CRISPR/Cas9核酸內(nèi)切酶體系的腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及CRISPR/Cas9核酸內(nèi)切酶體系的腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及其用途。本發(fā)明人通過縮小優(yōu)化Cas9表達(dá)元件，制備了具有組織細(xì)胞廣譜表達(dá)的Cas9蛋白的AAV表達(dá)載體，首次實(shí)現(xiàn)將整個(gè)表達(dá)元件和Cas9編碼序列包裝進(jìn)AAV病毒?；贏AV病毒包裝的特性，只需更換包裝衣殼質(zhì)粒，即可將此Cas9載體包裝成不同血清型的AAV病毒。本發(fā)明獲得的病毒可以有效地實(shí)現(xiàn)組織靶向表達(dá)及DNA編輯。
【專利說明】
CRI SPR/Cas9核酸內(nèi)切酶體系的腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及其 用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及CRISPR/Cas9核酸內(nèi)切酶體系 的腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] II型原核CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌的一種獲得性免疫系統(tǒng)，能夠降解噬菌體DNA或 外源質(zhì)粒。經(jīng)過改造的人工內(nèi)切核酸酶CRISPR/Cas9,由Cas9蛋白，含有引導(dǎo)序列的crRNA 和tracrRNA組成。通過20堿基的引導(dǎo)序列和目的DNA互補(bǔ)配對結(jié)合，Cas9在革E DNA進(jìn)行 切割產(chǎn)生雙鍵斷裂。DNA雙鏈斷裂通過高保真的同源重組或者容易引入插入/缺失突變的 非同源末端連接途徑進(jìn)行修復(fù)。通過同源重組途徑修復(fù)時(shí)，在同源模板存在情況下，將會按 照模板進(jìn)行定向修復(fù)。非同源末端連接途徑則會導(dǎo)致移碼突變，破壞讀碼框并擾亂蛋白的 表達(dá)。目前這一技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種基因型細(xì)胞及小鼠模型的制備，并可同時(shí)高效地獲 取多位點(diǎn)突變，極大地縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間。此外，在細(xì)胞水平及小鼠水平的疾病模型中，此系統(tǒng) 能夠有效地修復(fù)致病的基因突變，從根本上治療遺傳病。但是目前這一系統(tǒng)局限于受精卵 及肝臟中，其他器官的靶向遞送尚待解決。
[0003] 目前有慢病毒和腺病毒載體被用于遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)。但是，慢病毒會插入 基因組造成插入突變；而腺病毒為5型腺病毒，其嗜肝，在其他組織的表達(dá)非常少。
[0004] 綜上，本領(lǐng)域迫切需要進(jìn)一步優(yōu)化遞送CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以期能夠在其它器官 或組織中實(shí)現(xiàn)基因靶向操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供CRISPR/Cas9核酸內(nèi)切酶體系的腺相關(guān)病毒載體構(gòu)建及 其用途。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種表達(dá)Cas9的重組腺相關(guān)病毒載體，該載體包括如 下操作性連接的序列元件（按照5' 一 3'的方向）：5'末端反向重復(fù)序列（即L-ITR)，CMV 啟動子序列，核定位信號1序列，Cas9編碼核酸序列，核定位信號2序列，miniPolyA序列和 3'末端反向重復(fù)序列。
[0007] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的重組腺相關(guān)病毒載體中，所述的5'末端反向重復(fù)序列如 SEQ ID NO: 1中第1~141位所示；
[0008] 所述的CMV啟動子序列如SEQ ID NO: 1中第165~828位所示；
[0009] 所述的核定位信號1序列如SEQ ID NO: 1中第913~963位所示；
[0010] 所述的Cas9編碼核酸序列如SEQ ID NO: 1中第964~5064位所示；
[0011] 所述的核定位信號2序列如SEQ ID NO: 1中第5065~5112位所示；
[0012] 所述的miniPolyA序列如SEQ ID NO: 1中第5122~5169位所示；
[0013] 所述的3'末端反向重復(fù)序列如SEQ ID NO: 1中第5192~5332位所示。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組腺相關(guān)病毒載體中，在核定位信號1序列的5'端或 核定位信號2序列的3'端，還包括標(biāo)簽序列。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽是Flag，較佳地為3XFlag標(biāo)簽。
[0016] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的重組腺相關(guān)病毒載體的用途，用于制備病毒，所 述的病毒能夠在特定組織（如心臟）中表達(dá)Cas9蛋白。
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組腺相關(guān)病毒，所述病毒由所述的重組腺相關(guān) 病毒載體包裝獲得。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑盒，所述的試劑盒中包括：所述的重組腺相關(guān) 病毒；或所述的重組腺相關(guān)病毒載體。
[0019] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：所述的表達(dá)Cas9的重組腺相關(guān)病毒載 體。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，其中還包括能在體內(nèi)形成sgRNA (single-guided RNA)和 TracrRNA(Trans_activating crRNA)的載體或由該載體包裝成的腺相關(guān)病毒。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的在體內(nèi)形成sgRNA和TracrRNA的載體包括如下操作性 連接的序列元件（按照5' 一 3'的方向）：缺失D序列的5'末端反向重復(fù)序列，sgRNA和 TracrRNA的表達(dá)盒，和3'末端反向重復(fù)序列。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的sgRNA和TracrRNA序列的表達(dá)盒包括：U6啟動子序列， sgRNA和TracrRNA序列，U6終止子序列。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中，所述的缺失D序列的5'末端反向重復(fù)序列如 SEQ ID N0:2中第1~117位所示；
[0024] 所述的U6啟動子序列如SEQ ID N0:2中第141~389位所示；
[0025] 所述的sgRNA和TracrRNA序列如SEQ ID N0:2中第408~483位所示；
[0026] 所述的U6終止子序列如SEQ ID N0:2中第484~489位所示；或
[0027] 所述的3'末端反向重復(fù)序列如SEQ ID N0:2中第2108~2248位所示。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的sgRNA和TracrRNA序列的表達(dá)盒與3'末端反向重復(fù)序 列之間，還包括報(bào)告基因的表達(dá)盒。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的報(bào)告基因的表達(dá)盒包括：PGK啟動子，EGFP編碼核酸以及 SV40polyA〇
[0030] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0031] 圖1A、AAV-Cas9表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)帶有3xFlag標(biāo)簽的Cas9蛋白。Cas9 的完整表達(dá)元件依次為CMV啟動子，帶有3 X Flag標(biāo)簽及兩端核定位信號NLS的Cas9讀碼 框，人工微小加尾信號miniPolyA。總大小為5. Okb。
[0032] 圖1B、AAV-sgRNA表達(dá)質(zhì)粒的圖譜，該質(zhì)粒表達(dá)融合了引導(dǎo)RNA和TracrRNA的融 合RNA。該載體的5'端ITR刪除了 D序列（A -ITR)，將包裝成雙鏈AAV病毒。該載體中構(gòu) 建了小鼠PGK啟動子驅(qū)動的EGFP蛋白表達(dá)元件，用以方便檢測病毒感染表達(dá)分布。
[0033] 圖2、AAV9_Cas9注射小鼠左心室1個(gè)月后，利用抗Flag標(biāo)簽的抗體通過Western Blot檢測Cas9蛋白在小鼠各組織的表達(dá)狀況。
[0034] 圖3A、AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA共同注射小鼠1個(gè)月后，小鼠心肌靶點(diǎn)DNA測序 圖。
[0035] 圖3B、AAV9-Cas9和AAV9-sgRNA共同注射小鼠1個(gè)月后，小鼠心肌靶DNA位點(diǎn)的 測序結(jié)果，顯示發(fā)生隨機(jī)插入/缺失突變。
[0036] 圖3C、AAV9_Cas9和AAV9_sgRNA共同注射小鼠1個(gè)月后，通過Surveyor酶檢測小 鼠心肌靶點(diǎn)DNA發(fā)生突變的比例。
[0037] 圖4、pAAV-MCS的質(zhì)粒圖譜。
[0038] 圖5、pX330的質(zhì)粒圖譜。
[0039] 圖6、AAV_Cas9的質(zhì)粒圖譜。
[0040] 圖 7、pscAAV-U6-BB-chemeric_sgRNA 的質(zhì)粒圖譜。
[0041] 圖 8、scAAV-sgRNA 的質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，通過縮小優(yōu)化Cas9表達(dá)元件，制備了具有組織細(xì)胞廣 譜表達(dá)的Cas9蛋白的AAV表達(dá)載體，首次實(shí)現(xiàn)將整個(gè)表達(dá)元件和Cas9編碼序列包裝進(jìn)AAV 病毒。基于AAV病毒包裝的特性，只需更換包裝衣殼質(zhì)粒，即可將此Cas9載體包裝成不同 血清型的AAV病毒。本發(fā)明獲得的病毒可以有效地實(shí)現(xiàn)特定組織（如心臟）的靶向表達(dá)及 目的DNA編輯。
[0043] 術(shù)語
[0044] 如本文所用，所述的"操作性連接"或"可操作性相連"是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域 或核酸序列的功能性的空間排列。例如：啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定 位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子區(qū)域被"可操作地連接" 到該核酸序列上。
[0045] 如本文所用，所述的"元件"是指一些對于蛋白的表達(dá)有用的一系列功能性的核酸 序列，本發(fā)明中，所述的"元件"被系統(tǒng)地構(gòu)建以形成一種表達(dá)構(gòu)建體。所述的"元件"的序 列可以是本發(fā)明中所提供的那些，也包括它們的變體，只要這些變體基本上保留了所述"元 件"的功能，其通過插入或刪除一些堿基（如l -50bp ;較佳地l-30bp，更佳地l-20bp，更佳 地l-10bp)，或進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。
[0046] 如本文所用，所述的"表達(dá)盒"是指包含有表達(dá)目的基因所需的所有必要元件的基 因表達(dá)系統(tǒng)，通常其包括以下元件：啟動子、目的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括 信號肽編碼序列等。這些元件是操作性相連的。
[0047] 質(zhì)粒
[0048] 腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus，AAV)是一種不能自我復(fù)制的病毒，具有較 低的免疫原性。目前有約10種血清型AAV，不同血清型的AAV能夠選擇性地靶向不同組織。 但是AAV病毒載體裝載容量有限，不超過5. Okb。
[0049] 本發(fā)明人致力于研究利用AAV表達(dá)Cas9蛋白，但鑒于Cas9的編碼區(qū)4. 2kb，很難 實(shí)現(xiàn)將Cas9表達(dá)盒全部裝載入。因此，本發(fā)明人對于Cas9表達(dá)盒序列以及AAV載體中各 元件進(jìn)行了優(yōu)化改造。
[0050] 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV)載體是利用天然存在的腺相關(guān)病毒 某些特性經(jīng)過基因工程改造后產(chǎn)生的一種可供人工轉(zhuǎn)基因的載體。
[0051] 本發(fā)明提供了一種表達(dá)Cas9的重組腺相關(guān)病毒載體，該載體包括如下操作性連 接的序列元件：5'末端反向重復(fù)序列，CMV啟動子序列，核定位信號1序列，Cas9編碼核酸 序列，核定位信號2序列，miniPolyA序列和3'末端反向重復(fù)序列。該腺相關(guān)病毒載體的 主要元件的示意圖如圖1。
[0052] 本發(fā)明還提供了一種能在體內(nèi)形成sgRNA和TracrRNA的載體，該載體包括如下操 作性連接的序列元件：缺失D序列的5'末端反向重復(fù)序列，sgRNA和TracrRNA的表達(dá)盒， 和3'末端反向重復(fù)序列。
[0053] 為了實(shí)現(xiàn)成功的病毒包裝，本發(fā)明人選擇了 CMV啟動子作為啟動子，以及選擇了 精簡的polyA加尾信號，以3個(gè)串聯(lián)Flag作為標(biāo)簽，有效地簡化了載體中的元件結(jié)構(gòu)。對 于所用的各元件的序列，也進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)改造，以最精簡的序列構(gòu)成表達(dá)Cas9的AAV載 體，以利于成功包裝及表達(dá)。
[0054] 根據(jù)上述所提供的元件的信息，進(jìn)行了適當(dāng)?shù)淖兓胰匀槐Ａ羝湓泄δ艿纳鲜?元件的變異體也包括在本發(fā)明中。例如，在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明限定的序列雜交且具有相 同功能的序列變異體。如本文所用，術(shù)語"嚴(yán)格條件"是指：（1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫 度下的雜交和洗脫，如〇. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C;或（2)雜交時(shí)加有變性劑，如50% (v/v) 甲酰胺，0. 1%小牛血清/〇. 1% Ficoll，42°C等；或（3)僅在兩條序列之間的同源性至少在 70%以上、更佳地75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更優(yōu)選是95%以上時(shí)才發(fā)生 雜交。例如，所述序列也可為這些所限定序列的互補(bǔ)序列。
[0055] 本發(fā)明的各元件所指向的基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增 法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序 列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常 規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
[0056] 所述的載體中上述元件的上游以及下游的位置，還可包括限制性的酶切位點(diǎn)，這 樣有利于各元件的有機(jī)連接。
[0057] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括 體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多 個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀。
[0058] 包含上述的適當(dāng)多核苷酸序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于進(jìn) 行病毒的包裝。
[0059] 本發(fā)明構(gòu)建的上述載體可以與其他不同AAV衣殼質(zhì)粒組合包裝出不同血清型的 AAV病毒，并能靶向不同組織細(xì)胞。
[0060] 病毒
[0061] 本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體可以包裝成AAV的任何一種病毒血清型，進(jìn)行不同組織的 革巴向表達(dá)。
[0062] 重組腺相關(guān)病毒載體（rAAV)的包裝方法有很多種，例如雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染加輔助病 毒（多為腺病毒）感染法，無輔助病毒包裝系統(tǒng)，如Strategene公司的AAV Helper-Free System，輔助病毒被輔助病毒質(zhì)粒（如Strategene公司的pHelper質(zhì)粒）取代，從而產(chǎn)生 了不需要輔助病毒參與的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，采用無輔助病毒包裝 系統(tǒng)進(jìn)行包裝。
[0063] 在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，將包裝好的表達(dá)Cas9、sgRNA和TracrRNA的AAV9病毒 注射小鼠，成功地在小鼠心肌靶基因DNA中引入突變。
[0064] 試劑盒
[0065] 本發(fā)明還提供了包含有所述表達(dá)Cas9的重組腺相關(guān)病毒載體或由該載體包裝而 成的病毒的試劑盒。
[0066] 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還包括所述的在體內(nèi)形成sgRNA和 TracrRNA的載體或有該載體包裝而成的病毒。
[0067] 其它常用于進(jìn)行病毒包裝、轉(zhuǎn)染、注射等的試劑也可被包含在所述的試劑盒中，以 方便本領(lǐng)域技術(shù)人員使用。此外，所述試劑盒中還可包含有指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員操作的使 用說明書。
[0068] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0069] 材料和方法
[0070] 1.培養(yǎng)基
[0071] 細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM)、胎牛血清（FBS)購自Life Technologies公司；瓊脂糖購自 Promega公司；限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司；Taq酶和dNTPs購自TaKaRa公 司；寡聚核苷酸由南京金斯瑞公司合成。
[0072] 2、抗體
[0073] 鼠單抗CHC抗體購自BD Transduction Laboritories?;鼠單抗和兔多抗Flag抗 體購自Sigma。辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的驢抗鼠和抗兔IgG購自Jackson免疫研究實(shí) 驗(yàn)室。
[0074] 3、菌株與質(zhì)粒
[0075] (1)大腸桿菌 DH12S 獲自 Invitrogen(Cat. No. 18312-017) 〇
[0076] (2)AAV_Cas9 的構(gòu)建
[0077] 通過弓| 物：MluI-Xbal-CMV-F :atcACGCGTGTGTCTAGAACGCGTG GAGCTAGTTATTAAT(SEQ ID N0:3);和 CMV-EcoRI-R:atcGAATTCCGGTACCGGAGGCTG GATCGGTCCC(SEQ ID N0:4)擴(kuò)增 pAAV-MCS 載體（圖 4，GenBank :AF396260. 1)中的 CMV 啟動 子，通過Mlul和EcoRI酶切并接入pAAV-MCS，篩選引入Xbal的載體pAAV-CMV-hGHpolyA。
[0078] 通過 3' 末端互補(bǔ)配對的引物 miniPolyA-F :AGCTGGTACCGGTCCGCGAATTCaataaaata tctttattttcattacatctgtgt(SEQ ID N0:5)和 miniPolyA_R:ATCGCACGTGacacaaaaaaccaac acacagatgtaatgaaaa(SEQ ID N0:6)互為模板擴(kuò)增 miniPolyA，通過 Kpnl 和 Pmll 酶切接入 pAAV-CMV-hGHpolyA，獲得 pAAV-CMV-minipolyA。
[0079] 通過 Agel/EcoRI 從 pX330 (圖 5，獲自 Addgene，http://www. addgene. org/42230/)切下 3 X Flag-NLS-Cas9-NLS，接入 pAAV-CMV-minipolyA，從而獲得 AAV-Cas9， 如圖6。該質(zhì)粒的全序列如SEQ ID NO: 1所示，其中，各元件在序列中的位置如下：
[0080] NLS1 :第 913 ~963 位；
[0081] Cas9 :第 964 ~5064 位；
[0082] NLS2 :第 5065 ~5112 位；
[0083] L-ITR :第 1 ~141 位；
[0084] R-ITR :第 5192 ~5332 位（Complementary，其表示與 LITR 反向互補(bǔ)）；
[0085] 3 X FLAG :第 844 ~912 位；
[0086] miniPolyA :第 5122 ~5169 位；
[0087] CMV Promoter :第 165 ~828 位。
[0088] (3)AAV9-sgRNA 構(gòu)建
[0089] 以 pX330 為模板，通過引物 U6_XbaI_F :ATCTCTAGAgagggcctatttcccatgattc (SEQ N0:8)擴(kuò)增 U6_chemiric RNA，通過 Xbal 和 Pmll 接入載體 pAAV-CMV-hGHpolyA，替換掉 ITR 中間序列。獲得 pAAV-U6-BB-chemeric_sgRNA。
[0090] 以 pAAV-MCS 載體為模板，通過引物 AAV-L-ITR-Pcil-F :GCTGGCCTTITGCTCACATGT CCTGCAG(SEQ ID N0:9)和 AAV-L-ITR-XbaI-R:CGTTCTAGACACACGCGTGCGGCCGCCCACTCCCTC TCTGCGCGCTC(SEQ ID NO: 10)擴(kuò)增 A ITR(刪除了 L-ITR 的 3'端含有 D 序列的 24bp)，通過 Pcil 和 Xbal 替換原有的 L-ITR。從而獲得載體 pscAAV-U6-BB-chemeric_sgRNA(圖 7)。
[0091] pEGFP-Cl 載體（Clontech)通過 Bglll 和 BamHI 酶切并自連，去除 Bglll 到 BamHI 之間的酶切位點(diǎn)，然后以改造后載體為模板，通過引物PGK-EGFP-F : GGCCTTTCGACCGCTAG CGCTACCGGTCGC(SEQ ID N0:11)和 SV40_polyA-BglII-R:ACGAGATCTTAAGATACATTGATGAG ITTGGAC(SEQ ID N0:12)擴(kuò)增 EGFP-sv40_polyA 序列。然后使用引物 PGK-SalI-F:AGTC GTCGACTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGC(SEQ ID N0:13)和 PGK-EGFP-R:GGTAGCGCTAGCGGTC GAAAGGCCCGGAGATG(SEQ ID N0:14)從小鼠基因組DNA擴(kuò)增PGK啟動子。并以上述兩個(gè) PCR 產(chǎn)物為模板，使用引物 PGK-SalI-F :AGTCGTCGACTTGGGGTTGCGCCTTITCCAAGGC (SEQ ID 疊延伸方法擴(kuò)增融合的PGK-EGFP-SV40_polyA序列。再通過Sail和Bglll酶切接入載體 pscAAV-U6-BB-chemeic_sgRNA，從而獲得載體scAAV-sgRNA (圖8)。該質(zhì)粒的全序列如SEQ ID N0:2所示，其中，各元件在序列中的位置如下：
[0092] EGFP :第 1096 ~1815 位；
[0093] L-A ITR :第 1 ~117 位；
[0094] R-ITR :第 2108 ~2248 (Complementary)位；
[0095] SV40polyA :第 1840 ~2072 位；
[0096] U6promoter :第 141 ~389 位；
[0097] PGK promoter :第 574 ~1073 位；
[0098] TOterminator :第 484 ~489 位；
[0099] chimeric guide RNA scaffold :第 408 ~483 位。
[0100] 4、病毒包裝
[0101] 腺相關(guān)病毒包裝采用無輔助病毒的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。輔助質(zhì)粒l(pAdDeltaF6,購 自Penn Vector Core)含有所必需的腺病毒輔助基因，輔助質(zhì)粒2(pAAV2/9(p0008)Q，購自 Penn Vector Core)含有腺相關(guān)病毒復(fù)制及包裝必需基因。本實(shí)驗(yàn)中輔助質(zhì)粒2的衣殼蛋 白為血清型9,能夠輔助包裝成AAV9。將AAV-Cas9和AAV-sgRNA分別與上述兩個(gè)輔助質(zhì)粒 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72小時(shí)后收集細(xì)胞并破碎，經(jīng)過純化柱純化濃縮，測定滴度（vg/ml)，分 裝并凍存于-80 °C。
[0102] 5、AAV病毒介導(dǎo)的感染表達(dá)
[0103] 2. 5E+llvg總量的AAV9-Cas9病毒（病毒滴度lE+llvg/ml)通過左心室注射進(jìn)新 生小鼠（一周內(nèi)）的心腔內(nèi)，一個(gè)月后，取小鼠各組織勻漿檢測Cas9蛋白的表達(dá)。
[0104] 或者，AAV9-Cas9病毒和AAV9-sgRNA病毒各2. 5E+llvg，1:1混勻經(jīng)過左心室內(nèi)注 射，1個(gè)月后取心肌組織檢測目的位點(diǎn)DNA編輯狀況。
[0105] 6、蛋白的收集和檢測
[0106] 小鼠組織用 RIPA 緩沖液（50mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，2mM MgC12,0. 1% SDS，1. 5% NP-40,0. 5%去氧膽酸鈉）勻漿裂解（含蛋白酶抑制劑：5μg/ml P印statin A， 10μg/ml Leup印tin，5yM MG-132，lmM PMSF)，高速16,000g離心后取上清，然后加入相應(yīng) 體積的4X上樣緩沖液（12% SDS，6% 0 -巰基乙醇，30%甘油，以及適量的溴酚藍(lán)），混勻 后95°C溫浴10分鐘。Western blot檢測蛋白的方法參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（科學(xué)出版 社，第二版）。
[0107] 7、Cas9功能性檢測
[0108] 小鼠心肌組織抽提基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的位點(diǎn)DNA并測序。PCR產(chǎn)物經(jīng)過 Surveyor酶（Transgenomic公司）檢測突變效率。
[0109] 實(shí)施例1、Cas9的AAV表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0110] 保留AAV表達(dá)載體（pAAV-MCS)關(guān)鍵元件ITR，使用CMV啟動子和minipolyA位點(diǎn)替 換ITR中間序列。從pX330載體獲得3 X Flag-NLS-Cas9-NLS序列，插入到CMV和minipolyA 位點(diǎn)中間，從而獲得AAV-Cas9,其中ITR中間序列總共為5. Okb，其主要元件的示意圖如圖 1A，如此設(shè)計(jì)使得能夠滿足AAV包裝大小限制。
[0111] 構(gòu)建對應(yīng)的sgRNA表達(dá)載體將pX330中嵌合RNA表達(dá)元件插入到AAV表達(dá)載體 (pAAV-MCS)并替換ITR中間序列，得到AAV9-sgRNA，主要元件示意圖如圖1B。
[0112] 實(shí)施例2、Cas9成功包裝進(jìn)AAV9腺相關(guān)病毒并在小鼠成功表達(dá)
[0113] 將構(gòu)建好的Cas9的AAV表達(dá)載體（AAV-Cas9)包裝進(jìn)AAV9腺相關(guān)病毒，并通過 心腔內(nèi)注射新生小鼠（一周內(nèi)）。一個(gè)月后，收取小鼠各個(gè)不同組織，勻漿后通過western blot檢測Cas9蛋白的表達(dá)。
[0114] 結(jié)果如圖2所示，心臟中Cas9表達(dá)最高，其次是腦和肌肉。其他組織表達(dá)量很低 或檢測不到。
[0115] 實(shí)施例3、通過AAV9介導(dǎo)表達(dá)的Cas9蛋白在sgRNA及tracrRNA共同作用下能夠 對心肌細(xì)胞DNA進(jìn)行編輯
[0116] 向新生小鼠左心室注射表達(dá)Cas9和sgRNA嵌合RNA的AAV9腺相關(guān)病毒，一個(gè)月 后提取小鼠心肌基因組DNA。通過擴(kuò)增sgRNA靶向的DNA區(qū)段進(jìn)行測序，檢測該DNA區(qū)段的 序列。同時(shí)利用Surveyor核酸錯配酶檢測DNA中突變的比例。
[0117] 結(jié)果如圖3A-B所示，注射了表達(dá)Cas9和sgRNA的AAV9病毒的小鼠，其心肌基 因組靶點(diǎn)DNA發(fā)生突變，并且是插入或缺失突變。隨后使用Surveyor錯配核酸內(nèi)切酶檢 測突變效率。使用PCR擴(kuò)增基因組靶點(diǎn)DNA片段，并使其經(jīng)歷變性和重新緩慢均勻退火， 這時(shí)野生型和產(chǎn)生了突變的DNA分子解鏈并能夠形成含有錯配的雜交雙鏈DNA分子。這 種帶有錯配的DNA分子能夠被錯配酶切斷，定量切割后變小的DNA分子（cleaved)和未 切割的DNA分子（uncleaved)，并按照以下公式計(jì)算突變比例：％ gene modification = 100X [1-(1-fraction cleaved)1/2] (D. Y. Guschin, et al.，〃A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification,''Methods Mol. Biol. 649, 247 (2010)) 〇 根據(jù)上述方法計(jì)算，本實(shí)驗(yàn)中突變DNA大約為30-40% (圖3C)。
[0118] 上述結(jié)果表明，構(gòu)建的Cas9的AAV表達(dá)載體能夠成功包裝出AAV病毒，并且能夠 正常表達(dá)Cas9蛋白，而且具有基因組DNA編輯活性。
[0119] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種表達(dá)Cas9的重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于，該載體包括如下操作性連接的 序列元件：5'末端反向重復(fù)序列，CMV啟動子序列，核定位信號1序列，Cas9編碼核酸序列， 核定位信號2序列，miniPolyA序列和3'末端反向重復(fù)序列。2. 如權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于， 所述的5'末端反向重復(fù)序列如SEQ ID NO: 1中第1~141位所示； 所述的CMV啟動子序列如SEQ ID NO: 1中第165~828位所示； 所述的核定位信號1序列如SEQ ID NO: 1中第913~963位所示； 所述的Cas9編碼核酸序列如SEQ ID NO: 1中第964~5064位所示； 所述的核定位信號2序列如SEQ ID NO: 1中第5065~5112位所示； 所述的miniPolyA序列如SEQ ID NO: 1中第5122~5169位所示； 所述的3'末端反向重復(fù)序列如SEQ ID NO: 1中第5192~5332位所示。3. 如權(quán)利要求1或2所述的重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于，在核定位信號1序列的 5'端或核定位信號2序列的3'端，還包括標(biāo)簽序列。4. 權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒載體的用途，用于制備病毒，所述的病毒能夠在 特定組織中表達(dá)Cas9蛋白。5. -種重組腺相關(guān)病毒，其特征在于，所述病毒由權(quán)利要求1或2所述的重組腺相關(guān)病 毒載體包裝獲得。6. -種試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包括：權(quán)利要求5所述的重組腺相關(guān)病 毒；或權(quán)利要求1或2所述的重組腺相關(guān)病毒載體。7. 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其中還包括：權(quán)利要求1所述的表達(dá)Cas9 的重組腺相關(guān)病毒載體。8. 如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，其中還包括能在體內(nèi)形成sgRNA和 TracrRNA的載體或由該載體包裝成的腺相關(guān)病毒。9. 如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的在體內(nèi)形成sgRNA和TracrRNA 的載體包括如下操作性連接的序列元件：缺失D序列的5'末端反向重復(fù)序列，sgRNA和 TracrRNA的表達(dá)盒，和3'末端反向重復(fù)序列。10. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于， 所述的缺失D序列的5'末端反向重復(fù)序列如SEQ ID NO:2中第1~117位所示； 所述的U6啟動子序列如SEQ ID NO:2中第141~389位所示； 所述的sgRNA和TracrRNA序列如SEQ ID NO: 2中第408~483位所示； 所述的U6終止子序列如SEQ ID NO:2中第484~489位所示；或 所述的3'末端反向重復(fù)序列如SEQ ID NO:2中第2108~2248位所示。11. 如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的sgRNA和TracrRNA序列的表達(dá)盒 與3'末端反向重復(fù)序列之間，還包括報(bào)告基因的表達(dá)盒。
【文檔編號】C12N15/55GK106032540SQ201510114406
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月16日
【發(fā)明人】宋保亮, 謝暢
【申請人】中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院