一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體(ATTO?NH)，屬于納米生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明中的新型多肽配體包括用于和量子點(diǎn)發(fā)生FRET的染料ATTO590(1)、提高多肽水溶性并帶負(fù)電荷序列(2)、用于結(jié)合量子點(diǎn)的天冬酰胺和組氨酸間隔序列(3)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合。該配體合成方法簡單，其C端通過6組天冬酰胺和組氨酸間隔序列與量子點(diǎn)結(jié)合，大大提高了配體與量子點(diǎn)的結(jié)合速率及穩(wěn)定性，可以作為納米熒光探針廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)記。
【專利說明】
一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體。
【背景技術(shù)】
[0002] 金屬陽離子因?yàn)槠涠拘詫Νh(huán)境造成嚴(yán)重污染，所以發(fā)明一種新型敏感的檢測金屬 離子的方法很有必要?；谔囟ń饘匐x子的分子傳感器已成為近年來研究的熱點(diǎn)，而基于 量子點(diǎn)（QDs)的傳感器的發(fā)展高度依賴于新型配體與其的自組裝。親和金屬驅(qū)動的量子點(diǎn) 因?yàn)槠涓呖煽匦砸呀?jīng)有效運(yùn)用到功能化量子點(diǎn)中。研究表明組氨酸個數(shù)(NS6)對多肽配體 和量子點(diǎn)自組裝有影響，發(fā)現(xiàn)長組氨酸序列可加強(qiáng)結(jié)合親和力。然而，由于空間位阻，超過6 個組氨酸殘基的多肽序列很難提高結(jié)合力（Wang，J.H.，Li，J.Y.，Chen，Y.，et al .Electrophoresis 2015,36,2419-2424·)。因此，組氨酸的數(shù)量和結(jié)構(gòu)對多肽配體起到 至關(guān)重要的作用，對于設(shè)計高效多肽配體和量子點(diǎn)自組裝具有重大意義。此外，盡管組氨酸 標(biāo)簽是最流行的融合標(biāo)簽之一，但它有可能影響目標(biāo)蛋白的活性和它們的三級結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:為了克服現(xiàn)有多肽配體與QDs結(jié)合速度慢、穩(wěn)定性差 等問題，限制其在生物領(lǐng)域中的普及使用，為解決由于空間位阻，超過6個組氨酸殘基的多 肽序列很難提高結(jié)合力，以及雖然組氨酸標(biāo)簽是最流行的融合標(biāo)簽之一，但它有可能影響 目標(biāo)蛋白的活性和它們的三級結(jié)構(gòu)的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種與QDs結(jié)合速度快，而且穩(wěn) 定性好的新型多肽配體。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體， 其特征在于:包括用于和量子點(diǎn)發(fā)生FRET的染料ΑΤΤ0 590(1)、提高多肽水溶性并帶負(fù)電荷 序列(2)、用于結(jié)合量子點(diǎn)的天冬酰胺和組氨酸間隔序列(3)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合。
[0005] 所述的用于和量子點(diǎn)發(fā)生FRET的染料ATTO 590( 1)能作為受體接受量子點(diǎn)的激發(fā) 光再發(fā)出新的波長的發(fā)射光;所述的提高多肽水溶性并帶負(fù)電荷序列(2)為2個谷氨酸和一 個甘氨酸;所述的組氨酸序列(3)為6組天冬酰胺和組氨酸間隔的多肽序列。
[0006] 本發(fā)明所述的量子點(diǎn)為含有Zn的量子點(diǎn)，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdS e/ZnSe或者 CdTe/ZnSe〇
[0007] 采用上述的技術(shù)方案后，本發(fā)明取得的有益效果是:本發(fā)明設(shè)計了含有天冬酰胺 (N)和組氨酸(H)的新型多肽配體(ATTO 590-E2G(NH)6，ATT0-NH)。通過天冬酰胺分離組氨 酸，這種新穎的結(jié)構(gòu)將使所有組氨酸與結(jié)合在Zn 2+量子點(diǎn)的表面上，可大大減小空間位阻， 因此顯示出更好的結(jié)合親和力。此外，本發(fā)明提供的修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體，合成方法 簡單，可重復(fù)性高，與量子點(diǎn)結(jié)合速度快，穩(wěn)定性高，解決了現(xiàn)有量子點(diǎn)多肽配體穩(wěn)定性不 足而導(dǎo)致其在生物體內(nèi)的不穩(wěn)定，進(jìn)一步拓展了量子點(diǎn)一一多肽復(fù)合物作為納米熒光探針 在生物中的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0008]圖1是量子點(diǎn)與新型多肽配體(ΑΤΤ0-ΝΗ)發(fā)生FRET的示意圖，圖中：
[0009] 1用于和量子點(diǎn)發(fā)生FRET的染料ΑΤΤ0 590;
[0010] 2提高多肽水溶性并帶負(fù)電荷序列；
[0011] 3用于結(jié)合量子點(diǎn)的天冬酰胺和組氨酸間隔序列。
[0012]圖2是用熒光毛細(xì)管電泳檢測ΑΤΤ0-ΝΗ與QDs結(jié)合的電泳圖，其中：
[0013] a，QDs;b，ATTO-NH:QD = 8:1;c，ATTO-NH:QD =16:1;d，ATTO-NH:QD = 3 2:1;e，ΑΤΤ0-NH:QD = 64:1。
[0014] 圖3是用不同濃度咪唑在毛細(xì)管內(nèi)檢測ATTO-NH與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性曲線。
[0015]圖4是用不同濃度組氨酸在毛細(xì)管內(nèi)檢測ΑΤΤ0-ΝΗ與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性曲線。
[0016]圖5是用不同濃度含組氨酸標(biāo)簽多肽H6G6在毛細(xì)管內(nèi)檢測ΑΤΤ0-ΝΗ與QDs結(jié)合的穩(wěn) 定性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 本發(fā)明將就以下實(shí)施例作進(jìn)一步說明，但應(yīng)了解的是，這些實(shí)施例僅為例示說明 之用，而不應(yīng)被解釋為對本發(fā)明實(shí)施的限制。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 本發(fā)明所述的方法采用常規(guī)的固相Fmoc法，即固相樹脂上被Fmoc保護(hù)的單體氨基 酸去保護(hù)后露出氨基，通過縮合反應(yīng)與溶液中氨基酸的羧基形成肽鍵，從而將氨基酸連接 到樹脂上，使肽鏈從C端向N端延伸。
[0020] 1、基本材料：
[0021] (1)樹脂與連接分子：固相Fmoc法選擇的樹脂為Rink Amide-OiemMatrix?樹 月旨。這種樹脂具有非常好的溶脹性，可以使肽鏈之間更好地進(jìn)行縮合反應(yīng)，且有足夠的網(wǎng)絡(luò) 空間滿足不斷增長的肽鏈。采用HBTU和HOBt作為連接分子，將多肽分子固定到樹脂上。
[0022] (2)單體:合成所用單體為經(jīng)化學(xué)修飾的α-氨基酸。
[0023] 2、反應(yīng)步驟：
[0024]第一步，將第一個氨基酸共價連接到樹脂上
[0025]加入適當(dāng)?shù)目s合劑如HBTU和HOBt，使被保護(hù)氨基酸羧基端與樹脂形成共脂以完成 氨基酸的固定；
[0026]第二步，去保護(hù)
[0027]采用堿性溶劑20%哌啶去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基。
[0028]第三步，激活和交聯(lián)
[0029]采用活化劑HBTU和HOBt活化下一個氨基上的羧基，與樹脂上的氨基交聯(lián)，形成肽 鍵。
[0030] 第四步，重復(fù)第二步和第三步，反復(fù)循環(huán)添加單體氨基酸，按照E2G(NH)6
[0031] 序列的順序從右到左合成，直到合成完成。
[0032] 3、合成后處理：（1)洗脫和脫保護(hù)：用脫保護(hù)劑三氟乙酸（TFA)將肽鏈從樹脂上洗 脫下來，并脫除保護(hù)基。
[0033] (2)HPLC分析純化，凍干保存。
[0034] 通過上述方法，合成多肽序列ATTO 590-E2G(NH)6(ATT0-NH)
[0035] 4、QDs和ΑΤΤ0-ΝΗ在毛細(xì)管內(nèi)作用研究：
[0036] 在毛細(xì)管內(nèi)，先進(jìn)樣QDs 10s，間隔10s，再進(jìn)樣ATTO-NH 10s。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ΑΤΤ0-NH與QDs的結(jié)合反應(yīng)在32:1達(dá)到平衡(如圖2,曲線d)。
[0037]為了檢測新型多肽配體與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性，在QDs與ΑΤΤ0-ΝΗ進(jìn)樣后，再進(jìn)樣取代 分子Im，His，H6G6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入大量取代分子后，部分ΑΤΤ0-ΝΗ會從QDs表面被取代下 來(圖3,4,5)。
[0038]測試方法：
[0039]用熒光毛細(xì)管電泳檢測ΑΤΤ0-ΝΗ與QDs的結(jié)合，電泳條件：25mM硼酸緩沖液（pH 9.3)，電壓為18kV。[QD] = 2.5μΜ。檢測波長，實(shí)線為565nm檢測QDs，虛線為625nm檢測ΑΤΤ0 590 〇
[0040]用不同濃度咪唑在毛細(xì)管內(nèi)檢測ΑΤΤ0-ΝΗ與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性。電泳條件：25mM硼 酸緩沖液(pH 9.3)，電壓為 181^^170-^:00 = 32:1,^0==2.541^
[00411用不同濃度組氨酸在毛細(xì)管內(nèi)檢測ΑΤΤ0-ΝΗ與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性。電泳條件：25mM 硼酸緩沖液(pH 9 · 3)，電壓為 18kV。ATTO-NH: QD = 32:1，[ QD] = 2 · 5μΜ。
[0042] 用不同濃度含組氨酸標(biāo)簽多肽H6G6在毛細(xì)管內(nèi)檢測ΑΤΤ0-ΝΗ與QDs結(jié)合的穩(wěn)定性。 電泳條件:25mM硼酸緩沖液(pH 9 · 3)，電壓為 18kV。ATTO-NH: QD = 32:1，[ QD] = 2 · 5μΜ。
[0043] 實(shí)施例2
[0044] 多肽合成步驟參照實(shí)施例1。按照DDG(NH)6序列的順序從右到左合成，合成新型多 肽配體序列如下：
[0045] ATT0-DDG(NH)6
[0046] 實(shí)施例3
[0047]多肽合成步驟參照實(shí)施例1。按照EES(NH)6序列的順序從右到左合成，合成新型多 肽配體序列如下：
[0048] ATT0-EES(NH)6
[0049] 按照實(shí)施例1的方法將實(shí)施例2~3得到的多肽序列分別與QDs用毛細(xì)管電泳分析， 檢測條件與實(shí)施例1相同，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們都能和QDs穩(wěn)定結(jié)合。
[0050] 通過上述實(shí)施例可以看出，本發(fā)明的新型多肽配體可以實(shí)現(xiàn)量子點(diǎn)與多肽配體的 快速結(jié)合，并且穩(wěn)定性高，操作方便。
[0051] 以上述依據(jù)本發(fā)明的理想實(shí)施例為啟示，通過上述的說明內(nèi)容，相關(guān)工作人員完 全可以在不偏離本項(xiàng)發(fā)明技術(shù)思想的范圍內(nèi)，進(jìn)行多樣的變更以及修改。本項(xiàng)發(fā)明的技術(shù) 性范圍并不局限于說明書上的內(nèi)容，必須要根據(jù)權(quán)利要求范圍來確定其技術(shù)性范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體，其特征在于：該多肽配體包括用于和量子點(diǎn)發(fā)生 FRET的染料ATTO 590(1 )、提高多肽水溶性并帶負(fù)電荷序列（2)、用于結(jié)合量子點(diǎn)的天冬酰 胺和組氨酸間隔序列(3)，各序列之間以肽鍵相結(jié)合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體，其特征在于:所述用于和量 子點(diǎn)發(fā)生FRET的染料ATTO 590 (1)能作為受體接受量子點(diǎn)的激發(fā)光再發(fā)出新的波長的發(fā)射 光。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體，其特征在于:所述的提高多 肽水溶性并帶負(fù)電荷序列（2)為2個谷氨酸或天冬氨酸和一個甘氨酸或絲氨酸任意組合序 列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體，其特征在于:所述的組氨酸 序列(3)為6組天冬酰胺和組氨酸間隔的多肽序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種修飾量子點(diǎn)的新型多肽配體，其特征在于:所述的量子點(diǎn) 為含有Zn的量子點(diǎn)，如CdSe/ZnS、CdTe/ZnS、CdSe/ZnSe或者CdTe/ZnSe。
【文檔編號】C07K5/083GK106046115SQ201610375715
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】王建浩, 張晨澄, 邱琳, 蔣鵬舉, 柳麗, 王車禮, 滕萬, 滕一萬, 陳瑤
【申請人】常州大學(xué)