一種全人源抗CD45的全分子IgG抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種全人源抗CD45的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；且所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。本發(fā)明還公開了上述全分子IgG抗體的DNA分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和應(yīng)用。
【專利說明】
一種全人源抗CD45的全分子I gG抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種全人源抗⑶45的全分子IgG抗體，還 涉及該全分子IgG抗體的DNA分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 器官、細(xì)胞和組織移植排斥以及各種自身免疫性疾病目前認(rèn)為是主要是由T細(xì)胞 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)引起的。T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)最初是由輔助T細(xì)胞識(shí)別特定的抗原開始 的。這些輔助T細(xì)胞可能是以前遺留的記憶細(xì)胞免疫反應(yīng)或幼稚細(xì)胞釋放的胸腺和可以表 達(dá)任何一個(gè)極其廣泛的抗原受體。當(dāng)輔助T細(xì)胞識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞(APC)或巨噬細(xì)胞的表面 的抗原-MHC復(fù)合物后，輔助T細(xì)胞被刺激后釋放IL-2促進(jìn)輔助T細(xì)胞增殖。增殖導(dǎo)致大量的T 細(xì)胞識(shí)別一個(gè)特定的抗原。T細(xì)胞激活也可能刺激B細(xì)胞活化和非特異性巨噬細(xì)胞反應(yīng)。
[0003] -些細(xì)胞增殖分化成細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而破壞了抗原識(shí)別能力?？乖Ш?，成 熟的細(xì)胞可以保持記憶的輔助T細(xì)胞和記憶細(xì)胞毒性T細(xì)胞，在體內(nèi)循環(huán)和識(shí)別再次出現(xiàn)的 抗原。如果抗原引起這種反應(yīng)不是外源性抗原，而是內(nèi)源性抗原，就會(huì)導(dǎo)致自身免疫性疾 病，如果發(fā)生在器官移植中，就表現(xiàn)為移植排斥。因此，研究調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是急 需的。
[0004] CD45抗原是一種穩(wěn)定、高表達(dá)于所有白細(xì)胞和他們的前體細(xì)胞以及超過70%的骨 髓有核細(xì)胞表面上的單鏈細(xì)胞膜糖蛋白，CD45又被稱為GP180，T200或白細(xì)胞共同抗原 (LCA)，是一種分子量約為200kDa的酪氨酸磷酸酶，CD45能廣泛的表達(dá)于幾乎所有的白細(xì) 胞，包括骨髓的髓系前體細(xì)胞和淋巴結(jié)中的成熟淋巴細(xì)胞以及90 %的AML細(xì)胞，這些細(xì)胞和 組織為病人治療的緩解或復(fù)發(fā)提供了大量抗體結(jié)合位點(diǎn)。由于CD45作為白細(xì)胞的標(biāo)記物能 出現(xiàn)在正常和惡性細(xì)胞，所以在病人體內(nèi)應(yīng)用抗CD45抗體可以通過代謝分布到骨髓、脾臟 和淋巴結(jié)中與靶抗原結(jié)合，用于治療急性白血病或是器官移植排斥反應(yīng)或是一些自身免疫 性疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在 于提供一種全人源抗⑶45的全分子IgG抗體。
[0006] 本發(fā)明的目的又在于提供一種編碼上述全人源抗⑶45的全分子IgG抗體的DNA分 子。
[0007] 本發(fā)明的目的又在于提供一種含有能編碼上述全人源抗⑶45的全分子IgG抗體的 DNA分子表達(dá)載體。
[0008] 本發(fā)明的目的又在于提供一種被上述的表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
[0009] 本發(fā)明的目的還在于提供上述全人源抗⑶45的全分子IgG抗體的應(yīng)用。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過大量試驗(yàn)研究，包括全人源Fab噬菌體抗體庫 的篩選，抗CD45特異性抗體的純化，抗CD45全分子抗體IgG的制備、表達(dá)及純化，抗CD45全分 子抗體IgG的特性分析，最終獲得了 一種全人源抗CD45的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區(qū) 和重鏈可變區(qū)，
[0011] (1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或 多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
[0012] 且(2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè) 或多個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0013] 優(yōu)選地，所述的輕鏈可變區(qū)的三個(gè)抗原互補(bǔ)區(qū)⑶R的氨基酸序列為SEQ ID N0.5， SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重鏈可變區(qū)的三個(gè)抗原互補(bǔ)區(qū)⑶R的氨基酸序列 SSEQIDN0.8，SEQIDN0.^PSEQIDN0.1(^；f*。
[0014] 本發(fā)明還提出的一種全人源抗⑶45的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒 定區(qū)，所述的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0.11所示，所述的重鏈恒定區(qū)的氨基酸 序列為SEQ ID N0.12所示。
[0015] 本發(fā)明還提出的一種DNA分子，其編碼上述全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。
[0016] 優(yōu)選地，其編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQID NO. 1所示，編碼重鏈可變區(qū)的核 酸序列為SEQ ID N0.2所示。
[0017] 本發(fā)明還提出的一種表達(dá)載體，包含有上述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相 連的表達(dá)調(diào)控序列。
[0018] 本發(fā)明還提出的一種宿主細(xì)胞，被上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。
[00?9]優(yōu)選地，該宿主細(xì)胞可以是被上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的293Freesty le細(xì)胞。
[0020] 本發(fā)明還提出的上述全分子IgG抗體在制備與CD45相關(guān)的器官移植及自身免疫性 疾病的診斷試劑或治療藥物中的用途。
[0021] 目前國內(nèi)尚未報(bào)道專門針對(duì)CD45的抗體，本發(fā)明制備的是全人源IgG抗體，而且實(shí) 驗(yàn)證明有很好的特異性及能夠抑制CD8+及CD4+細(xì)胞的增殖。
[0022]本發(fā)明通過噬菌體抗體庫技術(shù)篩選到了對(duì)CD45具有高度親和力的人源Fab抗體， 并獲取了賦予所述抗體優(yōu)異特性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，并將所 述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)與含有抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體連接，最終獲得了具有特異的抗 原結(jié)合性和在器官移植動(dòng)物水平具有較好的抗排異反應(yīng)。
[0023]本發(fā)明提供了一種具有高特異性、良好親和力的抗CD45的全分子全人源單克隆抗 體。由于CD45作為白細(xì)胞的標(biāo)記物能出現(xiàn)在正常和惡性細(xì)胞，所以在病人體內(nèi)應(yīng)用抗CD45 抗體可以通過代謝分布到骨髓、脾臟和淋巴結(jié)中與靶抗原結(jié)合，用于治療急性白血病或是 器官移植排斥反應(yīng)或是一些自身免疫性疾病。本發(fā)明以CD45為靶分子，在噬菌體抗體庫技 術(shù)的基礎(chǔ)上制備出全分子人源抗體。對(duì)制備的人源抗CD45抗體做功能鑒定，顯示該抗體能 夠與CD45特異性結(jié)合，而且實(shí)驗(yàn)證明有很好的特異性及能夠抑制CD8+及CD4+細(xì)胞的增殖。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所得純化全人源抗⑶45的全分子I gG抗體的SDS-PAGE檢測結(jié) 果;其中1為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品，2為抗CD45抗體，3為抗TLR4抗體，4為細(xì)胞培養(yǎng)上清，5為流 穿；可見使用Pro. A柱純化抗⑶45抗體純度高。
[0025]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所得抗CD45抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測結(jié)果，可見抗CD45 抗體與CD45蛋白的結(jié)合能力較強(qiáng)。
[0026]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所得抗CD45抗體與CD45的免疫印跡鑒定結(jié)果；其中1為抗 ⑶45抗體與⑶45蛋白表達(dá)菌;2為抗⑶45抗體與BL21空菌;可見抗體與⑶45蛋白有特異性結(jié) 合能力。
[0027]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所得抗⑶45抗體的親和力檢測結(jié)果，KD值為2.699X10-1QM。
[0028] 圖5為T細(xì)胞與抗⑶45抗體、抗⑶3抗體孵育后的結(jié)果對(duì)比圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗⑶45 抗體對(duì)CD8+及CD4+細(xì)胞的增殖有抑制作用。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面，通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0030] 實(shí)施例1全人源抗⑶45的全分子IgG抗體的制備
[0031] 1)用⑶45抗原在人源Fab噬菌體庫中經(jīng)過六輪"吸附-洗脫-擴(kuò)增"的富集篩選，獲 得抗⑶45的Fab抗體，然后通過PCR擴(kuò)增測序獲得Fab抗體的可變區(qū)序列。
[0032] 2)根據(jù)已獲得的抗體的重輕鏈可變區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物。
[0033] 3)擴(kuò)增抗⑶45抗體重鏈、輕鏈。
[0034] 以上述制備的人源Fab模板，分別以上述涉及的重鏈和輕鏈的上下游引物擴(kuò)增全 分子人源抗體重鏈、輕鏈基因。
[0035] (l)PCR
[0036] 反應(yīng)體系如下：
[0038] 反應(yīng)條件如下：
[0040] (2)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下觀察目的條帶，切膠回收。
[0041 ] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0042] 4)雙酶切IgG表達(dá)質(zhì)粒
[0043] IgG表達(dá)質(zhì)粒pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk(購自 Invivogen公司）包含IgGl型 人源的重鏈和輕鏈(Lambda)恒定區(qū)堿基編碼序列。
[0044] (1 )pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk 模板載體的雙酶切
[0045] 反應(yīng)體系如下：
[0047]反應(yīng)條件為:37 °C酶切過夜。
[0048] (2) 1 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外下切膠回收。
[0049] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0050] 5)Infusion PCR重組表達(dá)質(zhì)粒 [0051 ] 反應(yīng)體系如下：
[0053] 反應(yīng)條件為：5(TC孵育15min。
[0054] 取5yL反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，鋪于相應(yīng)抗性的平板上，次日挑克隆送測序。將測 序結(jié)果正確的克隆保存菌種并擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。
[0055] 6)抗CD45抗體的表達(dá)
[0056] (1)取50yg重組后的重鏈質(zhì)粒于lmL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取50yg的輕鏈質(zhì)粒于 lmL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取200yL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，將上述三種 混合液室溫靜置5min;
[0057] (2)然后將兩個(gè)質(zhì)粒混合液混合均勻后，補(bǔ)加500yL的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻后 直接加入轉(zhuǎn)染試劑293Fectin的混合液，混合均勻后靜置20min。期間處理293F細(xì)胞，將293F 細(xì)胞離心后用293F Expression Medium重懸，然后計(jì)數(shù)以及用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)算細(xì)胞活力比，吸 取1 X 108個(gè)細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中，用293FExpression Medium定容為94mL;
[0058] (3)20min結(jié)束后將6mL的DNA、293Fectin的復(fù)合物加入準(zhǔn)備好的293F細(xì)胞中；
[0059] (4)將細(xì)胞放在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件8%⑶2，120^?，37°(：，6天后收集細(xì) 胞上清。
[0060] 7)抗CD45抗體的純化
[0061 ]將收集的細(xì)胞上清用0.22μπι的濾膜過濾，同時(shí)將平衡液和洗脫液過濾膜。用AKATA 純化儀按照Protein Α純化的標(biāo)準(zhǔn)步驟純化，以lmL/min的速度上樣，以1.5mL/min的速度洗 脫。
[0062] 結(jié)果成功表達(dá)并純化抗⑶45抗體。將純化抗⑶45抗體進(jìn)行SDS-PAGE檢測，其結(jié)果 如圖1所示，由圖1可知純化的抗體純度很高，且用Pro. A柱純化效果較好。
[0063]實(shí)施例2抗⑶45抗體的功能活性鑒定 [0064] 1)酶聯(lián)免疫法
[0065]用包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6 )CD45蛋白至2yg/mL包被ELISA96孔板，每孔 加入100yL，4 °C過夜;PBST (PBS含0.5 % TWeen20) 5 %脫脂牛奶-洗滌緩沖液封閉，37 °C孵育 2h; PBST洗滌5次后，每個(gè)孔中加入100yLPA21抗體(2yg/mL起始濃度，14個(gè)濃度梯度稀釋)37 °C 2h;以1:4000稀釋的羊抗人二抗lOOyL/孔加入到孔內(nèi)，37 °C孵育lh;過氧化物酶底物顯色 液100μL7孔，室溫下10分鐘后用2M硫酸中止反應(yīng)，上機(jī)檢測比色采用雙波長450nm/690nm。 [0066]結(jié)果如圖2示所示，由圖2可知:抗CD45抗體能與CD45蛋白起抗原抗體反應(yīng)。
[0067] 2)ffestern blot
[0068] 以不表達(dá)⑶45分子的空菌作為陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)染⑶45表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)菌作為陽性對(duì) 照進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，將此膜與2yg/mL PA21抗體室溫孵育lh， 1:4000稀釋HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司）和ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司）曝光于凝 膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司）。
[0069]結(jié)果如圖3所示:抗⑶45抗體與表達(dá)的⑶45蛋白的泳道有特異性結(jié)合。
[0070] 3)親和力檢測
[0071 ] 根據(jù)⑶45的等電點(diǎn)以及按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol優(yōu)化偶聯(lián)條 件，斜率優(yōu)化選擇醋酸鈉作為偶聯(lián)稀釋緩沖液。用此緩沖液稀釋CD45樣品稀釋至25yg/mL后 偶聯(lián)到CM5芯片上。預(yù)設(shè)偶聯(lián)水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀釋CD45樣品，稀 釋一系列濃度至0nM、5nM、10nM 2〇11]\1、4〇11]\1、8〇11]\1。設(shè)置進(jìn)樣時(shí)間為18〇8，解離時(shí)間1〇1^11，再 生緩沖液用50mMpH2·2Gly_HCl。按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol進(jìn)行上機(jī)測試。 [0072] 親和力檢測結(jié)果如圖4所示，KD值為2.699X10- 1QM。
[0073] 4)⑶45抗體抑制⑶8+及⑶4+細(xì)胞的增殖
[0074] 通過流式篩選的⑶8+及⑶4+的T細(xì)胞并鑒定⑶25及⑶69分子，將T細(xì)胞與抗⑶45抗 體、抗⑶3抗體(0KT3)共孵育3h后檢測T細(xì)胞的表型。
[0075]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抗⑶45抗體對(duì)⑶8+及⑶4+細(xì)胞的增殖有抑制作用。
[0076] 上述文中Μ為mol/L的含義。
[0077]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種全人源抗⑶45的全分子IgG抗體，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，其特征在于， (1)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多個(gè) 氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體； 且（2)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個(gè)或多 個(gè)氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述全分子IgG抗體，其特征在于，所述的輕鏈可變區(qū)的三個(gè)抗原互 補(bǔ)區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQIDN0.5，SEQIDN0.6和SEQIDN0.7所示 ；所述的重鏈可變 區(qū)的三個(gè)抗原互補(bǔ)區(qū)CDR的氨基酸序列為SEQIDN0.8，SEQIDN0.9和SEQIDN0.10所示。3. -種全人源抗⑶45的全分子IgG抗體，包含輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)，其特征在于， 所述的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID NO.11所示，所述的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為 SEQ ID NO. 12所示。4. 一種DNA分子，其編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述全分子IgG抗體的重鏈或/和輕鏈。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQID NO. 1所示，編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO.2所示。6. -種表達(dá)載體，包含有權(quán)利要求4所述的DNA分子以及與該DNA分子操作性相連的表 達(dá)調(diào)控序列。7. -種宿主細(xì)胞，被權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。8. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述全分子IgG抗體在制備與CD45相關(guān)的器官移植及自身免疫 性疾病的診斷試劑或治療藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】A61P35/02GK106046163SQ201610483095
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】馮振卿, 徐亞如, 許國貞, 劉振云, 唐奇, 朱進(jìn)
【申請(qǐng)人】安徽未名細(xì)胞治療有限公司