（參見如W097/09433，第10頁；Lehninger,Biochemistry，第2版；WorthPublishers,Inc.NY:NY(1975)，第71-77頁；Lewin，GenesIV，OxfordUniversityPress，NYandCellPress,Cambridge,MA(1990),第8頁，其通過引用并入本文)。[0043]用于產(chǎn)生編碼此類變體酶的適合外源核酸的方法更詳細(xì)地描述于下文中。[0044]兩個(gè)或更多個(gè)核酸或氨基酸序列之間的〃同一性百分比〃是考慮了空位數(shù)目和需要引入以優(yōu)化兩條或多條序列比對(duì)的每個(gè)空位的長(zhǎng)度，由所述序列共享的同一位置的數(shù)目的函數(shù)（即同一性％=同一位置的數(shù)目/位置總數(shù)x100)。比較序列和測(cè)定兩條或多條序列之間的同一性百分比可使用數(shù)學(xué)算法獲得，諸如在其缺省參數(shù)下的BLAST和空位BLAST程序(如Altschul等，J.Mol.Biol.215:403,1990;還參見BLASTN，萬維網(wǎng)址ncbi?nlm.nih?gov/BLAST，其通過引用并入本文）。[0045]如上所示，本發(fā)明實(shí)踐中采用的外源核酸可經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于在心代謝微生物中表達(dá)。重組蛋白質(zhì)的表達(dá)在其原始宿主外可能是難的。例如，密碼子使用偏好變化在不同的細(xì)菌物種中觀察到（Sharp等，Nucl.Acids.Res.33:1141,2005,其通過引用并入本文）。甚至在它們天然宿主內(nèi)的重組蛋白質(zhì)的過表達(dá)也可能是難的。在某些實(shí)施方案中，如本文所述的待引入宿主的核酸可經(jīng)受密碼子優(yōu)化，之后引入宿主以確保蛋白質(zhì)表達(dá)是有效或增強(qiáng)的。密碼子優(yōu)化是指在轉(zhuǎn)化之前改變基因或核酸編碼區(qū)的密碼子以反映宿主的典型密碼子使用而不改變由非天然DNA分子編碼的多肽。之前已經(jīng)描述了用于在異源宿主中的最佳基因表達(dá)的密碼子優(yōu)化方法(參見如Welch等，PLoS0ne4:e7002，2009;Gustafsson等，TrendsBiotechnol.22:346,2004;Wu等，Nucl.AcidsRes.35:D76,2007;Villalobos等，BMCBioinformatics7:285,2006;美國(guó)專利公開No.2011/0111413和2008/0292918;所述方法的公開內(nèi)容通過引用以其整體并入本文）。編碼適用于本發(fā)明實(shí)踐中的AB酶的外源核酸包括具有與選自由以下組成的組的核酸參考序列至少約85%同一性的核酸序列的那些:SEQIDN0:l、3、5、7、9、ll、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147和149。編碼適用于本發(fā)明實(shí)踐中的CB酶的說明性外源核酸包括經(jīng)經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于在莢膜甲基球菌巴斯中最佳表達(dá)的序列，諸如例如SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147和149的任一者。[0046]類似地，本公開編碼多肽變體的外源核酸分子可使用基于以上指定的參考文獻(xiàn)中所述的系統(tǒng)發(fā)育方法設(shè)計(jì)（美國(guó)專利No.8，005,620;Gustafsson等;Welch等;Villalobos等;Minshull等，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文）。[0047]編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸包括編碼具有或保留相應(yīng)L-氨基酸生物合成酶活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的多核苷酸。通過測(cè)量多肽轉(zhuǎn)化底物為產(chǎn)物的能力確定多肽是否具有特定活性的方法是本領(lǐng)域已知的。[0048]在一些實(shí)施方案中，所述外源核酸編碼可操作地連接至編碼天然碳水化合物生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列。典型地，所述表達(dá)控制序列是導(dǎo)致天然L-氨基酸生物合成酶過表達(dá)的一種表達(dá)控制序列。[0049]當(dāng)?shù)谝煌庠春怂峋幋aAB酶時(shí)，其通過可操作地連接至外源性表達(dá)控制序列。所述外源性表達(dá)控制序列可能可操作地連接至編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸以增強(qiáng)所需L-氨基酸的產(chǎn)生。所述外源性表達(dá)控制序列通常經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于從&代謝微生物宿主細(xì)胞最佳表達(dá)。[0050]在一些實(shí)施方案中，所述第一外源核酸編碼可操作地連接至編碼天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列。示例性表達(dá)控制序列包括下文所述的啟動(dòng)子。在這些實(shí)施方案中，天然L-氨基酸生物合成酶的表達(dá)通常增加（即過表達(dá)）。增加的表達(dá)或活性包括基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性增加高于野生型（天然或非-遺傳工程化)對(duì)照或參考微生物的水平。如果表達(dá)或活性是在基因或蛋白質(zhì)不正常表達(dá)或無活性的微生物中，則所述基因或蛋白質(zhì)過表達(dá)。如果表達(dá)或活性比野生型對(duì)照或參考微生物延長(zhǎng)或更久存在于重組微生物中，則基因或蛋白質(zhì)過表達(dá)。如本文所用，〃過表達(dá)的〃和〃過表達(dá)〃當(dāng)指代基因或蛋白質(zhì)時(shí)意指基因或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性增加。術(shù)語"核酸"、"多核苷酸"和"基因"在本文中可互換使用來指代單鏈或雙鏈形式的核酸殘基(如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)聚合物。[0051]除了上文所述的外源核酸之外，本發(fā)明的重組&代謝微生物還可包含增強(qiáng)所需L-氨基酸產(chǎn)生的遺傳修飾。例如，本發(fā)明的重組心代謝微生物還可包含可操作地連接至編碼內(nèi)源性酶的內(nèi)源性核酸的外源性表達(dá)控制序列，所述內(nèi)源性酶利用一種或多種由L-氨基酸生物合成酶所利用的相同底物或利用所需的L-氨基酸作為底物（8卩〃競(jìng)爭(zhēng)性〃內(nèi)源性酶）。這可以進(jìn)行以下調(diào)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性酶。[0052]在一些實(shí)施方案中，可能需要通過突變競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性酶以缺失或減弱其活性，從而降低或抑制競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性酶活性。如本文所用的"抑制"或"抑制的"是指靶基因表達(dá)或靶分子活性相對(duì)于對(duì)照、內(nèi)源性或參考分子直接或間接改變、降低、下調(diào)、消除或缺失，其中改變、降低、下調(diào)或消除是統(tǒng)計(jì)學(xué)上、生物上、工藝上或臨床上顯著的。[0053]用于在Q代謝微生物中下調(diào)、失活、敲除或缺失內(nèi)源性基因功能的各種方法是本領(lǐng)域已知的。例如，當(dāng)將外源性多核苷酸插入結(jié)構(gòu)基因以破壞轉(zhuǎn)錄時(shí)，靶向基因破壞是有效的基因下調(diào)方法。將包含位于具有與待破壞的靶宿主基因一部分的高度同源性的序列側(cè)翼的外源性插入DNA(如遺傳標(biāo)記）的基因盒引入宿主Ci代謝微生物。外源性DNA經(jīng)由天然DNA復(fù)制機(jī)制破壞靶宿主基因。在Q代謝微生物(包括甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌）中等位交換以構(gòu)建缺失/插入突變體已描述于例如Toyama和Lidstrom,Microbio1?144:183，1998;Stoylar等，Microbiol?145:1235，1999;Ali等，Microbiol?152:2931，2006;VanDien等，Microbiol?149:601，2003;Martin和Murrell，F(xiàn)EMSMicrobiol?Lett?127:243，2006中，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。例如，參與諸如碳水化合物合成途徑的其它途徑的酶還可靶向下調(diào)以將宿主微生物的代謝活性集中于L-氨基酸生物合成上。[0054]所述重組(^代謝微生物因此可被工程化以具有以增強(qiáng)的水平產(chǎn)生所需L-氨基酸的能力。在這些實(shí)施方案的一些中，當(dāng)在天然氣-來源的原料(如天然氣、甲烷等）的存在下在至少一組的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，所述重組Q代謝微生物以一定水平產(chǎn)生所需的L-氨基酸，所述水平比由天然&代謝微生物產(chǎn)生的水平至少大約10%且是由天然Q代謝微生物產(chǎn)生的水平的高達(dá)約2-倍、高達(dá)約3-、4-、5-、10-、20-、30-、40-、50-、60-、70-、80-、90-、100-和高達(dá)約500-或約1000-倍。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)在天然氣-來源的原料的存在下在至少一組的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，所述重組Q代謝微生物以一定水平產(chǎn)生所需的L-氨基酸，所述水平比由天然Q代謝微生物產(chǎn)生的水平大至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%大于且是由天然(Mf謝微生物產(chǎn)生的水平的高達(dá)約2-倍、高達(dá)約3-、4-、5-、10-、20-、30-、40_、50-、60-、70-、80-、90-、100-至約500-或約1000-倍。典型地，當(dāng)在天然氣-來源的原料的存在下在至少一組的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，由本發(fā)明的重組&代謝微生物產(chǎn)生所需L-氨基酸的增強(qiáng)水平是天然(Mf謝微生物的水平的至少約2-倍、3-、4-、5-、10-、20-、30-、40-、50_、60-、70-、80-、90-或100-倍。[0055]用于在微生物中表達(dá)外源核酸的重組方法是本領(lǐng)域熟知的。此類方法可見于描述于例如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarborLaboratory,NewYork(2001);和Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiologyJohnWileyandSons,Baltimore,MD(1999)中，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。對(duì)編碼酶或其功能片段的核酸分子的遺傳修飾可賦予從其天然存在狀態(tài)改變的重組細(xì)胞以生物化學(xué)能力或代謝能力。[0056]如本文所用，術(shù)語"內(nèi)源性"和"天然的"當(dāng)指代核酸、多肽(諸如酶）、化合物或活性時(shí)，是指正常存在于宿主細(xì)胞中的核酸、多肽、化合物或活性。術(shù)語〃同源性〃或〃同系物〃是指外源性(非天然的）來源的分子或活性，其是與存在于或來源于宿主細(xì)胞、物種或菌株的分子或活性相同或類似的分子或活性。[0057]如本文所用，術(shù)語"異源性"和"外源性"當(dāng)指代核酸分子、構(gòu)建體或序列時(shí)是指并非對(duì)表達(dá)其的細(xì)胞是天然的核酸分子或核酸分子序列一部分，對(duì)已經(jīng)改變或突變的宿主細(xì)胞是天然的核酸分子或核酸分子一部分，或者在類似條件下與天然表達(dá)水平相比表達(dá)改變的核酸分子。例如，異源對(duì)照序列（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子)可用于以不同于天然或在培養(yǎng)物中正常表達(dá)的基因或核酸分子的方式調(diào)控基因或核酸分子的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，異源核酸分子可能對(duì)于天然宿主細(xì)胞基因是同源性的，但可具有改變的表達(dá)水平或具有不同序列或這兩者。在其它實(shí)施方案中，異源或外源核酸分子對(duì)于宿主細(xì)胞或宿主基因組可能不是內(nèi)源性的，但反而可通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔等添加至宿主細(xì)胞，其中可將添加的分子整合至宿主基因組中，或可作為染色體外遺傳物質(zhì)(如質(zhì)粒或其它自復(fù)制載體)存在。術(shù)語〃異源性〃當(dāng)指代生物時(shí)是指不同于宿主細(xì)胞的物種。[0058]在某些實(shí)施方案中，可將多于一種異源或外源核酸分子引入宿主細(xì)胞作為各自的核酸分子、作為多順反子核酸分子、作為編碼融合蛋白質(zhì)的單個(gè)核酸分子或其任何組合，并且仍然被認(rèn)為多于一種異源或外源核酸。例如，可修飾心代謝微生物以表達(dá)可相同或不同的兩種或多種異源或外源核酸分子，所述核酸分子編碼如本文公開的一種或多種L-氨基酸生物合成酶。在某些實(shí)施方案中，將L-氨基酸生物合成酶-編碼多核苷酸分子的多個(gè)拷貝引入宿主細(xì)胞，其可為相同L-氨基酸生物合成酶或不同L-氨基酸生物合成酶編碼多核苷酸的兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或更多個(gè)拷貝。[0059]宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)化方法[0060]在進(jìn)行本發(fā)明的實(shí)踐中，將上文所述的外源核酸轉(zhuǎn)化至為Q代謝微生物的宿主細(xì)胞中。采用的心代謝微生物可為適用的天然菌株(如進(jìn)行發(fā)酵以選擇與親本菌株相比具有改善的生長(zhǎng)速率和增加總生物質(zhì)產(chǎn)率的菌株），或經(jīng)重組修飾以產(chǎn)生或過表達(dá)目標(biāo)L-氨基酸生物合成酶和/或具有增加的生長(zhǎng)速率。典型地，&代謝微生物是非光合&微生物(如并非藻類或植物）。[0061]在某些實(shí)施方案中，本公開采用&代謝微生物，其為原核生物或細(xì)菌，諸如甲基單胞菌屬(]^1：1171〇1]1011&8)、甲基桿菌屬(]\161：1171(^&(^61')、甲基球菌屬(]\^1：1171〇(30(^118)、甲基彎菌屬（Methylosinus)、甲基孢囊菌屬（Methylocystis)、甲基微菌屬(Methylomicrobium)、甲燒單胞菌屬(Methanomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilus)、甲基菌屬（Methylobacillus)、甲基桿菌屬（Methylobacterium)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、黃色桿菌屬（Xanthobacter)、桿菌屬（Bacillus)、副球菌屬(Paracoccus)、諾卡氏菌屬（Nocardia)、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)或假單胞菌屬（Pseudomonas)〇[0062]在另外的實(shí)施方案中，采用的心代謝細(xì)菌是甲烷營(yíng)養(yǎng)菌或嗜甲基菌。示例性甲烷營(yíng)養(yǎng)菌包括甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基彎菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微菌屬、甲烷單胞菌屬、甲基胞菌屬(Methylocella)或其組合。示例性嗜甲基菌包括扭脫甲基桿菌（Methylobacteriumextorquens)、耐福身才甲基桿菌（Methylobacterium^(1；[01：016^118)、白楊甲基桿菌（]\161：1171〇匕&(^61'；[11111卩0卩111；[)、氯甲燒甲基桿菌(Methylobacteriumchloromethanicum)、結(jié)瘤甲基桿菌（Methylobacteriumnodulans)或其組合。如本文所用，術(shù)語〃嗜甲基細(xì)菌〃是指任何能夠氧化呈任何形式（如固體、液體、氣體)的含有至少一個(gè)碳且不含有碳-碳鍵的任何化合物的細(xì)菌。在某些實(shí)施方案中，嗜甲基細(xì)菌可為甲烷營(yíng)養(yǎng)菌。例如，"甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌"是指具有氧化甲烷作為碳和能量來源的能力的任何嗜甲基細(xì)菌，其可能是碳和能量的主要來源。示例性甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌包括甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基彎菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微菌屬或甲烷單胞菌屬。[0063]甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌基于其碳同化途徑和內(nèi)部膜結(jié)果被分類為三組:1型（y變形菌）、II型（a變形菌和X型變形菌）。1型甲烷營(yíng)養(yǎng)菌使用核酮糖單磷酸(RuMP)途徑用于碳同化，而II型甲焼營(yíng)養(yǎng)菌使用氨酸途徑。X型甲焼營(yíng)養(yǎng)菌使用RuMP途徑但還表達(dá)低水平的絲氨酸途徑酶。本發(fā)明實(shí)踐中采用的甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌包括僅可利用&底物用于碳和能量來源的專性甲烷營(yíng)養(yǎng)菌，和天然具有利用一些多碳底物作為碳和能量來源的能力的兼性甲烷營(yíng)養(yǎng)菌。[0064]本發(fā)明實(shí)踐中采用的示例性兼性甲烷營(yíng)養(yǎng)菌包括甲基胞菌屬、甲基孢囊菌屬和甲基莢膜菌屬的一些種（如森林甲基胞菌（16七1171〇061138；[1￥68七1^8)、沼澤甲基胞菌(Methylocellapalustris)、凍原甲基胞菌(Methylocellatundrae)、道氏甲基抱囊菌(Methylocystisdaltona)菌株SB2、苔蘚甲基抱囊菌(Methylocystisbryophila)和金色甲基莢膜菌屬（Methylocapsaaurea)KYG)、嗜有機(jī)甲基桿菌（Methylobacteriumorganophilum)(ATCC27，886)、甲基叔丁基謎降解菌(Methylibiumpetroleiphilum)或其高生長(zhǎng)變體。用于本發(fā)明實(shí)踐中的示例性專性甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌包括莢膜甲基球菌巴斯(NCIMB11132)、甲基單胞菌屬某種16a(ATCCPTA2402)、發(fā)抱甲基彎菌(Methylosinustrichosporium)0B3b(NRRLB_ll，196)、生抱甲基彎菌（Methylosinussporium)(NRRLB-11，197)、小甲基抱囊菌（Methylocystisparvus)(NRRLB_11，198)、甲焼甲基單胞菌(Methylomonasmethanica)(NRRLB_ll，199)、白色甲基單胞菌（Methylomonasalbus)(NRRLB_ll，200)、莢膜甲基桿菌(Methylobactercapsulatus)Y(NRRLB_ll，201)、鞭毛甲基單胞菌（]^認(rèn)71〇111〇1^8：[>1386113七3)某種八<1-3670(?￡1?]\1?-2400)、大地甲基嗜酸菌(Methylacidiphiluminfernorum)、Methylacidiphilumfumariolicum、嗜喊甲基微菌(Methylomicrobiumalcaliphilum)、堪察加半島甲基酸性菌（Methyloacidakamchatkensis)或其高生長(zhǎng)變體。[0065]適用于本發(fā)明實(shí)踐中的心代謝微生物包括合成氣代謝細(xì)菌，諸如例如梭菌屬(Clostridium)、穆爾氏菌屬（Moorella)、熱球菌屬（Pyrococcus)、優(yōu)桿菌屬(￡油3(^61'；[11111)、脫硫桿菌屬（068111：[>(^3(^61'；[11111)、氧化碳嗜熱菌（031'13017(10也61'111118)、產(chǎn)醋菌屬（八。6丨08611；[11111)、醋酸桿菌屬(八。6丨(^3。丨61'；[11111)、厭氧醋菌屬（八。6丨03紐61'013；[11111)、丁酸桿菌屬(81^丫1'；^306丨61'；[11111)、消化鏈球菌屬(？6卩丨08奸6卩丨0(30(3(3118)等(3示例性合成氣代謝細(xì)菌包括產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum)、楊氏梭菌（Clostridium1jungdahli)、拉氏梭菌（Clostridiumragsdalei)、食一氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxydivorans)、食甲基丁酸桿菌（Butyribacteriummethylotrophicum)、伍氏梭菌(Clostridiumwoodii)^^(Clostridiumneopropanologen)^0[0066]其它適用于本發(fā)明實(shí)踐中的G代謝微生物包括真核生物，諸如例如酵母，包括假絲酵母屬(Candida)、亞羅酵母屬(Yarrowia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、（Pichia)、球擬酵母屬(Torulopsis)、紅酵母屬(Rhodotorula)等。[0067]本公開的微生物的每一種可用可能有助于生長(zhǎng)的異源生物生長(zhǎng)為經(jīng)分離的培養(yǎng)物，或這些細(xì)菌的一種或多種可組合以產(chǎn)生混合的培養(yǎng)物。在另一些進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本公開的&代謝非光合微生物是專性&代謝非光合微生物，諸如專性甲烷營(yíng)養(yǎng)菌或嗜甲基菌。[0068]之前提及的(^代謝微生物的任一種可用作親本或參考宿主細(xì)胞以制備本公開的重組Q代謝微生物。如本文所用，〃重組〃是指具有至少一種遺傳改變或已通過引入異源核酸分子修飾的非天然存在的生物、微生物、細(xì)胞、核酸分子或載體，或者是指經(jīng)改變以使得可控制內(nèi)源性核酸分子或基因的細(xì)胞。重組還是指來源于細(xì)胞的細(xì)胞或者具有一種或多種此類修飾的細(xì)胞的后代。遺傳改變包括例如，引入編碼蛋白質(zhì)或酶的可表達(dá)核酸分子的修飾，或其它核酸分子添加、缺失、取代或細(xì)胞遺傳物質(zhì)的其它功能改變。例如，重組細(xì)胞可表達(dá)在天然細(xì)胞（即未修飾的或野生型細(xì)胞）內(nèi)不以同一形式存在的基因或其它核酸分子，或可提供改變的內(nèi)源基因表達(dá)形式，此類基因可能另外過表達(dá)、低表達(dá)、最小表達(dá)或完全不表達(dá)。[0069]本文所述的重組心代謝微生物或甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌的任一者可經(jīng)轉(zhuǎn)化以包含至少一種外源核酸以向宿主提供新活性或增強(qiáng)的活性(如酶促活性），或可使用本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)行遺傳修飾以去除或基本上減少內(nèi)源基因功能。[0070]轉(zhuǎn)化是指引入核酸分子(如外源性或異源核酸分子)至宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可在染色體外載有外源或異源核酸分子或者整合在染色體內(nèi)。整合至宿主細(xì)胞基因組和自復(fù)制載體內(nèi)通常導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的核酸分子的遺傳穩(wěn)定的遺傳性。含有轉(zhuǎn)化的核酸分子的宿主細(xì)胞被稱為"非天然存在的"或"遺傳工程化"或"重組"或"轉(zhuǎn)化的"或"轉(zhuǎn)基因"細(xì)胞(如細(xì)菌）。[0071]用于在Q代謝微生物（如甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌）中表達(dá)異源核酸的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體是已知的。[0072]G代謝細(xì)菌的電穿孔描述于本文中并且之前已描述于例如Toyama等，F(xiàn)EMSMicrobiol?Lett?166:1，1998;Kim和Wood，Appl.Microbiol?Biotechnol?48:105，1997;Yoshida等，Biotechnol?Lett?23:787，2001及美國(guó)專利申請(qǐng)公開No?2008/0026005中。[0073]細(xì)菌接合，是指涉及供體與受體細(xì)胞直接接觸的特定類型的轉(zhuǎn)化，其頻繁地用于轉(zhuǎn)移核酸分子至&代謝細(xì)菌中。細(xì)菌接合涉及將"供體"和"受體"細(xì)胞與彼此密切接觸地混合在一起。接合通過在供體與受體細(xì)菌之間形成胞質(zhì)聯(lián)絲發(fā)生，而單向轉(zhuǎn)移新合成的供體核酸分子至受體細(xì)胞中。接合反應(yīng)中的受體是可通過從供體細(xì)菌水平轉(zhuǎn)移接受核酸的任何細(xì)胞。接合反應(yīng)中的供體是含有接合質(zhì)粒、接合轉(zhuǎn)座子或運(yùn)動(dòng)質(zhì)粒的細(xì)菌。供體質(zhì)粒的物理轉(zhuǎn)移可通過自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或在〃輔助〃質(zhì)粒的協(xié)助下發(fā)生。涉及&代謝細(xì)菌的接合在本文中描述，并且之前已描述于Stolyar等，Mikrobiologiya64:686,1995;Motoyama等，Appl.Micro.Biotech.42:67,1994;Lloyd等，Arch.Microbiol?171:364，1999;PCT公開No.TO02/18617;和Ali等，Microbiol.152:2931,2006中。[0074]適用于本發(fā)明實(shí)踐中的表達(dá)控制序列包括例如啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子、阻遏物、誘導(dǎo)子等。適用于本發(fā)明實(shí)踐中的啟動(dòng)子可為組成型的、滲漏的或可誘導(dǎo)的，并且對(duì)于采用的宿主細(xì)胞是天然或非-天然的。示例性啟動(dòng)子包括丙酮酸脫羧酶(PDC)啟動(dòng)子、脫氧-木酮糖磷酸合酶啟動(dòng)子、甲醇脫氫酶啟動(dòng)子（MDH)(諸如，例如在莢膜甲基球菌巴斯(Acc.No.MCA0779)mxaF基因的上游基因間區(qū)內(nèi)的啟動(dòng)子或扭脫甲基桿菌的MDH啟動(dòng)子(參見Springer等，F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.160:119(1998))、己酮糖6-磷酸合酶啟動(dòng)子、核糖體蛋白質(zhì)S16啟動(dòng)子、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子、絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶啟動(dòng)子、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶啟動(dòng)子、T5啟動(dòng)子、Trc啟動(dòng)子、用于PHA合成的啟動(dòng)子（Foeliner等，Appl.Microbiol.Biotechnol.40:284,1993)、丙酮酸脫駿酶啟動(dòng)子（Tokuhiro等，Appl.Biochem.Biotechnol?131:795,2006)、lac操縱子Plac啟動(dòng)子（Toyama等，Microbiol?143:595,1997)、雜合啟動(dòng)子諸如Ptrc(Brosius等，Gene27:161，1984)、從嗜甲基菌(EP296484)、甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中的天然質(zhì)粒鑒定的啟動(dòng)子等。[0075]另外地，可使用適用于外源核酸分子高表達(dá)的同源性或異源啟動(dòng)子。例如，美國(guó)專利如.7,098,005描述了使用啟動(dòng)子用于在&代謝細(xì)菌內(nèi)在異源編碼核酸的甲烷或甲醇的存在下高表達(dá)。[0076]在某些實(shí)施方案中，調(diào)控表達(dá)編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸可能是需要的以優(yōu)化非-天然存在的心代謝微生物的生長(zhǎng)速率并且可在多種碳來源條件下改善細(xì)菌生長(zhǎng)。這可通過使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。[0077]在某些實(shí)施方案中，編碼AB酶的核酸可操作地連接至可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。本發(fā)明實(shí)踐中采用的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子系統(tǒng)包括本領(lǐng)域已知的那些，并且包括四環(huán)素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng)；IPTG/lac操縱子可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng)、熱激可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng);金屬響應(yīng)性啟動(dòng)子系統(tǒng);硝酸鹽可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng);光可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng);蛻皮素可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng)、描述用于嗜甲基細(xì)菌和甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中的可誘導(dǎo)/可調(diào)控的系統(tǒng)（參見如美國(guó)專利申請(qǐng)No.US2010/0221813,其通過引用并入本文）等。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非-天然存在的&代謝微生物(如甲烷營(yíng)養(yǎng)菌、嗜甲基菌)包含：（1)可操作地連接至位于lacO操縱子序列側(cè)翼的啟動(dòng)子的編碼AB酶的外源核酸，和（2)可操作地連接至組成型啟動(dòng)子（如己酮糖-6_磷酸合酶啟動(dòng)子)的編碼lacl阻遏蛋白的外源核酸。當(dāng)LacI阻遏蛋白結(jié)合至在LDH或其它啟動(dòng)子側(cè)翼的lacO操縱子序列時(shí)，啟動(dòng)誘導(dǎo)，從而預(yù)防轉(zhuǎn)錄。IPTG結(jié)合lacl阻遏物且從lacO序列釋放其，從而允許轉(zhuǎn)錄。通過使用可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子系統(tǒng)，乳酸鹽合成可通過添加誘導(dǎo)劑控制。[0078]本發(fā)明實(shí)踐中采用的表達(dá)系統(tǒng)和表達(dá)載體任選地含有遺傳元件，諸如例如用于翻譯起始的一個(gè)或多個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)、聚腺苷酸化信號(hào)、限制酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其它克隆區(qū)段等。在某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子和/或密碼子優(yōu)化(更詳細(xì)地描述于上文中）用于在宿主甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中的編碼一種或多種碳水化合物生物合成酶的外源性多核苷酸的高組成型表達(dá)。還可使用在宿主甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中調(diào)控的外源核酸表達(dá)。例如，可使用如于例如美國(guó)專利申請(qǐng)No.US2010/0221813中所述的于嗜甲基細(xì)菌和甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中重組蛋白質(zhì)表達(dá)的可誘導(dǎo)/可調(diào)控系統(tǒng)。[0079]在某些實(shí)施方案中，啟動(dòng)子或密碼子優(yōu)化(更詳細(xì)地描述于上文中）用于在宿主甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中編碼一種或多種L-氨基酸生物合成酶的外源性多核苷酸的高組成型表達(dá)。還可利用在宿主甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中外源核酸的經(jīng)調(diào)控的表達(dá)。例如，可使用如于例如美國(guó)專利申請(qǐng)No.US2010/0221813中所述的于嗜甲基細(xì)菌和甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌中重組蛋白質(zhì)表達(dá)的可誘導(dǎo)/可調(diào)控系統(tǒng)。[0080]產(chǎn)生所需的L-氨基酸的方法[0081]本發(fā)明提供產(chǎn)生L-氨基酸的方法，所述方法包括在天然氣來源的碳原料的存在下在足以產(chǎn)生L-氨基酸的條件下培養(yǎng)重組&代謝微生物，其中所述&代謝微生物包含編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸。典型地，所述天然氣來源的碳原料是天然氣、甲烷或合成氣。適用于培養(yǎng)本發(fā)明的微生物的說明性條件描述于實(shí)施例中。[0082]多種培養(yǎng)方法可用于本文所述的微生物。例如，(^代謝微生物(諸如甲烷營(yíng)養(yǎng)菌或嗜甲基細(xì)菌)可通過分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)方法生長(zhǎng)。在某些實(shí)施方案中，將培養(yǎng)物在控制的培養(yǎng)裝置(諸如發(fā)酵罐、生物反應(yīng)器、中空纖維細(xì)胞等）中生長(zhǎng)。通常，以對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞通常負(fù)責(zé)在一些系統(tǒng)中目標(biāo)產(chǎn)物或中間體的大量生產(chǎn)，而穩(wěn)定期或指數(shù)期后產(chǎn)生可在其它系統(tǒng)中獲得。[0083]典型的分批培養(yǎng)方法是當(dāng)培養(yǎng)開始時(shí)設(shè)定了培養(yǎng)基組分且培養(yǎng)基組分在培養(yǎng)過程期間不改變的密封系統(tǒng)。即，將培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程開始時(shí)用一種或多種選擇的微生物接種，然后使其在不添加任何物質(zhì)至系統(tǒng)中的情況下生長(zhǎng)。如本文所用，〃分批〃培養(yǎng)是指不改變初始添加的特定碳來源的量，而可在培養(yǎng)期間監(jiān)測(cè)和改變因素（諸如pH和氧濃度）的對(duì)照。在分批系統(tǒng)中，系統(tǒng)的代謝物和生物質(zhì)組成持續(xù)改變直到培養(yǎng)終止。在批量培養(yǎng)物中，細(xì)胞(如細(xì)菌，諸如嗜甲基菌)將通常從靜止遲滯期移至高生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期至穩(wěn)定期，其中生長(zhǎng)速率減少或停止(并且如果條件不改變則將最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡）。[0084]補(bǔ)料分批培養(yǎng)是標(biāo)準(zhǔn)分批系統(tǒng)的變化，在所述系統(tǒng)中隨著培養(yǎng)進(jìn)展以一定增量添加目標(biāo)碳底物的。補(bǔ)料分批系統(tǒng)當(dāng)細(xì)胞代謝可能通過分解代謝物抑制抑制時(shí)并且當(dāng)在培養(yǎng)基中需要具有有限量的底物時(shí)是有用的。因?yàn)殡y于測(cè)量補(bǔ)料分批系統(tǒng)中的實(shí)際底物濃度，所以基于可測(cè)量因子(諸如PH、溶解的氧和廢氣分壓）的改變作出評(píng)估。分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域常見和已知的（參見如ThomasD.Brock,Biotechnology:ATextbookofIndustrialMicrobiology，第2版（1989)SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA；Deshpande，Appl.Biochem.Biotechno1?36:227，1992)〇[0085]連續(xù)培養(yǎng)是以下含義的〃開放〃系統(tǒng):持續(xù)添加限定的培養(yǎng)基至生物反應(yīng)器而同時(shí)去除等量的使用（"條件"）的培養(yǎng)基用于處理。連續(xù)培養(yǎng)通常使細(xì)胞維持恒定高液相密度，其中細(xì)胞主要處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期?？商娲兀B續(xù)培養(yǎng)可用經(jīng)固定的細(xì)胞(如生物膜)實(shí)施，其中持續(xù)添加碳和營(yíng)養(yǎng)素并且從細(xì)胞團(tuán)塊中持續(xù)去除有價(jià)值的產(chǎn)物、副產(chǎn)物和廢物。細(xì)胞固定可用由天然材料、合成材料或其組合組成的各種各樣的固體支撐物實(shí)現(xiàn)。[0086]連續(xù)或半連續(xù)培養(yǎng)允許調(diào)節(jié)影響細(xì)胞生長(zhǎng)或終產(chǎn)物濃度的一個(gè)或多個(gè)因素。例如，一種方法可以固定的速率維持有限的營(yíng)養(yǎng)素(如碳來源、氮)并允許所有其它參數(shù)隨著時(shí)間改變。在其它實(shí)施方案中，影響生長(zhǎng)的若干因素可持續(xù)改變同時(shí)如通過培養(yǎng)基濁度測(cè)量的細(xì)胞濃度保持恒定。連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的目標(biāo)是維持穩(wěn)態(tài)生長(zhǎng)條件同時(shí)平衡由于針對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速率排掉的培養(yǎng)基導(dǎo)致的細(xì)胞損失。為了最大化產(chǎn)物形成率，用于連續(xù)培養(yǎng)工藝和技術(shù)的調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)素和生長(zhǎng)因子的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見Brock,1992)。[0087]液相生物反應(yīng)器(如攪拌槽、填充床、單液相、雙液相、中空纖維膜)是本領(lǐng)域熟知的，并且可用于非-天然存在的微生物的生長(zhǎng)和生物催化。[0088]通過使用氣相生物反應(yīng)器，用于生物產(chǎn)生的底物由非-天然存在的微生物、細(xì)胞裂解物或其不含細(xì)胞的級(jí)分從氣體吸收，而非從液體。使用具有微生物的氣相生物反應(yīng)器是本領(lǐng)域已知的（如美國(guó)專利No?2，793，096;4，999，302;5，585，266;5，079，168;和6，143，556;美國(guó)法定發(fā)明登記H1430;美國(guó)專利申請(qǐng)公開No.2003/0032170;EmergingTechnologiesinHazardousWasteManagementIII，1993，Tedder和Pohland編輯，第411-428頁）。示例性氣相生物反應(yīng)器包括單程系統(tǒng)、閉環(huán)栗送系統(tǒng)；和流化床反應(yīng)器。通過利用氣相生物反應(yīng)器，甲烷或其它氣相底物可容易地用于由例如具有單氧酶活性的多肽進(jìn)行的生物轉(zhuǎn)化。在某些實(shí)施方案中，用于將氣體轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-氨基酸的方法在氣相生物反應(yīng)器中進(jìn)行。在另外的實(shí)施方案中，用于將氣體轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-氨基酸的方法在流化床反應(yīng)器中進(jìn)行。在流化床反應(yīng)器中，使流體(即氣體或液體）向上通過其上附接和生長(zhǎng)的微生物的顆粒床載體、通常是沙、顆粒活性碳或硅藻土。流體速度是使得顆粒床載體和附接的微生物懸浮（即床流化）。附接至顆粒床載體的微生物在流體中自由循環(huán)，從而允許流體中底物有效質(zhì)量傳遞至微生物和增加的微生物生長(zhǎng)。示例性流化床反應(yīng)器包括推流反應(yīng)器和完全混合的反應(yīng)器。使用具有微生物生物膜的流化床反應(yīng)器是本領(lǐng)域已知的（如Pfluger等，BioresourceTechnol.102:9919,2011;Fennell等，Biotechnol，Bioengin.40:1218,1992;Ruggeri等，WaterSci?Technol?29:347，1994;美國(guó)專利No?4，032，407;4，009，098;4，009，105;和3，846,289)。[0089]本公開所述的重組&代謝微生物可生長(zhǎng)為經(jīng)分離的純培養(yǎng)物，與可有助于生長(zhǎng)的異源非代謝微生物或與&代謝微生物的一種或多種不同菌株或物種可合并產(chǎn)生混合培養(yǎng)物。[0090]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的L-氨基酸在特定細(xì)胞生長(zhǎng)期（如遲滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期或死亡期）期間產(chǎn)生?？赡苄枰D(zhuǎn)化為L(zhǎng)-氨基酸的來自原料的碳而非Q代謝微生物的生長(zhǎng)和維持。在一些實(shí)施方案中，使如本文提供的非-天然存在的Q代謝微生物（如甲烷營(yíng)養(yǎng)菌、嗜甲基菌)培養(yǎng)至低至中等細(xì)胞密度(OD600)，然后L-氨基酸的產(chǎn)生開始。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生L-氨基酸而甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌不再分裂或非常緩慢地分裂。在一些實(shí)施方案中，所述L-氨基酸僅在穩(wěn)定期期間產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，所述L-氨基酸在對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期期間產(chǎn)生。[0091]包含由本文提供的重組&代謝微生物(如甲烷營(yíng)養(yǎng)菌、嗜甲基菌)產(chǎn)生的L-氨基酸的發(fā)酵罐組合物還可包含與生物發(fā)酵過程相關(guān)的其它有機(jī)化合物。例如，發(fā)酵的生物副產(chǎn)物可包括醇、環(huán)氧化物、醛、酮、酯的一種或多種或其組合。在某些實(shí)施方案中，所述發(fā)酵罐組合物可含有以下醇的一種或多種：甲醇、乙醇、丁醇或丙醇。其它化合物諸如H20、C0、C02、CON2、H2、02和未利用的碳原料(諸如甲烷、乙烷、丙烷和丁烷)也可存在于發(fā)酵罐滅菌氣體中。[0092]在某些實(shí)施方案中，本文提供的重組Q代謝微生物（如甲烷營(yíng)養(yǎng)菌、嗜甲基菌）以約0.001g/L的培養(yǎng)物至約500g/L的培養(yǎng)物產(chǎn)生本發(fā)明的L-氨基酸。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生的L-氨基酸的量是約lg/L的培養(yǎng)物至約100g/L的培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)生的L-氨基酸的量是約0.001g/L、0.01g/L、0.025g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0?3g/L、0?4g/L、0?5g/L、0?6g/L、0?7g/L、0?8g/L、0?9g/L、lg/L、2?5g/L、5g/L、7?5g/L、10g/L、12.5g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L、40g/L、45g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、125g/L、150g/L、175g/L、200g/L、225g/L、250g/L、275g/L、300g/L、325g/L、350g/L、375g/L、400g/L、425g/L、450g/L、475g/LS500g/L。[0093]產(chǎn)物[0094]除了本發(fā)明的重組Ci代謝細(xì)胞之外，本發(fā)明提供其它有用的產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供來源于本發(fā)明的重組&代謝微生物的培養(yǎng)物的生物質(zhì)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含重組&代謝微生物的生物質(zhì)，其中所述重組&代謝微生物包含編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸且其中所述重組&代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴?來源的原料轉(zhuǎn)化為所需的L-氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含重組心代謝微生物的生物質(zhì)，其中所述重組&代謝微生物包含編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸且其中所述重組&代謝微生物能夠?qū)⒓淄檗D(zhuǎn)化為所需的L-氨基酸[0095]如本文所用，〃生物質(zhì)〃是指具有生物來源的有機(jī)物質(zhì)，其可包括全細(xì)胞、裂解細(xì)胞、胞外物質(zhì)等的一種或多種。例如，從培養(yǎng)的微生物中收獲的物質(zhì)(如細(xì)菌或酵母培養(yǎng)物）被認(rèn)為是生物質(zhì)，其可包括細(xì)胞、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、包涵體、分泌或排泄至培養(yǎng)基的產(chǎn)物或其任何組合。在某些實(shí)施方案中，生物質(zhì)包含本公開的(^代謝微生物連同培養(yǎng)基，在所述培養(yǎng)基中生長(zhǎng)本公開的&代謝微生物。在其它實(shí)施方案中，生物質(zhì)包含從在&底物(如天然氣、甲烷等)上生長(zhǎng)的培養(yǎng)物恢復(fù)的本公開的Q代謝微生物(全部或裂解的或兩者）。在另外其它實(shí)施方案中，生物質(zhì)包含在&底物上培養(yǎng)的&代謝微生物的培養(yǎng)物的消耗培養(yǎng)基上清液。此類培養(yǎng)物可被認(rèn)為是可再生資源。就所需L-氨基酸的水平而言，本發(fā)明的生物質(zhì)是富含的。[0096]為細(xì)胞生長(zhǎng)向其提供天然氣-來源的底物的本發(fā)明的重組Q代謝微生物就如由其S13C值表示的其碳指紋而言是獨(dú)特的（來源自此類重組Q代謝微生物的產(chǎn)物也是這樣）。通過背景，合適的同位素測(cè)量和質(zhì)量平衡方法廣泛用于評(píng)估全球來源和甲烷吸附物（參見Whiticar和Faber，0rg.Geochem.10:759，1986;Whiticar，0rg.Geochem.16:531，1990)。為了使用殘余甲烷的S13C值測(cè)定氧化量，有必要了解由甲烷的微生物氧化導(dǎo)致的同位素分級(jí)分離程度。例如，好氧甲烷營(yíng)養(yǎng)菌可通過一種特定酶甲烷單加氧酶(MM0)代謝甲烷。甲烷營(yíng)養(yǎng)菌將甲烷轉(zhuǎn)化為甲醇且隨后轉(zhuǎn)化為甲醛。甲醛可經(jīng)進(jìn)一步氧化成C02以向細(xì)胞提供呈還原當(dāng)量(NADH)形式的能量，或通過與光合生物中的碳同化途徑類似的RuMP或絲氨酸循環(huán)摻入至生物質(zhì)內(nèi)（Hanson和Hanson,Microbio1?Rev.60:439，1996)。更特別地，I型甲燒營(yíng)養(yǎng)菌使用RuMP途徑用于生物質(zhì)合成并完全從CH4產(chǎn)生生物質(zhì)，而II型甲烷營(yíng)養(yǎng)菌使用從CH4同化50-70%細(xì)胞碳且從C〇2同化30-50%細(xì)胞碳的絲氨酸途徑(Hanson和Hanson,1996)。用于測(cè)量碳同位素組合物的方法提供于例如了611^161:〇11等(66〇(311；[111.(]〇81]1〇(311；[111.4(^370:1739，2006)中，所述方法在此通過引用以其整體并入。實(shí)施例2描述了在不同(^代謝微生物的細(xì)胞中穩(wěn)定的碳同位素分布的表征。所述細(xì)胞的高度負(fù)S13C值在從如實(shí)施例所述的那些細(xì)胞提取的化合物的S13C值中類似反映。本文所述的本發(fā)明產(chǎn)物的S13C(即本發(fā)明的重組Q代謝微生物(如上文所述）、從其來源的相關(guān)生物質(zhì)和L-氨基酸及組合物)可如實(shí)施例3所證明根據(jù)所用&底物的來源和純度改變。[0097]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組心代謝微生物及從其來源的相關(guān)生物質(zhì)和L-氨基酸及組合物展現(xiàn)了低于_30%。、低于-31%。、低于-32%。、低于-33%。、低于-34%。、低于-35%。、低于-36%。、低于-37%。、低于-38%。、低于-39%。、低于-40%。、低于-41%。、低于-42%。、低于-43%。、低于-44%。、低于-45%。、低于-46%。、低于-47%。、低于-48%。、低于-49%。、低于-50%。、低于-51%。、低于-52%。、低于-53%。、低于-54%。、低于-55%。、低于-56%。、低于-57%。、低于-58%。、低于-59%。、低于-60%。、低于-61%。、低于-62%。、低于-63%。、低于-64%。、低于-65%〇、低于-66%。、低于-67%。、低于-68%。、低于-69%?；虻陀?70%。的S13C。[0098]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組心代謝微生物以及從其來源的相關(guān)生物質(zhì)和L-氨基酸及組合物展現(xiàn)了約-35%。至約-50%。、-45%。至約-35%。、或約-50%。至約-40%。、或約-45%。至約-65%。、或約-60%。至約-70%。、或約-30%。至約-70%。的S13C。[0099]在另外的實(shí)施方案中，(^代謝非光合微生物生物質(zhì)具有低于約-30%。、或在約-40%。至約-60%。范圍內(nèi)的S13C。在某些實(shí)施方案中，所述生物質(zhì)包含重組(^代謝非光合微生物連同消耗培養(yǎng)基，或者所述生物質(zhì)包含重組&代謝非光合微生物培養(yǎng)物的消耗培養(yǎng)基上清液組合物，其中所述生物質(zhì)的S13C低于約-30%。。在某些其它實(shí)施方案中，所述L-氨基酸組合物從生物質(zhì)提取或濃縮，所述生物質(zhì)可包含重組(^代謝非光合微生物連同培養(yǎng)物的消耗培養(yǎng)基或者重組&代謝非光合微生物培養(yǎng)物的消耗培養(yǎng)基上清液組合物。[0100]在某些實(shí)施方案中，來源于&代謝微生物的L-氨基酸組合物(其可任選地為來自&代謝微生物生物質(zhì)的提取物或分離物)包含至少約50重量％至約80重量％的組合物的氫、氧和碳原子，且其中所述組合物的S13C低于約-35%?；虻陀诩s-36%?；虻陀诩s-37%。或低于約-38%?；虻陀诩s-39%?；虻陀诩s-40%。。在某些實(shí)施方案中，來源于其的L-氨基酸組合物包含具有氫、氧和碳原子的分子，其中所述氫、氧和碳原子是至少50重量％、至少55重量％、至少60重量％、至少65重量％、至少70重量％、至少75重量％、或至少80重量％、或至少90重量％、或至少95重量％的組合物，且其中所述組合物的S13C在約-30%。至約-70%。的范圍內(nèi)，或其中生物質(zhì)中的S13C隨著細(xì)胞密度增加而減小約-5%。至約-20%。，或其中所述生物質(zhì)的S13C比在相同時(shí)間產(chǎn)生的C02的S13C高平均5%。至15%。（當(dāng)在存在或不存在銅的情況下培養(yǎng)時(shí))。[0101]在天然氣-來源的原料的存在下培養(yǎng)的一些心代謝微生物的S13C的表征在下文中實(shí)施例說明。[0102]本發(fā)明還提供了動(dòng)物飼料，其包含本發(fā)明的重組心代謝微生物、相關(guān)生物質(zhì)和/或L-氨基酸組合物。如在本發(fā)明的實(shí)踐中所設(shè)想，所述動(dòng)物飼料可為牲畜飼料(諸如例如豬飼料、牛飼料、羊飼料等）、禽類飼料(諸如，例如雞飼料、火雞飼料等)或魚飼料(諸如，例如鮭魚飼料、甲殼類動(dòng)物飼料等）。所述動(dòng)物飼料還可包含添加劑，諸如例如植物來源的物質(zhì)(包括例如來源于谷物(諸如例如玉米、大麥、燕麥、大米、黑麥、小麥、高粱、布魯爾氏消耗谷物(Brewer'sspentgrain)等）的那些;及來源于豆類(諸如例如紫苜蓿、苜蓿、豌豆、蠶豆、扁豆、大豆等）的那些）、動(dòng)物-來源的物質(zhì)(諸如例如魚粉)和/或微生物-來源的物質(zhì)(包括例如來自可為例如細(xì)菌、酵母或藻類的異源微生物的生物質(zhì)）。在一些實(shí)施方案中，植物來源的物質(zhì)添加劑是大ii柏或婉蛋白質(zhì)。[0103]在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供培養(yǎng)物或發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含本發(fā)明的重組心代謝微生物、相關(guān)的生物質(zhì)和/或L-氨基酸組合物。典型地，所述培養(yǎng)物或發(fā)酵培養(yǎng)基還包含碳水化合物(如糖等)和/或水。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明培養(yǎng)或發(fā)酵培養(yǎng)基與第二微生物的細(xì)胞培養(yǎng)物組合物。典型地，所述第二微生物是細(xì)菌、酵母或藻類細(xì)胞。[0104]本發(fā)明的實(shí)施方案包括以下：[0105]1.-種生物質(zhì)，其來源于重組&代謝微生物培養(yǎng)物，其中所述重組&代謝微生物包含編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸，其中所述(^代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴鈦碓吹奶荚限D(zhuǎn)化為L(zhǎng)-氨基酸，并且其中所述生物質(zhì)的S13C低于_40%〇。[0106]2.如實(shí)施方案1所述的生物質(zhì)，其中所述重組心代謝微生物是非光合(^代謝微生物。[0107]3.如實(shí)施方案1-2中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組酶:賴氨酸生物合成酶、色氨酸生物合成酶、甲硫氨酸生物合成酶、半胱氨酸生物合成酶和蘇氨酸生物合成酶。[0108]4.如實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的賴氨酸生物合成酶:賴氨酸-敏感性天冬氨酸激酶Ill(lysC)、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶(asd)、二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、2，3，4,5_四氫吡啶_2,6_甲酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(dapD)、乙酰鳥氨酸/丁二酸二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(argD)、琥珀酰-二氨基庚二酸脫琥珀酰酶(dapE)、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(dapF)和二氨基庚二酸二羧酶(lysA)。[0109]5.根據(jù)實(shí)施方案4所述的生物質(zhì)，其中所述L-氨基酸是L-賴氨酸。[0110]6.如實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的色氨酸生物合成酶：分支酸-丙酮酸裂解酶（ubiC)、鄰氨基苯甲酸合酶組分I(trpE)、鄰氨基苯甲酸合酶組分II(trpG)、鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(trpD)、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶(trpC)、色氨酸生物合成蛋白質(zhì)（1:印〇、1'1-(5'磷酸核糖基)鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶（trpF)、n引噪-3-甘油磷酸合酶、色氨酸合酶a鏈（trpA)和色氨酸合酶0鏈(trpB)。7.根據(jù)實(shí)施方案6所述的生物質(zhì)，其中所述L-氨基酸是L-色氨酸。[0112]8.如實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中外源核酸編碼選自由以下組成的組的甲硫氨酸生物合成酶：高絲氨酸0-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(metA)、胱硫醚y-合酶(metB)、蛋白質(zhì)MalY、胱硫醚裂解酶(metC)、B12-依賴性甲硫氨酸合酶(metH)和5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(metE)。[0113]9.根據(jù)實(shí)施方案8所述的生物質(zhì)，其中所述L-氨基酸是L-甲硫氨酸。[0114]10.如實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的半胱氨酸生物合成酶:絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(CysE)、半胱氨酸合酶A和半胱氨酸合酶B〇[0115]11.根據(jù)實(shí)施方案10所述的生物質(zhì)，其中所述L-氨基酸是L-半胱氨酸。[0116]12.如實(shí)施方案1-3中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的蘇氨酸生物合成酶:天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、PLP-依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶。[0117]13.如實(shí)施方案12所述的生物質(zhì)，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸。[0118]14.根據(jù)實(shí)施方案1-13中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源核酸編碼對(duì)選自由大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌組成的組微生物是內(nèi)源性的L-氨基酸生物合成酶。[0119]15.如實(shí)施方案1-2中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的L-氨基酸生物合成酶序列：SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148或150的任一者。[0120]16.根據(jù)實(shí)施方案1-15中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述外源核酸的序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于從重組&代謝微生物最佳表達(dá)。[0121]17.根據(jù)實(shí)施方案1-16中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中編碼L-氨基酸生物合成酶的所述外源核酸可操作地連接至表達(dá)控制序列。[0122]18.如實(shí)施方案17所述的生物質(zhì)，其中所述表達(dá)控制序列是外源性表達(dá)控制序列。[0123]19.根據(jù)實(shí)施方案1-18中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述Q代謝微生物還包含內(nèi)源性酶活性的缺失。[0124]20.根據(jù)實(shí)施方案1-19中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述Q代謝微生物是甲烷營(yíng)養(yǎng)菌。[0125]21.根據(jù)實(shí)施方案20所述的生物質(zhì)，其中所述甲烷營(yíng)養(yǎng)菌是甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基彎菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微菌屬、甲烷單胞菌屬、甲基胞菌屬或甲基莢膜菌屬。[0126]22.如實(shí)施方案20所述的生物質(zhì)，其中所述甲烷營(yíng)養(yǎng)菌選自由以下組成的組:莢膜甲基球菌巴斯菌株、甲烷甲基單胞菌16a(ATCCPTA2402)、發(fā)孢甲基彎菌0B3b(NRRLB-11，196)、生孢甲基彎菌(NRRLB-ll，197)、小甲基孢囊菌(NRRLB-ll，198)、甲烷甲基單胞菌(NRRLB-ll，199)、白色甲基單胞菌(NRRLB-ll，200)、莢膜甲基桿菌（NRRLB-ll，201)、嗜有機(jī)甲基桿菌(六了0：27,886)、甲基單胞菌屬某種六1-3670$￡1^?-2400)、森林甲基胞菌、沼澤甲基胞菌(ATCC700799)、凍原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔蘚甲基孢囊菌、金色甲基莢膜菌屬KYG、大地甲基嗜酸菌、甲基叔丁基醚降解菌和嗜喊甲基微菌。[0127]23.根據(jù)實(shí)施方案1-22中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述天然氣來源的碳原料選自由以下組成的組:天然氣、合成氣、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、氰化物、甲胺、甲基硫醇、甲基鹵素及其任何組合或兩個(gè)或多個(gè)。[0128]24.根據(jù)實(shí)施方案23所述的生物質(zhì)，其中所述天然氣來源的碳原料是天然氣。[0129]25.根據(jù)實(shí)施方案23所述的生物質(zhì)，其中所述天然氣來源的碳原料是甲烷。[0130]26.根據(jù)實(shí)施方案23所述的生物質(zhì)，其中所述天然氣來源的碳原料是合成氣。[0131]27.根據(jù)實(shí)施方案23所述的生物質(zhì)，其中所述&代謝微生物是合成氣代謝細(xì)菌。[0132]28.根據(jù)實(shí)施方案27所述的生物質(zhì)，其中所述合成氣代謝細(xì)菌選自由以下組成的組:產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、嗜甲基丁酸桿菌、伍氏梭菌和產(chǎn)丙醇梭菌。[0133]29.如實(shí)施方案1-28中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)的S13C低于_50%〇。[0134]30.-種包含L-氨基酸的組合物，其中所述組合物展現(xiàn)了低于-40%。的S13C。[0135]31.如實(shí)施方案30所述的組合物，其中L-氨基酸選自由以下組成的組:L_賴氨酸、L-色氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和L-蘇氨酸。[0136]32.-種動(dòng)物飼料，其包含如實(shí)施方案1-29中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)或如實(shí)施方案30-31中任一項(xiàng)所述的組合物。[0137]33.如實(shí)施方案32所述的動(dòng)物飼料，其還包含植物來源的物質(zhì)。[0138]34.如實(shí)施方案33所述的動(dòng)物飼料，其中所述植物來源的物質(zhì)選自由大豆柏和豌豆蛋白質(zhì)組成的組。[0139]35.-種培養(yǎng)物或發(fā)酵培養(yǎng)基，其包含如實(shí)施方案1-27中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)或如實(shí)施方案40-42中任一項(xiàng)所述的組合物。[0140]36.-種包含編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸的重組心代謝微生物，其中所述&代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴鈦碓吹奶荚限D(zhuǎn)化為L(zhǎng)-氨基酸，并且其中所述生物質(zhì)的S13C低于-40%〇/。[0141]37.如實(shí)施方案36所述的重組&代謝微生物，其中所述重組&代謝微生物是非光合Ci代謝微生物。[0142]38.根據(jù)實(shí)施方案36-37中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的酶:賴氨酸生物合成酶、色氨酸生物合成酶、甲硫氨酸生物合成酶、半胱氨酸生物合成酶和蘇氨酸生物合成酶。[0143]39.根據(jù)實(shí)施方案36-38中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的賴氨酸生物合成酶:賴氨酸-敏感性天冬氨酸激酶Ill(lysC)、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶(asd)、二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、2，3，4，5-四氫吡啶-2，6_甲酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(dapD)、乙酰鳥氨酸/丁二酸二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(argD)、琥珀酰-二氨基庚二酸脫琥珀酰酶(dapE)、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(dapF)和二氨基庚二酸二羧酶(lysA)。[0144]40.根據(jù)實(shí)施方案39所述的重組&代謝微生物，其中L-氨基酸是L-賴氨酸。[0145]41.根據(jù)實(shí)施方案36-38中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的色氨酸生物合成酶:分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)、鄰氨基苯甲酸合酶組分I(trpE)、鄰氨基苯甲酸合酶組分II(trpG)、鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(trpD)、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶（trpC)、色氨酸生物合成蛋白質(zhì)（trpC)、N-(5'磷酸核糖基)鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶(trpF)、吲哚-3-甘油磷酸合酶、色氨酸合酶a鏈(trpA)和色氨酸合酶0鏈(trpB)。[0146]42.根據(jù)實(shí)施方案41所述的重組&代謝微生物，其中L-氨基酸是L-色氨酸。[0147]43.根據(jù)實(shí)施方案36-38中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中外源核酸編碼選自由以下組成的組的甲硫氨酸生物合成酶:高絲氨酸0-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(metA)、胱硫醚y-合酶(metB)、蛋白質(zhì)MalY、胱硫醚裂解酶(metC)、B12-依賴性甲硫氨酸合酶(metH)和5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(metE)。[0148]44.根據(jù)實(shí)施方案43所述的重組&代謝微生物，其中L-氨基酸是L-甲硫氨酸。[0149]45.根據(jù)實(shí)施方案36-38中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述外源核酸編碼選自由絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(CysE)半胱氨酸合酶A和半胱氨酸合酶B組成的組的半胱氨酸生物合成酶。[0150]46.根據(jù)實(shí)施方案45所述的重組&代謝微生物，其中L-氨基酸是L-半胱氨酸。[0151]47.根據(jù)實(shí)施方案36-38中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的蘇氨酸生物合成酶:天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、PLP-依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶。[0152]48.如實(shí)施方案47所述的重組&代謝微生物，其中L-氨基酸是L-蘇氨酸。[0153]49.根據(jù)實(shí)施方案36-48中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述外源核酸編碼對(duì)于選自由大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌組成的組的微生物是內(nèi)源性的L-氨基酸生物合成酶。[0154]50.根據(jù)實(shí)施方案36-37中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述外源核酸編碼選自由以下組成的組的L-氨基酸生物合成酶序列：SEQIDN0:、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148和150的任一者。[0155]51.根據(jù)實(shí)施方案36-50中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述外源核酸的序列經(jīng)密碼子優(yōu)化以用于從所述重組&代謝微生物最佳表達(dá)。[0156]52.根據(jù)實(shí)施方案36-51中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中編碼L-氨基酸生物合成酶的所述外源核酸可操作地連接至表達(dá)控制序列。[0157]53.如實(shí)施方案52所述的重組Q代謝微生物，其中所述表達(dá)控制序列是外源性表達(dá)控制序列。[0158]54.根據(jù)實(shí)施方案36-53中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述(^代謝微生物還包含內(nèi)源性酶活性的缺失。[0159]55.根據(jù)實(shí)施方案36-54中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述(^代謝微生物是甲烷營(yíng)養(yǎng)菌。[0160]56.根據(jù)實(shí)施方案55所述的重組Q代謝微生物，其中所述甲烷營(yíng)養(yǎng)菌是甲基單胞菌屬、甲基桿菌屬、甲基球菌屬、甲基彎菌屬、甲基孢囊菌屬、甲基微菌屬、甲烷單胞菌屬、甲基胞菌屬或甲基莢膜菌屬。[0161]57.如實(shí)施方案55所述的重組Q代謝微生物，其中所述甲烷營(yíng)養(yǎng)菌選自由以下組成的組:莢膜甲基球菌巴斯菌株、甲烷甲基單胞菌16a(ATCCPTA2402)、發(fā)孢甲基彎菌0B3b(NRRLB-ll，196)、生孢甲基彎菌（NRRLB-ll，197)、小甲基孢囊菌(NRRLB-ll，198)、甲烷甲基單胞菌(NRRLB-ll，199)、白色甲基單胞菌(NRRLB-ll，200)、莢膜甲基桿菌(NRRLB-11，201)、嗜有機(jī)甲基桿菌(ATCC27，886)、甲基單胞菌屬某種AJ-3670(FERMP-2400)、森林甲基胞菌、沼澤甲基胞菌(ATCC700799)、凍原甲基胞菌、道氏甲基孢囊菌菌株SB2、苔蘚甲基孢囊菌、金色甲基莢膜菌屬KYG、大地甲基嗜酸菌、甲基叔丁基醚降解菌和嗜喊甲基微菌。[0162]58.根據(jù)實(shí)施方案36-57中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述天然氣來源的碳原料選自由以下組成的組:天然氣、合成氣、甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、一氧化碳、二氧化碳、氰化物、甲胺、甲基硫醇、甲基鹵素及其任何組合或兩個(gè)或多個(gè)。[0163]59.如實(shí)施方案58所述的重組Q代謝微生物，其中所述天然氣來源的碳原料是天然氣。[0164]60.如實(shí)施方案58所述的重組Q代謝微生物，其中所述天然氣來源的碳原料是甲烷。[0165]61.如實(shí)施方案58所述的重組Q代謝微生物，其中所述天然氣來源的碳原料是合成氣。[0166]62.如實(shí)施方案61所述的重組&代謝微生物，其中所述&代謝微生物是合成氣代謝細(xì)囷。[0167]63.根據(jù)實(shí)施方案62所述的重組Q代謝微生物，其中所述合成氣代謝細(xì)菌選自由以下組成的組:產(chǎn)乙醇梭菌、楊氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌、嗜甲基丁酸桿菌、伍氏梭菌和產(chǎn)丙醇梭菌。[0168]64.根據(jù)實(shí)施方案36-63中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述生物質(zhì)的S13C低于_50%〇。[0169]65.-種產(chǎn)生L-氨基酸的方法，所述方法包括在天然氣來源的碳原料的存在下在足以產(chǎn)生L-氨基酸的條件下培養(yǎng)如實(shí)施方案36-64中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物。[0170]66.-種由如實(shí)施方案65所述的方法產(chǎn)生的L-氨基酸，其中所述L-氨基酸展現(xiàn)了低于-40%。的S13C。[0171]本發(fā)明的之前和其它方面可結(jié)合以下非限制性實(shí)施例而更容易理解。實(shí)施例[0172]實(shí)施例1[0173]&代謝微生物培養(yǎng)和生物反應(yīng)器條件[0174]將本公開的示例性&代謝微生物（甲烷營(yíng)養(yǎng)菌、嗜甲基菌、梭菌屬)培養(yǎng)在管內(nèi)、小瓶?jī)?nèi)、瓶?jī)?nèi)、板上、或生物反應(yīng)器(發(fā)酵）內(nèi)。用于各種微生物的生長(zhǎng)條件、培養(yǎng)基和碳來源描述于本實(shí)施例中。[0175]發(fā)孢甲基彎菌菌株0B3b(N(HMB11131);甲基單胞菌屬某種菌株16a(ATCCPTA-2402);或甲烷甲基單胞菌[0176]對(duì)于血清瓶，將細(xì)菌在30°C下在希金斯最低硝酸鹽培養(yǎng)基（NSM;Cornish等，J.Gen.Microbiol?130:2565，1984;Park等，Biotechnol?Bioeng?38:423，1991)或MM-W1培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將頂部空間組成調(diào)整為1:1體積的甲烷:空氣。將瓶以200_250rpm的速率振蕩。可替代地，將培養(yǎng)物維持在于含l:l(v/V)甲烷:空氣氣體混合物的氣密室中或在甲醇蒸汽(經(jīng)由石蠟?zāi)?密封板的封蓋內(nèi)的〇.5mL甲醇）的存在下生長(zhǎng)的含有1.5%w/v瓊脂的NSM-培養(yǎng)基板上，或者在補(bǔ)充有〇.5%甲醇的NSM-培養(yǎng)基板上。將板在加濕室中在30°C下倒置孵育。[0177]所用的NSM培養(yǎng)基的組成如下：1.0gMgS〇4*7H20、0.20gCaCl2*6H20、2.0ml螯合鐵溶液(〇.lg檸檬酸鐵（III)銨或0.5g氯化鐵（III);0.2gEDTA鈉鹽;0.3ml濃HC1;100.0ml蒸餾去離子H20)、1.0gKN03、0.5ml微量元素溶液（500.0mgEDTA、200.0mgFeS〇4.7H20、lO.OmgZnS〇4*7H2〇、3.0mgMnCl2*4H2〇、30.0mgH3B〇3、20.0mgCoCl2*6H2〇、1.0mgCaCl2*2H20、2.0mgNiCl2*6H20、3.0mgNa2Mo〇4*2H2〇、1.0L蒸餾水）、0.272gKH2P〇4、0.717gNa2HP〇4*12H20、任選的12.5g純化瓊脂（如OxoidL28或Bacto?瓊脂；當(dāng)制備板時(shí)使用）、1.0L蒸餾去離子水，pH調(diào)節(jié)至6.8并在121°C下高壓滅菌15分鐘。[0178]對(duì)于發(fā)酵，向含有1L滅菌限定培養(yǎng)基MM-W1的2-升生物反應(yīng)器接種來自在供應(yīng)了1:1(v/v)甲烷與空氣混合物的麗-W1中生長(zhǎng)的血清瓶批次培養(yǎng)物（10-20%v/v)的細(xì)胞。所用的培養(yǎng)基MM-W1的組成如下：0.8mMMgS〇4*7H20、10mMNaN03、0.14mMCaCl2、1.2mMNaHC03、2.35mMKH2P〇4、3.4mMK2HP〇4、20.7yMNa2Mo〇4*2H2〇、lyMCuS〇4*5H20、10yMFem-Na-EDTA和lmL/升的微量金屬溶液（每升含有500mgFeS〇4*7H20、400mgZnS〇4*7H20、20mgMnCl2*7H20、50mgCoCl2*6H20、10mgNiCl2*6H2〇、15mgH3B03、250mgEDTA)。在將培養(yǎng)基高壓滅菌和冷卻后，添加磷酸鹽、碳酸氫鹽和Fem-Na-EDTA。在某些發(fā)酵中，添加多達(dá)0.1%(w/v)的碳酸氫鹽。將反應(yīng)器內(nèi)含物用頂置葉輪以恒定750rpm攪拌。將培養(yǎng)物用以約60mL/min至約120mL/min噴射的恒定甲燒補(bǔ)料，同時(shí)以約10-100mL/min的可變速率供應(yīng)濃氧（至少85%)以維持約40%至約80%的溶解的氧水平(相對(duì)于培養(yǎng)基的空氣飽和）。[0179]將生物反應(yīng)器內(nèi)的溫度維持在30°C，且約每4小時(shí)至約24小時(shí)（對(duì)應(yīng)于大約50D單位的OD600增加）使用自動(dòng)添加0.5MNaOH和0.5MHC1、連同其它添加至培養(yǎng)物將pH維持在7.1±0.1。其它添加交替為金屬添加（10虛0^04、5福？6504、5虛？6111-他40了4最終濃度)和營(yíng)養(yǎng)素添加(5.75mMKxHyP04，10mMNaN03)。在這些條件下，觀察到基本上線性生長(zhǎng)至大于20的OD600,其有效的生物質(zhì)產(chǎn)生速率為約2.7至約3.3g干細(xì)胞重量/升/天。培養(yǎng)生物質(zhì)通過離心收集、在MM-W1培養(yǎng)基中洗滌一次，并且將回收的生物質(zhì)在-80°C下冷凍或立即用于細(xì)胞組分的分級(jí)分離(如脂質(zhì)提?。?。[0180]還可施加半連續(xù)發(fā)酵方法以維持生物質(zhì)產(chǎn)率且減少與發(fā)酵關(guān)閉和開始相關(guān)的時(shí)間（即運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間或前置時(shí)間）。[0181]隨著培養(yǎng)物濃度接近穩(wěn)定期（但在進(jìn)入穩(wěn)定期之前），細(xì)菌生物質(zhì)的收集以大約12-24小時(shí)間隔進(jìn)行。大約一半的生物反應(yīng)器體積通過經(jīng)由離心栗轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器去除。然后將等體積的滅菌或回收培養(yǎng)基返回至生物反應(yīng)器，使得反應(yīng)器的光密度為其初始值的大約一半。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，使得多個(gè)周期的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收可在單個(gè)發(fā)酵運(yùn)行期間進(jìn)行。[0182]莢膜甲基球菌巴斯(NCBffi11132)[0183]將細(xì)菌在42°C下培養(yǎng)在含有希金斯最低硝酸鹽培養(yǎng)基(NSM)或MM-W1培養(yǎng)基的血清瓶?jī)?nèi)。將頂部空間組成調(diào)整為1:1體積的甲烷:空氣。將瓶以200-250rpm的速率振蕩。可替代地，將培養(yǎng)物維持在含有1:1(v/v)甲烷:空氣氣體混合物的氣密室內(nèi)生長(zhǎng)的用1.5%w/v瓊脂固化的NSM-培養(yǎng)基板上。將板在加濕室中在42°C下倒置孵育于室內(nèi)。[0184]對(duì)于發(fā)酵，向含有1.25L滅菌培養(yǎng)基MMF1.1的3-升生物反應(yīng)器接種來自在供應(yīng)了l:l(v/v)甲烷與空氣混合物的相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的血清瓶批次培養(yǎng)物（10-20%v/v)的細(xì)胞。培養(yǎng)基MMF1.1的組成如下：0.8mMMgS〇4*7H20、40mMNaN03、0.14mMCaCl2、6mMNaHC03、4.7mMKH2P〇4、6.8mMK2HP〇4、20.7yMNa2Mo〇4*2H20、6yMCuS〇4*5H20、10yMFem-Na-EDTA和lmL/升的微量金屬溶液（每升含有500mgFeS〇4*7H20、400mgZnS〇4*7H20、20mgMnCl2*7H20、50mgCoCl2*6H2〇、10mgNiCl2*6H2〇、15mgH3B03、250mgEDTA)。在將培養(yǎng)基高壓滅菌和冷卻后，添加磷酸鹽、碳酸氫鹽和Fem-Na-EDTA。將反應(yīng)器內(nèi)含物用頂置葉輪以恒定750rpm攪拌。將培養(yǎng)物用以約60至約200mL/min噴射的恒定甲燒補(bǔ)料，同時(shí)以15_90mL/min的可變速率供應(yīng)濃氧(>85%)并且將溶解的氧水平維持低于10%(相對(duì)于培養(yǎng)基的空氣飽和）。[0185]將生物反應(yīng)器內(nèi)的溫度維持在44°C，且每3-6小時(shí)（在達(dá)到0D5后，對(duì)應(yīng)于大約3-50D單位的0D6QQ增加）使用自動(dòng)添加0.5MNaOH和0.5MHC1、連同銅和鐵添加（5虛CuS04、5yMFeSCk、10yMFem-Na-EDTA最終濃度）至培養(yǎng)物來將pH維持在7.0±0.1。在這些條件下，觀察到基本上線性生長(zhǎng)至大于10的OD600,其有效的生物質(zhì)產(chǎn)生速率為大于5克干細(xì)胞重量/升/天。培養(yǎng)生物質(zhì)通過離心收集、在MM-W1培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞一次，并且將細(xì)胞沉淀在-80°C下冷凍或立即用于細(xì)胞組分的分級(jí)分離。[0186]營(yíng)養(yǎng)素消耗被認(rèn)為是可限制發(fā)酵期間的生長(zhǎng)產(chǎn)率的問題。為了避免營(yíng)養(yǎng)素（主要是氮和磷酸鹽）的限制，由2-倍濃度的MMF1.1組成的營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)料在培養(yǎng)物0D6QQ超過5后開始。營(yíng)養(yǎng)素進(jìn)料以對(duì)應(yīng)于大約一半的培養(yǎng)物生長(zhǎng)速率的稀釋率開始以避免洗脫且維持0D增加同時(shí)擴(kuò)充培養(yǎng)物體積。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，使得多個(gè)周期的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收可在單個(gè)發(fā)酵運(yùn)行期間進(jìn)行。[0187]扭脫甲基桿菌或發(fā)孢甲基彎菌菌株0B3b(NCBffi11131)[0188]細(xì)菌在30°C下在含有補(bǔ)充有0.5%甲醇的希金斯最低硝酸鹽培養(yǎng)基(NSM)的管中培養(yǎng)。將管以200-250rpm的速率振蕩。可替代地，將培養(yǎng)物維持在于甲醇蒸汽(經(jīng)由石蠟?zāi)?密封板的封蓋內(nèi)的0.5mL甲醇）的存在下生長(zhǎng)的含有1.5%w/v瓊脂或者補(bǔ)充有0.5%甲醇的NSM-培養(yǎng)基板上。將板在加濕室中在正常氣氛下在30°C下倒置孵育。[0189]對(duì)于發(fā)酵，向含有1L限定培養(yǎng)基MM-W1的2-升生物反應(yīng)器接種來自培養(yǎng)管批次培養(yǎng)物（10-20%v/v)的細(xì)胞。培養(yǎng)基MM-W1的組成如上文所述。將反應(yīng)器內(nèi)含物用頂置葉輪以恒定800rpm攪拌。將培養(yǎng)物用初始大劑量的甲醇至0.5%的最終濃度和可變的甲醇進(jìn)料補(bǔ)料，同時(shí)以30-100mL/min的可變速率供應(yīng)純氧以維持60-90%的溶解的氧水平(相對(duì)于培養(yǎng)基的空氣飽和）。[0190]將生物反應(yīng)器內(nèi)的溫度維持在30°C，且如上文所述使用自動(dòng)添加0.5MNaOH和1MHC1、連同金屬和營(yíng)養(yǎng)素添加將pH維持在7.1±0.1。在這些條件下，觀察到基本上線性生長(zhǎng)至大于20的OD600,其有效的生物質(zhì)產(chǎn)生速率為2.7至3.3克干細(xì)胞重量/升/天。培養(yǎng)生物質(zhì)通過離心收集，將細(xì)胞在MM-W1培養(yǎng)基中洗滌一次，并且將細(xì)胞沉淀在-80°C下冷凍或立即用于細(xì)胞組分的分級(jí)分離。[0191]還可施加半連續(xù)發(fā)酵方法以維持生物質(zhì)產(chǎn)率且減少與發(fā)酵關(guān)閉和開始相關(guān)的時(shí)間（即運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間或前置時(shí)間）。[0192]隨著培養(yǎng)物濃度接近穩(wěn)定期(但在進(jìn)入穩(wěn)定期之前），積累的細(xì)菌生物質(zhì)的收集以大約12-24小時(shí)的間隔進(jìn)行。大約一半的生物反應(yīng)器體積通過經(jīng)由離心栗轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器去除。然后將等體積的新鮮或回收培養(yǎng)基返回至生物反應(yīng)器，使得反應(yīng)器的光密度為其初始值的大約一半。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵持續(xù)，使得多個(gè)周期的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收可在單個(gè)發(fā)酵運(yùn)行期間進(jìn)行。[0193]產(chǎn)乙醇梭菌和楊氏梭菌[0194]將梭菌屬細(xì)菌在37°C下培養(yǎng)在具有丁基橡膠塞和200kPa煉鋼廠廢氣的塑料涂敷的500ml-SchottDuran?GL45瓶?jī)?nèi)的100mL改良PETC培養(yǎng)基(ATCC培養(yǎng)基1754)中。通過測(cè)量600nm下的光密度(0D6QQ)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)。[0195]改良PETC培養(yǎng)基含有（每升）lgNH4Cl、0.4gKCl、0.2gMgS〇4*7H20、0.8gNaCl、O.lgKH2P〇4、20mgCaCl2*2H20、10ml微量元素溶液(參見下文）、10ml沃爾夫氏維生素溶液(Wolfe'svitamin溶液，參見下文）、2gNaHC〇3和lmg刃天青。在將pH調(diào)節(jié)至5.6后，將培養(yǎng)基煮沸、缺氧分散并在121°C下高壓滅菌15分鐘。煉鋼廠廢氣（組成：44%⑶、32%N2、22%C02、2%H2)或等效的合成混合物用作碳來源。所述培養(yǎng)基具有5.9的最終pH且用濃度為0?008%(w/v)的半胱氨酸-HC1和Na2S還原。[0196]微量元素溶液每升含有2g氨三乙酸(在添加剩余成分之前用K0H調(diào)節(jié)至pH6)、lgMnS〇4、0.8gFe(S〇4)2(NH4)2*6H20、0.2gCoCl2*6H20、0.2mgZnS〇4*7H20、20mgCuC12*2H2〇、20mgNiCl2*6H2〇、20mgNa2Mo〇4*2H2〇、20mgNa2Se〇4和20mgNa2W〇4。[0197]沃爾夫氏維生素溶液(Wolin等，J.Biol.Chem.238:2882,1963)含有(每升）2mg生物素、2mg葉酸、1Omg鹽酸吡咳醇、5mg硫胺-HC1、5mg核黃素、5mg煙酸、5mgD-(+)-泛酸?丐、0.lmg維生素B12、5mg對(duì)氨基苯甲酸和5mg硫辛酸。_8]a.產(chǎn)乙醇梭菌發(fā)酵[0199]產(chǎn)乙醇梭菌的發(fā)酵使用與例如美國(guó)專利申請(qǐng)No.2011/0300593中所述的那些方法類似的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將含有1?3L溶液A(3?083gNH4Ac;0?61gMgCl2*6H20;0?294gCaCl2*2H20;0.15gKC1;0.12gNaCl(任選的）；用蒸餾水補(bǔ)加至1L)的2-升生物反應(yīng)器用N2氣體噴射。添加85%出?〇4溶液（2.0251^，3〇11^)并使用濃水性順4〇11調(diào)節(jié)口11至5.3。然后添加13?5mL溶液B(20?Omg生物素；20?Omg葉酸；10?Omg吡哆醇HC1;50?Omg硫胺*HC1;50?Omg核黃素；50.Omg煙酸；50.OmgD_(*)_泛酸媽；50.Omg維生素B12;50.Omg對(duì)氨基苯甲酸；50.Omg硫辛酸；用蒸餾水補(bǔ)加至1L)并將溶液用犯氣體噴射。添加氯化鉻（II)直至所述溶液的氧化-還原電位(0RP)降低至大約-200mV，其中添加刃天青（1.35mL2g/L溶液）。添加多硫化鈉(5.4mL3M溶液，參見下文）并將溶液用N2噴射，然后用含有⑶的氣體（1%H2;13%N2;71%CO;15%C02)噴射。添加金屬硫化物溶液（150mL，參見下文)并將溶液再噴射30分鐘，之后以大約5%(v/v)的水平用活性生長(zhǎng)的產(chǎn)乙醇梭菌培養(yǎng)物接種。[0200]多硫化鈉溶液在充入Na2S(93.7g，0.39mol)和200mlH20的500ml燒瓶中制備。攪拌所述溶液直至鹽溶解且在恒定犯流下添加硫(25g，0.1mol)。在室溫下攪拌2小時(shí)后，將現(xiàn)在為透明紅褐色液體的多硫化鈉溶液(就Na而言為約4M且就硫而言為約5M)轉(zhuǎn)移至N2吹掃的血清瓶?jī)?nèi)，并且包裹在鋁箱內(nèi)。[0201]在配有氣密入口和出口的1L三頸燒瓶中制備鉻（II)溶液以允許在惰性氣體下允許且隨后轉(zhuǎn)移所需產(chǎn)物至合適的貯存燒瓶?jī)?nèi)。向所述燒瓶充入CrCl3*6H20(40g，0.15mol)、鋅顆粒[20目](18.38,0.28!11〇1)、汞（13.558，11^，0.0676111〇1)和5001^蒸餾水。在用吣沖洗1小時(shí)后，將混合物升溫至約80°C以起始反應(yīng)。在恒定他流下攪拌兩小時(shí)后，將混合物冷卻至室溫并再持續(xù)攪拌48小時(shí)，到這個(gè)時(shí)候反應(yīng)混合物變成深藍(lán)色溶液。將所述溶液轉(zhuǎn)移至N2吹掃的血清瓶?jī)?nèi)并在4°C下貯藏以用于未來使用。[0202]金屬硫化物溶液通過添加約950mL溶液A至1L發(fā)酵罐內(nèi)并用N2氣噴射制備。添加85%H3P〇4溶液（1?5mL，30mM)并將pH使用濃水性NH40H調(diào)節(jié)至5?3。添加溶液B(10mL)并將溶液用N2噴射。添加氯化鉻（II)直至所述溶液的氧化-還原電位(0RP)降低至大約-200mV，其中添加刃天青（lmL2g/L溶液）。添加溶液C(l/10;10mlFeCl3;5mlCoCl2;5mlNiCl2;lmlH3B03;lmlNa2Mo〇4;lmlMnCl2;lmlNa2TO4;lmlZnCl2;lmlNa2Se〇3;至1L培養(yǎng)基內(nèi)），然后添加多硫化鈉(2mL3M溶液），然后將所述溶液用N2氣體噴射。[0203]在分批條件下在多硫化物的存在下由產(chǎn)乙醇梭菌發(fā)酵包含C0的底物導(dǎo)致經(jīng)2-3天時(shí)間基本上增加的累積速率和大約4g/L的最終生物質(zhì)累積。例如，在大約1天的短遲滯期后，所述生物質(zhì)可經(jīng)大約36小時(shí)發(fā)酵從約0.5g/L增加至至少3.5g/L。此外，在多硫化物的存在下(如通常在分批發(fā)酵中存在的)在生長(zhǎng)期期間不產(chǎn)生乙酸鹽，并且在某些情況下消耗一些乙酸鹽，使得發(fā)酵罐內(nèi)乙酸鹽量有凈減少。培養(yǎng)生物質(zhì)通過離心收集、在培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞一次，并且將細(xì)胞沉淀在_80°C下冷凍或立即用于細(xì)胞組分的分級(jí)分離。[0204]還可施加半連續(xù)發(fā)酵方法以維持生物質(zhì)產(chǎn)率且減少與發(fā)酵關(guān)閉和開始相關(guān)的時(shí)間（即運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)間或前置時(shí)間）。[0205]隨著培養(yǎng)物濃度接近穩(wěn)定期（但在進(jìn)入穩(wěn)定期之前），細(xì)菌生物質(zhì)的收集以大約12-24小時(shí)的間隔進(jìn)行。大約一半的生物反應(yīng)器體積通過經(jīng)由離心栗轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器去除。然后將等體積的新鮮或回收培養(yǎng)基返回至生物反應(yīng)器，使得反應(yīng)器的光密度為其初始值的大約一半。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，使得多個(gè)周期的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收可在單個(gè)發(fā)酵運(yùn)行期間進(jìn)行。[0206]b.楊氏梭菌發(fā)酵[0207]楊氏梭菌的發(fā)酵使用與例如美國(guó)專利N〇,5，173,429和5,593,886中所述的那些方法類似的方法進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，分批發(fā)酵使用楊氏梭菌的生物純培養(yǎng)物進(jìn)行。制備培養(yǎng)基((l)80.0mL鹽，其包含KH2P〇43.00g/L、K2HP〇43.00g/L、（NH4)2S〇46.00g/L、NaCl6.00g/L、MgS〇4*2H201?25g/L;(2)1?Og酵母提取物；（3)1?Og胰蛋白酶；（4)3?0mlPFN(Pfenning)微量金屬溶液，其包含F(xiàn)eCl2*4H201500mg、ZnS〇4*7H20100mg、MnCl2*4H2030mg、H3B03300mg、C〇C12*6H2〇200mg、CuCl2*H2010mg、NiCl2*6H2020mg、NaMo〇4*2H2030mg、Na2Se〇3lOmg和達(dá)1L的蒸餾水；（5)10.0mlB維生素，包含吡哆醛HC110mg、核黃素50mg、硫胺HC150mg、煙酸50mg、Ca-D_泛酸鹽50mg、硫辛酸60mg、對(duì)氨基苯甲酸50mg、葉酸20mg、生物素20mg、氰鈷胺501^和達(dá)比的蒸餾水；（6)0.58半胱氨酸11(：1;(7)0.068〇3(：12*21120;(8)2.(^他1^03;(9)1.OmL刃天青(0.01%);和（10)920.OmL蒸餾水）在80%氮和20%C02的氣氛內(nèi)缺氧進(jìn)行。所述培養(yǎng)基的pH在發(fā)酵期間控制，并且用HC1維持在5.0。如果需要，調(diào)節(jié)pH用無菌10%Na0H或1.0%乙酸溶液進(jìn)行。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至157.5mL血清瓶并用丁基橡膠塞和鋁封密封。然后將瓶在121°C下高壓滅菌20分鐘。[0208]在開始實(shí)驗(yàn)之前大約48小時(shí)，將種子培養(yǎng)物在與如上文所述的那些瓶類似的那些瓶從楊氏梭菌的儲(chǔ)用培養(yǎng)物制備。將種子培養(yǎng)物在振蕩孵育器內(nèi)在37°C下生長(zhǎng)并且以1OOrpm振蕩。添加還原溶液(2.0mlNa2S、2.5%溶液和2.0ml半胱氨酸-HC1，3.5%溶液)至培養(yǎng)物，將其置于振蕩孵育器內(nèi)大約15分鐘以允許完全氧去除和溫度馴化。不像用于分離有機(jī)物的生物純培養(yǎng)物的程序，添加甲烷抑制劑在分批發(fā)酵中不是所需的。[0209]使用楊氏梭菌的發(fā)酵在含有營(yíng)養(yǎng)素培養(yǎng)基的NewBrunswickScientificBioflowlie2.5-升發(fā)酵罐中在37°C下進(jìn)行，并且維持1.5升的恒定液面同時(shí)將流體以高達(dá)1,000轉(zhuǎn)/分鐘的可變速率用以大約500立方厘米/分鐘的速率引入的氣體攪動(dòng)。最佳氣體滯留時(shí)間在三分鐘的范圍內(nèi)。氣體進(jìn)料隨著細(xì)菌對(duì)其的攝取而變化，其繼而是細(xì)胞密度的函數(shù)。[0210]隨著培養(yǎng)物濃度接近穩(wěn)定期（但在進(jìn)入穩(wěn)定期之前），細(xì)菌生物質(zhì)的收集以大約12-24小時(shí)的間隔進(jìn)行。大約一半的生物反應(yīng)器體積通過經(jīng)由離心栗轉(zhuǎn)移至單獨(dú)的容器去除。然后將等體積的新鮮或回收培養(yǎng)基返回至生物反應(yīng)器，使得反應(yīng)器的光密度為其初始值的大約一半。根據(jù)以上方案繼續(xù)生物反應(yīng)器發(fā)酵，使得多個(gè)周期的生長(zhǎng)和生物質(zhì)回收可在單個(gè)發(fā)酵運(yùn)行期間進(jìn)行。[0211]實(shí)施例2[0212]來自&代謝微生物的脂質(zhì)的穩(wěn)定碳同位素分布[0213]經(jīng)由元素分析儀/持續(xù)流體同位素比率質(zhì)譜，使用與IsoPrime100IRMS(Isoprime，Cheadle，UK)親合的CHN0S元素分析儀（varioISOTOPEcube，Elementar，Hanau，Germany)，分析發(fā)孢甲基彎菌生物質(zhì)和液體級(jí)分的干樣品的碳和氮含量（％干重量），及碳(13C)和氮(15N)穩(wěn)定同位素比率。將在發(fā)酵罐或血清瓶中培養(yǎng)的甲烷營(yíng)養(yǎng)型生物質(zhì)的樣品離心、重新懸浮于去離子水中，并且將對(duì)應(yīng)于0.2-2mg碳(約0.5-5mg干細(xì)胞重量）的體積轉(zhuǎn)移至5x9mm錫膠囊（CostechAnalyticalTechnologies,Inc.，Valencia，CA)并且在80°C下干燥24小時(shí)。類似地，將之前萃取的液體級(jí)分懸浮于氯仿中，并且將含有〇.1-1.5mg碳的體積轉(zhuǎn)移至錫膠囊并且在80°C下蒸發(fā)24小時(shí)至干燥。含有O.lmg碳的標(biāo)準(zhǔn)物提供可靠的S13C值。[0214]同位素比率以"5〃標(biāo)記(％。)表達(dá)，其中物質(zhì)的同位素組成相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物的同位素組成(在百萬分之一偏差的基礎(chǔ)上)通過S13C(或S15N)=(Rffia/Rfi獅M)x1，000給出，其中R是重與輕同位素形式的分子比率。碳標(biāo)準(zhǔn)物是ViennaPeeDeeBelemnite(V-PDB)和氮標(biāo)準(zhǔn)物是空氣。NIST(NationalInstituteofStandardsandTechnology)提出的SRM(標(biāo)準(zhǔn)參考材料)No.1547桃葉用作校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物。所有同位素分析在穩(wěn)定同位素生物地球化學(xué)中心(CenterforStableIsotopeBiogeochemistry,UniversityofCalifornia,Berkeley)進(jìn)行。C和N同位素分析的長(zhǎng)期外部精準(zhǔn)度分別為0.10%。和0.15%〇。[0215]將發(fā)孢甲基彎菌菌株〇B3b以三個(gè)不同發(fā)酵批次生長(zhǎng)在甲烷上，并且將甲基單胞菌屬某種16a以單個(gè)發(fā)酵批次生長(zhǎng)在甲烷上。分析這些培養(yǎng)物的每一種的生物質(zhì)的穩(wěn)定碳同位素分布(513C值;參見表1)。[0216]表1.不同甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中的穩(wěn)定的碳同位素分布[0219]*DCW(干細(xì)胞重量）以g/L報(bào)告，其使用特定相關(guān)因子相關(guān)1.0至0.558g/L的0D(對(duì)于Mt0B3b)、1.0至0.355g/L的0D(對(duì)于MeBath)及1.0至0.42g/L的0D(對(duì)于Mms16a))從測(cè)量的光密度（〇D6QQ)計(jì)算。對(duì)于Mt0B3b，每次發(fā)酵所用的碳酸氫鹽的初始濃度為1.2mM或0.01%(批次號(hào)68C)和0.1%或12mM(批次號(hào)68A和68B)。[0220]tEFT=按小時(shí)計(jì)的有效發(fā)酵時(shí)間[0221]此外，對(duì)如實(shí)施例1所述的生物反應(yīng)器內(nèi)的甲烷上生長(zhǎng)的菌株發(fā)孢甲基彎菌0B3b(Mt0B3b)、莢膜甲基球菌巴斯(MeBath)和甲基單胞菌屬某種16a(Mms16a)的生物質(zhì)和相應(yīng)的液體級(jí)分(參見表2)進(jìn)行穩(wěn)定碳同位素分析。[0222]表2.細(xì)胞和脂質(zhì)內(nèi)的穩(wěn)定碳同位素分布[0224]分別在94小時(shí)（3.14gDCW/L)、26小時(shí)（2.2gDCW/L)和39小時(shí)（1.14gDCW/L)收集來自菌株Mt0B3b、McBath和Mms16a的生物質(zhì)。表4中的脂質(zhì)的S13C值代表一式兩份測(cè)定的平均值。[0225]實(shí)施例3[0226]甲烷來源和純度對(duì)脂質(zhì)中穩(wěn)定碳同位素分布的影響[0227]為了檢查含有天然氣組分的甲烷上甲烷營(yíng)養(yǎng)菌生長(zhǎng)，將含有100mL限定培養(yǎng)基MMS1.0的一系列0.5-升血清瓶用來自在供應(yīng)了甲烷和空氣1:1(v/v)混合物的相同培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)的血清瓶分批培養(yǎng)物(5%v/v)的發(fā)孢甲基彎菌0B3b或莢膜甲基球菌巴斯接種。培養(yǎng)基MMS1.0的組成如下：0.8mMMgS〇4*7H20、30mMNaN03、0.14mMCaCl2、1.2mMNaHC03、2.35mMKH2P〇4、3.4mMK2HP〇4、20.7yMNa2Mo〇4*2H2〇、6yMCuS〇4*5H20、10yMFem-Na-EDTA及l(fā)mL/升的微量金屬溶液（每L含有：500mgFeS04*7H2〇、400mgZnS〇4*7H20、20mgMnCl2*7H20、50mgCoCl2*6H20、10mgNiCl2*6H20、15mgH3B03、250mgEDTA)。在將培養(yǎng)基高壓滅菌且冷卻之后，添加磷酸鹽、碳酸氫鹽和Fem-Na-EDTA。培養(yǎng)基的最終pH是7.0±0.1。[0228]將接種瓶用橡膠套塞密封并經(jīng)由注射器通過無菌0.45wii過濾器和無菌27G針注射添加的60mL甲烷氣體。將一式兩份培養(yǎng)物各自注射60mL體積的(A)99%純度的甲烷(2.0級(jí)，PraxairthroughAllianceGas,SanCarlos,CA)、（B)70%純度甲燒，代表天然氣標(biāo)準(zhǔn)(Sigma-Aldrich;還含有9%乙烷、6%丙烷、3%甲基丙烷、3%丁烷和其它微量烴組分）、（C)以甲烷來源A和B的1:1混合物遞送的85%純度的甲烷;及(D)>93%甲烷（1.3級(jí)，SpecialtyChemicalProducts，SouthHouston，TX;內(nèi)部分析顯示組成>99%甲燒）。將培養(yǎng)物在30°C(發(fā)孢甲基彎菌菌株〇B3b)或42°C(莢膜甲基球菌巴斯)下在以250rpm旋轉(zhuǎn)振蕩下孵育，并且通過取出lmL樣品來測(cè)定OD600以大約12小時(shí)的間隔測(cè)量生長(zhǎng)。在這些時(shí)間，將瓶排空并用60mL各種甲烷來源(A、B、C或D)和60mL濃氧(至少85%純度)替代頂部空間。以約24小時(shí)的間隔，去除5mL樣品，將細(xì)胞通過離心(8,000rpm，10分鐘)去除，然后在分析前在-80°C下貯藏。[0229]進(jìn)行分析來源于發(fā)孢甲基彎菌菌株0B3b和莢膜甲基球菌巴斯的甲烷營(yíng)養(yǎng)型生物質(zhì)的碳和氮含量（％干重量)及碳(13c)和氮(15N)穩(wěn)定同位素比率。表3顯示用于來自在具有不同水平純度的甲烷上和各個(gè)批次的瓶培養(yǎng)物內(nèi)生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌巴斯的生物質(zhì)樣品的穩(wěn)定碳同位素分析的結(jié)果。[0230]表3.在具有不同純度的不同甲烷來源上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌巴斯的穩(wěn)定碳同位素分布[0232]*甲烷純度:A:99%甲烷，2?0級(jí)(min?99%);B:70%甲烷，天然氣標(biāo)準(zhǔn)（含有9%乙烷、6%丙烷、3%甲基丙烷、3%丁烷）；C:85%甲烷(A和B甲烷的1:1混合物）[0233]t時(shí)間=按小時(shí)計(jì)的瓶培養(yǎng)時(shí)間[0234]在一種來源的甲烷(A，99%)上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌巴斯的平均S13C是-41.2土1.2，而在不同來源的甲烷(8,70%)上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌巴斯的平均513(：是-44.2±1.2。當(dāng)將甲烷來源A和B混合時(shí)，觀察到中間平均值S13C為-43.8±2.4。這些數(shù)據(jù)顯示在甲烷來源A和B上生長(zhǎng)的細(xì)胞物質(zhì)的S13C由于輸入甲烷的S13C的差異顯著不同于彼此。但是，在兩種氣體的混合物上生長(zhǎng)的細(xì)胞利用12C，且因此顯示出更負(fù)的S13C值的趨勢(shì)。[0235]進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)以檢查在不同甲烷來源上和各個(gè)批次的瓶培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的兩種不同的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌，莢膜甲基球菌巴斯和發(fā)孢甲基彎菌〇B3b是否顯示出S13C分布差異(參見表4)〇[0236]表4.在不同純度的不同甲烷來源上生長(zhǎng)的不同甲烷營(yíng)養(yǎng)菌的穩(wěn)定碳同位素分布[0239]*甲烷來源和純度:A:99%甲烷(2?0級(jí)）；D:>93%甲烷(1?3級(jí)）[0240]t時(shí)間=按小時(shí)計(jì)的瓶培養(yǎng)時(shí)間[0241]在第一甲烷來源(A)上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌的平均S13C是-44.5±8.8,而在相同甲烷來源上生長(zhǎng)的發(fā)孢甲基彎菌的平均S13C是-47.8±2.0。在第二甲烷來源(B)上生長(zhǎng)的莢膜甲基球菌的平均S13C為-37.9±0.4，而發(fā)孢甲基彎菌的平均S13C是-39.8±4.5。這些數(shù)據(jù)顯示在甲烷來源上生長(zhǎng)的細(xì)胞物質(zhì)的S13C與來自在相同來源的甲烷上生長(zhǎng)的不同菌株的細(xì)胞物質(zhì)的S13C高度類似。因此，觀察到的細(xì)胞物質(zhì)的S13C看起來主要依賴于輸入氣體的組成而非研究的特定細(xì)菌菌株的性質(zhì)。[0242]實(shí)施例4[0243]莢膜甲烷球菌巴斯菌株內(nèi)的L-賴氨酸生物合成操縱子的各個(gè)或兩個(gè)基因的克隆和表達(dá)[0244]為了創(chuàng)建過產(chǎn)生氨基酸L-賴氨酸的甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌菌株，含有編碼酶二氫吡啶二羧酸合酶((1&?4)(3￡〇10^)121)或二氨基庚二酸脫羧酶（17^)(3￡〇10勵(lì)：123)和二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶(dapF)(SEQID^):125)或琥珀酰二氨基庚二酸脫琥珀酰酶((1&口￡)(SEQIDNO:127)或天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)(SEQIDNO:129)或二氫吡啶羧酸還原酶((^口8)(3￡〇10勵(lì)：131)或乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(&坪0)(3￡〇10勵(lì)：133)的氨基酸序列的基因的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌表達(dá)載體經(jīng)由接合交配引入至莢膜甲基球菌巴斯內(nèi)。所述酶對(duì)于莢膜甲基球菌是天然的。游離型表達(dá)質(zhì)粒(含有編碼復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)移起點(diǎn)、耐藥性標(biāo)記(卡那霉素)和多克隆位點(diǎn)的序列）用于克隆工程化IPTG-可誘導(dǎo)(Laclq)甲醇脫氫酶(MDH)啟動(dòng)子的這些多核苷酸序列下游的每一個(gè)。將攜帶含途徑基因的質(zhì)粒(在相同表達(dá)系統(tǒng)中的一種非相關(guān)基因）或攜帶不具有所述啟動(dòng)子構(gòu)建體的質(zhì)粒的接合-感受態(tài)大腸桿菌菌株(S_17)(供體菌株）的菌落接種在含有卡那霉素的液體LB(30yg/mL)中，并且在37°C下生長(zhǎng)過夜。將一份液體供體培養(yǎng)物接種在100份含有卡那霉素(30yg/mL)的新鮮LB內(nèi)持續(xù)3-5小時(shí)，之后它們用于與受體甲烷營(yíng)養(yǎng)菌株交配。將甲烷營(yíng)養(yǎng)型（受體)菌株用約40mL甲烷接種在液體MM-W1培養(yǎng)基內(nèi)（Pieja等，2011，MicrobialEcology62:564-573)1-2天，之后交配直至它們到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600為約0.3)。[0245]兩親交配通過制備一定體積的受體和供體菌株進(jìn)行，使得OD600比率為1:1(如OD600為1.5的lmL甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和0D6Q()為1.5的lmL供體）。然后通過以13.2krpm離心60秒收集這些細(xì)胞。去除上清液，并將細(xì)胞沉淀輕輕重新懸浮于500yLMM-W1內(nèi)。對(duì)于大腸桿菌供體菌株，將離心和重新懸浮再重復(fù)2次以確保去除抗生素。然后將等體積的重新懸浮的受體和供體菌株細(xì)胞合并并通過輕輕吸打混合。將交配組合物以13.2krpm離心60秒，并且盡可能多地去除上清液。然后將細(xì)胞沉淀輕輕混合并作為單液滴沉積在交配瓊脂(含有無菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培養(yǎng)基)上。將交配板在含有甲烷和空氣（以1:1比率）的密封室內(nèi)在37°C下孵育48小時(shí)。在48小時(shí)的孵育時(shí)期后，將來自交配板的細(xì)胞通過添加lmLMM-W1培養(yǎng)基至板上并轉(zhuǎn)移混懸的細(xì)胞至2mLEppendorf管收集。將細(xì)胞通過離心沉淀并用100yL新鮮MM-W1重新懸浮，之后涂鋪至選擇板(含有卡那霉素7.5yg/mL的完全MM-W1瓊脂培養(yǎng)基)上以選擇穩(wěn)定維持構(gòu)建體的細(xì)胞。在42°C下孵育約1周后，攜帶質(zhì)粒的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌出現(xiàn)在這些板上。然后將菌落在42°C下在振蕩孵育器中生長(zhǎng)于含有1:1甲烷與空氣比率的密封容器內(nèi)的2.5ml液體培養(yǎng)基(麗S1)中。在24小時(shí)后，添加IPTG至5mM的最終濃度以誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。在另外72小時(shí)后，使用實(shí)施例9所述的方法測(cè)定培養(yǎng)物的氨基酸產(chǎn)生。表5提供菌株的概述。[0246]表5?菌株概述[0248]結(jié)果呈現(xiàn)于圖1中，其是為菌株函數(shù)的胞外L-賴氨酸濃度(如異源表達(dá)指定基因的菌株的細(xì)胞上清液內(nèi)所檢測(cè))除以培養(yǎng)物的光密度(〇D6Q()nm)的圖?；蛐完P(guān)鍵34和1067是空質(zhì)粒對(duì)照和在相同的啟動(dòng)子背景下表達(dá)非相關(guān)基因（編碼綠色熒光蛋白）的對(duì)照。所述條表示一至八種樣品的平均值(一些克隆不生長(zhǎng)）。所述圖表明指定基因的過表達(dá)導(dǎo)致胞外L-賴氨酸增加超過空質(zhì)粒對(duì)照(基因型關(guān)鍵34)10至16倍且增加超過不相關(guān)基因?qū)φ?基因型關(guān)鍵1067)1.2至2.1倍。所述結(jié)果證明由于指定的L-氨基酸生物合成酶-編碼核酸表達(dá)導(dǎo)致的胞外L-賴氨酸產(chǎn)生增加，這是在外源性啟動(dòng)子的控制下。[0249]實(shí)施例5[0250]在莢膜甲烷球菌巴斯中編碼高L-賴氨酸含量的蛋白質(zhì)(貯存蛋白質(zhì)）的基因的克隆和表達(dá)[0251]為了創(chuàng)建在細(xì)胞相關(guān)的生物質(zhì)內(nèi)過產(chǎn)生氨基酸L-賴氨酸的甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌菌株，將含有編碼具有升高的L-賴氨酸含量的蛋白質(zhì)氨基酸序列的若干種基因變體之一的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌表達(dá)載體(39六家族肽酶在此指定為把8111((5￡〇10勵(lì):152))經(jīng)由接合交配引入莢膜甲基球菌巴斯。游離型表達(dá)質(zhì)粒(含有編碼復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)移起點(diǎn)、耐藥性標(biāo)記(卡那霉素)和多克隆位點(diǎn)的序列）用于克隆工程化IPTG-可誘導(dǎo)(Laclq)甲醇脫氫酶(MDH)啟動(dòng)子的HighK多核苷酸序列（SEQIDNO:151、153、155、157、159、161、163和165,各自是莢膜甲基球菌巴斯的不同經(jīng)密碼子優(yōu)化序列）下游。將攜帶含實(shí)驗(yàn)基因的質(zhì)?；驔]有所述啟動(dòng)子-基因構(gòu)建體的"陰性對(duì)照"質(zhì)粒的接合-感受態(tài)大腸桿菌菌株(S-17)(供體菌株)的菌落接種在含有卡那霉素(30yg/mL)的液體LB中并且在37°C下生長(zhǎng)過夜。將一份液體供體培養(yǎng)物接種在100份含有卡那霉素（30iig/mL)的新鮮LB內(nèi)持續(xù)3-5小時(shí)，之后它們用于與受體甲烷營(yíng)養(yǎng)菌株交配。將甲烷營(yíng)養(yǎng)型（受體）菌株用約40mL甲烷接種在液體麗-W1培養(yǎng)基內(nèi)（Pieja等，2011，MicrobialEcology62:564-573)1-2天，之后交配直至它們到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（0D6qq為約0.3)〇[0252]兩親交配通過制備一定體積的受體和供體菌株進(jìn)行，使得OD600比率為1:1(如OD600為0.3的5mL甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和0D6Q()為0.3的5mL供體）。然后通過以13.2krpm離心60秒收集這些細(xì)胞。去除上清液，并將細(xì)胞沉淀輕輕重新懸浮于500yLMM-W1內(nèi)。對(duì)于大腸桿菌供體菌株，將離心和重新懸浮再重復(fù)2次以確保去除抗生素。然后將等體積的重新懸浮的受體和供體菌株細(xì)胞合并并通過輕輕吸打混合。將交配組合物以13.2krpm離心60秒，并且盡可能多地去除上清液。然后將細(xì)胞沉淀輕輕混合并作為單液滴沉積在交配瓊脂(含有無菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培養(yǎng)基)上。將交配板在含有甲烷和空氣（以1:1比率）的密封室內(nèi)在37°C下孵育48小時(shí)。在48小時(shí)的孵育時(shí)期后，將來自交配板的細(xì)胞通過添加lmLMM-W1培養(yǎng)基至板上并轉(zhuǎn)移混懸的細(xì)胞至2mLEppendorf管收集。將細(xì)胞通過離心沉淀并用100yL新鮮MM-W1重新懸浮，之后涂鋪至選擇板(含有卡那霉素7.5yg/mL的完全MM-W1瓊脂培養(yǎng)基)上以選擇穩(wěn)定維持構(gòu)建體的細(xì)胞。在42°C下孵育約1周后，攜帶質(zhì)粒的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌出現(xiàn)在這些板上。然后將菌落在42°C下在振蕩孵育器中生長(zhǎng)于含有1:1甲烷與空氣比率的密封容器內(nèi)的2.5ml液體培養(yǎng)基(麗S1)中。在24小時(shí)后，添加IPTG至5mM的最終濃度以誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。在指定的時(shí)間段(另外48或72小時(shí)，取決于培養(yǎng)條件)后，使用實(shí)施例9所述的方法測(cè)定培養(yǎng)物的氨基酸產(chǎn)生。表6提供菌株的概述。[0253]表6.菌株的概述[0255]在異源性表達(dá)指定基因的菌株的細(xì)胞生物質(zhì)樣品中檢測(cè)到的細(xì)胞相關(guān)的L_賴氣酸的濃度描述于圖2中。基因型關(guān)鍵34是空質(zhì)粒對(duì)照。所述條表示每個(gè)實(shí)驗(yàn)基因型中的八個(gè)克隆的平均值。所有基因編碼相同的S9A家族肽酶(HighK)蛋白質(zhì)，但每一種具有對(duì)應(yīng)于改變的密碼子使用的不同序列。所述圖表明指定基因的表達(dá)產(chǎn)生各種細(xì)胞-相關(guān)的L-賴氨酸內(nèi)含物?；蛐完P(guān)鍵1122顯示該值相對(duì)于對(duì)照（34)沒有增加，而基因型關(guān)鍵1115顯示超過對(duì)照53%增加。[0256]實(shí)施例6[0257]在莢膜甲烷球菌巴斯中二氫吡啶羧酸合酶和貯存蛋白質(zhì)的克隆和共表達(dá)[0258]為了創(chuàng)建過產(chǎn)生氨基酸L-賴氨酸的甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌菌株，將含有編碼酶二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)的氨基酸序列（SEQIDN0:121)的基因和編碼具有升高的賴氨酸含量的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的若干基因變體之一的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌表達(dá)載體(S9A家族肽酶在此指定為HighK(SEQIDN0:152))經(jīng)由接合交配引入莢膜甲基球菌巴斯。游離型表達(dá)質(zhì)粒(含有編碼復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)移起點(diǎn)、耐藥性標(biāo)記（卡那霉素）和多克隆位點(diǎn)的序列）用于克隆工程化1卩丁6-可誘導(dǎo)〇^(3^)甲醇脫氫酶(1?1〇啟動(dòng)子的(1&?4(5￡010勵(lì)：121)和把8111(多核苷酸序列（SEQIDN0:151、153、155、157、159、161、163和165,各自是莢膜甲基球菌巴斯的不同經(jīng)密碼子優(yōu)化序列）下游。將攜帶含實(shí)驗(yàn)基因的質(zhì)?；驔]有所述啟動(dòng)子-基因構(gòu)建體的"陰性對(duì)照"質(zhì)粒的接合-感受態(tài)大腸桿菌菌株(S-17)(供體菌株)的菌落接種在含有卡那霉素(30yg/mL)的液體LB中并且在37°C下生長(zhǎng)過夜。將一份液體供體培養(yǎng)物接種在100份含有卡那霉素（30yg/mL)的新鮮LB內(nèi)持續(xù)3-5小時(shí)，之后它們用于與受體甲烷營(yíng)養(yǎng)菌株交配。將甲烷營(yíng)養(yǎng)型（受體）菌株用約40mL甲烷接種在液體MM-W1培養(yǎng)基內(nèi)（Pieja等，2011，MicrobialEcology62:564-573)1-2天，之后交配直至它們到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6〇〇為約0.3)。[0259]兩親交配通過制備一定體積的受體和供體菌株進(jìn)行，使得OD600比率為1:1(如OD600為0.3的5mL甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和0D6Q()為0.3的5mL供體）。然后通過以13.2krpm離心60秒收集這些細(xì)胞。去除上清液，并將細(xì)胞沉淀輕輕重新懸浮于500yLMM-W1內(nèi)。對(duì)于大腸桿菌供體菌株，將離心和重新懸浮再重復(fù)2次以確保去除抗生素。然后將等體積的重新懸浮的受體和供體菌株細(xì)胞合并并通過輕輕吸打混合。將交配組合物以13.2krpm離心60秒，并且盡可能多地去除上清液。然后將細(xì)胞沉淀輕輕混合并作為單液滴沉積在交配瓊脂(含有無菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培養(yǎng)基)上。將交配板在含有甲烷和空氣（以1:1比率）的密封室內(nèi)在37°C下孵育48小時(shí)。在48小時(shí)的孵育時(shí)期后，將來自交配板的細(xì)胞通過添加lmLMM-W1培養(yǎng)基至板上并轉(zhuǎn)移混懸的細(xì)胞至2mLEppendorf管收集。將細(xì)胞通過離心沉淀并用100yL新鮮MM-W1重新懸浮，之后涂鋪至選擇板(含有卡那霉素7.5yg/mL的完全MM-W1瓊脂培養(yǎng)基)上以選擇穩(wěn)定維持構(gòu)建體的細(xì)胞。在42°C下孵育約1周后，攜帶質(zhì)粒的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌出現(xiàn)在這些板上。然后將菌落在42°C下在振蕩孵育器中生長(zhǎng)于含有1:1甲烷與空氣比率的密封容器內(nèi)的2.5ml液體培養(yǎng)基(麗S1)中。在24小時(shí)后，添加IPTG至5mM的最終濃度以誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。在指定的時(shí)間段(另外48或72小時(shí)，取決于培養(yǎng)條件)后，測(cè)定培養(yǎng)物的氨基酸產(chǎn)生。表7提供菌株的概述。[0260]表7?菌株概述[0262]^結(jié)果描述于下表8及如下文所述的圖3和4中。[0263]表8.由異源表達(dá)基因dapA和HighK蛋白質(zhì)編碼基因的莢膜甲基球菌巴斯進(jìn)行的胞外L-賴氨酸產(chǎn)生[0265]*%RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差）[0266]在異源表達(dá)指定基因的菌株的培養(yǎng)物中測(cè)定的細(xì)胞相關(guān)的L-賴氨酸的濃度描繪于圖3中。在圖中，基因型關(guān)鍵1067是在相同的啟動(dòng)子背景下表達(dá)不相關(guān)基因（熒光報(bào)告基因）的對(duì)照。所述條表示每個(gè)實(shí)驗(yàn)基因型的八個(gè)克隆的平均值。實(shí)驗(yàn)菌株（1186-1193)含有dapA以及編碼富L-賴氨酸蛋白質(zhì)（指定為HighK)的基因。所有HighK基因編碼相同的氨基酸序列，但具有不同的密碼子使用。預(yù)期各種密碼子使用將調(diào)節(jié)產(chǎn)生的HighK多肽的量。所述圖說明指定基因的表達(dá)導(dǎo)致各種細(xì)胞相關(guān)的L-賴氨酸;基因型關(guān)鍵1186顯示了該值相對(duì)于對(duì)照（1067)增加18%，而基因型關(guān)鍵1188顯示了超過對(duì)照（1067)的36%增加。[0267]在異源表達(dá)指定基因的菌株的培養(yǎng)物上清液樣品中檢測(cè)到的胞外L-賴氨酸的濃度描繪于圖4中。如在圖3中，基因型關(guān)鍵1067是在相同的啟動(dòng)子背景下表達(dá)不相關(guān)基因（熒光報(bào)告基因）的對(duì)照。所述條表示每個(gè)實(shí)驗(yàn)基因型的八個(gè)克隆的平均值。所述圖說明基于每組克隆的平均值，指定基因的表達(dá)導(dǎo)致胞外L-賴氨酸超過對(duì)照(基因型關(guān)鍵1067)增加8至23倍。[0268]圖3和4中表示的結(jié)果表明胞外L-賴氨酸和細(xì)胞相關(guān)的L-賴氨酸產(chǎn)生增加由于指定的外源核酸序列表達(dá)導(dǎo)致。[0269]實(shí)施例7[0270]在用于產(chǎn)生L-賴氨酸的莢膜甲烷球菌巴斯中氨基酸生物合成操縱子的基因的克隆和共表達(dá)[0271]為了創(chuàng)建過產(chǎn)生氨基酸L-賴氨酸的甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌菌株，將含有編碼來自莢膜甲基球菌巴斯和/或大腸桿菌氨基酸生物合成途徑的酶的氨基酸序列的不同基因組合（"操縱子"）的各種甲烷營(yíng)養(yǎng)菌表達(dá)載體構(gòu)建并經(jīng)由接合交配引入莢膜甲基球菌巴斯。這些操縱子含有以下基因：[0272]操縱子A:天冬氨酸激酶I(thrA;SEQID勵(lì)：135);二氫吡啶二羧酸合酶((1&?4;5￡〇ID121);二氨基庚二酸脫羧酶（lysA;SEQIDN0:123)[0273]操縱子B:天冬氨酸激酶II(metL;SEQID如：137);二氫吡啶二羧酸合酶（(1&口八；3￡〇10從)：121);二氨基庚二酸脫羧酶（1784;3￡〇10從)：123)[0274]操縱子(：:天冬氨酸激酶111(178(：;3￡010勵(lì)：139);高絲氨酸脫氫酶(11〇111;3￡010勵(lì)：141);二氫吡啶二羧酸合酶((1&?4;3￡〇10勵(lì)：121);二氨基庚二酸脫羧酶（17^;3￡〇10N0:123)[0275]操縱子D:高絲氨酸0-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(metA;SEQID勵(lì)：143);0-琥珀酰-1^高絲氨酸硫化氫解酶(11^^2;3￡〇10勵(lì)：145);高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(11^^￡;3￡〇10勵(lì)：147);甲硫氨酸合酶(metH;SEQIDN0:149)[0276]操縱子F:天冬氨酸激酶II(metL;SEQID腸：137);高絲氨酸0-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(11^^4;(3￡〇10從)：143);高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(1116丨￡;3￡〇10從)：147)[0277]操縱子6:天冬氨酸激酶111(178(：;3￡010勵(lì)：139);高絲氨酸脫氫酶(11〇111;3￡010如：141);高絲氨酸〇-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(111的4;3￡〇10^):143);高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(111的￡;SEQIDNO:147)[0278]游離型表達(dá)質(zhì)粒(含有編碼復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)移起點(diǎn)、耐藥性標(biāo)記(卡那霉素)和多克隆位點(diǎn)的序列）用于克隆工程化IPTG-可誘導(dǎo)(Laclq)甲醇脫氫酶(MDH)啟動(dòng)子的操縱子(上文指定)下游的多核苷酸序列。將攜帶含操縱子的質(zhì)?；驍y帶不具有所述啟動(dòng)子-操縱子構(gòu)建體的質(zhì)粒的接合-感受態(tài)大腸桿菌菌株(S_17)(供體菌株)的菌落接種在含有卡那霉素的液體LB(30yg/mL)中，并且在37°C下生長(zhǎng)過夜。將一份液體供體培養(yǎng)物接種在100份含有卡那霉素（30yg/mL)的新鮮LB內(nèi)持續(xù)3-5小時(shí)，之后它們用于與受體甲烷營(yíng)養(yǎng)菌株交配。將甲烷營(yíng)養(yǎng)型（受體）菌株用約40mL甲烷接種在液體MM-W1培養(yǎng)基內(nèi)（Pieja等，2011，MicrobialEcology62:564-573)1-2天，之后交配直至它們到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD6〇〇為約0.3)。[0279]兩親交配通過制備一定體積的受體和供體菌株進(jìn)行，使得OD600比率為1:1(如OD600為0.3的5mL甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和0D6Q()為0.3的5mL供體）。然后通過以13.2krpm離心60秒收集這些細(xì)胞。去除上清液，并將細(xì)胞沉淀輕輕重新懸浮于500yLMM-W1內(nèi)。對(duì)于大腸桿菌供體菌株，將離心和重新懸浮再重復(fù)2次以確保去除抗生素。然后將等體積的重新懸浮的受體和供體菌株細(xì)胞合并并通過輕輕吸打混合。將交配組合物以13.2krpm離心60秒，并且盡可能多地去除上清液。然后將細(xì)胞沉淀輕輕混合并作為單液滴沉積在交配瓊脂(含有無菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培養(yǎng)基)上。將交配板在含有甲烷和空氣（以1:1比率）的密封室內(nèi)在37°C下孵育48小時(shí)。在48小時(shí)的孵育時(shí)期后，將來自交配板的細(xì)胞通過添加lmLMM-W1培養(yǎng)基至板上并轉(zhuǎn)移混懸的細(xì)胞至2mLEppendorf管收集。將細(xì)胞通過離心沉淀并用100yL新鮮MM-W1重新懸浮，之后涂鋪至選擇板(含有卡那霉素7.5yg/mL的完全MM-W1瓊脂培養(yǎng)基)上以選擇穩(wěn)定維持構(gòu)建體的細(xì)胞。在42°C下孵育約1周后，攜帶質(zhì)粒的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌出現(xiàn)在這些板上。然后將菌落在42°C下在振蕩孵育器中生長(zhǎng)于含有1:1甲烷與空氣比率的密封容器內(nèi)的2.5ml液體培養(yǎng)基(麗S1)中。在24小時(shí)后，添加IPTG至5mM的最終濃度以誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。在指定的時(shí)間段(另外48或72小時(shí)，取決于培養(yǎng)條件)后，測(cè)定培養(yǎng)物的氨基酸產(chǎn)生。[0280]表9的結(jié)果表明胞外L-賴氨酸產(chǎn)生增加由于指定的外源核酸序列表達(dá)導(dǎo)致。[0281]表9.由異源表達(dá)參與氨基酸生物合成的基因的莢膜甲基球菌巴斯進(jìn)行的胞外L-賴氨酸產(chǎn)生[0284]對(duì)于表9中的每條序列，列出了推定含有指定序列的克隆組的最高檢測(cè)測(cè)定值。指定重組細(xì)胞具有增加的賴氨酸產(chǎn)生的下限被設(shè)定為比未改變的對(duì)照（即陰性對(duì)照菌株）的測(cè)定值高2-倍濃度的胞外賴氨酸。在測(cè)試的克隆組推定含有相同的異源基因組合的若干種情況下，觀察到胞外賴氨酸濃度相對(duì)于對(duì)照沒有增加。已證明莢膜甲基球菌巴斯的生長(zhǎng)受到甚至低濃度的胞外氨基酸的影響（Eroshin,Harwood和Pirt,1968,J.appl.Bact.,31，560-567)，表明了氨基酸生物合成改變將可能對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)不利。盡管不希望受到任何理論束縛，據(jù)信天然氨基酸生物合成活性的改變誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)細(xì)胞的高選擇性壓力以突變或另外失活引入的基因。因此，缺乏高于閾值的活性可由包括核酸序列突變或質(zhì)粒丟失的多種因素因素引起(其在鑒定為低于檢測(cè)閾值的若干個(gè)克隆中觀察到），并且不提供在那種情況下存在或不存在酶功能的決定性證據(jù)。[0285]實(shí)施例8[0286]用于產(chǎn)生L-甲硫氨酸的莢膜甲烷球菌巴斯中的氨基酸生物合成操縱子的基因的克隆和共表達(dá)[0287]為了創(chuàng)建過產(chǎn)生氨基酸L-甲硫氨酸的甲烷營(yíng)養(yǎng)型細(xì)菌菌株，將含有編碼來自莢膜甲基球菌巴斯和/或大腸桿菌氨基酸生物合成途徑的酶的氨基酸序列的四種不同基因組合("操縱子"）的各種甲烷營(yíng)養(yǎng)菌表達(dá)載體構(gòu)建并經(jīng)由接合交配引入莢膜甲基球菌巴斯。這些操縱子含有以下基因：[0288]操縱子B:天冬氨酸激酶II(metL;SEQID如：137);二氫吡啶二羧酸合酶（(1&口八；3￡〇10從)：121);二氨基庚二酸脫羧酶（1784;3￡〇10從)：123)[0289]操縱子D:高絲氨酸0-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(metA;SEQID勵(lì)：143);0-琥珀酰-1^高絲氨酸硫化氫解酶(11^^2;3￡〇10勵(lì)：145);高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(11^^￡;3￡〇10勵(lì)：147);甲硫氨酸合酶(metH;SEQIDN0:149)[0290]操縱子F:天冬氨酸激酶II(metL;SEQID腸：137);高絲氨酸0-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(11^^4;3￡〇10從)：143);高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(1116丨￡;3￡〇10從)：147)[0291]操縱子6:天冬氨酸激酶111(178(：;3￡010勵(lì)：139);高絲氨酸脫氫酶(11〇111;3￡010如：141);高絲氨酸〇-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(111的4;3￡〇10^):143);高半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(111的￡;SEQIDNO:147)[0292]游離型表達(dá)質(zhì)粒(含有編碼復(fù)制起點(diǎn)、轉(zhuǎn)移起點(diǎn)、耐藥性標(biāo)記(卡那霉素)和多克隆位點(diǎn)的序列）用于克隆工程化IPTG-可誘導(dǎo)(Laclq)甲醇脫氫酶(MDH)啟動(dòng)子的這些操縱子(參見上文)下游的多核苷酸序列。將攜帶含操縱子的質(zhì)粒或攜帶不具有所述啟動(dòng)子-操縱子構(gòu)建體的質(zhì)粒的接合-感受態(tài)大腸桿菌菌株(S_17)(供體菌株)的菌落接種在含有卡那霉素的液體LB(30yg/mL)中，并且在37°C下生長(zhǎng)過夜。將一份液體供體培養(yǎng)物接種在100份含有卡那霉素(30iig/mL)的新鮮LB內(nèi)持續(xù)3-5小時(shí)，之后它們用于與受體甲烷營(yíng)養(yǎng)菌株交配。將甲烷營(yíng)養(yǎng)型（受體）菌株用約40mL甲烷接種在液體麗-W1培養(yǎng)基內(nèi)（Pieja等，2011，MicrobialEcology62:564-573)1-2天，之后交配直至它們到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（0D6qq為約0.3)〇[0293]兩親交配通過制備一定體積的受體和供體菌株進(jìn)行，使得OD600比率為1:1(如OD600為0.3的5mL甲烷營(yíng)養(yǎng)菌和0D6Q()為0.3的5mL供體）。然后通過以13.2krpm離心60秒收集這些細(xì)胞。去除上清液，并將細(xì)胞沉淀輕輕重新懸浮于500yLMM-W1內(nèi)。對(duì)于大腸桿菌供體菌株，將離心和重新懸浮再重復(fù)2次以確保去除抗生素。然后將等體積的重新懸浮的受體和供體菌株細(xì)胞合并并通過輕輕吸打混合。將交配組合物以13.2krpm離心60秒，并且盡可能多地去除上清液。然后將細(xì)胞沉淀輕輕混合并作為單液滴沉積在交配瓊脂(含有無菌0.5%酵母提取物的完全MM-W1培養(yǎng)基)上。將交配板在含有甲烷和空氣（以1:1比率）的密封室內(nèi)在37°C下孵育48小時(shí)。在48小時(shí)的孵育時(shí)期后，將來自交配板的細(xì)胞通過添加lmLMM-W1培養(yǎng)基至板上并轉(zhuǎn)移混懸的細(xì)胞至2mLEppendorf管收集。將細(xì)胞通過離心沉淀并用100yL新鮮MM-W1重新懸浮，之后涂鋪至選擇板(含有卡那霉素7.5yg/mL的完全MM-W1瓊脂培養(yǎng)基)上以選擇穩(wěn)定維持構(gòu)建體的細(xì)胞。在42°C下孵育約1周后，攜帶質(zhì)粒的甲烷營(yíng)養(yǎng)菌出現(xiàn)在這些板上。然后將菌落在42°C下在振蕩孵育器中生長(zhǎng)于含有1:1甲烷與空氣比率的密封容器內(nèi)的2.5ml液體培養(yǎng)基(麗S1)中。在24小時(shí)后，添加IPTG至5mM的最終濃度以誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。在指定的時(shí)間段(另外48或72小時(shí)，取決于培養(yǎng)條件)后，測(cè)定培養(yǎng)物的氨基酸產(chǎn)生。[0294]表10中呈現(xiàn)的結(jié)果表明胞外L-甲硫氨酸產(chǎn)生增加由于指定的外源核酸序列表達(dá)導(dǎo)致。[0295]表10.由異源表達(dá)參與氨基酸生物合成的基因的莢膜甲基球菌巴斯進(jìn)行的胞外L-甲硫氨酸產(chǎn)生[0297]對(duì)于表10中的每條序列，列出了推定含有指定序列的克隆組的最高檢測(cè)測(cè)定值。指定重組細(xì)胞具有增加的L-甲硫氨酸產(chǎn)生的下限被設(shè)定為比未改變的對(duì)照（即陰性對(duì)照菌株)的測(cè)定值高2-倍濃度的胞外賴氨酸。在測(cè)試的克隆組推定含有相同的異源基因組合的若干種情況下，觀察到胞外賴氨酸濃度相對(duì)于對(duì)照沒有增加。已證明莢膜甲基球菌巴斯的生長(zhǎng)受到甚至低濃度的胞外氨基酸的影響(Eroshin，Harwood和Pirt，1968，J?appl?Bact?，31,560-567)，表明了氨基酸生物合成改變將可能對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)不利。盡管不希望受到任何理論束縛，據(jù)信天然氨基酸生物合成活性的改變誘導(dǎo)對(duì)表達(dá)細(xì)胞的高選擇性壓力以突變或另外失活引入的基因。因此，缺乏高于閾值的活性可由包括核酸序列突變或質(zhì)粒丟失的多種因素因素引起(其在鑒定為低于檢測(cè)閾值的若干個(gè)克隆中觀察到），并且不提供在那種情況下存在或不存在酶功能的決定性證據(jù)。[0298]實(shí)施例9_9]用于由莢膜甲烷球菌巴斯產(chǎn)生L-賴氨酸和L-甲硫氨酸的測(cè)定[0300]獲得含有具有IPTG-可誘導(dǎo)(Laclq)啟動(dòng)子-dapA構(gòu)建體的載體或不具有此類構(gòu)建體的載體(這兩者在5mMIPTG的存在下生長(zhǎng))的莢膜甲基球菌巴斯菌株的培養(yǎng)物樣品。將這些樣品以13.2krpm離心1.5分鐘，并且測(cè)定上清液和細(xì)胞沉淀的氨基酸產(chǎn)生。在用氯甲酸甲酯衍生化后，通過GC-MS分析不含細(xì)胞的上清液(參考Sue等）。為了評(píng)估生物質(zhì)內(nèi)的氨基酸組成，將細(xì)胞沉淀在6NHC1中在100°C下在持續(xù)攪動(dòng)下消化24小時(shí)，然后中和、用氯甲酸甲酯衍生化及隨后進(jìn)行GC-MS分析。定量分析使用Agilent6890/5972GC-MS系統(tǒng)進(jìn)行。GC裝配有0.25mmx30mx0.25wii維數(shù)的HP-5MS毛細(xì)管柱且以lmL/min的流速接受氦載體氣體。箱溫程序在55°C下開始3分鐘、以20°C/min的速率上升至325°C并保持2分鐘。使用Hamilton1〇此自動(dòng)進(jìn)樣器注射器注射1此樣品。樣品入口被維持在250°C、具有15:1的分流比且用塞滿玻璃絲的RestekSky精密低壓液滴入口襯作內(nèi)襯。[0301]L-賴氨酸衍生物在11.51分鐘時(shí)從柱洗脫并且使用142m/z特征離子定量?；衔镨b定通過在88m/z和26%豐度下相對(duì)于靶離子監(jiān)測(cè)定量離子驗(yàn)證。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物從于去離子水中的L-賴氨酸二鹽酸鹽制備。用于L-賴氨酸的校準(zhǔn)曲線使用1/x2加權(quán)線性回歸擬合。[0302]L-甲硫氨酸在9.954分鐘時(shí)從柱洗脫并且使用61m/z特征離子定量?；衔镨b定通過監(jiān)測(cè)115m/z(52%相對(duì)豐度)和147m/z(34%相對(duì)豐度)處的定量離子驗(yàn)證。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)物從于去離子水中的純甲硫氨酸制備。用于L-甲硫氨酸的校準(zhǔn)曲線使用l/x2加權(quán)線性回歸擬合。[0303]實(shí)施例10[0304]來源于Ci代謝微生物的生物質(zhì)和產(chǎn)物的穩(wěn)定碳同位素分布[0305]顯示產(chǎn)生升高水平的氨基酸(特別是L-賴氨酸(實(shí)施例1))的莢膜甲基球菌巴斯的工程化菌株的甲燒-來源的生物質(zhì)使用親合至ThermoDeltaIRMS的Costech元素分析儀，經(jīng)由元素分析儀/持續(xù)流體同位素比質(zhì)譜（IRMS)分析碳(13C)穩(wěn)定同位素比。將在血清瓶中培養(yǎng)的甲烷營(yíng)養(yǎng)型生物質(zhì)的樣品離心、在去離子水中洗滌一次、在去離子水中重新懸浮，并將對(duì)應(yīng)于0.2_2mg碳（約0.5_5mg干細(xì)胞重量）的體積轉(zhuǎn)移至5x9mm錫膠囊（CostechAnalyticalTechnologies，Inc.，Valencia，CA)且在80°C下干燥至少60小時(shí)。作為對(duì)照，將野生型莢膜甲基球菌巴斯和表達(dá)熒光蛋白-編碼核酸序列的工程化莢膜甲基球菌巴斯菌株的樣品平行培養(yǎng)、洗滌且重新懸浮于去離子水中、轉(zhuǎn)移至5x9mm錫膠囊且在80°C下干燥至少60小時(shí)。獲得可靠的樣品S13C值，從而在IRMS檢測(cè)窗內(nèi)提供~100至10,000mV的響應(yīng)。分析的生物質(zhì)樣品的IRMS響應(yīng)范圍在3195至8827mV的范圍內(nèi)。一式兩份分析每個(gè)樣品且平均碳(13C)穩(wěn)定同位素比率報(bào)告于表11中。[0306]同位素比率以"S〃標(biāo)記(％。)表達(dá)，其中物質(zhì)的同位素組成相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物的同位素組成(在百萬分之一偏差的基礎(chǔ)上)通過S13C=(R?a/R?俄M)x1，000給出，其中R是重(13C)與輕(12c)同位素形式的分子比率。碳標(biāo)準(zhǔn)物是ViennaPeeDeeBelemnite(v-PDB)。同位素分析由BetaAnalyticInc.(Miami，F(xiàn)L)在嚴(yán)格的保管鏈和質(zhì)量對(duì)照下（IS0/IEC17025:2005測(cè)試認(rèn)證；P幾A證書#59423)進(jìn)行。IRMS針對(duì)NIST-8541(石墨：-15.90+/-0.25%。）和NIST-8542(蔗糖：-10?47+/-0?13%Q)校準(zhǔn)。針對(duì)這些NIST標(biāo)志物（乙酰苯胺：-33?4+/-0.3%。)校準(zhǔn)的工作標(biāo)準(zhǔn)在測(cè)量未知數(shù)之前和之后運(yùn)行。在空白修正后，針對(duì)二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量的值是-33.22%。和-33.22%。。然后進(jìn)行歸一化，從而將結(jié)果調(diào)整0.2%。以使結(jié)果系統(tǒng)化為主要NIST參考。將+/-0.3%。(絕對(duì)）的保守誤差指定給結(jié)果以解釋不定誤差。盡管檢測(cè)器內(nèi)的再現(xiàn)性由制造商引用在〇.02%。內(nèi)，單個(gè)允許之間的偏離可變化0.3-0.5%。，且因此BetaAnalyticsInc.引用結(jié)果至最近的第10個(gè)而非第100個(gè)并指定+/-0.3%。的絕對(duì)誤差。[0307]將用于可誘導(dǎo)表達(dá)dapA或綠色熒光蛋白編碼核酸（參見表11)構(gòu)建的單獨(dú)莢膜甲基球菌巴斯菌株生長(zhǎng)在含有補(bǔ)充50ug/mL卡那霉素的110mL限定培養(yǎng)基麗S1.0的0.5L血清瓶?jī)?nèi)的甲烷上?？敲顾卦谟糜谂囵B(yǎng)野生型莢膜甲基球菌巴斯的培養(yǎng)基中省略。將來自在供應(yīng)了甲烷和空氣的大約1:1(v/v)混合物（如60mL甲烷至含有75mL空氣的頂部空間）的相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的25mL血清瓶分批培養(yǎng)物的菌株接種。所述培養(yǎng)基MMS1.0的組成如下：0.8mMMgS〇4*7H20、30mMNaN03、0.14mMCaCl2、1.2mMNaH⑶3、2.35mMKH2P〇4、3.4mMK2HP〇4、20.7yMNa2Mo〇4*2H2〇、6yMCuS〇4*5H20、10yMFem-Na-EDTA和lmL/升的微量金屬溶液（每L含有：500mgFeS04*7H20、400mgZnS〇4*7H20、20mgMnCl2*7H20、50mgC〇C12*6H2〇、lOmgNiCl2*6H20、15mgH3B03、250mgEDTA)。在將培養(yǎng)基高壓滅菌和冷卻后，添加磷酸鹽、碳酸氫鹽和Fem-Na-EDTA。培養(yǎng)基的最終pH為7.0±0.1。將血清瓶?jī)?nèi)的110mL體積培養(yǎng)物接種至初始0.1的〇D6Q()，用橡膠套塞密封且經(jīng)由注射器通過無菌0.45wii過濾器和無菌27G針注射添加的120mL甲烷氣體（99%純度；2.0級(jí)，由AllianceGas,SanCarlos,CA供應(yīng)的Praxair)。將培養(yǎng)物在42°C下在250rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩下垂直孵育，并且通過取出lmL樣品測(cè)定〇D6Q()測(cè)量生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到至少0.6的0D6Q()時(shí)，排空瓶并將頂部空間用60mL甲烷和120mL濃氧(至少85%純度)替代。將頂部空間以這種方式每8至12小時(shí)替代。當(dāng)達(dá)到1.6的0D6Q()(大約48小時(shí)生長(zhǎng))時(shí)，通過添加過濾器-滅菌的IPTG至5mM的最終濃度誘導(dǎo)所有培養(yǎng)物以開始靶基因產(chǎn)物的過表達(dá)。將培養(yǎng)物用如上指定替換的頂部空間氣體再生長(zhǎng)48小時(shí)。最終生物質(zhì)樣品通過離心(8,000rpm，10分鐘)收集并制備以用于如上所述的13C穩(wěn)定同位素分析。[0308]表11提供過表達(dá)dapA的莢膜甲基球菌巴斯的工程化菌株（允許L-賴氨酸產(chǎn)生(基因型ID1057)產(chǎn)生增加）以及表達(dá)編碼Dasher熒光蛋白（基因型ID1067)的基因的對(duì)照菌株及野生型親本菌株的穩(wěn)定碳同位素分布(S13C值）的概述。所述結(jié)果顯示S13C值是高度負(fù)的且表明在來自經(jīng)工程化用于過表達(dá)氨基酸、熒光蛋白的菌株以及莢膜甲基球菌巴斯野生型菌株的生物質(zhì)和產(chǎn)物中12C高度富集。[0309]表11.莢膜甲基球菌巴斯的工程化和對(duì)照菌株的菌株描述和其甲烷-來源的生物質(zhì)的穩(wěn)定碳同位素分布[0312]以上所述的各種實(shí)施方案可經(jīng)合并以提供另外的實(shí)施方案。本說明書提及和/或申請(qǐng)數(shù)據(jù)頁所列的所有美國(guó)專利、美國(guó)專利申請(qǐng)公開、美國(guó)專利申請(qǐng)、外國(guó)專利、外國(guó)專利申請(qǐng)和非-專利公開，包括但不限于2014年1月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/928,401通過引用以其整體并入本文。[0313]通常，在以下權(quán)利要求中，所用的術(shù)語不應(yīng)理解為將權(quán)利要求限制為說明書和權(quán)利要求所公開的特定實(shí)施方案，但應(yīng)被理解為包括所有可能的實(shí)施方案連同授予此類權(quán)利要求的全范圍等效形式。因此，所述權(quán)利要求不由本公開限制?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種重組&代謝微生物，其包含第一外源核酸，所述第一外源核酸選自由編碼L-氨基酸生物合成酶的外源核酸和編碼可操作地連接至編碼天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列的外源核酸組成的組，其中所述重組(^代謝微生物能夠?qū)⑻烊粴鈦碓吹奶荚限D(zhuǎn)化為所需的L-氨基酸，并且其中所述重組&代謝微生物的δ13(：低于_30%〇。2.如權(quán)利要求1所述的重組&代謝微生物，其中所述第一外源核酸編碼L-氨基酸生物合成酶。3.如權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述微生物還包含編碼貯存多肽的第二外源核酸。4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述天然氣來源的原料是天然氣。5.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述天然氣來源的原料是甲烷。6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中重組甲烷營(yíng)養(yǎng)型微生物包含比由天然&代謝微生物產(chǎn)生的水平大至少約10%的水平產(chǎn)生所需的L-氨基酸的能力。7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述&代謝微生物是甲烷營(yíng)養(yǎng)菌。8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述第一外源核酸編碼選自由賴氨酸生物合成酶、色氨酸生物合成酶、甲硫氨酸生物合成酶、半胱氨酸生物合成酶及蘇氨酸生物合成酶組成的組的L-氨基酸生物合成酶。9.如權(quán)利要求8所述的重組&代謝微生物，其中所需的L-氨基酸是賴氨酸，且其中所述第一外源核酸編碼選自由以下組成的組的賴氨酸生物合成酶:賴氨酸-敏感性天冬氨酸激酶Ill(lysC)、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶(asd)、二氫啦啶二羧酸合酶(dapA)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、2，3，4，5-四氫吡啶-2，6-甲酸N-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(dapD)、乙酰鳥氨酸/琥珀酰二氨基庚二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(argD)、琥珀酰-二氨基庚二酸脫琥珀酰酶(dapE)、琥珀酰二氨基庚二酸轉(zhuǎn)氨酶、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶（dapF)及二氨基庚二酸脫羧酶(lysA)〇10.如權(quán)利要求9所述的重組Q代謝微生物，其中所述第一外源核酸編碼二氫吡啶二羧酸合酶(dapA)。11.如權(quán)利要求8所述的重組&代謝微生物，其中所需的L-氨基酸是L-甲硫氨酸，且其中所述第一外源核酸編碼選自由以下組成的組的甲硫氨酸生物合成酶:高絲氨酸〇-琥珀酰轉(zhuǎn)移酶(metA)、胱硫醚γ-合酶(metB)、蛋白質(zhì)MalY、胱硫醚β-裂解酶(metC)、Β12-依賴性甲硫氨酸合酶(metH)及5-甲基四氫蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶(metE)。12.如權(quán)利要求8所述的重組&代謝微生物，其中所述L-氨基酸是L-半胱氨酸，且其中所述第一外源核酸編碼選自由以下組成的組的半胱氨酸生物合成酶：絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(CysE)、半胱氨酸合酶Α及半胱氨酸合酶Β。13.如權(quán)利要求8所述的重組&代謝微生物，其中所需的L-氨基酸是L-蘇氨酸，并且其中所述第一外源核酸編碼選自由以下組成的組的蘇氨酸生物合成酶:天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、PLP-依賴性氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶及蘇氨酸合酶。14.如權(quán)利要求8所述的重組&代謝微生物，其中所需的L-氨基酸是L-色氨酸，且其中所述第一外源核酸編碼選自由以下組成的組的色氨酸生物合成酶：分支酸-丙酮酸裂解酶(ubiC)、鄰氨基苯甲酸合酶組分I(trpE)、鄰氨基苯甲酸合酶組分II(trpG)、鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（trpD)、磷酸核糖鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶（trpC)、色氨酸生物合成蛋白質(zhì)(trpC)、N-(5'_磷酸核糖基)鄰氨基苯甲酸異構(gòu)酶(trpF)、吲哚-3-甘油磷酸合酶、色氨酸合酶α鏈(trpA)及色氨酸合酶β鏈(trpB)。15.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述第一外源核酸編碼具有與選自由以下組成的組的參考序列至少90%同一性的氨基酸序列的L-氨基酸生物合成酶：SEQIDN0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148和150。16.如權(quán)利要求1和3-7中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述第一外源核酸編碼可操作地連接至編碼天然L-氨基酸生物合成酶的核酸的表達(dá)控制序列。17.如權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述第一外源核酸的序列為了從所述重組&代謝微生物最佳表達(dá)經(jīng)密碼子優(yōu)化。18.如權(quán)利要求3-16中任一項(xiàng)所述的重組&代謝微生物，其中所述第二外源核酸的序列為了從所述重組&代謝微生物最佳表達(dá)經(jīng)密碼子優(yōu)化。19.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述第一外源核酸編碼L-氨基酸生物合成酶，并且其中所述第一外源核酸包含具有與選自由以下組成的組的參考序列至少85%同一性的核酸序列：SEQIDΝΟ:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147和149。20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物，其中所述微生物展現(xiàn)低于-35%。的δ13(：。21.-種生物質(zhì)，其來源于如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的重組Q代謝微生物的培養(yǎng)物。22.如權(quán)利要求21所述的生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)的δ13(：低于-30%。。23.如權(quán)利要求21所述的生物質(zhì)，其中所述生物質(zhì)的δ13(：低于-35%。?！疚臋n編號(hào)】C12N1/21GK106029870SQ201580009087【公開日】2016年10月12日【申請(qǐng)日】2015年1月16日【發(fā)明人】R·M·薩維爾,J·A·西爾弗曼,E·G·盧寧,B·D·多斯,L·J·吉維爾,S·M·雷斯尼克,D·D·瑞基茲蓋【申請(qǐng)人】凱利斯塔公司