一種制備s-氰醇的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種制備S-氰醇的方法。通過(guò)將氰醇裂解酶進(jìn)行固定化，然后在純有機(jī)溶劑中催化底物反應(yīng)制備S-氰醇。本發(fā)明人對(duì)采用固定化氰醇裂解酶制備S-氰醇的方法進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了優(yōu)化的反應(yīng)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的優(yōu)化的制備S-氰醇方法能夠高效的制備S-氰醇，產(chǎn)物收率高，固定的氰醇裂解酶能夠重復(fù)利用，而且工藝穩(wěn)定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
_種制備s-槪酵的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種氰醇裂解酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氰醇裂解酶是一種在化工生產(chǎn)中非常有用的工業(yè)用酶，其天然活性是催化氰醇的 裂解并釋放出氫氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反應(yīng)，即HCN與醛酮的加成，得到具有光學(xué)活 性的a-氰醇產(chǎn)物。
[0003] 天然的S-氰醇裂解酶存在于橡膠、木薯和高粱等少數(shù)幾種植物組織中，豐度 低，純化難度大。1995年，Wajant采用五步純化法從木薯中分離得到了木薯氰醇裂解酶 MeHNL(Plant Sci.，1995, 108, 1) ;White等人采用三步法從木薯葉中提取了 MeHNL，采用 鹽析和透析的方式得到了酶液，但是應(yīng)用于化學(xué)催化的立體選擇性不高（Plant Physiol 1998,116,1219)。來(lái)源于木薯（Manihot esculenta)的氰醇裂解酶（MeHNL)是一種 S-氰 醇裂解酶，已有文獻(xiàn)報(bào)道將MeHNL用于催化S-型手性氰醇的化學(xué)合成，ee值〉99%，具有 重要的應(yīng)用價(jià)值，例如S-間苯氧基苯甲醛氰醇是新型菊酯類(lèi)農(nóng)藥的通用中間體。1993年， Wajant等人報(bào)道了編碼MeHNL的cDNA序列和蛋白序列。
[0004] 目前的制備S-氰醇的方法產(chǎn)物效率低下，酶利用率低，很難進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用， 因此本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開(kāi)發(fā)制備效率高、酶利用率高，工藝簡(jiǎn)單適合進(jìn)行大規(guī)模工業(yè) 化生產(chǎn)的制備S-氰醇的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種氰醇裂解酶、其制備方法及應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供了一種制備S-氰醇的方法，包括步驟：
[0007] (1)制備固定化的氰醇裂解酶；
[0008] (2)將所述固定化的氰醇裂解酶與反應(yīng)底物接觸，進(jìn)行催化反應(yīng)，從而生成所述 s-氰醇；
[0009] (3)分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（1)中，所述固定化的氰醇裂解酶選自下組：氰醇裂解 酶的交聯(lián)酶聚集體（CLEA，氰醇裂解酶酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使之不溶于水 從而形成固定化氰醇裂解酶）、吸附劑吸附的氰醇裂解酶（優(yōu)選地，所述吸附劑包括活性 炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等）。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（1)中固定化的氰醇裂解酶的制備方法如下：
[0012] (a)向氰醇裂解酶水溶液中加入戊二醛至終濃度5-15% (v/v);
[0013] (b)向步驟（a)獲得的溶液中加入沉淀劑，然后收集沉淀，即獲得所述固定化的氰 醇裂解酶（氰醇裂解酶的交聯(lián)酶聚集體）。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（b)中，所述沉淀劑為硫酸銨，加入硫酸銨固體至 30% -50% (w/v)終濃度，優(yōu)選為35% -40% (w/v)終濃度，最優(yōu)選為36% (w/v)終濃度。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)中，加入戊二醛至終濃度10% (v/v)。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述沉淀劑為PEG3000,加入PEG3000至10% -30% (w/v)終濃 度，優(yōu)選為15% -25% (w/v)終濃度，最優(yōu)選為20% (w/v)終濃度。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中，所述反應(yīng)底物為間苯氧基苯甲醛、和丙酮氰醇 (或，氰氫酸）；優(yōu)選地，丙酮氰醇的濃度是間苯氧基苯甲醛濃度的2倍。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中，反應(yīng)的溫度為0°C -40°C，優(yōu)選為10°C -35°C， 更優(yōu)選地為15-25°C，如21°C。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中，將所述底物溶于MTBE中，加入所述固定化的氰 醇裂解酶進(jìn)行催化反應(yīng)。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（2)中，反應(yīng)體系為MTBE有機(jī)相；反應(yīng)條件為：固定 化的氰醇裂解酶為催化劑，MTBE為溶劑，底物為間苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇（或，氰氫酸）， 15°C -25°C (優(yōu)選為20°C )反應(yīng)3-5小時(shí)（優(yōu)選為4小時(shí)），攪拌速度為400-500rpm ;反應(yīng) 體系中間苯氧基苯甲醛濃度為0. 1摩爾/升-1. 2摩爾/升（優(yōu)選為0. 5摩爾/升），丙酮 氰醇濃度為〇. 2摩爾/升一 2摩爾/升（優(yōu)選為1. 0摩爾/升），而且丙酮氰醇的濃度是間 苯氧基苯甲醛濃度的1. 5-3倍（優(yōu)選為2倍）。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述氰醇裂解酶為天然氰醇裂解酶或重組氰醇裂解酶（包括突 變的氰醇裂解酶）。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. : 5或SEQ IDN0. : 1 所示。
[0023] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1A顯示了實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜。
[0025] 圖1B顯示了本發(fā)明突變的氰醇裂解酶的凝膠電泳圖譜。
[0026] 圖2顯示催化活性測(cè)定曲線(xiàn)。
[0027] 圖3顯示了本發(fā)催化反應(yīng)的HPLC檢測(cè)結(jié)果。
[0028] 圖4顯示了本發(fā)明所構(gòu)建的質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，獲得一種制備S-氰醇的方法，通過(guò)將氰醇裂解 酶進(jìn)行固定化，然后在純有機(jī)溶劑中催化底物反應(yīng)制備S-氰醇。本發(fā)明人對(duì)采用固定化氰 醇裂解酶制備S-氰醇的方法進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了優(yōu)化的反應(yīng)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明 的優(yōu)化的制備S-氰醇方法能夠高效的制備S-氰醇，產(chǎn)物收率高，固定的氰醇裂解酶能夠重 復(fù)利用，而且工藝穩(wěn)定。
[0030] 在描述本發(fā)明之前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于所述的具體方法和實(shí)驗(yàn)條件，因?yàn)檫@ 類(lèi)方法和條件可以變動(dòng)。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)其目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并 且不意圖是限制性的，本發(fā)明的范圍將僅由所附的權(quán)利要求書(shū)限制。
[0031] 除非另外定義，否則本文中所用的全部技術(shù)與科學(xué)術(shù)語(yǔ)均具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域 的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。如本文所用，在提到具體列舉的數(shù)值中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ) "約"意指該值可以從列舉的值變動(dòng)不多于1 %。例如，如本文所用，表述"約1〇〇"包括99 和101和之間的全部值（例如，99. 1、99. 2、99. 3、99. 4等）。
[0032] 雖然在本發(fā)明的實(shí)施或測(cè)試中可以使用與本發(fā)明中所述相似或等價(jià)的任何方法 和材料，本文在此處例舉優(yōu)選的方法和材料。
[0033] 氰醇裂解酶
[0034] 氰醇裂解酶（Hydroxynitrile lyase)主要來(lái)源于橡膠、木薯和高粱等少數(shù)幾種植 物組織。主要包括：木薯氰醇裂解酶（MeHNL)、漆樹(shù)氰醇裂解酶（HbHNL)、杏仁氰醇裂解酶 (PaHNL) 〇
[0035] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述氰醇裂解酶為木薯氰醇裂解酶。
[0036] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，優(yōu)選地木薯氰醇裂解酶野生型序列如下：
[0038] 本發(fā)明還提供了一種突變型的氰醇裂解酶，該突變型的氰醇裂解酶特別適合用于 本發(fā)明的制備S-氰醇的方法。使用該突變型的氰醇裂解酶，與野生型酶相比，產(chǎn)物收率更 高，而且更適于固定化酶的可重復(fù)利用。
[0039] 在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述突變的氰醇裂解酶的序列如下：
[0041] 氰醇裂解酶基因序列優(yōu)化
[0042] 在本發(fā)明中，提供了優(yōu)化的、特別適合在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)的氰醇裂解酶蛋白 的核酸編碼序列。
[0043] 本發(fā)明人選用大腸桿菌偏好密碼子，在不改變其氨基酸序列的前提下對(duì)氰醇裂解 酶的DNA序列進(jìn)行了優(yōu)化。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，僅依據(jù)密碼子頻率獲得的優(yōu)化序列并不完 全適合在大腸桿菌中表達(dá)。因此本發(fā)明人進(jìn)行了二次優(yōu)化，其中包括消除不利于表達(dá)的二 級(jí)結(jié)構(gòu)（如發(fā)夾結(jié)構(gòu)），改變基因中A+T組成、改變G+C含量等。
[0044] 經(jīng)過(guò)大量測(cè)試和篩選，本發(fā)明人在眾多優(yōu)化序列中獲得了一個(gè)特別優(yōu)化的氰醇裂 解酶編碼序列。所述優(yōu)化的氰醇裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，
[0045]
[0046] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的突變型的氰醇裂解酶的多核苷酸 序列如下：
[0048] 載體和宿主細(xì)胞
[0049] 本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明的優(yōu)化的氰醇裂解酶基因的載體，以及含所述載 體的宿主細(xì)胞。
[0050] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，所述述載體具有在大腸桿菌（更佳地在大腸桿菌 BL21(DE3)菌株）中表達(dá)的能力。
[0051] 本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以使用的常規(guī)方法獲得本發(fā)明的優(yōu)化的氰醇裂解酶基 因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一種優(yōu)選的合成法為不對(duì)稱(chēng)PCR法。不對(duì)稱(chēng)PCR 法是用不等量的一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)生大量的單鏈DNA(SSDNA)。這對(duì)引物分別稱(chēng)為非 限制引物與限制性引物，其比例一般為50-100 : 1。在PCR反應(yīng)的最初10-15個(gè)循環(huán)中，其 擴(kuò)增產(chǎn)物主要是雙鏈DNA，但當(dāng)限制性引物（低濃度引物）消耗完后，非限制性引物（高濃 度引物）引導(dǎo)的PCR就會(huì)產(chǎn)生大量的單鏈DNA。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā) 明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純 化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0052] 本發(fā)明的多核苷酸序列可以通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，表達(dá)或生產(chǎn)目的蛋白，包 括步驟：
[0053] (1)用編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸的重組表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞，較佳地大腸桿菌細(xì)胞；
[0054] (2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；
[0055] (3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0056] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明蛋白的編碼DNA序列和合適 的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體，優(yōu)選市售的載體：PET28。這些方法包括體外重組DNA 技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟 動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。 此外，表達(dá)載體優(yōu)選包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的 表型性狀。
[0057] 本發(fā)明還提供的重組載體，其包含本發(fā)明的經(jīng)過(guò)優(yōu)化的MeHNL DNA序列。在優(yōu)選 的實(shí)施方式中，所述重組載體的啟動(dòng)子下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個(gè)酶切位點(diǎn)。需要表 達(dá)目的基因時(shí)，將目的基因連接入適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)，從而可操作地連接目的 基因與啟動(dòng)子。
[0058] 在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組載體在5'到3'方向上包括：?jiǎn)?dòng)子，目的基 因和終止子。如果需要，所述重組載體還可以包括以下元件：蛋白純化標(biāo)簽；3'多聚核苷 酸化信號(hào)；非翻譯核酸序列；轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列；選擇標(biāo)記（抗生素抗性基因、熒光蛋白 等）；增強(qiáng)子；或操作子。
[0059] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組載體包括色氨酸啟動(dòng)子Trp2,優(yōu)選 地，其序列如下：
[0061] 用于制備重組載體的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。表達(dá)載體可以是細(xì)菌 質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要其能夠 在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以被米用。
[0062] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以采用熟知的方法構(gòu)建含有本發(fā)明啟動(dòng)子和/或目的基 因序列的載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。
[0063] 本發(fā)明的表達(dá)載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使宿主轉(zhuǎn)錄目的RNA或表 達(dá)目的蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、鏈霉菌 屬、農(nóng)桿菌：或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如植物細(xì)胞。本領(lǐng)域一般 技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和宿主細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技 術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物（如大腸桿菌）時(shí)，可以用CaCV法處理， 也可用電穿孔法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法， 常規(guī)機(jī)械方法（如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等）。轉(zhuǎn)化植物也可使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化或基 因槍轉(zhuǎn)化等方法，例如葉盤(pán)法、幼胚轉(zhuǎn)化法、花芽浸泡法等。對(duì)于轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器 官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得轉(zhuǎn)基因的植物。
[0064] 術(shù)語(yǔ)"可操作連接"是指將準(zhǔn)備轉(zhuǎn)錄表達(dá)的目的基因以一種本領(lǐng)域的常規(guī)方式連 接到它的控制序列以被表達(dá)。
[0065] 工程菌的培養(yǎng)和目的蛋白發(fā)酵生產(chǎn)
[0066] 在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞，表達(dá)本發(fā)明的基因序列 所編碼的蛋白。根據(jù)宿主細(xì)胞的不同，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基，在適 于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法 (如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)）誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。工程細(xì)胞可以是快 速利用甲醇型（Mut+)或慢速利用甲醇型（Muts)。
[0067] 在本發(fā)明中，可采用常規(guī)的發(fā)酵條件。代表性的條件包括（但并不限于）：
[0068] (a)就溫度而言，氰醇裂解酶的發(fā)酵及誘導(dǎo)溫度保持在25_35°C ;
[0069] (b)就誘導(dǎo)期的pH值而言，誘導(dǎo)期pH控制在3-9 ;
[0070] (c)就溶氧（D0)而言，D0控制在20-90%，溶氧的維持可以用氧氣/空氣混合氣 體的通入來(lái)解決；
[0071 ] (d)就補(bǔ)料而言，補(bǔ)料種類(lèi)宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可單獨(dú)補(bǔ)料或混合補(bǔ) 料；
[0072] (e)就誘導(dǎo)期IPTG濃度而言，常規(guī)誘導(dǎo)濃度都可用于本發(fā)明，通常iptg濃度控制 在 0? 1-1. 5mM ;
[0073] (f)就誘導(dǎo)時(shí)間而言，沒(méi)有特別限制，通常為2-20小時(shí)，較佳地為5-15小時(shí)。
[0074] 本發(fā)明的目的蛋白氰醇裂解酶存在大腸桿菌細(xì)胞胞內(nèi)，通過(guò)離心機(jī)收集宿主細(xì) 胞，然后通過(guò)高壓、機(jī)器力、酶解細(xì)胞被或其他細(xì)胞破碎方法破碎宿主細(xì)胞，釋放重組蛋白， 優(yōu)選的是高壓法。宿主細(xì)胞裂解液可通過(guò)鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純 化，也可直接進(jìn)行層析純化。
[0075] 層析技術(shù)包括陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、疏水層析、親和 層析等技術(shù)。常用的層析方法包括：
[0076] 1?陰離子交換層析：
[0077] 陰離子交換層析介質(zhì)包括（但不限于）：Q_Sepharose、DEAE-Sepharose。如果發(fā) 酵樣品的鹽濃度較高，影響與離子交換介質(zhì)的結(jié)合，則在進(jìn)行離子交換層析前需降低鹽濃 度。樣品可以用稀釋、超濾、透析、凝膠過(guò)濾層析等手段進(jìn)行平衡緩沖液的更換，直至與對(duì)應(yīng) 的離子交換柱平衡液系統(tǒng)相似，然后上樣，進(jìn)行鹽濃度或pH的梯度洗脫。
[0078] 2?疏水層析：
[0079] 疏水層析介質(zhì)包括（但不限于）：Phenyl_Sepharose、Butyl-Sepharose、 Octyle-Sepharose。樣品通過(guò)添加NaCl、（NH 4)2S04等方式提高鹽濃度，然后上樣，通過(guò)降低 鹽濃度方法洗脫。通過(guò)疏水層析除去疏水性有較大差異的雜蛋白。
[0080] 3.凝膠過(guò)濾層析
[0081] 疏水層析介質(zhì)包括（但不限于）：Sephacryl、Superdex、Sephadex類(lèi)。通過(guò)凝膠 過(guò)濾層析更換緩沖體系，或進(jìn)一步精純。
[0082] 4?親和層析
[0083] 親和層析介質(zhì)包括（但不限于）：HiTrap? Heparin HP Columns。
[0084] 固定化的氰醇裂解酶
[0085] 本發(fā)明中的術(shù)語(yǔ)"固定化的氰醇裂解酶"是指，用物理或化學(xué)方法處理水溶性的氰 醇裂解酶使之變成不溶于水或固定于固相載體的但仍具有酶活性的氰醇裂解酶衍生物。
[0086] 在本發(fā)明中，優(yōu)選地固定化的氰醇裂解酶的制備方法包括：
[0087] 吸附法
[0088] 利用各種吸附劑將氰醇裂解酶或含氰醇裂解酶菌體吸附在其表面上而使酶固定 的方法。通常有物理吸附法和離子吸附法。
[0089] 常用吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
[0090] 采用吸附法固定酶，其操作簡(jiǎn)便、條件溫和，不會(huì)引起酶變性或失活，且載體廉價(jià) 易得，可反復(fù)使用。
[0091] 載體結(jié)合法
[0092] 最常用的是共價(jià)結(jié)合法，即氰醇裂解酶的非必需基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵和載體形成不可 逆的連接。在溫和的條件下能偶聯(lián)的蛋白質(zhì)基團(tuán)包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸 的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)，不能是酶 表現(xiàn)活力所必需的基團(tuán)。
[0093] 交聯(lián)法
[0094] 依靠雙功能團(tuán)試劑使氰醇裂解酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使之不溶于 水從而形成固定化酶。本發(fā)明中優(yōu)選采用的雙功能團(tuán)試劑有戊二醛、順丁烯二酸酐等。酶 蛋白的游離氨基、酚基、咪唑基及巰基均可參與交聯(lián)反應(yīng)。
[0095] 交聯(lián)酶聚集體（CLEA)是指酶在某些鹽、有機(jī)溶劑或非離子聚合物存在下形成 的一種穩(wěn)定的超分子結(jié)構(gòu)，再經(jīng)過(guò)交聯(lián)即成為具有高活性、高穩(wěn)定性的交聯(lián)酶聚集體 (CLEAs)。其原理是向未經(jīng)高度純化的蛋白質(zhì)溶液中加入鹽、有機(jī)溶劑、非離子聚合物等誘 導(dǎo)蛋白質(zhì)分子物理聚集，通過(guò)非共價(jià)鍵形成超分子結(jié)構(gòu)，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)分子原有的三維 結(jié)構(gòu)。
[0096] 包埋法
[0097] 氰醇裂解酶被裹在凝膠的細(xì)格子中或被半透性的聚合物膜包圍而成為格子型和 微膠囊型兩種。包埋法制備固定化氰醇裂解酶除包埋水溶性酶外還常包埋細(xì)胞，制成固定 化細(xì)胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有氰醇裂解酶的菌體，在本文中包含術(shù)語(yǔ)"固定化的 氰醇裂解酶"內(nèi)。
[0098] 本發(fā)明中優(yōu)選地制備固定化的氰醇裂解酶的方法如下：
[0099] 取含有氰醇裂解酶的水溶液，加入硫酸銨固體至終濃度50 % -70 % (w/v)(優(yōu)選為 約60%，可以為55%、65% )，冰浴攪拌，離心收集沉淀。冰浴攪拌下，將蛋白硫酸銨沉淀加 入5%-20% (v/v)(優(yōu)選為優(yōu)選地為8%-15% (v/v)，最優(yōu)選地為約11 % (v/v)，可以為 10% (v/V))戊二醛的水溶液，離心收集沉淀，即可獲得固定化的氰醇裂解酶。
[0100] 制備酶制劑組合物
[0101] 本發(fā)明還提供了一種酶制劑組合物，該酶制劑組合物中包含本發(fā)明的氰醇裂解 酶。
[0102] 本發(fā)明的酶制劑組合物還可以包含：檸檬酸、和/或乙酸。
[0103] S-氰醇的制備方法
[0104] 本發(fā)明還提供了一種S-氰醇的制備方法，所述方法包括步驟：
[0105] (1)將本發(fā)明的突變的氰醇裂解酶與反應(yīng)底物接觸，進(jìn)行催化反應(yīng)，從而生成所述 s-氰醇；
[0106] (2)分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。
[0107] 在本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟（1)中，所述反應(yīng)底物為間苯氧基苯甲醛、 和丙酮氰醇（或，氰氫酸）。
[0108] 在本發(fā)明優(yōu)選地實(shí)施方式中，所述步驟（1)中，催化反應(yīng)的溫度為0-20°C。
[0109] 本發(fā)明優(yōu)選的反應(yīng)體系為MTBE有機(jī)相；反應(yīng)條件為：CLEA固定化酶為催化劑， MTBE為溶劑，底物為間苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇（或，氰氫酸），15°C _25°C (優(yōu)選為20°C ) 反應(yīng)3-5小時(shí)（優(yōu)選為4小時(shí)），攪拌速度為400-500rpm。反應(yīng)體系中間苯氧基苯甲醛濃度 為0. 1摩爾/升-1. 2摩爾/升（優(yōu)選為0. 5摩爾/升），丙酮氰醇濃度為0. 2摩爾/升一 2摩爾/升（優(yōu)選為1. 〇摩爾/升），而且丙酮氰醇的濃度是間苯氧基苯甲醛濃度的1. 5-3 倍（優(yōu)選為2倍）。
[0110] 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：
[0111] (1)采用本發(fā)明的方法制備S-氰醇產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率能夠達(dá)到99 %以上，重復(fù)利用5次 后，轉(zhuǎn)化率仍然能夠達(dá)到95%以上。
[0112] (2)本發(fā)明的方法中使用本發(fā)明的突變的氰醇裂解酶，催化反應(yīng)活性遠(yuǎn)高于野生 型的氰醇裂解酶，是野生型的兩倍左右。
[0113] (3)采用本發(fā)明的方法制備S-氰醇，周期短，成本低，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0114] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明詳細(xì)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。以下實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料和試劑如無(wú)特別說(shuō)明均可從市售渠道獲 得。
[0115] 實(shí)施例1突變體的構(gòu)建
[0116] 根據(jù)Wajant報(bào)道的MeHNL的蛋白序列1 (SEQ ID N0. : 1)，根據(jù)大腸桿菌的密碼子 偏好性，合成了 MeHNL DNA序列2(SEQ ID N0. :2)，克隆至質(zhì)粒pET28(購(gòu)自Invitrogene公 司）的Ndel-Hindlll位點(diǎn)。以該質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)序列3和序列4。使用隨機(jī)誘 變?cè)噭┖?，通過(guò)改變MnS0 4濃度來(lái)進(jìn)行多個(gè)反應(yīng)，從而將1至3個(gè)點(diǎn)突變引入MeHNL基因， 使MeHNL酶氨基酸序列中1-3個(gè)氨基酸被替換。為擴(kuò)增編碼MeHNL酶，分別以引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4作為正向和反向引物。兩個(gè)引物都含有與使用Gateway Technology 通過(guò)定點(diǎn)重組克隆獲得的PCR擴(kuò)增MeHNL基因片段相容的位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳 圖譜如圖1所示，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期相符。
[0117] 易錯(cuò)PCR擴(kuò)增使用下述溫度程序：94°C 2min，94°C 30s和68°C lmin的25個(gè)循 環(huán)，接著68°C 10min。首先將易錯(cuò)PCR片段克隆進(jìn)pDONR載體（購(gòu)自Invitrogene公司）， 制備大規(guī)模PENTR(購(gòu)自Invitrogene公司）質(zhì)粒文庫(kù)，起始超過(guò)20, 000個(gè)菌落。然后以 pDEST 14為載體，將pENTR入門(mén)質(zhì)粒文庫(kù)構(gòu)建為表達(dá)文庫(kù)。然后將表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)入化學(xué)感受態(tài) E. coil BL21 Star (DE3)(購(gòu)自Invitrogene公司），用于表達(dá)突變的MeHNL基因。
[0118] 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (DE3)，得到的Kana抗性的轉(zhuǎn)化子，接種至LB培養(yǎng)基在37°C 進(jìn)行培養(yǎng)。0D600 = 0. 6-1. 0之間時(shí)，加入IPTG至終濃度0.1 mM，降溫至25-30°C，繼續(xù)培養(yǎng) 16小時(shí)，4000rpm離心收集菌體。
[0119] 酶活測(cè)定：參考 Selmar 報(bào)道的方法（Analytical Biochemistry 166 (1987)， 208-211)，間苯氧基苯甲醛10mM，甲醇20uL，20mM檸檬酸緩沖液（pH5. 0)，丙酮氰醇50mM，粗 酶液10uL。上述反應(yīng)液于25度溫育，上述反應(yīng)液于25度溫育，分別在l-5min測(cè)定250nm 的吸光度變化。每分鐘內(nèi)催化產(chǎn)生lumole間苯氧基苯甲醛所需要的酶量定義為1個(gè)酶活 單位。變化速率最快的即為酶活最高的突變體。
[0120] 檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，為突變體，▲為野生型，?為對(duì)照試驗(yàn)（不加酶）。突變體 酶活 / 野生型酶活=(0.2299-0. 086)八0. 1577-0. 086)*100%= 200.6%。
[0121] 從圖中可以看出突變體的活性要顯著高于野生型的活性，催化活性為野生型的 200%。測(cè)序獲得該高活性的突變型為序列5 (SEQ ID N0. : 5)。
[0122] 本實(shí)施例中所用引物序列如下：
[0123] 正向引物：5' -GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GGT GAC CGC CCA TTT C-3, SEQ ID NO. :3 ；
[0124] 反向引物：5' -GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA AGC ATA AGC ACG GCC-3' SEQ ID NO. :4。
[0125] 實(shí)施例2菌種構(gòu)建和高密度發(fā)酵
[0126] 合成含有序列6(3￡0 10勵(lì).：6)的色氨酸啟動(dòng)子，并連接到？￡了28&的此〇1和恥61 位點(diǎn)，然后分別將實(shí)施例1中的序列1和5的編碼多核苷酸連接到前述的Ndel-Xhol位點(diǎn)， 得到含有串聯(lián)色氨酸啟動(dòng)子的大腸桿菌質(zhì)粒pTrp2-MeHNLl和pTrp2-MeHNL5 (質(zhì)粒圖譜如 圖4所示）。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (購(gòu)自Invitrogene公司），在Kana抗性平板上得 到相應(yīng)的菌種，接種到LB培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，用20%甘油保存菌種。
[0127] 將菌種接種于裝有200mL LB培養(yǎng)基的1L搖瓶中，于37 °C，180-220rpm培養(yǎng) 10-16h。將上述培養(yǎng)好的種子按10% (v/v)的比例接種于3L上罐發(fā)酵培養(yǎng)基（M9)中 (葡萄糖4g/L，磷酸氫二鈉12. 8g/L，磷酸二氫鉀3g/L，氯化銨lg/L，硫酸鈉0. 5g/L，氯化鈣 0? 0152g/L，六水氯化鎂 0? 41g/L。），在 25-35°C，300-800rpm，空氣流量 2-6L/min 的條件下 培養(yǎng)。培養(yǎng)6-1011后，以5-2〇1111711的速率流加含60%甘油的補(bǔ)料培養(yǎng)基，持續(xù)至發(fā)酵結(jié)束。 流加補(bǔ)料培養(yǎng)基數(shù)小時(shí)至〇D_達(dá)到80-100時(shí)，放罐，5000rpm離心收集菌體。菌體裂解后 測(cè)定酶活，分別為73U/mg粗蛋白和143U/g粗蛋白。凝膠電泳檢測(cè)與預(yù)期相符。
[0128] 實(shí)施例3MeHNL的固定化（交聯(lián)酶聚集體，CLEA)
[0129] 方案1 :分別取含有序列1和序列5的大腸桿菌80g濕菌體，重懸于260mL檸檬酸 緩沖液（50mM，pH 5. 5)，超聲破菌，14000rpm離心30min收取上清液，加入戊二醛至終濃度 10%，攪拌下加入硫酸銨固體至終濃度36%，冰浴上攪拌15111；[11，14000印1]1離心收集沉淀， 分別得到4. lg (序列1)和4. 5g (序列5)固定化MeHNL。
[0130] 方案2 :分別取含有序列1和序列5的大腸桿菌80g濕菌體，重懸于260mL乙酸 緩沖液（50mM，pH 5. 5)，超聲破菌，14000rpm離心30min收取上清液，加入戊二醛至終濃度 15 %，攪拌下加入乙二醇二甲醚至終濃度80 %，冰浴上攪拌30min，14000rpm離心收集沉 淀，分別得到3. 9g (序列1)和4. lg (序列5)固定化MeHNL。
[0131] 方案3 :分別取含有序列1和序列5的大腸桿菌80g濕菌體，重懸于260mL乙酸 緩沖液（50mM，pH 5. 5)，超聲破菌，14000rpm離心30min收取上清液，加入戊二醛至終濃度 15 %，攪拌下加入PEG3000 (聚乙二醇）至終濃度20 %，冰浴上攪拌30min，14000rpm離心收 集沉淀，分別得到4g (序列1)和4. lg (序列5)固定化MeHNL。三種方案所得交聯(lián)酶聚集體 的活力如下表所示：
[0132] 表 1
[0133]
[0134] 注：總酶活=固定化酶比酶活X固定化酶重量。
[0135] 雖然沉淀劑選用PEG3000的固定化酶比酶活較高，但是成本比硫酸銨高；并且采 用硫酸銨的總酶活回收率更高，因此采用硫酸銨作為固定化酶沉淀劑。
[0136] 實(shí)施例4-5固定化酶的使用（純有機(jī)相）
[0137] 在 100mL MTBE (methyl tert-butyl ether，甲基叔丁基醚）（實(shí)施例 4)，或異丙醚 (實(shí)施例5)中，加入10mL間苯氧基苯甲醛，2. 5g MeHNL固定化酶，5mL丙酮氰醇，20°C攪拌 反應(yīng)，攪拌速度為400-500rpm。反應(yīng)4小時(shí)取樣用HPLC檢測(cè)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，過(guò)濾回收固定化 酶，投入下一批次。重復(fù)使用的情況見(jiàn)表2。
[0138] 表 2
[0139]
[0140] 注：A為突變型；WT為野生型。液相色譜檢測(cè)，轉(zhuǎn)化率計(jì)算方式為，轉(zhuǎn)化率=產(chǎn)物 八產(chǎn)物+底物）*1〇〇%。
[0141] 實(shí)施例6-7固定化酶的使用（水+有機(jī)相）
[0142] 在50mL檸檬酸溶液（50mM，pH5)中，加入10mL間苯氧基苯甲醛，5g MeHNL (序列 1)固定化酶，5mL氰氫酸，分別加入50mL MTBE (實(shí)施例6)，或50mL異丙醚（實(shí)施例7)，20°C 攪拌反應(yīng)，攪拌速度為400-500rpm。反應(yīng)4小時(shí)后取樣用HPLC檢測(cè)轉(zhuǎn)化率，結(jié)束反應(yīng)后，過(guò) 濾回收固定化酶，投入下一批次。重復(fù)使用的情況見(jiàn)表3。
[0143]表 3
[0146] 根據(jù)實(shí)施例4-7的結(jié)果，本發(fā)明優(yōu)選的反應(yīng)體系為MTBE有機(jī)相；反應(yīng)條件為： CLEA固定化酶為催化劑，MTBE為溶劑，底物為間苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇（或，氰氫酸）， 15°C -25°C (優(yōu)選為20°C )反應(yīng)3-5小時(shí)（優(yōu)選為4小時(shí)），攪拌速度為400-500rpm。反 應(yīng)體系中間苯氧基苯甲醛濃度為0. 1摩爾/升-1. 2摩爾/升（優(yōu)選為0. 5摩爾/升），丙 酮氰醇濃度為〇. 2摩爾/升一 2摩爾/升（優(yōu)選為1. 0摩爾/升），而且丙酮氰醇的濃度是 間苯氧基苯甲醛濃度的1. 5-3倍（優(yōu)選為2倍）。
[0147] 實(shí)施例9分析檢測(cè)
[0148] 采用高效液相色譜（HPLC)法監(jiān)測(cè)反應(yīng)：以水和乙腈（45:55)為流動(dòng)相，色譜柱為 0DS-18反相柱，島津LC-15C高效液相色譜，210nm下檢測(cè)紫外吸收；反應(yīng)體系用水和乙腈 (45:55)進(jìn)行稀釋?zhuān)x心并用尼龍膜過(guò)濾后進(jìn)樣檢測(cè)。在本發(fā)明優(yōu)選地反應(yīng)體系中，HPLC檢 測(cè)反應(yīng)進(jìn)程（圖3):反應(yīng)1小時(shí)后，檢測(cè)，17. 3min為間苯氧基苯甲醛，17. 5min為S-構(gòu)型 氰醇.
[0149] 手性純度采用Agilent 1260液相色譜進(jìn)行分析，檢測(cè)條件為：Chiralpak AD-H 柱，正己燒：乙醇（0. 1% DEA) = 90:10,0. 8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。經(jīng)過(guò)比對(duì)本發(fā)明制 得的S-構(gòu)型的產(chǎn)物與目標(biāo)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自江西科苑生物藥業(yè)有限公司）一致。
[0150] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種制備S-氰醇的方法，其特征在于，包括步驟： (1) 制備固定化的氰醇裂解酶； (2) 將所述固定化的氰醇裂解酶與反應(yīng)底物接觸，進(jìn)行催化反應(yīng)，從而生成所述S-氰 醇； (3) 分離并純化所述S-氰醇產(chǎn)物。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中，所述固定化的氰醇裂解酶 選自下組：氰醇裂解酶的交聯(lián)酶聚集體（CLEA，氰醇裂解酶酶分子之間發(fā)生交聯(lián)凝集成網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)，使之不溶于水從而形成固定化氰醇裂解酶）、吸附劑吸附的氰醇裂解酶（優(yōu)選地， 所述吸附劑包括活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等）。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中固定化的氰醇裂解酶的制備 方法如下： (a) 向氰醇裂解酶水溶液中加入戊二醛至終濃度5-15% (v/v); (b) 向步驟（a)獲得的溶液中加入沉淀劑，然后收集沉淀，即獲得所述固定化的氰醇裂 解酶（氰醇裂解酶的交聯(lián)酶聚集體）。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟（b)中，所述沉淀劑為硫酸銨，加 入硫酸銨固體至30 %-50 % (w/v)終濃度，優(yōu)選為35 %-40 % (w/v)終濃度，最優(yōu)選為36 % (w/v)終濃度。5. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟（a)中，加入戊二醛至終濃度10% (v/v) 〇6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中，所述反應(yīng)底物為間苯氧 基苯甲醛、和丙酮氰醇（或，氰氫酸）；優(yōu)選地，丙酮氰醇的濃度是間苯氧基苯甲醛濃度的2 倍。7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中，反應(yīng)的溫度為0°C -40°C， 優(yōu)選為l〇°C -35°C，更優(yōu)選地為15-25°C，如21°C。8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中，將所述底物溶于MTBE中， 加入所述固定化的氰醇裂解酶進(jìn)行催化反應(yīng)。9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟（2)中，反應(yīng)體系為MTBE有機(jī)相； 反應(yīng)條件為：固定化的氰醇裂解酶為催化劑，MTBE為溶劑，底物為間苯氧基苯甲醛，丙酮氰 醇（或，氰氫酸），15°C -25°C (優(yōu)選為20°C )反應(yīng)3-5小時(shí)（優(yōu)選為4小時(shí)），攪拌速度為 400-500rpm ;反應(yīng)體系中間苯氧基苯甲醛濃度為0. 1摩爾/升-1. 2摩爾/升（優(yōu)選為0. 5 摩爾/升），丙酮氰醇濃度為〇. 2摩爾/升一 2摩爾/升（優(yōu)選為1. 0摩爾/升），而且丙 酮氰醇的濃度是間苯氧基苯甲醛濃度的1. 5-3倍（優(yōu)選為2倍）。10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. :5 或 SEQ ID NO. :1 所示。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK106032543SQ201510498174
【公開(kāi)日】2016年10月19日
【申請(qǐng)日】2015年8月13日
【發(fā)明人】田振華, 程占冰, 孫傳民
【申請(qǐng)人】南京博優(yōu)康遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司