生產(chǎn)油脂成分的方法、高級(jí)不飽和脂肪酸的制造方法、以及衣藻種jsc4株的制作方法
【專利摘要】一種生產(chǎn)油脂成分的方法，在通過培養(yǎng)藻類生產(chǎn)油脂成分的方法中，其特征在于，用含有海鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)海生的衣藻(Chlamydomonas)屬的藻類。FERM BP-2226620140305
【專利說明】
生產(chǎn)油脂成分的方法、高級(jí)不飽和脂肪酸的制造方法、以及衣 藻種JSG4株
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及作為燃料、化學(xué)品原料等有用的油脂成分的生產(chǎn)方法，特別是涉及特 征在于用含有海鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)衣藻(Ch lamy domonas)屬的藻類的油脂成分的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 光合作用生物是利用光能固定C02的生物的總稱，特別是藻類是只要培養(yǎng)條件良 好就具有高光合作用效率的光合作用生物的一種。藻類的工業(yè)培養(yǎng)已進(jìn)行了半個(gè)世紀(jì)以 上，有其作為工業(yè)原料、燃料、飼料和精細(xì)化工的原料以及作為健康食品的需求，可認(rèn)為在 今后藻類生產(chǎn)在產(chǎn)業(yè)上也會(huì)占據(jù)重要的位置。
[0003] 在藻類的培養(yǎng)過程中，通過固定C02的工序來生產(chǎn)各種有用的碳成分，因此一直以 來廣泛地進(jìn)行了藻類的培養(yǎng)以及通過培養(yǎng)生產(chǎn)各種碳成分的研究。
[0004] 由于擔(dān)心今后會(huì)出現(xiàn)化石燃料的枯竭化，因此越來越需要進(jìn)行替代燃料的早期探 索，而且由于需求者對(duì)健康意識(shí)的提高，對(duì)于有利于維持/改善健康的功能性化學(xué)品的需求 增加，對(duì)于藻類所產(chǎn)生的有用成分的關(guān)注在日益增長。
[0005] 以往，作為使用了藻類制造碳成分的方法，例如作為燃料、化學(xué)品原料等有用的乙 醇的制造，專利文獻(xiàn)1中記載有:在海水的鹽分濃度下生長并在細(xì)胞內(nèi)蓄積淀粉并且通過保 持在黑暗且厭氧性環(huán)境中從而由細(xì)胞內(nèi)的淀粉生成乙醇的屬于衣藻屬的微藻類 Chlamydomonas sp.MT-JE-SH-1。作為解決上述課題的方法，專利文獻(xiàn)1中記載了 ：（1)通過 在海水的鹽分濃度下使其生長并在細(xì)胞內(nèi)蓄積淀粉，保持在黑暗且厭氧性環(huán)境中，從而由 細(xì)胞內(nèi)的淀粉生成乙醇的屬于衣藻屬的微藻類Chlamydomonas sp. MT-JE-SH-1;以及(2)在 海水的鹽分濃度下培養(yǎng)屬于衣藻屬的微藻類Chlamydomonas sp.MT-JE-SH-1并使淀粉蓄積 在細(xì)胞內(nèi)之后，一邊將含有所培養(yǎng)的藻體的漿料的pH保持在6.0~9.0的范圍，一邊保持在 黑暗且厭氧性環(huán)境下從而生成乙醇的方法。
[0006] 另外，作為油脂成分的制造方法，專利文獻(xiàn)中2記載了 ：培養(yǎng)作為屬于網(wǎng)黏菌科網(wǎng) 黏菌屬（1^&71'；[111:11111&06&6 1^&71'；[111:11111&8611118.)的4,7，10，13，16-二十二碳五稀酸產(chǎn)生 菌L59株(FERM P-18987)的微生物，使作為構(gòu)成脂肪酸含有4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸 的油脂蓄積在菌體中，之后分離菌體，利用溶劑從分離后的菌體中抽提上述油脂后，水解該 抽提物的方法。
[0007] 非專利文獻(xiàn)1中記載了：對(duì)使用海生藻類生產(chǎn)油脂與培養(yǎng)時(shí)的鹽濃度的關(guān)系進(jìn)行 了研究，鹽濃度在初始濃度超過1.5M的情況下，抑制藻類的生長，在0.5~1.0M的情況下，以 尚含有率生成油脂。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)1:日本專利第3837589號(hào)公報(bào) [0011] 專利文獻(xiàn)2:日本專利第4081794號(hào)公報(bào)
[0012] 非專利文獻(xiàn)
[0013] 非專利文獻(xiàn)1:生物科學(xué)與工程雜志（亇一于少才文，彳才f彳工^7 ^ K， 彳才工^^二71]^夕、、），101卷，223-226頁（2006年）（了〇11^1&1(^81〇8(^61^6 &11(1 Bioengineering,Vol 101,223-226(2006))

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 發(fā)明要解決的問題
[0015]在以上的【背景技術(shù)】中，雖然藻類生產(chǎn)有用的碳成分，但大多生產(chǎn)效率低，無法充分 響應(yīng)需求者的要求，期待提供一種使用生產(chǎn)效率高的藻類生產(chǎn)有用碳成分的方法。
[0016]因此，鑒于上述【背景技術(shù)】，本發(fā)明的課題是提供使用了藻類的高效率生產(chǎn)有用碳 成分的方法。
[0017] 用于解決問題的方案
[0018] 本發(fā)明人等為了解決上述課題，對(duì)藻類的探索和該藻類的培養(yǎng)方法進(jìn)行了詳細(xì)地 研究，解決了課題。
[0019] 即，本發(fā)明中，通過提供以下所述的生產(chǎn)油脂成分的方法、以及新型微藻類，從而 解決了上述課題。
[0020] [1]-種生產(chǎn)油脂成分的方法，其為通過培養(yǎng)藻類生產(chǎn)油脂成分的方法，其特征在 于:用含有海鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)海生的衣藻(Chlamydomonas)屬的藻類。
[0021 ] [ 2 ]根據(jù)[1 ]所述的生產(chǎn)油脂成分的方法，其中，屬于衣藻(Ch 1 amydomonas)屬的藻 類為衣藻種JSW株(Chlamydomonas sp.JSC4) 〇
[0022] [3]根據(jù)[1]或[2]所述的生產(chǎn)油脂成分的方法，其中，含有海鹽的培養(yǎng)基在220nm 的波長下測定硝酸鹽含量時(shí)，含量為l〇mg/L以下。
[0023] [4]根據(jù)[1]~[3]中任意一項(xiàng)所述的生產(chǎn)油脂成分的方法，其中，培養(yǎng)基中的海鹽 的質(zhì)量％為〇. 5~5質(zhì)量％的范圍。
[0024] [5]根據(jù)[1]~[4]中任意一項(xiàng)所述的生產(chǎn)油脂成分的方法，其中，含有海鹽的培養(yǎng) 基是含有海水、濃縮海水或人工海水的培養(yǎng)基。
[0025] [6]-種高級(jí)不飽和脂肪酸的制造方法，其特征在于，對(duì)通過[1]~[5]中任意一項(xiàng) 所述的生產(chǎn)油脂成分的方法得到的油脂成分進(jìn)行水解。
[0026] [7]根據(jù)[6]所述的高級(jí)不飽和脂肪酸的制造方法，其中，高級(jí)不飽和脂肪酸為油 酸或亞麻酸。
[0027] [8]-種衣藻種JSC4株(Chlamydomonas sp.JSC4)，其具有油脂成分生產(chǎn)能力。 [0028] 發(fā)明的效果
[0029] 根據(jù)本發(fā)明，能夠提供使用了藻類的以高效率生產(chǎn)有用碳成分的方法。
【附圖說明】
[0030] 圖1是衣藻種JSC4株的營養(yǎng)細(xì)胞(在適宜的生長環(huán)境、豐富的營養(yǎng)條件下旺盛地進(jìn) 行增殖的狀態(tài)的細(xì)胞)的顯微鏡照片。
[0031] 圖2是近緣的衣藻種的18S rDNA序列的比較。
[0032]圖3是近緣的衣藻種的18S rDNA序列的比較。
[0033]圖4是近緣的衣藻種的18S rDNA序列的比較。
[0034]圖5是表示OD22Qr?與硝酸鹽濃度的關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0035]圖6是在氮充足條件下或氮缺陷條件下培養(yǎng)的衣藻種JSC4株（Chlamydomonas sp.JSC4)的脂肪酸的組成分析的結(jié)果。
[0036]圖7是用不同的海鹽濃度培養(yǎng)的衣藻種JSC4株的C02固定化能力分析結(jié)果。
[0037]圖8是用不同的海鹽濃度培養(yǎng)的衣藻種JSC4株的C02固定化能力分析結(jié)果。
[0038]圖9是用不同的海鹽濃度培養(yǎng)的衣藻種JSC4株的C02固定化能力分析結(jié)果。
[0039]圖10是用不同的海鹽濃度培養(yǎng)的衣藻種JSC4株的C02固定化能力分析結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0040] [藻類]
[0041] 本發(fā)明中使用的藻類的特征在于，其為衣藻(Chlamydomonas)屬的藻類。
[0042] 衣藻是由屬于綠藻綱衣藻目（或者團(tuán)藻目）的單細(xì)胞的鞭毛蟲組成的屬。多數(shù)衣藻 是淡水產(chǎn)的，但也有生長在海水中的。本發(fā)明的海生的衣藻(Chlamydomonas)屬的藻類是指 能夠在海中、淡咸水中或含有海鹽的培養(yǎng)基中生長的衣藻(Chlamydomonas)屬的藻類。
[0043]本發(fā)明中使用的衣藻(Ch 1 amydomonas)屬的藻類只要為海生的藻類，則沒有特別 限定。
[0044] 由于海水中存在營養(yǎng)源，所以不需要在培養(yǎng)基中另外添加營養(yǎng)源。另外，也不需要 使用純水。而且，藻類的培養(yǎng)中糖源不是必需的。本發(fā)明生產(chǎn)油脂成分的方法在成本方面也 很優(yōu)異。
[0045] 而且，由于培養(yǎng)基中的鹽濃度高，所以培養(yǎng)液沒有污染的危險(xiǎn)。本發(fā)明在能夠簡便 地培養(yǎng)衣藻(Chlamydomonas)屬的藻類，在能夠以大量培養(yǎng)、大規(guī)模地生產(chǎn)油脂成分這方面 也很優(yōu)異。
[0046] 為了解決上述課題，本發(fā)明人等對(duì)以高效率生產(chǎn)作為目的的油脂成分的藻類進(jìn)行 了探索，發(fā)現(xiàn)作為藻類優(yōu)選為衣藻屬的藻類。
[0047] 而且還發(fā)現(xiàn)：由于高效率生產(chǎn)油脂成分，因而在衣藻屬中特別優(yōu)選為衣藻種JSC4 株(Chlamydomonas sp.JSW)，從而完成了本發(fā)明。
[0048][衣藻種JSC4株]
[0049] 本發(fā)明中使用的衣藻種JSC4株(Chlamydomonas SP.JSC4)的分離精制通過下述步 驟來進(jìn)行。
[0050] 即，利用常規(guī)方法從臺(tái)灣中西部海岸采集的淡咸水樣品中僅對(duì)1個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分離、 無菌化。使用示出以下組成的HSM瓊脂培養(yǎng)基，通過在20°C、8~15WH01光子(photons)/m 2/ 秒、12小時(shí)光期、12小時(shí)暗期的光條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，每兩周進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)來建立藻 株，根據(jù)形態(tài)觀察及其他確定為衣藻屬的綠藻，并命名為JSC4株。
[0051] [表1]

[0053]衣藻種JSC4株的藻類學(xué)性質(zhì)如下所述。將衣藻種JSC4株的營養(yǎng)細(xì)胞(在適宜的生 長環(huán)境、豐富的營養(yǎng)條件下旺盛地進(jìn)行增殖的狀態(tài)的細(xì)胞)的顯微鏡照片示于圖1。
[0054](形態(tài)性質(zhì)）
[0055] (1)營養(yǎng)細(xì)胞為橢圓形，大小約為10M1。營養(yǎng)細(xì)胞中具有兩根與細(xì)胞長度約等倍的 鞭毛。營養(yǎng)細(xì)胞具有運(yùn)動(dòng)性。
[0056] (2)營養(yǎng)細(xì)胞的外圍被細(xì)胞壁包圍，內(nèi)部存在一個(gè)核、葉綠體，另外可以看到線粒 體、高爾基體、液胞、油滴等。葉綠體內(nèi)的基底部具有蛋白核(pyrenoid)。
[0057](生殖方式）
[0058] (1)在營養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)形成二~八個(gè)內(nèi)生孢子，均勻分布在細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)生孢子在該細(xì)胞 內(nèi)具有一個(gè)核、葉綠體。
[0059] (2)也進(jìn)行通過二分裂的增殖。
[0060](生理/生化性狀）
[0061 ] (1)培養(yǎng)液:能夠在海中、淡咸水中和含有海鹽的培養(yǎng)液中生長。
[0062] (2)光合作用能力:能夠進(jìn)行利用光合作用的光自養(yǎng)生長。
[0063] (3)含有色素:葉綠素a、葉綠素b、及其它的類胡蘿卜素類。
[0064] (4)同化貯藏物質(zhì)：淀粉。
[0065] (5)生長溫度區(qū)域：15 °C~35 °C (最適溫度25 °C)。
[0066] (6)生長pH 區(qū)域:pH6.0~10.0(最適pH為 7.0)。
[0067]由上述內(nèi)容可知，衣藻種JSC4株根據(jù)形態(tài)觀察及其他被確定為衣藻屬的綠藻。 [0068] 衣藻種JSC4株的18S rDNA基因的鹽基序列示于序列表的序列號(hào)1。圖2~圖4是對(duì) 近緣的衣藻種的18S rDNA序列進(jìn)行比較的圖。陰影(shaded)是衣藻種JSC4株的分子標(biāo)記序 列。衣藻種JS(34株的最近緣的物種為德巴衣藻(Chlamydomonas debaryana)，但若著眼于分 子標(biāo)記序列，則并非為相同物種。由此，由比較18S rDNA序列的觀點(diǎn)來看，將衣藻種JSC4株 判斷為新型的微藻類株。
[0069]衣藻種JSC4株在2014年3月5日被保藏于獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基盤機(jī)構(gòu)專 利生物保藏中心（千葉縣木更津市上總鐮足2-5-8)，根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，以保藏號(hào) FERM BP-22266進(jìn)行了國際保藏。
[0070] [培養(yǎng)基]
[0071] 本發(fā)明中，在培養(yǎng)屬于衣藻屬的藻類時(shí)優(yōu)選使用培養(yǎng)基。
[0072] 使用的培養(yǎng)基只要是屬于衣藻屬的藻類生長的條件則沒有限制，但含有海水、濃 縮海水或人工海水的培養(yǎng)基使油脂產(chǎn)生能力提高，因此特別優(yōu)選含有海鹽的培養(yǎng)基。
[0073]例如，作為這樣的培養(yǎng)基，特別是可以優(yōu)選使用改良Bold 3N培養(yǎng)基。
[0074]作為其他可以使用的培養(yǎng)基，可列舉出改良Basal培養(yǎng)基、改良Bristol培養(yǎng)基、 BG-11培養(yǎng)基、改良HSM(High Salt medium)培養(yǎng)基等，但從能夠以高效率生產(chǎn)油脂成分的 觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選為改良Bold 3N培養(yǎng)基。
[0075] 作為本發(fā)明中使用的培養(yǎng)的特征，可列舉出在氮含量低的條件下的培養(yǎng)。
[0076] 在氮含量低的條件下的培養(yǎng)既可以是伴隨增殖的氮消耗所導(dǎo)致的氮缺陷狀態(tài)下 的培養(yǎng)，也可以是通過將藻體移植在氮含量低的培養(yǎng)基等的培養(yǎng)。
[0077] 本發(fā)明中，培養(yǎng)基中所含的氮含量可以通過在220nm的波長下測定培養(yǎng)基中所含 的硝酸鹽的含量來評(píng)價(jià)。
[0078] 培養(yǎng)基中所含的氮含量并不限定于該方法，例如也可通過利用離子傳感器、利用 顯色試劑的吸光度測定等對(duì)硝酸鹽、銨鹽的含量進(jìn)行測定來評(píng)價(jià)。
[0079]測定法是對(duì)由1999年Collos等報(bào)告的方法進(jìn)行改良而進(jìn)行的（文獻(xiàn):應(yīng)用藻類學(xué) 亇一于少才。歹彳 K 彳 口 口'2-），11 卷，179-184頁（1999年）（Journal of Applied Phycology，Volume ll，P179_184(1999))〇
[0080] 詳細(xì)的測定法記載于下述實(shí)施例。
[0081] 以下記載了本發(fā)明中使用的改良Bold 3N培養(yǎng)基的組成。
[0082] [表 2]

[0084] [海鹽]
[0085] 本發(fā)明中發(fā)現(xiàn):培養(yǎng)基中的海鹽的濃度（占培養(yǎng)基整體的質(zhì)量％)對(duì)油脂成分的生 產(chǎn)能力產(chǎn)生很大影響。因此，通過在上述培養(yǎng)基中添加最佳濃度的海鹽，從而能夠提高油脂 成分的生產(chǎn)效率。
[0086]本發(fā)明中可以使用的海鹽可列舉出已知的傳統(tǒng)海鹽。本發(fā)明中使用的海鹽既可以 是使海水蒸發(fā)干燥而得到的海鹽，也可以使用海水、海水的濃縮液，但為了調(diào)整培養(yǎng)基中所 含的濃度，更優(yōu)選使用作為海水的固體成分的海鹽。
[0087] 另外，也可以使用人工海水。本發(fā)明中使用的人工海水是模擬海水的組成并經(jīng)人 工調(diào)節(jié)后的粉末、濃縮液，在飼養(yǎng)、培養(yǎng)需要海水的生物時(shí)，從獲得性、再現(xiàn)性、廉價(jià)性等理 由出發(fā)作為替代天然海水的物質(zhì)?？梢允褂檬惺鄣娜斯ずＫ?，但市售的人工海水將氯化鈉 作為主要成分，含有各種各樣的無機(jī)鹽類、pH調(diào)節(jié)劑等，根據(jù)用途通過用自來水、蒸餾水進(jìn) 行稀釋而成為接近海水成分的物質(zhì)。
[0088] 另外，即使不是上述的海鹽等，也可以調(diào)整并使用可以使用的鹽作為適合本發(fā)明 的目的的培養(yǎng)基。
[0089] 本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)上述海鹽濃度對(duì)油脂生產(chǎn)效率產(chǎn)生很大影響。
[0090] 在評(píng)價(jià)藻類的油脂生產(chǎn)能力(mg/L/天)時(shí)，作為優(yōu)選的海鹽濃度，可列舉出0.5~5 質(zhì)量％，其中2.0~5.0質(zhì)量％的范圍作為目的的油脂成分的含量也高，因而特別優(yōu)選。
[0091] 需要說明的是，在假定進(jìn)行藻類的大量培養(yǎng)時(shí)，使用海水具有便利性，但即使使用 氯化鈉，對(duì)于生產(chǎn)油脂也具有相同的效果，因而可優(yōu)選使用。
[0092] [培養(yǎng)方法]
[0093] 本發(fā)明中，屬于衣藻屬的藻類的培養(yǎng)方法可通過用已知的傳統(tǒng)方法來進(jìn)行。
[0094] 培養(yǎng)時(shí)可以使用本發(fā)明中的上述培養(yǎng)基。
[0095] 作為本發(fā)明使用的培養(yǎng)方法，也可以使用靜置培養(yǎng)法，但考慮到藻類的藻體生產(chǎn) 率和油脂成分的生產(chǎn)率，則優(yōu)選為通過振蕩培養(yǎng)法或深部通氣攪拌培養(yǎng)法的培養(yǎng)。振蕩培 養(yǎng)既可以是往復(fù)振蕩，也可以是旋轉(zhuǎn)振蕩。作為培養(yǎng)溫度，通?？稍?5~40°C下進(jìn)行藻體產(chǎn) 生。
[0096] 如上所述，利用本發(fā)明的培養(yǎng)方法培養(yǎng)海洋性微藻類時(shí)，不僅顯示出穩(wěn)定的增殖， 而且也可得到油脂成分的比例極其高的衣藻藻類。
[0097]另外，光條件只要是能夠進(jìn)行光合作用的條件則沒有特別限制，但優(yōu)選為連續(xù)光。
[0098] 培養(yǎng)結(jié)束后，從作為得到粗油脂的方法的培養(yǎng)液中回收藻體，可通過作為一般的 方法的離心分離法、利用濾紙和玻璃濾器的過濾法等進(jìn)行。以此方式回收的藻體可保持原 狀、或者通過冷凍干燥法、熱風(fēng)干燥法等制成干燥藻體?？蓮牡玫降脑弩w或其干燥藻體中抽 提油脂成分。
[0099] 本發(fā)明中優(yōu)選供給普通二氧化碳?xì)怏w進(jìn)行。
[0100] 作為二氧化碳?xì)怏w的供給法，可用已知的傳統(tǒng)方法進(jìn)行，例如可通過在培養(yǎng)液中 通氣來適宜地供給二氧化碳?xì)怏w。
[0101 ]本發(fā)明中生產(chǎn)的油脂成分的特征在于，其為甘油三酯。
[0102]甘油三酯是甘油的?；w，通過進(jìn)行烷基酯化從而可期待用作生物柴油燃料。
[0103] 本發(fā)明中作為甘油三酯列舉的化合物是甘油與脂肪酸的酯體，脂肪酸是碳原子數(shù) 為10~30的高級(jí)飽和或者不飽和脂肪酸。
[0104] 另外，本發(fā)明也提供作為生物柴油燃料有用的高級(jí)不飽和脂肪酸的制造方法。
[0105] 即，可通過對(duì)本發(fā)明的方法中得到的油脂成分進(jìn)行水解，來制造燃燒效率高的高 級(jí)不飽和脂肪酸。
[0106] 作為燃燒效率高的高級(jí)不飽和脂肪酸，可列舉出油酸或亞麻酸，由于燃燒效率特 別高，因而特別優(yōu)選為油酸。
[0107] 對(duì)用于生產(chǎn)上述高級(jí)不飽和脂肪酸的最佳海鹽濃度進(jìn)行研究的結(jié)果，可舉出優(yōu)選 為0.5~5質(zhì)量％，特別優(yōu)選為2.0~5質(zhì)量％的范圍。
[0108] [油脂的抽提方法]
[0109] 作為從藻體抽提油脂成分的方法，可以使用通常的油脂的抽提方法，特別是可以 使用通過由Fo 1 ch法、B1 i gh-Dy er法代表的氯仿/甲醇系等有機(jī)溶劑的一般抽提方法，但并 不限定于此。
[0110]實(shí)施例
[0111]以下舉出實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
[0112](培養(yǎng)液中的藻濃度的測定）
[0113]用預(yù)先精密秤量好的0.45M1孔徑的過濾器過濾來自光生物反應(yīng)器的液體樣品，對(duì) 其進(jìn)行冷凍干燥直至恒重并進(jìn)行精密秤量。用過濾前后的過濾器質(zhì)量之間的差除以過濾后 的液體樣品量，確定了藻濃度。
[0114](培養(yǎng)液中的氮含量的測定）
[0115]用0.22M1孔徑的過濾器過濾來自光生物反應(yīng)器的液體樣品，用蒸餾水稀釋至20 倍。使用UV/VIS分光光度計(jì)，通過在220nm(0D22Q)波長下的光密度確定了硝酸鹽含量。
[0116] 即，使用圖5所示的OD22Q和硝酸鹽含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD22Q中的值換算成硝酸鹽濃 度。
[0117](藻體中的油脂成分的分析）
[0118] 將15mg冷凍干燥后的藻體量取到裝有0.5g直徑0.5mm的玻璃珠的微量瓶中，向其 中加入lmL的0.5M濃度K0H溶液，用珠磨式均質(zhì)器進(jìn)行40分鐘破碎處理。一邊用7mL的0.5M濃 度K0H溶液進(jìn)行潤洗，一邊將處理液轉(zhuǎn)移至50mL體積的耐熱玻璃瓶進(jìn)行密封，在水浴中100 °C下處理15分鐘。冷卻至室溫后，加入8mL的0.7M濃度HC1甲醇溶液和10mL的14% (v/v)三氟 化硼甲醇溶液(Sigma-Aldrich Corporation)，再次在水浴中100°C下處理15分鐘。冷卻至 室溫后，加入4mL的飽和食鹽水和3mL的正己烷，用渦流混合器攪拌5分鐘。將攪拌后的液體 轉(zhuǎn)移至50mL體積的塑料離心管中，并以7000rpm離心分離2分鐘。取出100yL上清至微量離心 管(Eppendorf)，加入890此的正己燒和10yL的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)（十五燒酸甲酯，Sigma公司），之后 以lOOOOrpm離心分離3分鐘，用GCMS分析裝置對(duì)上清進(jìn)行分析。
[0119] 在GCMS分析裝置（GCMS-QP2010Plus，島津制作所）中安裝DB-23毛細(xì)管色譜柱 (0.25mm<}) X60m，0.15iim膜厚，Agilent Technologies Inc.)，以2.3mL/分鐘流動(dòng)氦氣。噴 射器、離子源和接口溫度分別設(shè)為230、230和250°C，色譜柱溫度在注入樣品后1分鐘保持在 50°C，之后以25°C/分鐘升溫至175°C，進(jìn)而以4°C/分鐘升溫至230°C后保持5分鐘。注入lyL 上述上清，并以分流比5:1進(jìn)行色譜柱分離，以50~500m/z的全掃描模式檢測出脂肪酸甲酯 的每個(gè)成分，以內(nèi)標(biāo)的添加量作為基準(zhǔn)進(jìn)行定量并將其作為油脂量。
[0120] (C〇2固定化能力的分析）
[0121] 使用生物質(zhì)的濃度(g/L)的隨時(shí)間經(jīng)過分布圖，計(jì)算出對(duì)應(yīng)于干燥藻體單位重量 的時(shí)間曲線的增殖率。
[0122] 生物質(zhì)產(chǎn)生速度(Pbi_ss;mg/L/天）由下式求得。
[0123] [數(shù)學(xué)式1]
[01 24] Pbiomass = A X/ A t
[0125] 式中，AX表示培養(yǎng)時(shí)間A t(d)中的生物質(zhì)的濃度(mg/L)的變化量。
[0126] 而且，C02固定化速度(PGQ2; mg/L/天）由下式求得。
[0127] [數(shù)學(xué)式2]
[0128] PCQ2(mg/L/天）=1 ? 88 X Pbi_ss
[0129] 作為藻類的生物質(zhì)的典型的分子式，使用COq.48Hi.83Nq.iiPq.oi。
[0130] C〇2固定化率（％)由下式求得。
[0131] [數(shù)學(xué)式3]
[0132] C02 固定化率（％) =
[01 33] 100 X ( Cc〇2, influent-Cc〇2, effluent) /Cc〇2, influent
[0134] 式中，0〇]24也1_*和0〇]2,冊1_*分別表示(》 2的流入濃度和流出濃度。
[0135] (實(shí)施例1)
[0136] (培養(yǎng)基的比較）
[0137] 制備將表3中示出組成的改良Basal培養(yǎng)基、改良Bristol培養(yǎng)基、BG-11培養(yǎng)基、改 良Bold 3N培養(yǎng)基、改良HSM(High Salt medium)培養(yǎng)基各1升，分別放入體積1升的光生物 反應(yīng)器中，用高壓釜進(jìn)行滅菌。在各光生物反應(yīng)器中以藻濃度成為約l〇〇mg/L的方式接種衣 藻種JS(34株(Chlamydomonas sp ? JS(34)，在室溫下連續(xù)照射24小時(shí)200iimol光子/m2/秒強(qiáng)度 的熒光燈光、以50mL/分鐘通氣含2%二氧化碳?xì)怏w空氣，用攪拌器以200rpm進(jìn)行攪拌，以上 述條件培養(yǎng)5.7天。
[0138] 表4中示出對(duì)各培養(yǎng)液的油脂成分進(jìn)行分析后的結(jié)果。藻體中的油脂含量、單位培 養(yǎng)液的油脂產(chǎn)生速度均是改良Bold 3N培養(yǎng)基的最高。
[0139] [表 3]
[0143] (實(shí)施例2)
[0144] (海鹽的添加效果）
[0145] 制備將表3中示出組成的改良Bold 3N培養(yǎng)基中海鹽（Sea Salt)添加量設(shè)為 0.5 %、2 %、3.5 %、以及5% (w/v)的培養(yǎng)基各1升，分別放入體積1升的光生物反應(yīng)器中用高 壓釜滅菌。在各光生物反應(yīng)器中以藻濃度成為約l〇〇mg/L的方式接種衣藻種JSC4株 (Chlamydomonas sp. JSC4)，在室溫下連續(xù)照射24小時(shí)200_〇1光子/m2/秒強(qiáng)度的焚光燈 光，以50mL/分鐘通氣含2%二氧化碳?xì)怏w空氣，用攪拌器以200rpm進(jìn)行攪拌，以上述的條件 培養(yǎng)10天。
[0146] 所有樣品均隨著藻體的增殖培養(yǎng)液中的硝酸鹽含量降低，在1.9或2.7天時(shí)變?yōu)?10mg/L以下。其后藻體中的油脂含量和油脂產(chǎn)生速度顯著增加。尤其是在海鹽的添加量為 2%、3.5%、以及5%時(shí)，藻體中的油脂含量達(dá)到50%以上的高含量，最大的油脂產(chǎn)生速度為 非常高的140mg/L/天以上。
[0147] [表 5]
[0149](實(shí)施例3)
[0150](在氮缺陷條件下的培養(yǎng)對(duì)生物柴油的品質(zhì)帶來的效果）
[0151] 生物柴油的品質(zhì)通過不飽和脂肪酸相對(duì)于飽和脂肪酸的比例進(jìn)行評(píng)價(jià)。生物柴油 中的飽和脂肪酸含量影響在高溫下的氧化抑制。另一方面，不飽和脂肪酸含量影響在低溫 下的流動(dòng)性。為了對(duì)生物柴油賦予低溫下和高溫下的良好特性，重要的是，生物柴油中的飽 和脂肪酸和不飽和脂肪酸是等量的。脂肪酸的特征受到培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分、外部氣溫以 及光強(qiáng)度產(chǎn)生的環(huán)境壓力的影響。這些壓力中，氮缺陷條件是影響藻類的脂肪代謝最重要 的因素。
[0152] 在氮充足條件下以及氮缺陷條件下培養(yǎng)的衣藻種JSC4株（Chlamydomonas sp.JSC4)的脂肪酸的組成示于圖6。圖6中，作為對(duì)照，與源自大豆油的脂肪酸的組成進(jìn)行比 較。衣藻種JSC4株的培養(yǎng)條件與實(shí)施例2相同。
[0153]如圖6所示，證實(shí)了在氮缺陷條件下衣藻種JSC4株中的脂肪的蓄積存在油酸(C18: 1)增加的傾向并且存在亞麻酸(C18:3)減少的傾向。根據(jù)生物柴油的特性，通過以高比例含 有油酸，從而具備更好的氧化穩(wěn)定性和在低外部氣溫下的冷濾點(diǎn)(CFPP)。而且，基于歐洲生 物燃料標(biāo)準(zhǔn)(EN14214)，亞麻酸(C18:3)的含量被限定為最大12%(m/m)。因此，證實(shí)了由衣 藻種JSC4株生成的油脂用于制造生物燃料具有合適的品質(zhì)。
[0154]而且，如圖6所示，與源自大豆油的脂肪酸的組成相比，衣藻種JSC4株顯示出高的 飽和脂肪酸含量和低的多元不飽和脂肪酸(n多2)含量。通常油脂中的飽和脂肪酸的高含量 使生物燃料具有優(yōu)異的流動(dòng)性和密度。另一方面，多元不飽和脂肪酸的低含量不僅使在低 外部氣溫下的氧化穩(wěn)定性增加，而且也可賦予合適的冷濾點(diǎn)。因此，從油脂中具有合適的脂 肪酸的特征的觀點(diǎn)出發(fā)，證實(shí)了衣藻種JSC4株是適用于制造生物燃料的株。
[0155] (實(shí)施例4)
[0156] (控制海鹽和氮源也對(duì)衣藻種JSC4株的C02固定帶來效果）
[0157] 以一定時(shí)間間隔對(duì)用不同的海鹽濃度培養(yǎng)的衣藻種JSC4株的C02固定化能力進(jìn)行 調(diào)查。結(jié)果示于圖7~圖10。如圖7~圖10所示，不同的海鹽濃度中的C0 2固定化率和C02固定 速度隨著時(shí)間經(jīng)過顯示出與整體相同的傾向。即，顯示出在培養(yǎng)2-3天后達(dá)到最高值之后逐 漸減少的鐘形的曲線。
[0158] 圖7~圖10中，在海鹽的添加量為2%的條件下獲得⑶2固定化率和⑶2固定速度的 最大值，分別為54.9 %和1319. Omg/L/天。由于具有優(yōu)異的C〇2固定能力，因而證實(shí)了衣藻種 JSC4株是對(duì)使用了工業(yè)氣體的C02固定實(shí)用的株。
[0159] 以上說明的各實(shí)施方式中的各構(gòu)成以及它們的組合等為一個(gè)例子，在不脫離本發(fā) 明的要旨的范圍內(nèi)，可以對(duì)構(gòu)成部分進(jìn)行添加、省略、置換、以及其他變更。另外，本發(fā)明不 限于各實(shí)施方式，僅限于權(quán)利要求(claim)的范圍。
[0160] 產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0161] 根據(jù)本發(fā)明，能夠使用藻類以高效率生產(chǎn)有用碳成分。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生產(chǎn)油脂成分的方法，其為通過培養(yǎng)藻類生產(chǎn)油脂成分的方法，其特征在于，用 含有海鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)海生的衣藻(Chlamydomonas)屬的藻類。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)油脂成分的方法，其中，屬于衣藻(Ch 1 amydomonas)屬的 藻類為衣藻種JSC4株(Chlamydomonas sp.JSC4) 〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)油脂成分的方法，其中，含有海鹽的培養(yǎng)基在220nm的 波長下測定硝酸鹽含量時(shí)，含量為l〇mg/L以下。4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)油脂成分的方法，其中，培養(yǎng)基中的海鹽的 質(zhì)量％為〇.5~5質(zhì)量％的范圍。5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)油脂成分的方法，其中，含有海鹽的培養(yǎng)基 是含有海水、濃縮海水或人工海水的培養(yǎng)基。6. -種高級(jí)不飽和脂肪酸的制造方法，其特征在于，對(duì)通過權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所 述的生產(chǎn)油脂成分的方法得到的油脂成分進(jìn)行水解。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的高級(jí)不飽和脂肪酸的制造方法，其中，高級(jí)不飽和脂肪酸為油 酸或亞麻酸。8. -種衣藻種JSC4株(Chlamydomonas sp. JSC4)，其具有油脂成分生產(chǎn)能力。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK106029893SQ201480057777
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年3月17日
【發(fā)明人】近藤昭彥, 蓮沼誠久, 賀詩欣, 皆川純, 西江晴男, 太郎田博之, 張嘉修
【申請人】國立大學(xué)法人神戶大學(xué), 大學(xué)共同利用機(jī)關(guān)法人自然科學(xué)研究機(jī)構(gòu), Dic株式會(huì)社