一種氰醇裂解酶、其制備方法及應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種氰醇裂解酶、其制備方法及應用。具體地，獲得一種突變的氰醇裂解酶，實驗結(jié)果表明，所述突變的氰醇裂解酶的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200％以上。
【專利說明】
一種氰醇裂解酶、其制備方法及應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及一種氰醇裂解酶及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氰醇裂解酶是一種在化工生產(chǎn)中非常有用的工業(yè)用酶，其天然活性是催化氰醇的 裂解并釋放出氫氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反應，即HCN與醛酮的加成，得到具有光學活 性的a-氰醇產(chǎn)物。
[0003] 天然的S-氰醇裂解酶存在于橡膠、木薯和高粱等少數(shù)幾種植物組織中，豐度 低，純化難度大。1995年，Wajant采用五步純化法從木薯中分離得到了木薯氰醇裂解酶 MeHNL(Plant Sci.，1995, 108, 1) ;White等人采用三步法從木薯葉中提取了 MeHNL，采用 鹽析和透析的方式得到了酶液，但是應用于化學催化的立體選擇性不高（Plant Physiol 1998,116,1219)。來源于木薯（Manihot esculenta)的氰醇裂解酶（MeHNL)是一種 S-氰 醇裂解酶，已有文獻報道將MeHNL用于催化S-型手性氰醇的化學合成，ee值〉99%，具有 重要的應用價值，例如S-間苯氧基苯甲醛氰醇是新型菊酯類農(nóng)藥的通用中間體。1993年， Wajant等人報道了編碼MeHNL的cDNA序列和蛋白序列。
[0004] 采用微生物作為宿主菌是快速大量的得到氰醇裂解酶的有效方法。Effenberger 等人1996年在大腸桿菌中報道了 MeHNL在大腸桿菌中的重組表達，但是蛋白多為包涵體， 可溶性蛋白含量較低（Angew 1996,35,437)。陳樹華等2001年將MeHNL基因克隆到質(zhì)粒 pPic9K，實現(xiàn)了在酵母菌中的表達（生物工程學報，2001，17 (1)，78)，但是酶活仍然不夠 高，難以達到實際應用的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種氰醇裂解酶、其制備方法及應用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種突變的氰醇裂解酶，所述突變的氰醇裂解酶在野 生型的氰醇裂解酶的對應于SEQ ID N0. : 1的第60位谷氨酸（E)、第128位色氨酸（W)、第 220位異亮氨酸（I)發(fā)生突變。
[0007] 在另一優(yōu)選例中，所述氰醇裂解酶為木薯氰醇裂解酶（MeHNL)。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述第60位谷氨酸（E)突變?yōu)楦拾彼幔℅);和/或
[0009] 第128位色氨酸（W)突變?yōu)楸彼幔ˋ);和/或
[0010] 第220位異亮氨酸（I)突變?yōu)榱涟彼幔↙)。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述突變的氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. : 5所示。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述突變的氰醇裂解酶的催化活性為同等條件下相應的野生型 氰醇裂解酶催化活性的150%~350%，優(yōu)選地為180%~220%。
[0013] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種多核苷酸分子，所述多核苷酸選自下組：
[0014] (a)編碼如SEQ ID N0. : 5所示多肽的多核苷酸；
[0015] (b)序列如SEQ ID N0. :2或7所示的多核苷酸；
[0016] (c)核苷酸序列與SEQ ID NO. : 2或7所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98%)， 且編碼SEQ ID N0. : 1或5所示多肽的多核苷酸；
[0017] (d)與（a)-(c)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。
[0018] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有本發(fā)明第二方面所述的核酸 分子。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述載體為PET28。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述載體還包括色氨酸啟動子Trp2 ;優(yōu)選地所述色氨酸啟動子 Trp2的核苷酸序列如SEQ ID N0. :6所示
[0021] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞含有本發(fā)明第三方面所 述的載體或染色體整合有本發(fā)明第二方面所述的核酸分子。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述宿主細胞為原核細胞、或真核細胞。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述原核細胞為大腸桿菌。
[0024] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述的突變的氰醇裂解酶的 方法，其特征在于，包括步驟：
[0025] (i)在適合的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細胞，從而表達出所述的突 變的氰醇裂解酶；和
[0026] (ii)分離所述的突變的氰醇裂解酶。
[0027] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種酶制劑，所述酶制劑包含本發(fā)明第一方面所述突 變的氰醇裂解酶。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述酶制劑還包括選自下組的一種或多種組分：檸檬酸，蘋果 酸，和丁二酸。
[0029] 本發(fā)明的第七方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的突變的氰醇裂解酶、如本發(fā)明 第六方面所述的酶制劑的用途，用于制備具有光學活性的S-氰醇產(chǎn)物。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述用途還包括催化HCN與醛酮的加成反應。
[0031] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種制備S-氰醇的方法，包括步驟：
[0032] (1)將本發(fā)明第一方面所述的突變的氰醇裂解酶與反應底物接觸，進行催化反應， 從而生成所述S-氰醇；
[0033] (2)分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（1)中，所述反應底物包括間苯氧基苯甲醛，和/或丙 酮氰醇。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（1)中，催化反應的溫度為0-20°C。
[0036] 應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0037] 圖1A顯示了實施例1中PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。
[0038] 圖1B顯示了本發(fā)明突變的氰醇裂解酶的凝膠電泳圖譜。
[0039] 圖2顯示催化活性測定曲線。
[0040] 圖3顯示了本發(fā)催化反應的HPLC檢測結(jié)果。
[0041] 圖4顯示了本發(fā)明所構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜。
【具體實施方式】
[0042] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，意外地獲得一種突變的氰醇裂解酶，實驗結(jié)果 表明，所述突變的氰醇裂解酶的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200%以上。本發(fā)明還提 供了所述突變的氰醇裂解酶的用途。
[0043] 具體地，本發(fā)明對MeHNL的序列針對大腸桿菌進行了密碼子優(yōu)化，并根據(jù)定向進 化的方法在MeHNL的DNA序列中引入隨機突變，篩選突變體文庫得到最優(yōu)序列，發(fā)現(xiàn)對其中 的60位突變?yōu)镚，128位氨基酸突變?yōu)锳，220位突變?yōu)長。并將該序列克隆到了大腸桿菌質(zhì) 粒，啟動子為色氨酸啟動子Trp2,轉(zhuǎn)化導入大腸桿菌，進行高密度發(fā)酵。采用這種方式得到 的MeHNL，比酶活高達300u/mL，高于已知的異源表達的氰醇裂解酶，且發(fā)酵周期短，不需要 誘導劑，成本低。
[0044] 在描述本發(fā)明之前，應當理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實驗條件，因為這 類方法和條件可以變動。還應當理解本文所用的術(shù)語其目的僅在于描述具體實施方案，并 且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書限制。
[0045] 除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學術(shù)語均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時，術(shù)語 "約"意指該值可以從列舉的值變動不多于1 %。例如，如本文所用，表述"約100"包括99 和101和之間的全部值（例如，99. 1、99. 2、99. 3、99. 4等）。
[0046] 雖然在本發(fā)明的實施或測試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價的任何方法 和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。
[0047] 氰醇裂解酶
[0048] 氰醇裂解酶（Hydroxynitrile lyase)主要來源于橡膠、木薯和高粱等少數(shù)幾種植 物組織。主要包括：木薯氰醇裂解酶（MeHNL)、漆樹氰醇裂解酶（HbHNL)、杏仁氰醇裂解酶 (PaHNL) 〇
[0049] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，所述氰醇裂解酶為木薯氰醇裂解酶。
[0050] 在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中，優(yōu)選地木薯氰醇裂解酶野生型序列如下：
[0053] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實施方式中，所述突變的氰醇裂解酶的序列如下：
[0054]
[0055] 氰醇裂解酶基因序列優(yōu)化
[0056] 在本發(fā)明中，提供了優(yōu)化的、特別適合在大腸桿菌細胞中表達的氰醇裂解酶蛋白 的核酸編碼序列。
[0057] 本發(fā)明人選用大腸桿菌偏好密碼子，在不改變其氨基酸序列的前提下對氰醇裂解 酶的DNA序列進行了優(yōu)化。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，僅依據(jù)密碼子頻率獲得的優(yōu)化序列并不完 全適合在大腸桿菌中表達。因此本發(fā)明人進行了二次優(yōu)化，其中包括消除不利于表達的二 級結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)），改變基因中A+T組成、改變G+C含量等。
[0058] 經(jīng)過大量測試和篩選，本發(fā)明人在眾多優(yōu)化序列中獲得了一個特別優(yōu)化的氰醇裂 解酶編碼序列。所述優(yōu)化的氰醇裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，
[0060] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，編碼本發(fā)明的突變型的氰醇裂解酶的多核苷酸 序列如下：
[0063] 載體和宿主細胞
[0064] 本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明的優(yōu)化的氰醇裂解酶基因的載體，以及含所述載 體的宿主細胞。
[0065] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述述載體具有在大腸桿菌（更佳地在大腸桿菌 BL21(DE3)菌株）中表達的能力。
[0066] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用的常規(guī)方法獲得本發(fā)明的優(yōu)化的氰醇裂解酶基 因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一種優(yōu)選的合成法為不對稱PCR法。不對稱PCR 法是用不等量的一對引物，PCR擴增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA(SSDNA)。這對引物分別稱為非 限制引物與限制性引物，其比例一般為50-100 : 1。在PCR反應的最初10-15個循環(huán)中，其 擴增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物（低濃度引物）消耗完后，非限制性引物（高濃 度引物）引導的PCR就會產(chǎn)生大量的單鏈DNA。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā) 明的序列信息適當?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純 化擴增的DNA/RNA片段。
[0067] 本發(fā)明的多核苷酸序列可以通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，表達或生產(chǎn)目的蛋白，包 括步驟：
[0068] (1)用編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸的重組表達 載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導合適的宿主細胞，較佳地大腸桿菌細胞；
[0069] (2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞；
[0070] (3)從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0071] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明蛋白的編碼DNA序列和合適 的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達載體，優(yōu)選市售的載體：PET28。這些方法包括體外重組DNA 技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟 動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。 此外，表達載體優(yōu)選包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細胞的 表型性狀。
[0072] 本發(fā)明還提供的重組載體，其包含本發(fā)明的經(jīng)過優(yōu)化的MeHNL DNA序列。在優(yōu)選 的實施方式中，所述重組載體的啟動子下游包含多克隆位點或至少一個酶切位點。需要表 達目的基因時，將目的基因連接入適合的多克隆位點或酶切位點，從而可操作地連接目的 基因與啟動子。
[0073] 在另一優(yōu)選的實施方式中，所述重組載體在5'到3'方向上包括：啟動子，目的基 因和終止子。如果需要，所述重組載體還可以包括以下元件：蛋白純化標簽；3'多聚核苷 酸化信號；非翻譯核酸序列；轉(zhuǎn)運和靶向核酸序列；選擇標記（抗生素抗性基因、熒光蛋白 等）；增強子；或操作子。
[0074] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述重組載體包括色氨酸啟動子Trp2,優(yōu)選 地，其序列如下：
[0076] 用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。表達載體可以是細菌 質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊灰淠軌?在宿主體內(nèi)復制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以被米用。
[0077] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以采用熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明啟動子和/或目的基 因序列的載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。
[0078] 本發(fā)明的表達載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎允顾拗鬓D(zhuǎn)錄目的RNA或表 達目的蛋白質(zhì)。宿主細胞可以是原核細胞，如大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、鏈霉菌 屬、農(nóng)桿菌：或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。本領(lǐng)域一般 技術(shù)人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體和宿主細胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原核生物（如大腸桿菌）時，可以用CaCV法處理， 也可用電穿孔法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法， 常規(guī)機械方法（如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等）。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基 因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。對于轉(zhuǎn)化的植物細胞、組織或器 官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。
[0079] 術(shù)語"可操作連接"是指將準備轉(zhuǎn)錄表達的目的基因以一種本領(lǐng)域的常規(guī)方式連 接到它的控制序列以被表達。
[0080] 工程菌的培養(yǎng)和目的蛋白發(fā)酵生產(chǎn)
[0081] 在獲得工程細胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細胞，表達本發(fā)明的基因序列 所編碼的蛋白。根據(jù)宿主細胞的不同，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基，在適 于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群?，用合適的方法 (如溫度轉(zhuǎn)換或化學誘導）誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。工程細胞可以是快 速利用甲醇型（Mut +)或慢速利用甲醇型（Muts)。
[0082] 在本發(fā)明中，可采用常規(guī)的發(fā)酵條件。代表性的條件包括（但并不限于）：
[0083] (a)就溫度而言，氰醇裂解酶的發(fā)酵及誘導溫度保持在25_35°C ;
[0084] (b)就誘導期的pH值而言，誘導期pH控制在3-9 ;
[0085] (c)就溶氧（D0)而言，D0控制在20-90%，溶氧的維持可以用氧氣/空氣混合氣 體的通入來解決；
[0086] (d)就補料而言，補料種類宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可單獨補料或混合補 料；
[0087] (e)就誘導期IPTG濃度而言，常規(guī)誘導濃度都可用于本發(fā)明，通常iptg濃度控制 在 0? 1-1. 5mM ;
[0088] (f)就誘導時間而言，沒有特別限制，通常為2-20小時，較佳地為5-15小時。
[0089] 本發(fā)明的目的蛋白氰醇裂解酶存在大腸桿菌細胞胞內(nèi)，通過離心機收集宿主細 胞，然后通過高壓、機器力、酶解細胞被或其他細胞破碎方法破碎宿主細胞，釋放重組蛋白， 優(yōu)選的是高壓法。宿主細胞裂解液可通過鹽析、超濾等方法進行初步純化后再進行層析純 化，也可直接進行層析純化。
[0090] 層析技術(shù)包括陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和 層析等技術(shù)。常用的層析方法包括：
[0091] 1?陰離子交換層析：
[0092] 陰離子交換層析介質(zhì)包括（但不限于）：Q_Sepharose、DEAE-Sepharose。如果發(fā) 酵樣品的鹽濃度較高，影響與離子交換介質(zhì)的結(jié)合，則在進行離子交換層析前需降低鹽濃 度。樣品可以用稀釋、超濾、透析、凝膠過濾層析等手段進行平衡緩沖液的更換，直至與對應 的離子交換柱平衡液系統(tǒng)相似，然后上樣，進行鹽濃度或pH的梯度洗脫。
[0093] 2?疏水層析：
[0094] 疏水層析介質(zhì)包括（但不限于）：Phenyl_Sepharose、Butyl-Sepharose、 Octyle-Sepharose。樣品通過添加NaCl、（NH 4)2S04等方式提高鹽濃度，然后上樣，通過降低 鹽濃度方法洗脫。通過疏水層析除去疏水性有較大差異的雜蛋白。
[0095] 3.凝膠過濾層析
[0096] 疏水層析介質(zhì)包括（但不限于）：Sephacryl、Superdex、Sephadex類。通過凝膠 過濾層析更換緩沖體系，或進一步精純。
[0097] 4?親和層析
[0098] 親和層析介質(zhì)包括（但不限于）：HiTrap? Heparin HP Columns。
[0099] 制備酶制劑組合物
[0100] 本發(fā)明還提供了一種酶制劑組合物，該酶制劑組合物中包含本發(fā)明的氰醇裂解 酶。
[0101] 本發(fā)明的酶制劑組合物還可以包含：檸檬酸、和/或乙酸。
[0102] S-氰醇的制備方法
[0103] 本發(fā)明還提供了一種S-氰醇的制備方法，所述方法包括步驟：
[0104] (1)將本發(fā)明的突變的氰醇裂解酶與反應底物接觸，進行催化反應，從而生成所述 S-氰醇；
[0105] (2)分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。
[0106] 在本發(fā)明優(yōu)選地實施方式中，所述步驟（1)中，所述反應底物為間苯氧基苯甲醛、 和丙酮氰醇（或，氰氫酸）。
[0107] 在本發(fā)明優(yōu)選地實施方式中，所述步驟（1)中，催化反應的溫度為0-20°C。
[0108] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0109] (1)本發(fā)明的突變的氰醇裂解酶，催化反應活性遠高于野生型的氰醇裂解酶，是野 生型的兩倍左右；
[0110] (2)編碼本發(fā)明的突變的氰醇裂解酶的多核苷酸序列，在大腸桿菌中表達量高，表 達穩(wěn)定，能夠顯著降低制備氰醇裂解酶的成本。
[0111] (3)采用本發(fā)明的制備突變的氰醇裂解酶，周期短，成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0112] 下面結(jié)合具體實施例，進一步詳陳本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲 得。
[0113] 實施例1突變體的構(gòu)建
[0114] 根據(jù)Wajant報道的MeHNL的蛋白序列1 (SEQ ID N0. : 1)，根據(jù)大腸桿菌的密碼子 偏好性，合成了 MeHNL DNA序列2(SEQ ID N0. :2)，克隆至質(zhì)粒pET28(購自Invitrogene公 司）的Ndel-Hindlll位點。以該質(zhì)粒為模板，設計引物，見序列3和序列4。使用隨機誘 變試劑盒，通過改變MnS0 4濃度來進行多個反應，從而將1至3個點突變引入MeHNL基因， 使MeHNL酶氨基酸序列中1-3個氨基酸被替換。為擴增編碼MeHNL酶，分別以引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4作為正向和反向引物。兩個引物都含有與使用Gateway Technology 通過定點重組克隆獲得的PCR擴增MeHNL基因片段相容的位點。PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳 圖譜如圖1所示，獲得擴增產(chǎn)物與預期相符。
[0115] 易錯PCR擴增使用下述溫度程序：94°C 2min，94°C 30s和68°C lmin的25個循 環(huán)，接著68°C lOmin。首先將易錯PCR片段克隆進pDONR載體（購自Invitrogene公司）， 制備大規(guī)模口￡犯^(購自11^1廿呢 61^公司）質(zhì)粒文庫，起始超過20,000個菌落。然后以 pDEST 14為載體，將pENTR入門質(zhì)粒文庫構(gòu)建為表達文庫。然后將表達文庫轉(zhuǎn)入化學感受態(tài) E. coil BL21Star(DE3)(購自Invitrogene公司），用于表達突變的MeHNL基因。
[0116] 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)，得到的Kana抗性的轉(zhuǎn)化子，接種至LB培養(yǎng)基在37°C 進行培養(yǎng)。0D600 = 0. 6-1. 0之間時，加入IPTG至終濃度0.1 mM，降溫至25-30°C，繼續(xù)培養(yǎng) 16小時，4000rpm離心收集菌體。
[0117] 酶活測定：參考 Selmar 報道的方法（Analytical Biochemistry 166 (1987)， 208-211)，間苯氧基苯甲醛10mM，甲醇20uL，20mM檸檬酸緩沖液（pH5. 0)，丙酮氰醇50mM，粗 酶液10uL。上述反應液于25度溫育，上述反應液于25度溫育，分別在l-5min測定250nm 的吸光度變化。每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生lumole間苯氧基苯甲醛所需要的酶量定義為1個酶活 單位。變化速率最快的即為酶活最高的突變體。
[0118] 檢測結(jié)果如圖2所示，為突變體，▲為野生型，?為對照試驗（不加酶）。突變體 酶活 / 野生型酶活=(0.2299-0. 086)八0. 1577-0. 086)*100%= 200.6%。
[0119] 從圖中可以看出突變體的活性要顯著高于野生型的活性，催化活性為野生型的 200%。測序獲得該高活性的突變型為序列5 (SEQ ID N0. : 5)。
[0120] 本實施例中所用引物序列如下：
[0121] 正向引物：5' -GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GGT GAC CGC CCA TTT C-3, SEQ ID NO. :3 ；
[0122] 反向引物：5' -GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA AGC ATA AGC ACG GCC-3' SEQ ID NO. :4。
[0123] 實施例2菌種構(gòu)建和高密度發(fā)酵
[0124] 合成含有序列6(3￡0 10勵.：6)的色氨酸啟動子，并連接到？￡了28&的此〇1和制61 位點，然后分別將實施例1中的序列1和5的編碼多核苷酸連接到前述的Ndel-Xhol位點， 得到含有串聯(lián)色氨酸啟動子的大腸桿菌質(zhì)粒pTrp2-MeHNLl和pTrp2-MeHNL5 (質(zhì)粒圖譜如 圖4所示）。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (購自Invitrogene公司），在Kana抗性平板上得 到相應的菌種，接種到LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)，用20%甘油保存菌種。
[0125] 將菌種接種于裝有200mL LB培養(yǎng)基的1L搖瓶中，于37 °C，180-220rpm培養(yǎng) 10-16h。將上述培養(yǎng)好的種子按10% (v/v)的比例接種于3L上罐發(fā)酵培養(yǎng)基（M9)中 (葡萄糖4g/L，磷酸氫二鈉12. 8g/L，磷酸二氫鉀3g/L，氯化銨lg/L，硫酸鈉0. 5g/L，氯化鈣 0? 0152g/L，六水氯化鎂 0? 41g/L。），在 25-35°C，300-800rpm，空氣流量 2-6L/min 的條件下 培養(yǎng)。培養(yǎng)6-1011后，以5-2〇1111711的速率流加含60%甘油的補料培養(yǎng)基，持續(xù)至發(fā)酵結(jié)束。 流加補料培養(yǎng)基數(shù)小時至〇D_達到80-100時，放罐，5000rpm離心收集菌體。菌體裂解后 測定酶活，分別為73U/mg粗蛋白和143U/g粗蛋白。凝膠電泳檢測與預期相符。
[0126] 實施例3MeHNL的固定化（交聯(lián)酶聚集體，CLEA)
[0127] 分別取含有序列1和序列5的大腸桿菌50g濕菌體，重懸于200mL檸檬酸緩沖 液（50mM，pH 5. 5)，超聲破菌，14000rpm離心30min收取上清液，加入硫酸銨固體至終濃 度60%，冰浴上攪拌15min，14000rpm離心收集沉淀。冰浴攪拌下，將蛋白硫酸銨沉淀加 入10%戊二醛的水溶液，離心收集沉淀，分別得到4. lg(序列1)和4. 5g(序列5)固定化 MeHNL〇
[0128] 實施例4-5固定化酶的使用（純有機相）
[0129] 在 100mL MTBE (methyl tert-butyl ether，甲基叔丁基醚）（實施例 4)，或異丙醚 (實施例5)中，加入10mL間苯氧基苯甲醛，2.5g MeHNL固定化酶（序列5)，5mL丙酮氰醇， 20°C攪拌反應，攪拌速度為400-500rpm。反應4小時取樣用HPLC檢測反應轉(zhuǎn)化率，過濾回 收固定化酶，投入下一批次。重復使用的情況見表1。
[0130]
[0131]
[0132] 注：A為突變型；WT為野生型。液相色譜檢測，轉(zhuǎn)化率計算方式為，轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)物 八產(chǎn)物+底物）*1〇〇%。
[0133] 實施例6-7固定化酶的使用（水+有機相）
[0134] 在50mL檸檬酸溶液（50mM，pH5)中，加入10mL間苯氧基苯甲醛，5g MeHNL (序列 1)固定化酶，5mL氰氫酸，分別加入50mL MTBE (實施例6)，或50mL異丙醚（實施例7)，20°C 攪拌反應，攪拌速度為400-500rpm。反應4小時后取樣用HPLC檢測轉(zhuǎn)化率，結(jié)束反應后，過 濾回收固定化酶，投入下一批次。重復使用的情況見表2。
[0135] 表 2
[0136]
[0138] 根據(jù)實施例4-7的結(jié)果，本發(fā)明優(yōu)選的反應體系為MTBE有機相；反應條件為： CLEA固定化酶為催化劑，MTBE為溶劑，底物為間苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇（或，氰氫酸）， 20°C反應3-5小時，攪拌速度為400-500rpm。反應體系中間苯氧基苯甲醛濃度為0. 1-1. 2 摩爾/升，丙酮氰醇濃度為〇. 2 - 2摩爾/升），而且丙酮氰醇的濃度是間苯氧基苯甲醛濃 度的1. 5-3倍。
[0139] 實施例9分析檢測
[0140] 采用高效液相色譜（HPLC)法監(jiān)測反應：以水和乙腈（45:55)為流動相，色譜柱為 0DS-18反相柱，島津LC-15C高效液相色譜，210nm下檢測紫外吸收；反應體系用水和乙腈 (45:55)進行稀釋，離心并用尼龍膜過濾后進樣檢測。在本發(fā)明優(yōu)選地反應體系中，HPLC檢 測反應進程（圖3):反應1小時后，檢測，17. 3min為間苯氧基苯甲醛，17. 5min為S-構(gòu)型 氰醇.
[0141] 手性純度采用Agilent 1260液相色譜進行分析，檢測條件為：Chiralpak AD-H 柱，正己燒：乙醇（0. 1% DEA) = 90:10,0. 8mL/min，檢測波長為220nm。經(jīng)過比對本發(fā)明制 得的S-構(gòu)型的產(chǎn)物與目標物質(zhì)標準品（購自江西科苑生物藥業(yè)有限公司）一致。
[0142] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種突變的氰醇裂解酶，其特征在于，所述突變的氰醇裂解酶在野生型的氰醇裂解 酶的對應于SEQ ID NO. : 1的第60位谷氨酸（E)、第128位色氨酸（W)、第220位異亮氨酸 (I)發(fā)生突變。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氰醇裂解酶為木薯氰醇裂解酶 (MeHNL)〇3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第60位谷氨酸（E)突變?yōu)楦拾彼幔℅); 和/或 第128位色氨酸（W)突變?yōu)楸彼幔ˋ);和/或 第220位異亮氨酸（I)突變?yōu)榱涟彼幔↙)。 優(yōu)選地，所述突變的氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. :5所示。4. 一種多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸選自下組： (a) 編碼如SEQ ID NO. : 5所示多肽的多核苷酸； (b) 序列如SEQ ID NO. :2或7所示的多核苷酸； (c) 核苷酸序列與SEQ ID NO. :2或7所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )，且 編碼SEQ ID NO. : 1或5所示多肽的多核苷酸； (d) 與（a)-(c)任一所述的多核苷酸互補的多核苷酸。5. -種載體，其特征在于，所述載體含有權(quán)利要求4所述的核酸分子。6. -種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權(quán)利要求5所述的載體或染色體整 合有權(quán)利要求4所述的核酸分子。7. -種制備權(quán)利要求1所述的突變的氰醇裂解酶的方法，其特征在于，包括步驟： (i) 在適合的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的宿主細胞，從而表達出所述的突變的氰醇 裂解酶；和 (ii) 分離所述的突變的氰醇裂解酶。8. -種酶制劑，其特征在于，所述酶制劑包含權(quán)利要求1所述突變的氰醇裂解酶。9. 如權(quán)利要求1所述的突變的氰醇裂解酶、如權(quán)利要求8所述的酶制劑的用途，其特征 在于，用于制備具有光學活性的S-氰醇產(chǎn)物。10. -種制備S-氰醇的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 將權(quán)利要求1所述的突變的氰醇裂解酶與反應底物接觸，進行催化反應，從而生成 所述S-氰醇； (2) 分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。
【文檔編號】C12P13/00GK106032531SQ201510481026
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年8月7日
【發(fā)明人】田振華, 羅煜, 丁時誠, 瞿旭東
【申請人】南京博優(yōu)康遠生物醫(yī)藥科技有限公司