一種長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKT1；4及其編碼基因與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKT1；4及其編碼基因與應(yīng)用。該轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明的長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKT1；4及其編碼基因可用于提高農(nóng)作物或優(yōu)良牧草的耐鹽性。鹽脅迫下EeHKT1；4基因主要在根和葉鞘中表達(dá)，而葉中的表達(dá)量很低并呈現(xiàn)基本不變的趨勢(shì)。將EeHKT1；4基因在煙草中過(guò)量表達(dá)，與野生型煙草相比，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性顯著被提高，說(shuō)明EeHKT1；4基因在植物耐鹽抗逆遺傳改良中具有重要的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
一種長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTI ;4及其編碼基因與 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)與生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 由于全球氣候變暖，世界人口不斷增加，工業(yè)污染加劇，灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展，化肥使 用不當(dāng)?shù)纫蛩?，土壤鹽漬化日趨嚴(yán)重，這不僅使得土壤荒漠化、生態(tài)環(huán)境進(jìn)一步惡化，并且 已經(jīng)成為阻礙作物生長(zhǎng)發(fā)育及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的主要因素。目前我國(guó)土壤鹽漬化日益嚴(yán)重，已經(jīng) 嚴(yán)重影響到農(nóng)作物的生產(chǎn)，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)里下降，這一嚴(yán)峻問(wèn)題亟待解決。現(xiàn)有技術(shù)解決問(wèn) 題的主要途徑還是傳統(tǒng)改良鹽漬土的方法，如淡水洗滌、合理灌溉和使用CaC0 3等。但是，傳 統(tǒng)措施投資大、效益低，并且隨著大量化學(xué)物質(zhì)的加入會(huì)加劇土壤的次生鹽漬化，這迫使人 們考慮采用其它措施來(lái)改良利用鹽漬土壤。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，培育抗鹽漬、耐干旱的適 宜在鹽漬土壤上生長(zhǎng)并具有較高經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值的植物品系，是開(kāi)發(fā)利用鹽漬土壤的一條 經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。所以對(duì)耐鹽基因的研究成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。
[0003] 增強(qiáng)植物耐鹽性或改良土壤鹽堿化已成為現(xiàn)階段面臨的主要問(wèn)題，而長(zhǎng)穗偃麥草 (Elytrigia elongata)是小麥的近緣種，原產(chǎn)于歐洲東南部和小亞細(xì)亞，生境為海濱和鹽 堿草甸，具有極強(qiáng)的耐鹽性，已成為改良小麥不可缺少的野生基因庫(kù)。研究發(fā)現(xiàn)，高親和K+ 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HKT(High Affinity K+Transporter)通過(guò)限制根部Na+的吸收，以維持體內(nèi)，特別 是地上部低的Na+濃度和高的K+/Na+比，是高等植物耐鹽性的關(guān)鍵。發(fā)明人已從長(zhǎng)穗偃麥草 強(qiáng)耐鹽種質(zhì)材料中篩選到與耐鹽基因緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記特異位點(diǎn)Xgwm044,經(jīng)測(cè)序證 明該位點(diǎn)核苷酸序列與一粒小麥TmHKT7-A2(TmHKTl ;4)基因同源性達(dá)93%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種高親和K+的長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTI ;4及其編 碼基因。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTI ;4及其編碼基因 在制備轉(zhuǎn)基因植物和提尚農(nóng)作物耐鹽能力中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTI ;4,其氨基酸序列為含有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0007] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl;4含有編碼p-loop A區(qū)域 的一段保守序列LFFTAVSAATVSSMSTV，其中第129位的S(絲氨酸）為P-loop A區(qū)域特異選擇 性位點(diǎn)，與Na+轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)。
[0008] 本發(fā)明基因包括編碼所述長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTI; 4的核苷酸序列為含 有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
[0009] 本發(fā)明提供一種含有上述任一種基因的重組載體。
[0010]可將本發(fā)明基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明蛋白的重組表達(dá) 載體，進(jìn)一步將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，獲得表達(dá)本發(fā)明長(zhǎng)穗偃麥草HKT類 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl ;4的基因工程菌。
[0011] 在本發(fā)明實(shí)例中，通過(guò)將EeHKTl ;4基因插入到表達(dá)載體pBI121上構(gòu)建得到重組表 達(dá)載體pB 1121 -EeHKT 1; 4。進(jìn)一步，將該表達(dá)載體導(dǎo)入到宿主菌中獲得表達(dá)EeHKT 1; 4基因工 程菌。
[0012] 上述重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013] 本發(fā)明還提供了上述EeHKT 1; 4基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明提供了長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl; 4或其編碼基因在提高植物耐鹽 能力中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明提供了長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl; 4或其編碼基因在植物種質(zhì)資源 改良育種中的應(yīng)用。
[0016] 優(yōu)選地，所述植物為農(nóng)作物或牧草。
[0017] 得到具有耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因水稻，使其可以在鹽漬土壤上生長(zhǎng)，這是開(kāi)發(fā)利用鹽 漬土壤的一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑。
[0018] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：提供長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl; 4及其編 碼基因，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證將該EeHKTl ;4基因在煙草中表達(dá)，可提高煙草耐鹽環(huán)境的能力；可將 EeHKTl ;4基因轉(zhuǎn)入農(nóng)作物中，獲得具有耐鹽能力的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，以提高農(nóng)作物的適應(yīng)性， 在農(nóng)作物育種中有重要的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為EeHKTl ;4跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)。
[0020] 圖2為長(zhǎng)穗偃麥草EeHKTl ;4與一粒小麥TmHKTl ;4-A2、硬粒小麥TdHKTl ;4-1氨基酸 的多重比較。箭頭所指的S(絲氨酸)為P-loop A區(qū)域特異選擇性位點(diǎn)。
[0021] 圖3為Real time RT-PCR分析不同濃度（0、25、50、100、150和2001111)恥(：1處理4811 后對(duì)長(zhǎng)穗偃麥草根、葉鞘及葉片中EeHKTl; 4基因表達(dá)水平的影響。圖中每個(gè)點(diǎn)均代表平均 值土標(biāo)準(zhǔn)誤(SEKnzShActin基因在Real time RT-PCR中作為內(nèi)參。
[0022] 圖4為長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl ;4基因植物表達(dá)載體pBI121-EeHKTl ;4的 構(gòu)建流程。
[0023] 圖5為轉(zhuǎn)基因植株L1、L7和野生型植株在OmM和200mM NaCl脅迫下，野生型煙草 (WT)與轉(zhuǎn)基因株系耐鹽性的影響。圖5A為鹽脅迫10d后對(duì)野生型與轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)情況的 影響圖(WT:野生型煙草，T2:轉(zhuǎn)基因煙草）；圖5B為鹽脅迫10d后對(duì)野生型與轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng) 狀況及根、莖、葉中K+、Na+變化的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神 和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。 [0025]若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技 術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0026]實(shí)施例1長(zhǎng)穗偃麥草及其編碼基因的cDNA克隆與鑒定
[0027] 根據(jù)已知的長(zhǎng)穗偃麥草EeHKTl; 4基因部分序列，長(zhǎng)度為614bp，設(shè)計(jì)5 ' -和3 '端引 物，采用RT-PCR和RACE方法從長(zhǎng)穗偃麥草中克隆到5 ' -和3 '端序列，長(zhǎng)度分別為580bp和 1117bp。最后將以上3個(gè)片段拼接得到EeHKTl;4基因全長(zhǎng)cDNA為1977bp，包含1722bp的開(kāi)放 閱讀框(〇RF)，28bp的5'非翻譯區(qū)（UTR)和227bp的3'-UTR，見(jiàn)圖1。編碼573個(gè)氨基酸，推測(cè)分 子量為62.92kDa，等電點(diǎn)為9.73。將其命名為EeHKTl; LEeHKTl; 4跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。
[0028] 具體操作如下：
[0029] (1)引物信息：
[0030] ① 5'端引物：
[0031] UPM：
[0032] 長(zhǎng)（〇·4μΜ):
[0033] 5 '-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 '
[0034] 短（2μΜ):5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，
[0035] 5，ΗΚΤ1;4WR1:5，-GTCTCATCATCGGCGGTAGTCG-3 '
[0036] NUP:5 '-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 '
[0037] 5 ' ΗΚΤ1;4NR2:5 '-GATCTCGACGCGCCTGGACGAC-3 '
[0038] ②3,端引物：
[0039] 3 ' ΗΚΤ1;4WF1:5 '-ACGTACCTCACACGAGGCTGCG-3 '
[0040] 3 ' 0:5 '-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3 '
[0041 ] 3 ' ΗΚΤ1;4NF1:5 '-TGTTCACGACGGTGTCCACGTTCT-3 '
[0042] 3 '1:5 '-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3 '
[0043] ③0RF框引物：
[0044] 0RF-F:5 '-ATGCAACTCCCAAGTCATAA-3 '
[0045] 0RF-R:5 '-CTAACTAAGCTTCCAGGTCC-3 '
[0046] (2)5'和3'段序列克隆方法按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit與 TaKaRa 3'_Full RACE Core Set With PrimerScropt? RTase試劑盒技術(shù)方法操作。
[0047] (3)將獲得的長(zhǎng)穗燕麥草高親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因全長(zhǎng)cDNA命名為EeHKTl ;4,其核 苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。長(zhǎng)穗偃麥草 EeHKTl;4與一粒小麥TmHKTl;4-A2、硬粒小麥TdHKTl;4-l氨基酸的多重比較見(jiàn)圖2，圖中第 129位的S(絲氨酸)為P-loop A區(qū)域特異選擇性位點(diǎn)。
[0048] 實(shí)施例2長(zhǎng)穗偃麥草EeHKTl;4基因在鹽脅迫下的表達(dá)特征
[0049] 為了分析長(zhǎng)穗偃麥草耐鹽能力變化規(guī)律，4周齡的長(zhǎng)穗偃麥草幼苗分別用不同濃 度NaCl (0、25、50、100、150和200mM NaCl)處理48h后各組織（葉片、葉鞘和根）中EeHKTl; 4基 因的表達(dá)水平進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。具體方法為：以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，
[0050] HKT1 ; 4基因表達(dá)引物序列為5 ' -CCGATGATGAGACGAGCAAG-3 ' 及5 ' -ATGGCGAGGACGACGAA-3,。
[0051] Actin基因引物序列為5' -CTTGACTATGAACAAGAGCTGGAAA-3 ' 及5 ' -TGAAAGATGGCTGGAAAAGGA-3,。
[0052]操作方法如下：
[0053] (1)總RNA提取:按照EZ-10RNA Mini-Preps試劑盒操作步驟提取長(zhǎng)穗偃麥草基因 組總RNA。
[0054] (2)cDNA第一鏈的合成：
[0055] ① DNA消除反應(yīng)：5XgDNA Eraser Buffer 2.0yL，gDNA Eraser l.OyL，Total RNA xyL，RNase Free dH2〇7_xyL，Total lO.OyL。于42°C反應(yīng)2min;
[0056] ②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：上述（1)反應(yīng)液 10.0yL，5XPrimerScript Buffer 4.0yL， PrimerScript RT Enzyme Mixl 1.0yL,RT Primer Mix 1.0yL,RNase Free dH2〇 4.0yL, Total 20.0 yL。于37°C反應(yīng)15min，85°C反應(yīng)5s，4°C保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。（注:總RNA的使用 量為lyg。）
[0057] (3)Real_time PCR:反應(yīng)體系：cDNA lyL，Primers 1.6yL，R0X Reference Dye 0.4yL，SYBRKPremixEix TaqII 10yL，dH2〇 7yL，總體積20yL。反應(yīng)條件：95°C30s;95°C 5s，60 °C lmin，40個(gè)循環(huán);95°C 10s; 65°C 5s，95°C 5s。記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，分析EeHKTl; 4基因 表達(dá)豐度強(qiáng)弱。
[0058] Real time RT-PCR分析表明：隨著NaCl(50_200mM)處理濃度的增加，其葉片、葉鞘 和根中的EeHKTl ;4基因轉(zhuǎn)錄豐度均呈增加趨勢(shì)，且表現(xiàn)出根〉葉鞘〉葉片的趨勢(shì)。這說(shuō)明 EeHKTl;4基因能夠從葉鞘和根木質(zhì)部汁液中卸載Na+，進(jìn)而防止葉片中的Na+積累至毒害水 平，從而在維持地上部K+、Na+穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用。
[0059]實(shí)施例3長(zhǎng)穗偃麥草EeHKTl; 4基因功能鑒定
[0000] 利用Clontech Infusion試劑盒相關(guān)的技術(shù)方法，將EeHKTl ;4基因正向插入到植 物表達(dá)載體PBI121的Xba I和Sma頂每切之間（圖4)，得到植物過(guò)量表達(dá)載體pBI121-35S-EeHKTl;4-Nos。采用 CaCl2 凍融法將 pBI121-35S-EeHKTl;4-Nos 質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌 EHA105 中， 利用葉盤侵染法，將含有pBI 121-35S-EeHKTl; 4-Nos植物表達(dá)載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液對(duì)已 分化出愈傷組織的葉盤進(jìn)行侵染，振蕩侵染7min，黑暗處理2d，放置于含50mg/L卡那霉素 (Kan)與500mg/L羧芐青霉素(Carb)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，以獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。 [0061 ] 將轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草分別在0、50、100和200mM NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中 脅迫l〇d，用蒸餾水沖洗煙草植株表面鹽分，然后將根用預(yù)冷的20mM 0&(：12潤(rùn)洗811^11，吸水 紙吸干其表面水分，分別取其根與地上部，于80°C烘干（Wang et al.2007;Guo et al. 2015)。將干樣放入20mL試管中，加入1 OmL的1 OOmM冰乙酸，90°C溫浴2h，冷卻后過(guò)濾，稀 釋適當(dāng)倍數(shù)，使用原子吸收分光光度計(jì)(AA-6300C, Shimadza,Kyoto Japan)測(cè)定K+、Na+。 [0062] 將轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草分別在0、50、100和200mM NaCl的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中 離子脅迫l〇d，用蒸餾水沖洗煙草植株表面鹽分，然后將根用預(yù)冷的20mM 0&(：12潤(rùn)洗811^11， 吸水紙吸干其表面水分，分別取其根與地上部，于80 °C烘干（Wang et al. 2007; Guo et al. 2015)。將干樣放入20mL試管中，加入1 OmL的1 OOmM冰乙酸，90°C溫浴2h，冷卻后過(guò)濾，稀 釋適當(dāng)倍數(shù)，使用原子吸收分光光度計(jì)(六4-6300(：，311；[1]^(123，1(7〇1:〇，加口311)測(cè)定1( +、似+。通 過(guò)分析不同濃度NaCl條件下野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草地上部與地下部K+、Na+累積模式變化 規(guī)律。結(jié)果表明：隨著NaCl(50~200mM)處理濃度的增加，Na+的積累濃度在煙草的根、莖、葉 中均呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，表現(xiàn)出根〉莖〉葉的趨勢(shì)（圖5A)，而K+呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（圖5B)。其中在100 ~200mM NaCl處理下，轉(zhuǎn)基因煙草根與莖中Na+積累濃度高于野生型，分別高于15.3%、 18.2%與11.7%、14.2%，而K+沒(méi)有明顯差異；而轉(zhuǎn)基因葉片中Na+濃度顯著低于野生型煙 草，分別為30.2%、33.9%，相反K+濃度顯著高于野生型，為29.7%、37.0%。這表明，與野生 型煙草相比，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草中的Na+被沉積在根部和莖中，減少了其葉中Na+的過(guò)量積 累，以避免了對(duì)葉片的傷害，從而維持了葉片中K+、Na+穩(wěn)態(tài)，從而提高了轉(zhuǎn)基因煙草植株的 耐鹽性。
[0063]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl; 4，其特征在于，其氨基酸序列為含有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。2. 如權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl; 4，其特征在于，含有編碼P-loop A區(qū)域的一段保守序列LFFTAVSAATVSSMSTV，其中第129位的絲氨酸為P-loop A區(qū)域特 異選擇性位點(diǎn)，與Na+轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)。3. 編碼權(quán)利要求1所述的長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKT 1; 4的基因。4. 如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列為含有SEQ ID NO. 1所示的核 苷酸序列。5. 含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組載體。6. 含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組微生物。7. 含有權(quán)利要求3或4所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。8. 權(quán)利要求3或4所述基因在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。9. 長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKT 1; 4或其編碼基因在提高植物耐鹽能力中的應(yīng)用。10. 長(zhǎng)穗偃麥草HKT類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白EeHKTl; 4或其編碼基因在植物種質(zhì)資源改良育種中的 應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK106046131SQ201610562031
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月15日
【發(fā)明人】孟林, 郭強(qiáng), 張琳, 毛培春, 田小霞
【申請(qǐng)人】北京市農(nóng)林科學(xué)院